Procédures légères
Fonction des cellules natural killer dans un modèle murin d’exacerbation viro-induite de l’asthme allergique
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un asthme allergique aggravé par un rhinovirus leur est induit par instillations nasales répétées sous anesthésie, avec administration d'anticorps derrière l'oeil, pour étudier le rôle des cellules natural killer. Le porteur indique que ces protocoles ne sont pas identifiés comme douloureux mais génèrent le stress de préhensions répétées et les effets de l'infection respiratoire. Il affirme que la complexité et la cinétique de cette pathologie ne peuvent être reproduites in vitro ou in silico.
Objectifs
L’asthme est une maladie pulmonaire chronique complexe aboutissant à une obstruction bronchique réversible, qui affecte les enfants et les adultes. Dans le monde, en 2019, on estime que 262 millions de personnes souffraient d’asthme et que cette maladie a entraîné 461 000 décès. Cependant, ces chiffres sont très probablement sous-estimés. L’asthme est sévère pour environ 10% des patients qui souffrent de symptômes persistants malgré une bithérapie de fond incluant des fortes doses de corticoïdes inhalés. Les exacerbations ou aggravations des symptômes d’asthme restent un problème majeur dans le suivi et l’évolution des asthmatiques, qu’ils soient sévères ou non. Elles représentent le motif principal de recours aux soins. Environ 50 à 80% des exacerbations sont associées à des infections virales respiratoires (chez les adultes et les enfants, respectivement). Parmi les virus impliqués, 50-60% sont des rhinovirus, appartenant plus précisément aux groupes A et C. Même si certains mécanismes impliqués dans les exacerbations ont été identifiés, les connaissances restent insuffisantes pour développer des traitements efficaces. Il y a donc un réel besoin de mieux comprendre la physiopathologie des exacerbations viro-induites des asthmatiques allergiques, quel que soit leur âge et leur traitement. Les cellules natural killer (NK) participent à l’immunité innée antivirale précoce, et sont présentes en grande quantité dans les poumons. Cependant, leur rôle dans les exacerbations viro-induites de l’asthme sont largement méconnus. L’objectif de notre travail est de mettre en place un modèle d’exacerbation induite par un rhinovirus (RV) chez la souris, après sensibilisation allergique pulmonaire. Nous utiliserons le RV-C15, qui est associé à des symptômes plus sévères. Dans ce modèle, nous identifierons et caractériserons les cellules NK pulmonaires et leurs fonctions.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet sont de plusieurs niveaux : (1) d’ordre technique ou expérimental, avec la mise en place du modèle d’exacerbation de l’asthme expérimental induite par un rhinovirus de type RV-C15 ; (2) d’ordre fondamental, avec une meilleure compréhension du rôle des cellules NK dans la pathogénèse des exacerbations viro-induites de l’asthme. A plus long terme, ce modèle pourra servir de modèle d’étude pré-clinique pour évaluer de nouvelles thérapeutiques dans le traitement des exacerbations viro-induites de l’asthme.
Procédures
- Instillations intranasales sous anesthésie volatile (isoflurane 2% avec un débit d’air de 1L/min) : * 25µl par souris et par instillation * 6 instillations intranasale par souris, d’extraits d’acarien ou de solution saline * 1 instillation intranasale par souris, de rhinovirus vivant ou de solution contrôle - administration intraveineuse d’anticorps sous anesthésie volatile (isoflurane 2% avec un débit d’air de 1L/min) au niveau du sinus rétro-orbital : 50µl. Une admnistration par souris, uniquement pour la procédure 3. - 1 administration intrapéritonéale par souris pour adminitration léthale de pentobarbital
Impact sur les animaux
Les protocoles d’asthme n’ont pas été identifiés comme protocoles douloureux. Cependant, ils peuvent provoquer des nuisances sur les animaux comme le stress de la préhension pour l'anesthésie volatile (6-7 fois), et celui d'une injection intra-péritonéale pour le surdosage d'anesthésique avant la mise à mort. L'infection avec le rhinovirus RV-C15 génère quant à elle un stress lors de la phéhension pour l'anesthésie volatile (1 fois), et des effets indésirables liés à l'infection respiratoire. Néanmoins, aucune douleur n'a été signalée à ce jour dans la bibliographie concernant l'infection à RV-C15. Les animaux seront donc quotidiennement surveillés afin de répertorier d'éventuels effets indésirables, comme la perte de poids.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de prélever les organes.
Remplacement
Il s’agit de l’étude d’une pathologie faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux paramètres dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro, ou modélisées in silico. Nous allions néanmoins ce travail à des études in vitro analysant les fonctions des cellules NK de patients asthmatiques qui pourront enrichir le projet présenté ici, voire orienter nos études futures.
Réduction
Les calculs des effectifs sont basés sur notre expérience en matière de modèles d’asthme et les calculs de puissance effectués permettant des analyses statistiques correctes et la mesure de nombreux paramètres caractéristiques de l’asthme : inflammation (cellules : nombre et localisation, cytokine) et remodelage bronchique, ainsi que sur la publication ayant décrit l’utilisation du RV-C15 pour induire une exacerbation des réponses asthmatiques chez la souris BALB/c (Rajput, et al. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.649520). Ainsi, le nombre a été calculé au plus juste pour chaque protocole. Plus précisément, pour les procédures 1 et 2, nous nous sommes basés sur des résultats précédemment obtenus (composition du lavage bronchoalvéolaire en nombre d’éosinophiles chez des souris mâles et des souris femelles sensibilisées à un autre acarien ou non sensibilisées), et avons réalisé un calcul d’effectif avec le logiciel InVivoStat v4.3.0 en considérant un risque alpha de 5% et une puissance de 80%. Le calcul ainsi réalisé donne un nombre de sujets de 6 par groupe. Pour ce qui est de la procédure 3, nous nous sommes basés sur des résultats préliminaires sur le pourcentage de cellules NK localisées dans le parenchyme pulmonaire parmi les cellules NK pulmonaires. En utilisant le logiciel InVivoStat v4.3.0, avec un risque alpha égal à 5%, une puissance de 80%, et avec pour objectif de mettre en évidence une différence absolue minimale égale à 2 écart-types, nous avons obtenu un effectif de 6 animaux par groupe L’étude préliminaire permettant d’établir notre modèle chez la souris C57BL/6J sera réalisée sur 6 groupes de souris par sexe afin d’envisager toutes les combinaisons et de ne négliger aucun groupe contrôle (y compris les souris sensibilisées aux extraits d’acariens et non infectées et leurs contrôles non sensibilisés), afin de caractériser complétement le modèle. Il faut signaler que ce modèle de sensibilisation allergique est très dépendant de l’animalerie où il est effectué, car les réponses immunes mises en jeu sont modifiées par le microbiote de l’animal, lui-même dépendant de la structure d’accueil. Cependant pour les études suivantes, nous éliminerons les groupes « souris sensibilisées aux extraits d’acariens et non infectées » et leurs contrôles « non sensibilisés » afin de réduire le nombre d’animaux utilisés aux conditions infectées par RV-C15 vivant ou non vivant.
Raffinement
Les expérimentations seront débutées 7 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Les animaux seront hébergés en cage de 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique teintés. Les facteurs physiques de l'environnement (lumière, bruit, température et renouvellement d'air) sont contrôlés et adaptés au modèle murin. Après anesthésie gazeuse à l’isoflurane (2% avec un débit d’air de 1L/min) et instillation intrasale, les souris seront surveillées jusqu’à leur réveil. Après infection avec le RV-C15, les souris seront suivies quotidiennement par un personnel qualifié. Une fiche d’observation sera remplie afin d’assurer un suivi de l’état de souffrance/douleur des animaux et de prendre les mesures adaptées le plus précocément possible.
Choix des espèces
Les modèles animaux souris reproduisent les différents paramètres de la pathologie asthmatique allergique. En outre de nombreuses souris génétiquement modifiées ou anticorps spécifiques existent permettant d’identifier des molécules ou cellules impliquées. Dans la plupart des protocoles, les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-8 semaines) comme dans la majorité de la littérature sur le sujet.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 978 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Un glioblastome leur est implanté dans le cerveau par stéréotaxie, avec suivi par IRM et injections répétées d'un peptide seul ou couplé à des nanocapsules de paclitaxel, une perte de poids supérieure à 20 % déclenchant la mise à mort. Le porteur revendique une combinaison d'études permettant de "raffiner" les doses et de réduire les lots suivants. Il affirme qu'il est "indispensable" de passer par un modèle animal reproduisant le glioblastome avant tout essai chez l'humain.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde, une survie médiane de 14 mois et aucun traitement curatif. Le traitement actuel consiste en une exérèse chirurgicale suivie par le protocole de Stupp (radiothérapie et chimiothérapie avec le témozolomide). Des travaux publiés ont montré l’action anti-mitotique du peptide NFL-TBS.40-63 dans des cellules de GBM (rats, souris, humain). Ce peptide inhibe la prolifération et la viabilité des cellules souches et différenciées de GBM. Chez des rats porteurs d’un GBM orthotopique (F98), des injections intraveineuses répétées de ce peptide (15 mg/kg, une injection par jour pendant 5 jours) diminue de 53,5% la taille de la tumeur et améliore leur survie par rapport aux animaux non traités (résultats non publiés). Sur ce même modèle tumoral, la barrière hémato-encéphalique est lésée et permet le passage de molécules comme ce peptide (APAFIS N°2901) (résultats non publiés). De plus, adsorbé à la surface de nanocapsules lipidiques (LNCs), ce peptide augmente leur internalisation dans des cellules murines de GBM (GL261) comparativement aux LNCs seules. In vivo, une seule injection intratumorale de LNCs couplées au peptide et chargées en paclitaxel (0,8 mg/kg) diminue de manière plus efficace le volume tumoral de souris portant un GBM murin comparativement aux LNCs chargées en paclitaxel et non couplées au peptide (75% contre 60%, respectivement). Une société de biotechnologies en santé travaille sur les formulations du peptide seul (GC01) et combiné aux LNCs-paclitaxel (GC04) pour en faire de futurs candidats-médicaments pour le GBM. Leur développement pharmaceutique a permis de les formuler pour une utilisation clinique (formulations validées in vitro sur des cellules de GBM, notamment les cellules F98 utilisées dans ce projet) (résultats non publiés). Le but de ces travaux avancés de recherches pré-cliniques non réglementaires est d’étudier la tolérance et l’efficacité de GC01 et GC04 après administrations répétées chez des rats sains ou porteurs de GBM en déterminant la voie d’administration la plus adaptée (intraveineuse IV, intrapéritonéale IP ou sous-cutanée SC) dans un modèle physiopathologique proche de celui observé chez l’Homme afin de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients.
Bénéfices attendus
Une société de biotechnologies en santé travaille actuellement sur des formulations du peptide seul (GC01) et combiné aux LNCs chargées en paclitaxel (GC04) pour en faire de futurs candidats-médicaments dans le traitement du GBM. Ces nouvelles formulations ont été préalablement testées et validées in vitro sur des cellules de GBM (notamment sur les cellules F98 qui seront utilisées dans ce projet) (résultats non publiés). Le but de ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire est donc d’étudier in vivo la tolérance et l’efficacité de GC04 et de valider le maintien de l’activité de GC01 après administrations répétées chez des rats sains ou porteurs de GBM tout en déterminant la voie d’administration la plus adaptée pour ces traitements (intraveineuse IV, intrapéritonéale IP ou sous-cutanée SC) dans un modèle physiopathologique le plus proche possible de celui observé chez l’Homme, dans le but de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients opérables ou non. Ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire ont pour but de valider l’innocuité des traitements et leur efficacité et ainsi, confirmer leur intérêt thérapeutique. Si l’intérêt thérapeutique est attesté et la posologie déterminée, ces travaux pourront servir de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques.
Procédures
Dans l’étude 1, les animaux subiront deux types d’intervention, des injections IV ou IP ou SC sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) et un prélèvement par ponction cardiaque (1 fois puisque cette intervention sera suivie par la mise à mort des animaux). Dans l’étude 2, les animaux subiront trois types d’intervention, l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure quelques heures, le suivi de la croissante tumorale par IRM (3 IRM de suivi qui dureront quelques heures et qui seront espacées de plusieurs semaines) et des injections IV ou IP ou SC sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles). Dans l’étude 3, les animaux subiront deux types d’intervention, une injection unique IV ou IP ou SC qui durera quelques minutes et des prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudale et de la veine jugulaire (5 à 7 prélèvements maximum, qui dureront quelques minutes chacun et qui seront espacés de plusieurs minutes à plusieurs heures). Dans l’étude 4, les animaux subiront trois types d’intervention, l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure quelques heures, le suivi de la croissante tumorale par IRM (1 IRM de suivi qui durera quelques heures) et des injections IV ou IP ou SC (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) ou une injection unique IV, qui dure quelques minutes, ou une injection intra-tumorale qui durera quelques heures.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de l’étude 1 qui a pour but d’évaluer l’innocuité des traitements et de définir ainsi les doses maximales répétées tolérées (MTRD) ou les doses sans effet nocif observables (NOAEL). GC04 étant composé d’un anticancéreux (le paclitaxel), des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’acte chirurgical et la croissance tumorale (hyperpression intracrânienne, œdème, etc.) ainsi qu’à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, pour toutes les études décrites, les animaux seront tous mis à mort par inhalation de CO2 pour prélèvements de sang et/ou d’organes afin de réaliser des études post-mortem, ou seront mis à mort suite à l’atteinte de points limites spécifiques et établis selon un tableau de score (par animal) qui permettra d’évaluer l’état général des animaux (une perte de poids supérieure à 20%, par rapport au poids mesuré en début de protocole, ou un score égal ou supérieur à 12 points impliquera la mise à mort de l’animal avant la fin de la procédure ou de l’étude).
Remplacement
L’utilisation de GC01 et GC04 en thérapeutique étant à visée humaine, il est nécessaire de réaliser des études précliniques, comme ici des études toxicologiques et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur innocuité et efficacité avant de passer à des essais cliniques chez l’Homme. Ces traitements visent les femmes et les hommes, c’est pourquoi il est important de démontrer leur innocuité chez les deux sexes. Des travaux menés sur des cultures de cellules tumorales et saines ont déjà été réalisées pour valider les molécules et formulations testées. Pour compléter l’étude, il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer.
Réduction
La combinaison des deux premières études (études 1 et 2) permettra de raffiner la posologie et le mode d’administration, et ainsi de réduire le nombre de lot d’animaux à tester dans les études suivantes (études 3 et 4). Le nombre d’animaux mâles pourra également être réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez les femelles. De plus, lors de l’étude de toxicité, une seule dose à la fois sera testée. Ainsi, si la plus haute dose n’est pas toxique, les doses plus basses ne seront pas systématiquement testées. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il n’est pas utile d’avoir plus d’animaux, mais il est préférable de ne pas en utiliser moins, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe. Pour les études 1 (toxicité) et 4 (biodistribution), des comparaisons multiples (ANOVA) et des comparaisons appariées (Bonferroni’s correction) vont être effectués entre les différents groupes, notamment entre les groupes contrôles et les groupes traités. Pour l’étude 2 (efficacité), les analyses statistiques seront réalisées grâce au test Log-Rank après représentation des données sous forme de courbes type Kaplan-Meier, afin d’évaluer de potentielles différences significatives entre les différents traitements.
Raffinement
Les animaux sont reçus 2 à 4 semaines avant de débuter les expérimentations afin qu’ils s’acclimatent à leur nouvel environnement et à la contention. Selon l’Arrêté du 01/02/2013 fixant les conditions d’agrément, d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs, éleveurs ou fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques, le nombre de rats maximum par cage sera défini en fonction de leur poids (et âge) et du type de cage (surface adaptée). Par exemple, 7 rats femelles de 200-300g pourront être hébergées dans des cages de 1820 cm2. Aucune alimentation spécifique (à part nourriture et eau suffisantes), ni enrichissement particulier des cages (à part la présence d’une cabane) n’est nécessaire pour mener ces études. La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien de leur poids, de leur bien-être, d’un changement dans leur comportement, de l’apparition de signes cliniques de souffrance (posture, poils hérissés et sales, tremblements, prostration, difficultés de se déplacer, aucune réponse aux stimuli …). Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi. Afin d’évaluer de façon raffiner la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sous forme de tableau sera mis en place et annoté régulièrement pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé (apparence physique, comportement, hydratation et prise de poids). Un score de 0 à 4 sera établi pour chaque paramètre contrôlé, 0 correspondant à un paramètre normal et 4 correspondant à un paramètre anormal fortement prédictif d’une souffrance ou d’une douleur. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, pour un score inférieur à 12 points (points limites prédictifs et précoces adaptés), de la buprénorphine (0,05 mg/kg) serait administrée (en sous-cutanée) toutes les 4h en journée (3 injections maximum par jour), pendant plusieurs jours, jusqu’à ce que ces signes disparaissent. Une perte de poids supérieure à 20%, par rapport au poids mesuré en début de protocole, ou un score égal ou supérieur à 12 points (critère d’arrêt) impliquera la mise à mort de l’animal. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet.
Choix des espèces
Au début de l’expérimentation, les rats Fischer adultes seront âgés de 9-10 semaines. A leur arrivée à l’animalerie, les rats fournis seront âgés de 6-7 semaines. Pendant les 2 à 3 semaines de stabulation, les animaux s’acclimateront à leur nouvel environnement et seront manipulés par les expérimentateurs quotidiennement pour les habituer à la contention et ainsi réduire leur stress lors des études. Le choix de l’âge en début de projet a été dicté par la procédure de chirurgie (la taille de l’animal doit être suffisante pour être adaptée au cadre de stéréotaxie utilisé dans l’animalerie), mais aussi par les précédents travaux réalisés dans le laboratoire. Les animaux seront des femelles et des mâles. Il est important de vérifier l’efficacité anti-tumorale de GC01 et GC04 sur les deux sexes puisque ce traitement est destiné à la fois aux femmes et aux hommes. Ces études seront d’abord réalisées sur des rats Fisher femelles adultes, qui ont déjà été utilisées dans de précédentes études menées sur GC01. Selon les résultats (étude 1 et 2), les doses à injecter chez les rats mâles pourront être modulées pour ainsi réduire au strict minimum le nombre de lots d’animaux mâles à utiliser (réduction).
Intérêt de la supplémentation orale en « molécule M » pendant la grossesse et la période de lactation lors d’un déséquilibre alimentaire maternel induit par la consommation d’une alimentation grasse hypercalorique: étude pré-clinique chez la souris
- Enseignement supérieur
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 282 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mères sont soumises à une alimentation grasse hypercalorique pendant la gestation et la lactation, puis mères et descendance subissent des gavages, des prélèvements sanguins répétés et des tests de tolérance au glucose sur animal vigile, pour étudier l'effet d'une supplémentation en une vitamine. La plupart sont tuées pour prélèvements, seules 80 souris adultes du groupe témoin pouvant être conservées pour l'élevage selon les besoins de l'unité. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes de substitution" pour étudier ces paramètres métaboliques et conclut à un usage "indispensable" de la souris.
Objectifs
Rechercher par quels mécanismes biologiques la supplémentation orale en molécule M chez la mère pendant la grossesse et la lactation améliore la santé métabolique de la descendance.
Bénéfices attendus
Identification du mode d’action de la molécule M lors de la supplémentation orale pendant la gestation et la lactation, en vue de la mise en place d'un protocole de supplémentation systématique chez la femme enceinte et réduire ainsi les facteurs de risque d'obésité chez l'enfant.
Procédures
Ce projet nécessite l’exploration fonctionnelle du contrôle glycémique chez la souris. Les animaux seront ainsi soumis à des tests de performance métabolique, comparables à ceux utilisés chez l’Homme, permettant d’apprécier le rôle physiologique de l’insuline et de détecter des états pré-diabétiques et diabétiques, caractérisés par une intolérance au glucose, une résistance à l’insuline, voir une hyperglycémie à jeun. Ces tests nécessitent des administrations pharmacologiques et des prélèvements sanguins. Les animaux recevront une charge soit de glucose (2g/kg) soit d’insuline (0,75u/kg) par voie intrapéritonéale et un relevé des excursions glycémiques sera réalisé après administration. Pour cela, des prélèvements sanguins (10 microlitres) seront réalisés afin de mesurer la glycémie et l’insulinémie des animaux. En pratique, 7 prélèvements seront réalisés sur une durée de 135 minutes. Comme chez l’Homme, ces tests de performance métabolique sont réalisés impérativement sur sujet vigile car les anesthésiques sont hyperglycémiants et sont incompatibles avec les paramètres physiologiques mesurés. Les procédures de ces tests sont parfaitement maitrisées et le mode opératoire est parfaitement cadré et partagé par la communauté scientifique.
Impact sur les animaux
Le modèle expérimental de mise sous régime HFD maternel pendant la gestation et la lactation provoque un stress métabolique qui se traduit par une adiposité supérieure voir une intolérance au glucose (cette dernière est recherchée dans ce projet). Il n'y a pas de dystocie, et la taille des portées et le sex-ratio à la naissance est conservé dans ce modèle. D'autre part la consommation en molécule M exogène n’a pas d’effet indésirable connu. La supplémentation orale en molécule M, qui est une vitamine, vise au contraire à contrer une carence induite expérimentalement par une alimentation maternelle appauvrie (modèle conventionnel HFD semi-synthétique). La supplémentation orale en molécule M dans ce contexte a donc un effet bénéfique attendu. Les tests de tolérance au glucose pourront provoquer soit une hypoglycémie (injection d'insuline) ou une hyperglycémie (injection de glucose). Enfin les tests de prélevements sanguins au bout de la queue sont succeptibles de générer un inconfort.
Devenir
Tous les animaux soumis au régime hypercalorique et/ou à la molécule M sont soit mis à mort au cours de la procédure (pour prélèvements post-mortem) ou en fin de procédure (par inhalation de CO2) car ils ne peuvent être conservés pour d'autres études de l'unité, du fait de cette programmation nutritionnelle obésogène. En revanche les 80 souris adulte (mâles et femelles) soumis au régime standard et qui participent au projet uniquement pour produire une descendance F1 controle (qui sera quant à elle étudiée), seront soit mises à mort (par inhalation de CO2) soit éventuellement conservées à des fins d'élevage, en fonction des besoin de l'équipe ou de l'unité. Le choix sera donc fait par la responsable de l'animalerie.
Remplacement
Les animaux de laboratoire nous permettent de modéliser l’obésité nutritionnelle et ses complications. Leur utilisation est indispensable pour décrire les processus qui se déroulent pendant l’installation de cette maladie, souvent asymptomatique dans sa phase précoce, et qui ne sont pas encore totalement élucidés à ce jour. Il n’existe pas de méthodes de substitution permettant d’étudier les paramètres physiologiques complexes recherchés dans nos études (prise alimentaire, dépense énergétique, thermogenèse, glycémie, adiposité, etc). Ces paramètres mettent en jeu des arc-réflexes, des rétrocontrôles, et des dialogues entre les organes qui ne peuvent être modélisés complètement. De plus, ces paramètres sont l’expression d’une perception et intégration cérébrale de signaux nutritionnels et métaboliques qui ne peut être étudiée que dans un organisme vivant.
Réduction
Les procédures décrites dans ce projet, ainsi que la stratégie expérimentale, ont été optimisées, standardisées et validées lors d'une précédente étude. L’optimisation des procédures réduisent la variabilité interindividuelle et évitent des études pilotes supplémentaires, ce qui finalement réduit les effectifs nécessaires au projet. Cela permet également de déterminer le nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour mener à bien les analyses statistiques et donc là encore d’optimiser le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les procédures concernant l’installation du modèle expérimental et les prises de mesures ont été optimisées et standardisées. Le personnel a été formé et maitrise tous les actes à réaliser. Le travail avec les animaux s’effectue en conditions calmes et maitrisées. Les aliments et l’eau de boisson sont fournis ad libitum. Les animaux sont surveillés quotidiennement et des soins vétérinaires peuvent être donnés au besoin selon l’avis d’un vétérinaire. Les conditions d’hébergements sont enrichies (maison et matériaux de nidation) et apportent des conditions optimales permettant l’expression de comportements innés (vie sociale, gestation, enfouissement, nidation, protection, lactation).
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Sa taille est compatible avec la dissection de tissus et organes d’intérêt permettant des analyses biochimiques, cellulaires, moléculaires, et histologiques. Cet animal permet d’obtenir des analyses pertinentes du comportement alimentaire. La réalisation de différents tests fonctionnels explorant les performances métaboliques est aussi possible chez cet animal, comme la recherche de la tolérance au glucose et la sensibilité à l’insuline, du fait de nombreuses similarités qui existent avec le métabolisme de l’espèce humaine. Les stades de développement étudiés sont les suivants : Stade postnatal P5, P8, P12 (descendance) : ce stade permet d’étudier le rôle neurotrophique de l’insuline (cf procédure 3) Stade postnatal P2 (descendance) : ce stade permet d’étudier le développement sensoriel des animaux (cf procédure 4) Stade postnatal P17 (descendance) : ce stade permet d’étudier la maturation du système neuronal à mélanocortine (cf procédure 5) Stade postnatal P60 (descendance) : ce stade permet d’étudier le contrôle glycémique des animaux (cf procédure 6) Stade adulte (mère) : ce stade permet de caractériser le modèle expérimental et d’évaluer le contrôle glycémique (cf procédure 2)
Effets de type antidépresseurs des nouveaux produits de synthèse de la ketamine
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections de dérivés de la kétamine puis passent une série de tests comportementaux, dont le test de la nage forcée, le labyrinthe en croix surélevé, l'open field et le splash test, pour évaluer un possible effet antidépresseur. Le porteur retient la souche Balb/C pour son "phénotype naturellement anxieux", ce qui lui évite d'infliger un stress supplémentaire. Il affirme que les réponses comportementales et la pharmacodynamie de ces molécules ne sont "pas modélisables" sans animaux.
Objectifs
Notre projet vise à édudier les effets antidépresseurs des dérivés de la kétamine (NPS) sur des souris Balb/C de phénotype anxieux. Ces effets seront étudiés d'un point de vue pharmacocinétique et comportemental.
Bénéfices attendus
Le potentiel thérapeutique des dérivés de la kétamine (appelé nouveaux produits de synthèse, NPS) n'a jamais été étudié. Cette étude pharmacologique et comportementale permettra d'identifier un potentiel candidat médicament ayant une activité pharmacologique "antidépresseur".
Procédures
Etude pharmacocinétique : 1 prélèvement sanguin/animal : 2 min (n=200); Comportement: 5 à 10 minutes (n=180) : 1-Test de la nage forcée : Les souris sont placées dans des bocaux de 10 cm de diamètre et de 30 cm de profondeur remplis d’eau tiède (25°C). Ce test de 6 minutes, mesure le temps de nage ainsi que le temps d’immobilité (n=45) 2- Test du labyrinthe en croix surélevé : Ce labyrinthe est composé de 2 bras ouverts et de 2 bras fermés reliés par une plateforme centrale, à 50 cm au-dessus du sol et éclairée par une lampe de faible puissance. Les souris peuvent explorer librement l’ensemble du labyrinthe pendant 5 minutes. Une caméra permet l’enregistrement des déplacements. Un phénotype anxieux se caractérise par une diminution du temps passé dans les bras ouverts par rapport au temps passé dans les bras fermés (n=45). 3- Test de l'openfield : L’animal est placé dans une enceinte étrangère en plexiglas à 2 dimensions (43x43 cm). Les souris peuvent explorer librement l’ensemble de l'enceinte pendant 10 minutes. Des cellules photoélectriques infrarouges permettent l’enregistrement automatique des déplacement de l'animal. Ce test est caractéristique d’un phénotype de type anxieux en évaluant le temps passé et le nombre d’entrées dans le centre de l’enceinte (n=45). 4- Splash test : Les souris sont aspergées avec un spray par environ 500 microlitres d’une solution de sucrose à 10%. La latence et fréquence de toilettage est alors mesurée pendant 5 minutes(n=45).
Impact sur les animaux
Les nuisances pour ces animaux sont très faibles. Pour l'axe comportemental, les administrations I.P seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques et les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable. Pour le test de la nage forcée les animaux ne subiront pas ce test jusqu'à épuisement car limité à une durée de 6 minutes.
Devenir
Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure pour analyses tissulaires et biochimiques des prélèvements.
Remplacement
L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes qui iduisent une réponse comportementale n'est à ce jour pas modélisable. De façon similaire, les analyses de pharmacodynamique des traitements après administration i.p. ne sont pas modélisables non plus.
Réduction
Le calcul de puissance est effectuée pour les expériences de pharmacologie a été réalisé avec le logicile biostatGV. Un écart type de 20 % (issue des données de la littérature et de notre propre expérience) et la possibilité de discriminer un effet de 30% a été envisagé. Une puissance de 0,9 et un alpha de 0,05 ont été choisis. Ceci indique 10 animaux par groupe. Une approche statistique sera envisagée par analyse de la variance (ANOVA) entre les différents groupes d'animaux suivis pas des tests post-hoc adéquat. Les seuils de significativité seront fixés à *p
Raffinement
Le choix de la souche de souris Balb/C constitue un raffinement du protocole dans la mesure où il n'est pas nécessaire d'induire un stress à ces animaux pour évaluer l'activité antidépressive des différents traitements. Par ailleurs, l'évaluation pharmacocinétique effectuée avant la partie comportementale permet de déterminer parvance la dose intéressante de NPS à laquelle l'effet de type anxiodépressif.
Choix des espèces
L'utilisation de de souris est nécessaire pour ce projet en particulier la souche Balb/C de par son phenotype naturellement anxieux. Les animaux entreront dans le protocole expérimental lorsqu'ils seront agés de 8 à 10 semaines.
Etude du rôle du récepteur P2X7 dans un modèle d’uvéite
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une uvéite auto-immune leur est induite par injection d'une toxine et transfert de cellules immunitaires, avec un suivi par imagerie de la rétine sous anesthésie, pour évaluer le récepteur P2X7 comme cible thérapeutique. Le porteur décrit une maladie qui n'entraînerait pas de douleur perceptible, tout en prévoyant la surveillance de signes tels que prostration, abattement ou perte de poids. Il justifie l'effectif élevé par la "grande variabilité" du développement de la pathologie entre souris et affirme que les études in vitro ne permettent pas d'étudier les signes cliniques.
Objectifs
Le projet vise à induire un modèle d'uvéite, l'Uvéite Autoimmune Expérimentale (EAU) chez des souris et d'évaluer le rôle du récepteur P2X7 comme potentielle cible thérapeutique (de manière constitutive ou induite sur certains types cellulaires spécifiquement) ou traiter en empêchant soit l'activation et/ou le recrutement du système immunitaire dans l'oeil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires et déterminer lesquelles sont impliquées. Nous allons donc induire une EAU chez des animaux n'exprimant pas ce récepteur de manière constitutive ou de manière induite sur certains types cellulaires spécifiquement ou traiter des animaux qui développent une uvéite avec des agonistes ou antagonistes de ce récepteur afin de déterminer l'effet potentiellement bénéfique de cette cible pour inhiber la réponse immunitaire au cours de l'uvéite.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'évaluer le rôle du récepteur P2X7 comme potentielle cible thérapeutique (de manière constitutive ou induite sur certains types cellulaires spécifiquement) ou traiter en empêchant soit l'activation et/ou le recrutement du système immunitaire dans l'oeil soit en induisant la mort de ces cellules immunitaires et déterminer lesquelles sont impliquées.
Procédures
Induction de l’Uvéite Auto-immune Expérimentale (EAU) par injection d’une toxine, transfert adoptif de cellules immunitaires par injection IV et suivi de l’évolution de la maladie (EAU) par des actes non invasifs (imagerie rétinienne (fond d’œil) et OCT (tomographie en cohérence optique). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie par méthode réglementaire de l’animal. Il n’y a pas de procédure chirurgicale engagée dans ce projet.
Impact sur les animaux
Avec ce projet les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). L’induction de l’EAU est un phénotype qui n’entraîne pas de douleur perceptible (pas de changement du comportement de la souris). L’évolution de la maladie est surveillée par des actes non invasifs qui n’engendrent donc pas de douleur ou de détresse. Les animaux sont anesthésiés au cours de ces explorations également pour le maintien de l’animal immobile.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Les études in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude.
Réduction
Nous devons induire plusieurs expériences en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Certains ne développeront pas la maladie, d’autres la développeront à un stade plus avancé ou la sévérité de l’inflammation sera différente. Nous aurons donc besoin de 10 animaux par lots pour un total de 900 souris. Le nombre de 10 animaux par groupe est basé sur les résultats de nos expériences dans notre laboratoire afin de permettre la réalisation des analyses statistiques adéquates pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
La seule anesthésie mise en oeuvre sera la gazeuse à base d'un mélange dioxygène/isoflurane. Les animaux sont hébergés en groupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Les animaux auront une période d'une semaine d'acclimatation avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Tous signes d’inconfort ou de détresse avant l’apparition des signes cliniques autres que ceux de l’EAU, tels que l'apparence et la position anormale : poil ébouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, couché sur le côté; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Les critères absolus sont: État de choc, léthargie, inconscience, immobilité. Difficultés respiratoires. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6J sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour l'EAU. En outre, il est relativement simple d'examiner le système visuel et d'autres tissus chez la souris, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développée le modèle d'invalidation génique conditionnelle et le modèle de uvéité, EAU. Les animaux seront utilisés entre 2 et 4 mois, âges auquels ils sont succeptibles de développer la pathologie. Les animaux sont identifiés par bague numérotée ou tatouage. Les animaux sont génotypés par PCR après prélèvement d’un bout de leur queue.
Évaluation des potentiels effets curatifs et protecteurs d’un mélange nutritionnel contre le développement de l’insulinorésistance et du diabète de type 2 chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont soumis à un régime hypercalorique pour induire une obésité, puis à un gavage quotidien pendant quatorze semaines, des prélèvements de sang et de fèces, un test de tolérance au glucose et un prélèvement d'organes final après anesthésie et exsanguination par l'aorte, pour tester un mélange de berbérine et d'extraits de pomme et de citrus. Les retombées annoncées pour la santé humaine restent hypothétiques face à l'obésité et aux complications métaboliques provoquées chez les animaux. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut remplacer le "modèle animal intégré" et conclut à l'impossibilité du remplacement.
Objectifs
Cette procédure aura pour objet d’explorer l’effet curatif synergique de la berbérine et des extraits de pomme et de citrus sur l’apparition de l’insulino-résistance et du diabète sucré chez le rat. Cet effet pourrait résulter d’une action multiple impliquant d’une part, les effecteurs de perte de poids (augmentation de la dépense énergétique, diminution de l’absorption de nutriments et diminution de l’appétit), et d’autre part, la mise en jeu sur le long terme d’actions anti-inflammatoire et régulatrice du métabolisme, incluant le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Les résultats générés par les techniques in vitro ou ex-vivo ne permettent pas d'avoir des résultats suffisamment fiables puisque le diabète (lié à l’obésité) est une maladie systémique caractérisée par des altérations mutiorganiques (une intolérance au glucose, un stress oxydatif, un dysfonctionnement endothélial, anomalies des fonctions cardio-vasculaire et rénale). Il est donc impossible de créer l'environnement à facettes multiples de cette pathologie et le recours au modèle animal intégré est donc plus adapté à la problématique de ce projet. De plus, les produits évalués dans ce projet ont une action systémique, l’étude du lien entre le microbiote et la physiopathologie du diabète n’est possible que par une approche expérimentale in vivo et il n'existe pas de moyens alternatifs permettant de l'étudier dans un contexte qui doit tenir compte de la physiologie globale de l'animal.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions. Un gavage (environ 30 secondes par rat) sera effectué quotidiennement pendant les 14 dernières semaines du protocole expérimental. Le prélèvement de sang (environ 20 minutes par rat), le catwalk (environ 30 minutes par rat), le prélèvement de fèces (environ 1h par rat) et le test de tolérance au glucose (1h30 par rat) seront effectués en début, milieu et fin de protocole (0, 14, 28 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements d'organes (après 28 semaines) après leur anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg) puis euthanasie par exsanguination au niveau de l'aorteabdominale.Ces interventions concernent les 120 animaux sur une durée totale de 28 semaines.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu sur les animaux du groupe avec le régime contrôle. Les animaux soumis au régime HFD vont développer une obésité avec des complications métaboliques qui est l'objet de l'étude. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par l'obésité.
Devenir
Tous les animaux des lots étudiés sont concernés par l’euthanasie. Cette dernière est pratiquée par exsanguination au niveau de l’aorte abdominale après anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) /médétomidine (150 μg/kg). L'euthanasie est justifiée par les prélèvements d'organes qui serviront aux analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Remplacement
Le remplacement des animaux n’est pas possible pour répondre aux questions du présent projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in-silico et in-vitro).
Réduction
De manière à respecter la règle de réduction, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum permettant d’anticiper les différences interindividuelles. Le nombre de 12 rats est nécessaire et suffisant pour réaliser une analyse descriptive. Ce nombre est basé sur notre expérience précédente de mise en œuvre de protocoles de pharmacologie expérimentale lors desquels nous avions obtenus des résultats reproductibles et exploitables.
Raffinement
- Un hébergement qui respecte les recommandations en vigueur, une animalerie contrôlée (température, hygrométrie) et un enrichissement des cages (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). - Un suivi régulier des animaux par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires) - La définition de points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. - L’optimisation des protocoles expérimentaux pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.
Choix des espèces
L'exposition des rats Wistar à un régime hypercalorique permettra d'étudier la capacité du mélange nutritionnel testé à prévenir le développement de la résistance à l’insuline, de l’hyperglycémie chronique et les perturbations cardiovasculaire associées. Incluant également l’étude du lien entre les perturbations cardio-vasculaires et la modification du microbiote intestinal. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6-7 semaines.