Procédures légères

76 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de foie humain, une inoculation des virus des hépatites B et Delta et des prélèvements sanguins répétés pendant douze semaines, pour identifier des voies de signalisation et des cibles antivirales. Le porteur indique que l'échec de la greffe peut faire perdre du poids aux souris ou entraîner leur mort par insuffisance hépatique. Il décrit la souris au foie humanisé comme une alternative "indispensable", le chimpanzé, seul autre modèle naturellement infectable, étant interdit.

Objectifs

Le virus de l’hépatite Delta (VHD) est un virus satellite qui repose sur la présence du virus de l’hépatite B (VHB) pour sa multiplication. Les co-infections VHD-VHB représentent la forme la plus sévère des hépatites virales entraînant une accélération la progression de la fibrose hépatique vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire (CHC) ou cancer du foie. La progression de la maladie hépatique implique une dérégulation des voies de signalisation cellulaires avec des conséquences sur l’inflammation et sur l’environnement entrainant le développement du cancer. Le but de ce projet est d’identifier les voies de signalisation dérégulées par le VHD et le VHB dans les hépatocytes, ou cellules du foie, afin de découvrir de nouvelles protéines conduisant à la progression de la maladie et de mettre au point de nouvelles molécules antivirales permettant de prévenir la progression de la maladie hépatique et le développement du cancer du foie.

Bénéfices attendus

Afin d’identifier les voies cellulaires dérégulées lors de co-infections VHB-VHD, nous souhaitons établir un atlas des changements cellulaires induits lors des infection VHB et VHD au sein des hépatocytes, ce dans le but d’identifier les voies de signalisation pertinentes pour les virus et la maladie ainsi que leurs régulateurs. Nous pensons ainsi pouvoir découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques antivirales ainsi que des candidats-médicaments pour un futur développement préclinique de nouveaux antiviraux et concepts de chimio-prévention.

Procédures

Les animaux recevront tout d’abord une injection intraveineuse afin d’améliorer la prise de greffe. Cette injection est réalisée sur animaux anesthésiés et ayant reçu une analgésie locale. Les animaux seront ensuite soumis à une petite chirurgie permettant la greffe de cellules de foie humain susceptibles à l’infection par le VHB et le VHD. L’injection de cellules de foie humain est réalisée dans la rate des animaux. L’infection par le VHB et le VHD sera réalisée par inoculation des virus par une injection unique dans le péritoine sur animaux vigiles après désinfection à l’alcool de la zone à piquer. Les animaux seront également soumis à un prélèvement de sang une fois toutes les 2 semaines pendant 12 semaines, soit un prélèvement avant l’inoculation et 5 prélèvements après l’inoculation, soit un total de 6 prélèvements. Les prélèvements sont réalisés sur animaux anesthésiés et ayant reçu une analgésie locale.

Impact sur les animaux

Nous utilisons et maîtrisons ce modèle murin depuis plus de 6 ans et la procédure de greffe depuis plus de 10 ans. La greffe de cellules de foie humain est réalisée suite à une petite chirurgie nécessitant une exposition de la rate Cette chirurgie n’induit pas d’effets indésirables chez les animaux. Il est néanmoins possible que la greffe soit inefficace et que les cellules de foie humain transplantées ne repeuplent pas le foie des souris. Dans ce cas, les animaux vont perdre du poids et peuvent mourir d’hépatodéficience aigüe. Suite à la greffe, les animaux ont recouvré un état de santé et de bien-être compatible avec leur utilisation dans ce projet. Les infections par le VHB et le VHD n’entraînent pas de phénotype particulier ni de douleur ou souffrance chez l’animal. Les animaux infectés peuvent vivre plusieurs mois sans problème.

Devenir

Les animaux de la colonie de reproducteurs seront mis à mort lorsque la qualité de reproduction déclinera. Les 2 animaux d’un couple sont mis à mort si aucune portée n’est obtenues depuis plus de 3 mois. Les animaux greffés chez qui la prise de greffe n’est pas efficace seront mis à mort car ils ne pourront pas être utilisés pour d’autre procédures. Les animaux inoculés avec les virus de l’hépatite B et Delta ainsi que les animaux contrôles non infectés sont mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie et le sang qui nous permettront de réaliser les différentes analyses nécessaires à ce projet.

Remplacement

Afin de remplacer l’utilisation d’animaux, une majorité d’expériences sont menées en amont, in vitro sur des lignées cellulaires et sur des hépatocytes primaires humains afin de nous assurer de la réelle nécessité de poursuivre sur ces modèles animaux greffés avec des hépatocytes humains. Il est toutefois nécessaire d’utiliser des animaux pour ce projet car les lignées cellulaires sont dérivées de cellules cancéreuses avec un phosho-protéome fortement altéré par rapport à des cellules primaires. De plus l’utilisation d’hépatocytes primaire nécessiterait un nombre très élevé de cellules fraichement isolées, les cellules congelées étant très difficiles à infecter in vitro. L’utilisation de biopsies humaines n’est également pas envisageable car les patients diagnostiqués avec une infection VHD sont très rares, et leur condition de conservation n’est pas compatible avec nos besoins permettant d’analyser le phospho-protéome. Dès lors, notre modèle de souris au foie humanisé est une alternative indispensable à l’identification de nouvelles voies dérégulées par les virus et potentiellement cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, seul le nombre requis de souris seront greffées pour ce projet. Nous avons déterminé au préalable le nombre d’animaux nécessaire à ce projet sur la base de 2 critères principaux à savoir le taux de repeuplement du foie par les hépatocytes humains greffés, déterminés par dosage de l’albumine humaine sérique, et les charges virales VHB et VHD qui peuvent être très variables. Nos études de corrélation charge virale/albumine humaine montrent une corrélation positive pour VBH, mais pas de corrélation pour VHD. De plus la co-infection VHB-VHD réduit significativement la charge virale VHB, le VHD interférant avec le cycle viral du VHB. Nous avons donc estimé qu’un nombre de 8 souris par groupe est le minimum requis afin d’obtenir des résultats intra et inter-groupes comparables et interprétables.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tube de coton pour nidifier et des briques de tremble pour ronger, les animaux sont maintenus en groupe de 3 minimum afin d’éviter tout stress de l’animal isolé, les souris greffées auront un suivi quotidien adapté et tous les moyens nécessaires seront mis en œuvre pour éviter tout stress ou douleurs des procédures expérimentales (anesthésie, analgésie), des points limites adaptés et précoces ont été établis afin de soustraire les animaux à toute forme de souffrance inutile.

Choix des espèces

Seul le chimpanzé peut-être naturellement infecté, comme l’homme, par les virus VHB et VHD. L’utilisation du chimpanzé étant interdite depuis la nouvelle directive européenne relative à l’utilisation d’animaux en expérimentation animale, l’étude de ces virus in vivo est donc restreinte. Seuls les modèles de souris chimériques au foie humanisé peuvent maintenant être utilisés. De plus ces souris au foie humanisé permettent d’étudier précisément l’impact des maladies hépatiques et virales sur les hépatocytes humains et de tester des approches thérapeutiques pertinentes pour les patients. Les animaux seront utilisés à un âge adulte d’environ 8 semaines pour la greffe d’hépatocytes et un âge d’environ 20 semaines au moment de l’inoculation des virus.

280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit une chirurgie créant un défaut osseux dans la mandibule avec section du nerf alvéolaire inférieur, suivie de séances d'imagerie sur deux mois, pour tester des biomatériaux de régénération osseuse. Le porteur reconnaît de possibles difficultés de mastication et prévoit une nourriture molle les premiers jours. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier ensemble formation osseuse, vascularisation et innervation dans la complexité d'un être vivant.

Objectifs

En ingénierie tissulaire pour la réparation osseuse, l’utilisation de scaffolds tridimensionnels a pour but d’offrir une alternative à la greffe pour combler des défauts osseux de taille critique. Ces scaffolds sont principalement des biomatériaux possédant des propriétés d’ostéoinduction et d’ostéoconduction grâce à leur composition. Cependant, les biomatériaux favorisant la vascularisation pour la réparation osseuse sont rares, et ceux prenant en compte le processus d’innervation sont quasiment inexistants. Même si le rôle de la vascularisation dans l’os est connu depuis longtemps, celui de l’innervation n’a été montré que récemment dans des études de dénervation de l’os, ce qui explique le manque de biomatériaux qui prennent en compte ce processus dans la régénération osseuse. Pour pouvoir d’une part confirmer le rôle de l’innervation dans la réparation osseuse ainsi que la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, et d’autre part tester le potentiel de régénération osseuse de différents biomatériaux fabriqués au laboratoire, il est donc nécessaire de passer à un modèle de petit animal. La fabrication de ces biomatériaux dans le laboratoire se fait dans le cadre du projet SPARK qui vise au développement de nouvelles matrices tridimensionnelles pour des applications en ingénierie tissulaire osseuse. Ce projet a donc pour but de développer un modèle permettant d’étudier le rôle de l’innervation dans la réparation de l’os et de tester le potentiel de différents biomatériaux dans la régénération osseuse, notamment dans les processus d’innervation et de vascularisation.

Bénéfices attendus

La reconstruction de défauts osseux critiques est l’un des défis majeurs dans le domaine clinique, en particulier dans le cas de lésions osseuses dues à des traumatismes, cancers, ou autres maladies induisant des pertes de tissu osseux telles que les pseudarthroses ou l’ostéoporose. Ce projet a pour but de tester le potentiel de régénération osseuse, de vascularisation et d'innervation de nouveaux biomatériaux pour le comblement osseux. Il pourra ainsi permettre de sélectionner des matériaux intéressants pour la réparation osseuse dans un contexte clinique.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à la chirurgie du défaut osseux circulaire dans la mandibule, couplé à la résection du nerf alvéolaire inférieur. Ils seront également tous soumis à la microtomographie aux rayons X aux temps 15 jours, 1 mois et 2 mois. Enfin, après la dernière série d'acquisition d'imagerie aux rayons X, les animaux seront euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone.

Impact sur les animaux

La réalisation du défaut osseux circulaire dans la mandibule de rat pourrait entrainer des difficultés de mastication et donc de nutrition des animaux après la chirurgie. C'est pour cette raison que les animaux recevront de la nourriture molle et enrichie pendant les 2 à 3 premiers jours après la chirurgie.

Devenir

A l'issue de la première procédure (chirurgie du défaut osseux et résection du nerf alvéolaire inférieur), les animaux seront maintenus en vie pour pouvoir réaliser la seconde procédure (imagerie aux rayons X) aux temps 15 jours, 1 mois et 2 mois. A l'issue de la dernière acquisition (2 mois), tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir réaliser ensuite des analyses histologiques et immunohistochimiques au niveau du défaut osseux.

Remplacement

Aucune méthode in vitro ne permet d’étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l’innervation induites par des biomatériaux tout en prenant en compte la complexité d’un être vivant (système immunitaire, flux sanguin…).

Réduction

L’utilisation de méthodes d’imagerie in vivo pour le suivi à differents temps de la reconstruction osseuse permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés pour ces expérimentations. Le nombre d’animaux par groupe est également calculé pour utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats exploitables de manière statistique.

Raffinement

La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée en post-opératoire pour limiter la douleur. Les conditions de stabulation des animaux seront également adaptées avec isolement des animaux après l’opération pour limiter les risques de réouverture de l’incision. Les rats seront ensuite regroupés 5 jours plus tard de façon à favoriser les interactions sociales importantes pour le bien-être animal. Les conditions d’hébergement et le milieu d’enrichissement seront également pensés pour favoriser le bien-être des animaux (litière avec copeaux, tuyaux pour jouer et se cacher…).

Choix des espèces

Le rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l’animal de matériaux destinés au traitement de défauts osseux. Sa taille plus grande que la souris permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant dans l’os de la mandibule. Les rats utilisés seront des rats Wistar adultes de 10 à 12 semaines. En effet, ils devront avoir achevé leur croissance pour éliminer le biais induit par le développement sur la régénération osseuse. De plus, la taille plus importante de la mandibule chez les adultes facilitera l’opération.

198 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent cinq injections de tamoxifène, et pour 108 d'entre elles une injection de cardiotoxine dans un muscle de la patte afin de provoquer une lésion, pour étudier la régénération musculaire par les cellules souches. Le porteur affirme que l'anesthésie et l'analgésie "garantissent l'absence de douleur" et que les souris reprennent leurs activités dès le réveil. Il conclut qu'aucune méthode ne peut se substituer à l'animal, ce processus reposant selon lui sur des interactions entre tissus lésés impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

Les muscles squelettiques composent près de la moitié de la masse totale d’un individu et permettent la motricité du corps. Ils sont principalement composés de fibres musculaires, de vaisseaux sanguins, de nerfs et de tissu conjonctif. Suite à une blessure, les cellules souches résidentes du tissu musculaire s’activent, prolifèrent et réparent le tissu musculaire lésé. Ce processus implique une communication avec les cellules voisines afin de reconstruire les fibres musculaires de façon optimale. Le projet de recherche consiste à étudier la réparation musculaire en identifiant les signaux de communication importants, déployés spécifiquement par les cellules souches musculaires au cours de la régénération musculaire. Nous développerons deux approches, la première consistera à isoler des cellules souches d’animaux modèles et de former des muscles in vitro pour étudier des voies de régulation spécifiques au cours de la régénération musculaire. La deuxième approche nous permettra d’évaluer la régénération du tissu musculaire, mais cette fois-ci in vivo, à partir de ces mêmes modèles de souris transgéniques. Dans le contexte de régénération musculaire, ce projet de recherche nous permettra d’identifier les voies de communication entre cellules qui sont essentielles à la réparation musculaire. Ce projet utilisera au total 198 souris, ceci correspondant à la réduction optimale du nombre de souris nous permettant d’obtenir des résultats statistiquement interprétables.

Bénéfices attendus

Cette approche permettra d’identifier les signaux extracellulaires reçus par les cellules souches musculaires au cours de la régénération du muscle. En plus d’augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction des cellules souches musculaires du muscle squelettique, ces résultats permettront de concevoir de nouvelles stratégies de médecine régénérative.

Procédures

5 injections intrapéritonéales d'huile contenant ou non du tamoxifène sur animaux vigiles (198 animaux). Chaque injection prend 5 minutes. Une injection intramusculaire de cardiotoxine dans le muscle releveur de la patte sur animaux anesthésiés (108 animaux). Cette intervention dure 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les trois modèles conditionnels et inductibles de souris transgéniques, qui seront utilisés dans le projet, ne présentent pas de phénotype dommageable à l’état basal. Les injections intrapéritonéales de tamoxifène (procédure n°1 et 2) n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal, aux doses et fréquences utilisées. L’utilisation d’analgésique et d'anesthésique au cours de la procédure n°2 de lésion musculaire garantit l’absence de douleur chez l'animal. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu’elles ne montrent pas de signes de douleur pendant les jours suivants.

Devenir

Les animaux sont mis à mort et les muscles sont prélevés.

Remplacement

Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour l’étude de la régénération du muscle via l’activation des cellules souches musculaires. Ce processus repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Ces résultats n'auraient pas pu être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ce qui justifie la poursuite de notre projet utilisant des modèles transgéniques murins.

Réduction

L'utilisation des animaux sera réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales et contrôlé à l'aide d’analyses statistiques adaptées (T-Test ou ANOVA). De plus, les résultats de la procédure n°1 conditionneront la mise en œuvre de la procédure n°2, ceci permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant le début de chaque procédure, les animaux suivront une période d’acclimatation d’au moins une semaine. Au cours de la procédure n°1, les animaux seront pesés quotidiennement dès le premier jour de l’injection et ce jusqu’à la dernière injection, puis une fois par semaine jusqu’à leur mise à mort. Anesthésiques et analgésiques sont utilisés au cours de la procédure n°2 afin de prévenir au maximum le stress et la souffrance des animaux. En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés au moins 1 fois par semaine afin de contrôler leur posture, leur mobilité, leur comportement et leur niveau d’interaction sociale, tout changement pourrait refléter souffrance, douleur ou stress, même minime, chez l’animal. Si ces changements sont relevés pendant plus de 48h, des mesures adéquates seront prises en accord avec le personnel animalier afin d’améliorer les conditions de vie de l’animal et d’éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l’Homme, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l’analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. De plus, la souris permet l'utilisation de modèles transgéniques conditionnels et inductibles, permettant la délétion d’un gène d’intérêt dans un type cellulaire et à un temps donné. Les expériences menées sur ces modèles ont permis d’obtenir des résultats fondamentaux et novateurs qui n'auraient clairement pas pu être établis à l'aide de lignées cellulaires. Les expériences seront principalement réalisées sur des souris âgées de 8 semaines. L'âge choisi est le plus adapté à l'étude de la régénération du muscle squelettique. Plus jeune, le tissu est encore en croissance. Plus âgé, une fibrose peut se développer et perturber le processus de régénération.

1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des xénogreffes de tumeurs neuroendocrines, sous la peau ou par chirurgie dans la rate, des anesthésies répétées et des séances d'imagerie, avant prélèvement des tumeurs et des organes. Le porteur met au point une molécule d'imagerie visant le récepteur à la somatostatine, avec une extension thérapeutique espérée. Il affirme que l'usage d'un "organisme entier" est "indispensable" pour évaluer la toxicité.

Objectifs

Les Tumeurs NeuroEndocrines (TNE) sont des tumeurs rares et hétérogènes dans leur présentation anatomopathologique et clinique. Cela rend leur diagnostic, leur pronostic et la prise en charge thérapeutique particulièrement difficiles. L’approche théranostique (utilisation de l’imagerie pour cartographier les cellules cancéreuses et les traiter de manière ciblée) est particulièrement développée pour ce type de tumeurs. Celle-ci utilise en effet la présence d’une molécule particulière à la surface des cellules tumorales (le récepteur à la somatostatine). Cette stratégie thérapeutique est actuellement la plus efficace pour le traitement des TNE mais elle comporte quelques limites. En effet, le récepteur à la somatostatine n’est pas toujours présent, notamment dans les tumeurs les plus agressives. Nous savons qu’il existe un autre récepteur présent dans ces tumeurs, le récepteur X, et nous souhaitons l’utiliser pour développer une nouvelle approche théranostique. Cela nous permettrait de proposer un nouvel outil pour l’imagerie, et à plus long terme pour la thérapie. Cette stratégie pourrait s’avérer profitable dans d’autres pathologies tumorales puisque ce récepteur existe dans d’autres types de cancers. Dans ce projet, nous proposons de cibler le récepteur X grâce à une petite molécule appelée aptamère, qui est facile à produire. Notre agent ciblant le récepteur X sera dans un premier temps couplé à une molécule fluorescente, puis à un élément radioactif. Nous souhaitons démontrer que l’aptamère peut être utilisé en imagerie des TNE grâce à deux modèles murins de progression tumorale que nous maîtrisons au laboratoire.

Bénéfices attendus

En cas de réussite, ce projet appuiera la transition de notre stratégie de l’imagerie vers la thérapie. Pour cela, il suffira de modifier le couplage de l’aptamère en utilisant un composé radioactif adapté aux traitements anticancéreux. Cela constituera une stratégie thérapeutique complémentaire à celle déjà existante pour le traitement des TNE. Les retombées potentielles de ce projet pourront également concerner d’autres cancers. En effet, le récepteur X est présent dans de nombreux types de tumeurs.

Procédures

- Anesthésies répétées (pour chirurgie et imagerie) - Injections sous-cutanées - Injections intraveineuses - Procédure chirurgicale : greffe intrasplénique (10 minutes depuis le début de l’anesthésie jusqu’à la suture de la laparotomie) dans 3 procédures (2, 4 et 6) - Pousse tumorale limitée (taille inférieure à 1500mm3 pour le modèle sous-cutané, nodules hépatiques millimétriques dans le modèle intrasplénique)

Impact sur les animaux

La xénogreffe par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. Les tumeurs développées dans ce modèle sont de petite taille. Elles n’entraînent pas de gêne chez les animaux. Aucune métastase n’est observée. La xénogreffe par injection intrasplénique implique une petite chirurgie sous anesthésie générale avec un risque de douleur au réveil. L'imagerie implique également une petite anesthésie générale.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à l’issue de chaque procédure pour analyse des tumeurs développées et des organes prélevés.

Remplacement

Notre projet vise à développer un nouvel outil permettant l’imagerie in vivo des tumeurs neuroendocrines grâce au récepteur X, puis de développer un agent thérapeutique. L’utilisation d’un organisme entier est donc indispensable car il faut évaluer la toxicité éventuelle de notre molécule au niveau des différents organes. La molécule a été au préalable testée sur des cultures de cellules tumorales afin de remplacer une partie des travaux chez la souris.

Réduction

Quatre aptamères différents ont été testés sur des cultures de cellules tumorales. Seuls deux de ces aptamères seront testés chez la souris. De plus, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au minimum tout en générant des résultats valables sur le plan statistique. A chaque étape du projet, nous sélectionnerons la meilleure molécule et le meilleur modèle, ce qui permettra de réduire également le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Ils seront pesés deux fois par semaine. Si des signes de souffrance sont identifiés après la chirurgie (prostration, difficulté de déplacement), une analgésie pourra être maintenue (par exemple par ajout de Doliprane dans l’eau de boisson). Si une perte de poids supérieure à 20% du poids maximal (28g) survient, l’animal sera immédiatement mis à mort. La xenogreffe sous-cutanée est réalisée par le personnel de la plateforme qui maîtrise parfaitement le geste. Les animaux reçoivent des analgésiques (buprénorphine 0.05 mg/kg, et lidocaïne en crème 5% au niveau de la zone de la laparotomie) avant la chirurgie afin de prévenir toute souffrance. La petite laparotomie nécessaire à l’injection est suturée à l’aide de fil chirurgical résorbable, ce qui améliore considérablement le confort des animaux.

Choix des espèces

Pour acquérir les données nécessaires à la validation de nos séquences aptamères pour l’imagerie des TNE, nous avons besoin d’utiliser des modèles mimant au mieux la pathologie. Nos modèles de xénogreffes sur souris ont été validés lors d’études antérieures et sont bien caractérisés et maîtrisés. La souris est relativement proche de l’homme. De, plus l'utilisation de souris immunodéficientes facilite la prise tumorale. Toutes les xénogreffes seront réalisées sur des souris Athymic nude ou Swiss nude de 5 à 7 semaines, qui est l'âge optimal d'utilisation des souches de souris immunodéprimées et pour lequel nos modèles de xénogreffes ont été validés lors d'études antérieures.

470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime hyperlipidique, une partie subit une chirurgie stéréotaxique implantant une sonde dans le cerveau, un isolement en cage individuelle de trois semaines et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur étudie les troubles de l'humeur associés à l'obésité et à l'inflammation, avec des retombées nutritionnelles ou pharmacologiques renvoyées au long terme. Il affirme que le recours au modèle animal reste une "nécessité expérimentale".

Objectifs

Le thème général du projet concerne l'étude des effets nocifs d'une alimentation déséquilibrée sur les troubles de l'humeur. Plus précisément, il s'agit ce caractériser et de comprendre le développement des troubles de l'humeur associés à la consommation chronique d'un régime hypercalorique hyperlipidique chez la souris. Nous nous intéressons particulièrement aux effets de cette alimentation sur l'inflammation dite "de bas bruit" qu'elle va générer, et qui va médier un certain nombre de processus conduisant à la perturbation du fonctionnement des systèmes de neurotransmission monoaminergiques qui peuvent sous-tendre le développement des troubles de l'humeur, jusqu'à la dépression. Si certains effets de l'inflammation dans ces phénomènes sont aujourd'hui décrits, les mécanismes neurochimiques précis mis en jeu ne sont pas encore totalement élucidés. En particulier, leur implication dans le déficit de réponse aux antidépresseurs, dont la proportion est largement plus présente chez les patients dépressifs présentant une inflammation chronique, reste peu étudiée et reste à démontrer.

Bénéfices attendus

Ce travail apportera des données scientifiques utiles pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la dépression associée à l’inflammation. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il permettra à plus long terme de développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et/ou pharmacologiques pour améliorer la réponse thérapeutique et la prise en charge des individus atteints de troubles de l’humeur, en particulier lorsque ces derniers sont associés à un contexte inflammatoire.

Procédures

Des chirurgies seront réalisées sur souris anesthésiées, afin d'insérer dans une région spécifique du cerveau une sonde de dialyse, permettant de receuillir le milieu extracellulaire et d'y doser un neurotransmetteur, la dopamine. Il est prévu un nombre de 120 souris pour cette procédure, qui sera réalisée une seule fois sur chaque animal. Les souris seront soumises à la contention nécessaire à une injection intra-péritonéale (470 souris), 120 souirs seront placées en isolement pendant 3 semaines. Les souris seront soumises à des tests comportementaux (420 souris).

Impact sur les animaux

La prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisance pour les souris. Un comportement anxieux et/ou de type dépressif (modèlisé ici) est atendu chez les souris soumises au régime hyperlipidique et fait l'objet de cette étude. Les douleurs attendues concernent celles liées à la chirurgie stéréotaxique, la contention et l'injection intra-péritonéale et l'isolement en cage individuelle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures, afin de prélever leur cerveau pour analyses ultérieures.

Remplacement

L'objectif général du projet est de mieux comprendre chez l'animal les ménanismes mis en jeu dans le développement des troubles de l'humeur en condition inflammatoire induite par une exposition chronique à un régime obésogène. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l'étude des troubles de l'humeur reste une nécessité expérimentale afin d'appréhender la réalité physiologique de nos résultats. La recherche d'alternatives dans des bases de données démontre que les solutions de rechange ne sont pas à ce jour disponibles ou applicables.

Réduction

Les mêmes souris seront sucessivement soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale.Lorsque cela est possible, les mêmes souris seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Le nombre minimal de souris pour chaque groupe expérimental est fixé afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante, afin de ne pas répéter la procédure.

Raffinement

A leur arrivée, les souris bénéficient d'une période minimale d'une semaine d'habituation à leur nouvel environnement avant de débuter les expérimentations. En concertation avec la structure Bien-Etre du laboratoire, nous avons défini les meilleurs conditons d'hébergement possibles ainsi que les points limites et d'arret précoces et adaptés. Les souris seront ainsi hébergées par 5 (excepté pour le test comportemental de mesure de fatigue en cage individuelle avec roue d'activité sur une période maximale de 3 semaines), avec présence de différents enrichissements, surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Les protocoles réalisés sur les animaux sont au préalables soumis puis approuvés par l'équipe en charge de l'animalerie afin d'assurer les bonnes conditions d'expérimentation. Pour les procédures invasives et/ou susceptibles de générer une douleur, les soins pré- et pos-opératoires sont appliqués, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie sont mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes évitant la répétition des expériences.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permet un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. Les animaux arriveront au laboratoire à l’âge du sevrage (P21). Ils seront mis immédiatement sous régime contrôle ou hyperlipidique jusqu’à la fin de l’expérience. Toutes les expériences seront ensuite faites à l’âge adulte (après 15 semaines d'exposition au régime).