Procédures légères

1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des xénogreffes de tumeurs neuroendocrines, sous la peau ou par chirurgie dans la rate, des anesthésies répétées et des séances d'imagerie, avant prélèvement des tumeurs et des organes. Le porteur met au point une molécule d'imagerie visant le récepteur à la somatostatine, avec une extension thérapeutique espérée. Il affirme que l'usage d'un "organisme entier" est "indispensable" pour évaluer la toxicité.

Objectifs

Les Tumeurs NeuroEndocrines (TNE) sont des tumeurs rares et hétérogènes dans leur présentation anatomopathologique et clinique. Cela rend leur diagnostic, leur pronostic et la prise en charge thérapeutique particulièrement difficiles. L’approche théranostique (utilisation de l’imagerie pour cartographier les cellules cancéreuses et les traiter de manière ciblée) est particulièrement développée pour ce type de tumeurs. Celle-ci utilise en effet la présence d’une molécule particulière à la surface des cellules tumorales (le récepteur à la somatostatine). Cette stratégie thérapeutique est actuellement la plus efficace pour le traitement des TNE mais elle comporte quelques limites. En effet, le récepteur à la somatostatine n’est pas toujours présent, notamment dans les tumeurs les plus agressives. Nous savons qu’il existe un autre récepteur présent dans ces tumeurs, le récepteur X, et nous souhaitons l’utiliser pour développer une nouvelle approche théranostique. Cela nous permettrait de proposer un nouvel outil pour l’imagerie, et à plus long terme pour la thérapie. Cette stratégie pourrait s’avérer profitable dans d’autres pathologies tumorales puisque ce récepteur existe dans d’autres types de cancers. Dans ce projet, nous proposons de cibler le récepteur X grâce à une petite molécule appelée aptamère, qui est facile à produire. Notre agent ciblant le récepteur X sera dans un premier temps couplé à une molécule fluorescente, puis à un élément radioactif. Nous souhaitons démontrer que l’aptamère peut être utilisé en imagerie des TNE grâce à deux modèles murins de progression tumorale que nous maîtrisons au laboratoire.

Bénéfices attendus

En cas de réussite, ce projet appuiera la transition de notre stratégie de l’imagerie vers la thérapie. Pour cela, il suffira de modifier le couplage de l’aptamère en utilisant un composé radioactif adapté aux traitements anticancéreux. Cela constituera une stratégie thérapeutique complémentaire à celle déjà existante pour le traitement des TNE. Les retombées potentielles de ce projet pourront également concerner d’autres cancers. En effet, le récepteur X est présent dans de nombreux types de tumeurs.

Procédures

- Anesthésies répétées (pour chirurgie et imagerie) - Injections sous-cutanées - Injections intraveineuses - Procédure chirurgicale : greffe intrasplénique (10 minutes depuis le début de l’anesthésie jusqu’à la suture de la laparotomie) dans 3 procédures (2, 4 et 6) - Pousse tumorale limitée (taille inférieure à 1500mm3 pour le modèle sous-cutané, nodules hépatiques millimétriques dans le modèle intrasplénique)

Impact sur les animaux

La xénogreffe par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. Les tumeurs développées dans ce modèle sont de petite taille. Elles n’entraînent pas de gêne chez les animaux. Aucune métastase n’est observée. La xénogreffe par injection intrasplénique implique une petite chirurgie sous anesthésie générale avec un risque de douleur au réveil. L'imagerie implique également une petite anesthésie générale.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à l’issue de chaque procédure pour analyse des tumeurs développées et des organes prélevés.

Remplacement

Notre projet vise à développer un nouvel outil permettant l’imagerie in vivo des tumeurs neuroendocrines grâce au récepteur X, puis de développer un agent thérapeutique. L’utilisation d’un organisme entier est donc indispensable car il faut évaluer la toxicité éventuelle de notre molécule au niveau des différents organes. La molécule a été au préalable testée sur des cultures de cellules tumorales afin de remplacer une partie des travaux chez la souris.

Réduction

Quatre aptamères différents ont été testés sur des cultures de cellules tumorales. Seuls deux de ces aptamères seront testés chez la souris. De plus, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au minimum tout en générant des résultats valables sur le plan statistique. A chaque étape du projet, nous sélectionnerons la meilleure molécule et le meilleur modèle, ce qui permettra de réduire également le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Ils seront pesés deux fois par semaine. Si des signes de souffrance sont identifiés après la chirurgie (prostration, difficulté de déplacement), une analgésie pourra être maintenue (par exemple par ajout de Doliprane dans l’eau de boisson). Si une perte de poids supérieure à 20% du poids maximal (28g) survient, l’animal sera immédiatement mis à mort. La xenogreffe sous-cutanée est réalisée par le personnel de la plateforme qui maîtrise parfaitement le geste. Les animaux reçoivent des analgésiques (buprénorphine 0.05 mg/kg, et lidocaïne en crème 5% au niveau de la zone de la laparotomie) avant la chirurgie afin de prévenir toute souffrance. La petite laparotomie nécessaire à l’injection est suturée à l’aide de fil chirurgical résorbable, ce qui améliore considérablement le confort des animaux.

Choix des espèces

Pour acquérir les données nécessaires à la validation de nos séquences aptamères pour l’imagerie des TNE, nous avons besoin d’utiliser des modèles mimant au mieux la pathologie. Nos modèles de xénogreffes sur souris ont été validés lors d’études antérieures et sont bien caractérisés et maîtrisés. La souris est relativement proche de l’homme. De, plus l'utilisation de souris immunodéficientes facilite la prise tumorale. Toutes les xénogreffes seront réalisées sur des souris Athymic nude ou Swiss nude de 5 à 7 semaines, qui est l'âge optimal d'utilisation des souches de souris immunodéprimées et pour lequel nos modèles de xénogreffes ont été validés lors d'études antérieures.

470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime hyperlipidique, une partie subit une chirurgie stéréotaxique implantant une sonde dans le cerveau, un isolement en cage individuelle de trois semaines et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur étudie les troubles de l'humeur associés à l'obésité et à l'inflammation, avec des retombées nutritionnelles ou pharmacologiques renvoyées au long terme. Il affirme que le recours au modèle animal reste une "nécessité expérimentale".

Objectifs

Le thème général du projet concerne l'étude des effets nocifs d'une alimentation déséquilibrée sur les troubles de l'humeur. Plus précisément, il s'agit ce caractériser et de comprendre le développement des troubles de l'humeur associés à la consommation chronique d'un régime hypercalorique hyperlipidique chez la souris. Nous nous intéressons particulièrement aux effets de cette alimentation sur l'inflammation dite "de bas bruit" qu'elle va générer, et qui va médier un certain nombre de processus conduisant à la perturbation du fonctionnement des systèmes de neurotransmission monoaminergiques qui peuvent sous-tendre le développement des troubles de l'humeur, jusqu'à la dépression. Si certains effets de l'inflammation dans ces phénomènes sont aujourd'hui décrits, les mécanismes neurochimiques précis mis en jeu ne sont pas encore totalement élucidés. En particulier, leur implication dans le déficit de réponse aux antidépresseurs, dont la proportion est largement plus présente chez les patients dépressifs présentant une inflammation chronique, reste peu étudiée et reste à démontrer.

Bénéfices attendus

Ce travail apportera des données scientifiques utiles pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la dépression associée à l’inflammation. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il permettra à plus long terme de développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et/ou pharmacologiques pour améliorer la réponse thérapeutique et la prise en charge des individus atteints de troubles de l’humeur, en particulier lorsque ces derniers sont associés à un contexte inflammatoire.

Procédures

Des chirurgies seront réalisées sur souris anesthésiées, afin d'insérer dans une région spécifique du cerveau une sonde de dialyse, permettant de receuillir le milieu extracellulaire et d'y doser un neurotransmetteur, la dopamine. Il est prévu un nombre de 120 souris pour cette procédure, qui sera réalisée une seule fois sur chaque animal. Les souris seront soumises à la contention nécessaire à une injection intra-péritonéale (470 souris), 120 souirs seront placées en isolement pendant 3 semaines. Les souris seront soumises à des tests comportementaux (420 souris).

Impact sur les animaux

La prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisance pour les souris. Un comportement anxieux et/ou de type dépressif (modèlisé ici) est atendu chez les souris soumises au régime hyperlipidique et fait l'objet de cette étude. Les douleurs attendues concernent celles liées à la chirurgie stéréotaxique, la contention et l'injection intra-péritonéale et l'isolement en cage individuelle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures, afin de prélever leur cerveau pour analyses ultérieures.

Remplacement

L'objectif général du projet est de mieux comprendre chez l'animal les ménanismes mis en jeu dans le développement des troubles de l'humeur en condition inflammatoire induite par une exposition chronique à un régime obésogène. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l'étude des troubles de l'humeur reste une nécessité expérimentale afin d'appréhender la réalité physiologique de nos résultats. La recherche d'alternatives dans des bases de données démontre que les solutions de rechange ne sont pas à ce jour disponibles ou applicables.

Réduction

Les mêmes souris seront sucessivement soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale.Lorsque cela est possible, les mêmes souris seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Le nombre minimal de souris pour chaque groupe expérimental est fixé afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante, afin de ne pas répéter la procédure.

Raffinement

A leur arrivée, les souris bénéficient d'une période minimale d'une semaine d'habituation à leur nouvel environnement avant de débuter les expérimentations. En concertation avec la structure Bien-Etre du laboratoire, nous avons défini les meilleurs conditons d'hébergement possibles ainsi que les points limites et d'arret précoces et adaptés. Les souris seront ainsi hébergées par 5 (excepté pour le test comportemental de mesure de fatigue en cage individuelle avec roue d'activité sur une période maximale de 3 semaines), avec présence de différents enrichissements, surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Les protocoles réalisés sur les animaux sont au préalables soumis puis approuvés par l'équipe en charge de l'animalerie afin d'assurer les bonnes conditions d'expérimentation. Pour les procédures invasives et/ou susceptibles de générer une douleur, les soins pré- et pos-opératoires sont appliqués, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie sont mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes évitant la répétition des expériences.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permet un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. Les animaux arriveront au laboratoire à l’âge du sevrage (P21). Ils seront mis immédiatement sous régime contrôle ou hyperlipidique jusqu’à la fin de l’expérience. Toutes les expériences seront ensuite faites à l’âge adulte (après 15 semaines d'exposition au régime).

2 132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles subissent une injection intrapéritonéale, une injection rétro-orbitale sous anesthésie et des prélèvements mensuels de sang à la queue pendant six à douze mois, pour étudier le cancer du foie et la maladie du foie gras. Le porteur reconnaît une prise de poids importante liée aux régimes imposés et une altération de l'état général due au développement tumoral attendu au foie. Il présente le modèle murin comme "indispensable", seul modèle permettant selon lui d'invalider des gènes de façon tissu-spécifique.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique. Ce projet nécessitera 2132 souris et sera mené pour une durée de 3 ans.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle de STING, RhoA, ATM, ATR, DNAM-1 et LECT2, dans le contrôle prolifératif des hépatocytes, mais aussi dans la compréhension des mécanismes sous-jacents assurant l'intégrité génomique dans le foie, mécanismes faisant défaut au cours de l'hépatocarcinogenèse humaine. Ces travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, une injection intra-péritonéale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée 30 secondes ) sur animal vigile (756 animaux). Une injection rétro-orbitale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute) sur animal anesthésié (820 animaux). Un prélèvement au niveau de l'apex de la queue de l'animal sera réalisé pour une mesure de glycémie de manière mensuelle (6 répétitions, pendant 6 ou 12 mois suivant l’expérimentation, durée : 30 secondes - 1 minute) sur animal vigile (2132 animaux).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (2132).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence NAFLD/NASH/CHC.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet, 2132 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux sont constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. La taille des groupes a été déterminée selon nos travaux préliminaires ou basée sur l’expérience de nos études antérieures. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour-nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (injection à l’œil) sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au CHC. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90% de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence NAFL/NASH. Une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.

1 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles reçoivent des injections de cocaïne, des chocs électriques jusqu'à 0,6 mA, des chirurgies stéréotaxiques avec vecteurs viraux et l'implantation de fibres optiques, avant une perfusion intracardiaque, pour étudier les circuits neuronaux du conflit approche-évitement et de la rechute. Le porteur affirme que la cocaïne, l'évitement et la perfusion "n'engendrent ni douleur ni stress" et que le choc choisi reste inférieur aux intensités habituelles. Il conclut à la "nécessité" d'un organisme vivant intègre, qu'aucune technique in vitro ne remplacerait.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’identifier les mécanismes impliqués dans les situations conflictuelles chez la souris, lorsque l'individu hésite entre approche et évitement en condition normale ou sous l'influence de substances psychoactives telles que la cocaïne. Identifier les circuits neuronaux des comportements conflictuels est clé afin d'empêcher le phénomène de rechute. Ce projet se focalise sur des structures cérébrales critiques dans ces deux types de comportement, à savoir l'hippocampe, le noyau paraventriculaire du thalamus ainsi que de leur cible cérébrale commune : le nucleus accumbens. Bien que ces structures aient déjà été impliquées dans les comportements addictifs aux substances psychoactives, il reste à comprendre leur interaction pendant les comportements d'approche, d'évitement, et de rechute chez la souris. Afin d'atteindre l’objectif général, nous réaliserons une étude anatomo-fonctionnelle de ces structures cérébrales à plusieurs moments clés des comportements d'approche ou d'évitement. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ces différents circuits.

Bénéfices attendus

Les expériences proposées amélioreront notre compréhension sur le phénomène de rechute, en examinant comment les informations contenues dans l’environnement peuvent déclencher des comportements inadaptés précipitant la recherche compulsive de cocaïne. Les neurones du noyau accumbens participant à ce circuit en recevant des informations de l'hippocampe et du thalamus paraventriculaire pourraient représenter une cible thérapeutique pour prévenir les rechutes chez les patients atteints d’addiction à la cocaïne, et plus largement aux drogues d’abus.

Procédures

Ce projet implique 3 procédures expérimentales décrites en item 4 Toutes les procédures (1, classe légère, 2 à 3, classe modérée) comprennent le comportement d’évitement (4h sur une journée, les animaux recevront un maximum de 1 injection de substance psychoactive et de saline), un comportement de récompense avec une substance psychoactive ou une solution saline (entre 15 min et 1h par jour, sur 4 jours, les animaux recevront un maximum de 4 injections de la substance psychoactive, et de 4 injections de saline) et la perfusion intracardiaque (7 min). Les procédures 2 et 3 comprennent la chirurgie stéréotaxique pour des injections de vecteurs viraux (45-60 min sous anesthésie générale) et peut comprendre une injection d'un composé chimique ou d'une solution saline (étude pharmacogénétique, CNO). La procédure 3 comprend également une chirurgie stéréotaxique additionnelle pour l’implantation de fibres optiques (1 ou 2 fibres, 60-90 min) pour les études d’optogénétique et de photométrie de fibre.

Impact sur les animaux

Le comportement de récompense à la cocaïne, d’évitement et la perfusion intracardiaque n’engendrent ni douleur ni stress. L'intensité du choc électrique choisie (maximum de 0.6 mA) est inférieure aux intensités de chocs classiquement utilisées dans la littérature (0,7 mA). Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures dont la douleur est prise en charge tout le long de l'expérience, via l’usage d’anesthésiques et analgésiques, avant, pendant et après la chirurgie (jusqu’à 8 jours).

Devenir

Notre étude nécessite d’une part de fixer les tissus cérébraux afin d’y réaliser des marquages immunohistochimiques. Ce but expérimental nécessitant la mise en place d’une méthode de mise à mort de perfusion intracardiaque. A l’issue de chaque procédure, les souris recevront une dose d’anesthésique et perfusées avec une solution fixatrice (4% paraformaldéhyde). Ces souris ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.

Remplacement

L’utilisation d'animaux vivants se justifie par la nécessité d’identifier des phénomènes physiologiques complexes au sein des circuits neuronaux impliqués dans le comportement conflictuel chez la souris, ainsi que leur interaction fonctionnelle. De nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent entre elles. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé à ce jour par des techniques in vitro. De plus, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques sous-tendant les comportements conflictuels restent inconnus.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 1950 souris adultes (mâles et femelles) sur une période de 5 ans (Annexe Chronogramme). Plan d'expériences: Afin de réduire le nombre d’animaux, toutes les souris de chaque groupe serviront aux immunomarquages après la phase de comportement. Statistiques : le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance (voir 3.4.10). Pour comparer 2 groupes, nous utiliserons un t-test de Student ou un test non-paramétrique. Pour comparer plus de 2 groupes, nous utiliserons une analyse de variance (ANOVA) à 1 ou 2 facteurs. Dans le cas des mesures répétées (évaluation des performances mnésiques), des ANOVAs à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats seront utilisés. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra de plus d'utiliser toutes les souris générées.

Raffinement

Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences où les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes sont rapprochées les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri- opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être (Annexe Points Limites). Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés (la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement) et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical. Toutes les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 11 semaines. Les souris transgéniques seront élevées dans notre animalerie. Les procédures expérimentales débuteront après 1 semaine d’habituation. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris ne seront plus utilisées au-delà de 10 mois.

1 044 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles passent les tests comportementaux du rotarod et de l'open-field pendant neuf jours, 864 d'entre elles recevant en plus trois injections intrapéritonéales quotidiennes, pour caractériser un modèle de mouvements anormaux lié à une mutation du gène ADCY5 et tester une molécule. Le porteur décrit un stress possible lié aux injections et au nouvel environnement, ainsi qu'une légère perte de poids. Il présente la souris comme "le modèle le plus utilisé" pour ces maladies du mouvement.

Objectifs

L’objectif général de ce projet est de déterminer le phénotype de ces souris et de caractériser les anomalies de fonction de l’AC5 (gain de fonction ou perte de fonction) consécutives à cette mutation, et les conséquences sur les voies de signalisation dans lesquelles l’AC5 est impliquée. Nous avons choisi de commencer par une évaluation comportementale motrice et une évaluation de l’effet de KW6002 par deux procédures comportant le test de l’open field et du rotarod, qui font l’objet de cette demande.

Bénéfices attendus

Bénéfices tant scientifiques que théreputiques. Mise en évidence des anomalies motrices similaires à celles observées chez les petients et essai d'un traitement potentiel de ces anomalies. Ces découvertes bénéficeront à la caractérisation et compréhension des anomalies moléculaires expliquant les symptômes observés chez les patients et permettront de découvir de nouveaux traitement et d'améliorer la prise en charge des patients qui souffrent d'une maladie rares et orpheline donc nécessitant un effort de recherche pour les soutenir.

Procédures

Pas de prélèvement ni de chirurgie. Tous les animaux décrits dans les procédures N°1 et N°2 (nombre maximum 1044) vont passer des tests comportementaux rotarod et openfield d’une durée totale de 9 jours. Les temps passés sur l’appareil rotarod et dans l’appareil openfield pour chaque animal sont environ 35 min et 10 min respectivement. Les animaux décrits dans la procédure N°2 (nombre maximum 864) recevront des injections intrapéritonéales tous les jours au cours des tests comportementaux d’une durée totale de 9 jours. Chaque animal reçoit 3 injections par jour dont 1 injection avant chaque test openfield et 1 injection avant le test rotarod. Chaque injection dure moins d’une minute

Impact sur les animaux

Les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. Les injections intrapéritonéales ainsi que le nouvel environnement dans l’appareil openfield pourraient potentiellement introduire un stress chez certains animaux. Une légère perte du poids (jusquà 1g) pourrait arriver chez certains animaux notamment ceux qui présentent une meilleure capacité motrice durant le test du rotarod. Mais ce phénomène s’arrête quand le test est fini. Les animaux reprennent leur poids très rapidement. Une fatigue liée aux tâches d’apprentissage pourrait apparaître pendant la réalisation de la tâche, mais qui n’induirait qu’un arrêt de la participation à la tâche par l’animal sans conséquence négative pour lui, il sera replacé dans sa cage. Toutes les précautions nécessaires seront prises afin d’éviter le stress. L’animal est manipulé tous les jours pendant deux semaines avant commencer les protocoles. L’animal sera placé aussi dans l’appareil afin d’acclimater. Les expérimentateurs vérifient quotidiennement l’état d’animal notamment les signes du stress

Devenir

A la fin des procédures, il y aura une euthanasie réglementaire pour des analyses biochimiques au niveau cérébrale pour l'étude des anomalies neurobiologiques en lien avec les anomalies.

Remplacement

Notre projet propose de disséquer les bases moléculaires du rôle de la mutation d’ADCY5 dans le contrôle moteur et l’apparition de mouvements anormaux, mettant en jeu différents réseaux neuronaux. Le fonctionnement de ce réseau ne peut, à ce jour, pas être reproduit ni modélisé par des modèles in vitro ou computationnels. Le projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris transgéniques et ne peut se faire qu’à l’aide d’études comportementales au niveau de l’animal. Il est donc impossible de remplacer les animaux par un modèle cellulaire pour les tests comportementaux. Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l'étude de comportements tels que les mouvements anormaux et leurs conséquences. Une fois les acteurs moléculaires déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures lorsque cela est possible pour limiter le nombre d’animaux utilisés. D’une façon générale, nous nous efforçons continuellement d’évaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible.

Réduction

Concernant la réduction, des expériences précédentes nous ont permis de définir le nombre minimal d'animaux permettant de générer des données statistiquement solides. Le nombre total d’animaux est de 1044 au maximum. Quand cela sera possible et afin de réduire leur nombre, les mêmes animaux sont utilisés dans les deux tests comportementaux rotarod et openfield. – Nos connaissances sur le modèle étudié, notamment sur les potentielles doses fonctionnelles de KW6002, nous permettront de limiter le nombre de doses à essayer et d’animaux nécessaires pour générer des résultats statistiquement robustes.

Raffinement

Concernant le raffinement, pour toute cette étude, les conditions d’hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur et d’inconfort possible. Pendant les procédures, les animaux seront observés et manipulés quotidiennement et une pesée sera effectuée tous les 7-10 jours. Les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 5 animaux, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne nocturne de 12h. L’eau, la nourriture seront fournies ad libitum, un carré de coton pour nidifier est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux un enrichissement. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien. L’évaluation de la douleur et de la détresse est réalisée en observant l’aspect des souris et leur comportement. Les points limites seront pour l’apparence et la posture : poil ébouriffé, perte excessive de poils, blessure cutanée, automutilation, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le côté, hypothermie. Pour les comportements anormaux ces points limites seront : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, apathie, prostration, diminution de l’appétit et amaigrissement, changement des périodes de sommeil, réduction de la mobilité. Ces contrôles seront enregistrés et doivent permettre de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Le cas échéant, des méthodes seront mises en place pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux (injection d’antalgiques) si trouble mineur ou passage, ou bien mise à mort règlementaire par CO2. Les mutations dans les lignées transgéniques envisagées ne sont pas dommageables pour l’état de santé de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies du mouvement proche de celle de l’homme. La souris est un modèle reconnu d’étude du mouvement, notamment car elles ont des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés et sont déjà utilisées dans des modèles de mouvements anormaux, particulièrement pertinents dans l’étude de la pathologie étudiée ici. Dans nos études, les souris transgéniques portent la même mutation que chez les patients. Les animaux utilisés seront adultes âgés au-delà de 8 semaines. Cette partie du projet s’intéresse à la cause et les traitements des mouvements anormaux liés aux mutations du gène ADCY5, exprimés dans un organisme mature, à l’âge adulte, en prenant en compte la variabilité individuelle et le sexe. Afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux, nous utiliserons donc uniquement des animaux adultes

1 430 poulets et 325 dindes vont être utilisés, tous tués, dans des procédures classées de souffrance légère à modérée. Chaque oiseau reçoit par sonde œsophagienne une suspension de parasites coccidies, puis est mis à mort par électronarcose et exsanguination pour récupérer une génération fraîche de parasites. Le porteur reconnaît que l'objet n'est pas la recherche mais la production régulière de souches, faute selon lui de pouvoir les multiplier in vitro. Il qualifie cette remultiplication sur oiseaux d'"indispensable" et la répète environ tous les six mois.

Objectifs

Les coccidioses des volailles sont des affections très fréquentes dues à des organismes unicellulaires parasites du genre Eimeria. Elles ont des conséquences économiques et sanitaires majeures. Les coccidies se multiplient dans le tube digestif des oiseaux à l'intérieur de cellules intestinales, entraînant une baisse de l'absorption des nutriments, des diarrhées, de la prostration, et parfois de la mortalité en fonction des espèces de coccidies et des quantités de parasites ingérées. Les coccidioses sont les maladies parasitaires les plus importantes en aviculture avec un coût annuel mondial estimé à plus de 12 milliards d'euros. Dans le cadre d’études pour mieux connaître les coccidies parasites du poulet et de la dinde, et investiguer de nouvelles approches pour contrôler leur développement, il est nécessaire de produire régulièrement sur oiseaux des nouvelles générations de ces parasites pour les avoir toujours à disposition. Les oocystes (formes de résistance dans l’environnement) de ces coccidies peuvent survivre un an ou plus, mais au-delà de six mois, une proportion croissante de ces oocystes meurt, rendant impossible leur exploitation, notamment le dénombrement des formes viables et infectieuses. Or, dans nos activités, il est indispensable de maîtriser les doses infectieuses pour les essais de recherche conduits avec ces parasites. Il n’existe pas de moyen de disposer de ces parasites autrement qu’en infectant des oiseaux hôtes. Le développement sur cellules in vitro a des rendements négatifs, la cryoconservation (conservation par le froid) permet de conserver les souches, mais pas de les réutiliser rapidement et aux quantités souhaitées. Ainsi, nous devons remultiplier ces coccidies par passages sur oiseaux environ tous les six mois. Il est prévu d’entretenir par passages réguliers six espèces de coccidies du poulet et trois espèces de coccidies de la dinde qui constituent notre collection. Les oiseaux seront infectés par voie orale avec une suspension d’oocystes. Les matières fécales contenant la nouvelle génération d’oocystes excrétés et les contenus intestinaux et caecaux seront collectés entre cinq et huit jours après inoculation, en fonction des espèces de coccidies.

Bénéfices attendus

La remultiplication régulière des souches de coccidies détenues par notre laboratoire est un prérequis indispensable aux travaux en coccidiologie aviaire que nous réalisons. Elle permet de disposer de populations de parasites frais dont tous les individus sont viables et infectieux. Les quantités administrées de parasites sont ainsi maîtrisées lors d'infections expérimentales ou d'essais in vitro.

Procédures

L'administration des parasites se fera en une seule prise, par voie orale, sur animaux maintenus en contention individuellement, avec une sonde oesophagienne, sous un volume d'un mL. Cette étape dure moins de deux minutes par animal. L'intervention suivante sera la mise à mort, par électronarcose directement suivie d'exsanguination. Cette étape dure moins d'une minute par animal.

Impact sur les animaux

Les doses infectieuses pour les remultiplications sont inférieures aux doses pathogènes susceptibles d’entraîner des troubles chez les sujets, le but n’étant pas de reproduire la maladie mais seulement d’obtenir une génération fraîche de parasites. Le nombre de remultiplications est réduit à 1 par an pour les coccidies les moins utilisées, le but étant de maintenir ces souches même si une proportion des oocystes est déjà morte. Pour l’évaluation de la conservation du potentiel pathogène, seulement trois poulets seront utilisés, et les doses utilisées correspondront à un développement intermédiaire, avec des lésions typiques et une morbidité faible.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux. Pas de réutilisation possible pour des essais avec coccidies car le système immunitaire des oiseaux a été sollicité et perturbe le développeemnt des parasites lors de réinfection. Nécessité de maintenir des souches pures, donc impossibilité de réutiliser les animaux pour d'autres remultiplications car une excrétion résiduelle des parasites peut persister longtemps (plusieurs semaines).

Remplacement

Il n’existe pas de moyen de produire ces parasites autrement qu’en infectant des oiseaux hôtes. Le développement sur cellules in vitro a des rendements négatifs, la cryoconservation permet de conserver les souches, mais pas de réutiliser rapidement et aux quantités souhaitées. Le redémarrage à partir des souches cryoconservées demande quatre à cinq passages sur oiseaux pour obtenir suffisamment de parasites, avec un délai dépassant quatre mois. Pour avoir des parasites pour nos travaux réguliers, nous sommes obligés de les multiplier régulièrement sur oiseaux.

Réduction

Le remplacement n’étant pas possible, nous avons réduit les effectifs au minimum pour pouvoir néanmoins obtenir suffisamment de parasites pour conduire les essais associés. De plus, pour les coccidies les moins étudiées, seulement un passage annuel est prévu.

Raffinement

Les installations sont équipées des raffinements et enrichissements suivants : élevage en groupes homogènes, cordelettes suspendues, rampes d’abreuvement par pipettes qui servent également de perchoirs, éclairage naturel complété par un éclairage artificiel en jours courts.

Choix des espèces

Les coccidies des volailles sont strictement inféodées aux espèces qu’elles parasitent (sauf rares exceptions). Ainsi, les coccidies du poulet (Gallus gallus) ne se développent que chez cet hôte, et les coccidies de la dinde (Meleagris gallopavo) ne se développent que chez la dinde. Il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo qui permette de réaliser le cycle dans sa totalité de façon satisfaisante et susceptible de produire les quantités d’oocystes nécessaires à nos travaux. Age maximal à la fin de la remultiplication : 8 semaines, valable seulement pour E. necatrix, l’espèce la moins prolifique. Pour les cinq autres souches et les coccidies du dindon, âge maximal de six semaines. Pour E. necatrix nous utiliserons des oiseaux plus âgés que ceux utilisés pour remultiplier les autres espèces de coccidies, car cette espèce est très peu prolifique, et le rendement est meilleur si l’intestin est plus long, ce qui est le cas sur sujets plus âgés.