Procédures légères
Évaluation d’un nouveau traitement pour protéger le foie des atteintes provoquées par des médicaments
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
624 souris mâles vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à trois injections intrapéritonéales, dont 600 microlitres de paracétamol pour une souris de 30 grammes. 96 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, 528 un niveau modéré, et toutes sont tuées pour le prélèvement du foie. Le porteur ne retient que des mâles, les femelles synthétisant le glutathion plus vite et supportant mieux le surdosage. Les bénéfices annoncés, de nouvelles pistes contre la première cause d'insuffisance hépatique d'origine médicamenteuse, sont renvoyés au long terme, alors que l'intoxication provoquée est immédiate et que le porteur qualifie le modèle animal d'"incontournable" après des essais in vitro qu'il dit déjà concluants sur hépatocytes.
Objectifs
Le paracétamol (appelé aussi acétaminophène, connu sous le nom de Doliprane) est l’un des médicaments les plus utilisés pour faire baisser la fièvre et soulager la douleur. Il est sûr lorsqu’il est pris aux doses recommandées, mais une prise trop importante peut provoquer de graves lésions du foie. Cette toxicité est liée à la formation, dans le foie, d’une substance nocive qui épuise les défenses naturelles de la cellule. Le seul traitement actuellement disponible est la N-acétylcystéine (NAC), efficace uniquement lorsqu’elle est administrée très rapidement après l’intoxication. Malgré ce traitement, le surdosage en paracétamol reste aujourd’hui la principale cause d’insuffisance hépatique aiguë. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc nécessaires, notamment pour agir à des stades plus avancés de la maladie. Des travaux récents ont montré que certains dérèglements des mitochondries (les «centrales énergétiques » des cellules) jouent un rôle clé dans les lésions du foie provoquées par le paracétamol. Notre équipe a développé une nouvelle molécule capable de bloquer ces dérèglements et de protéger les cellules du foie. Ce projet vise à évaluer, chez la souris, l’efficacité de ce composé comme traitement potentiel contre les atteintes hépatiques dues à un surdosage en paracétamol.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique d’un nouvel inhibiteur de cyclophilines (C105SR) dans l’intoxication au paracétamol, qui constitue la principale cause de défaillance hépatique d’origine médicamenteuse. Les résultats attendus permettront de : - déterminer l’efficacité du C105SR en termes de protection hépatique et mitochondriale, seul ou en association avec le traitement de référence (N-acétylcystéine) ; - mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la toxicité induite par le paracétamol et dans l’action protectrice du C105SR ; - identifier de nouvelles pistes thérapeutiques susceptibles d’améliorer la prise en charge de l’intoxication au paracétamol. À plus long terme, les connaissances générées pourraient également ouvrir la voie à l’exploration de stratégies innovantes de protection mitochondriale dans d’autres maladies hépatiques ou non hépatiques où le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle central.
Procédures
Les souris auront une administration par voie intrapéritonéale de paracétamol (ou son diluant), de C105SR (ou son diluant), et de NAC (ou son diluant), chacune d'une durée de 10 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris recevront : 1) une injection intrapéritonéale de paracétamol (APAP) ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (600 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection). Le modèle d’intoxication au paracétamol utilisé dans ce projet repose sur l’administration d’une dose unique de paracétamol à des souris mâles adultes qui provoque une atteinte hépatique aiguë, caractérisée par une élévation des enzymes hépatiques plasmatiques reproduisant de manière fiable les lésions observées chez l’humain après un surdosage. La majorité des souris ne présentent que des signes transitoires et modérés (diminution d’activité, diminution de la prise alimentaire), mais une petite proportion peut montrer des signes plus marqués, comme une posture anormale ou une perte de poids. Une surveillance quotidienne sera assurée après l’administration du paracétamol par les zootechniciens et les expérimentateurs (voir grille de score) ; 2) une injection intrapéritonéale de NAC ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (360 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection) ; 3) une injection intrapéritonéale de C105SR ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (210 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie.
Remplacement
Nos travaux préliminaires ont permis de valider in vitro la capacité de l'inhibiteur de cyclophilines à protéger les hépatocytes en culture de la toxicité du paracétamol. Nous arrivons ainsi à un stade du projet où le recours à un modèle animal est devenu incontournable pour confirmer ces observations dans un organisme entier et dans un environnement physiologique complexe. En effet, à ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des mécanismes impliqués dans l’intoxication par le paracétamol, lesquels résultent d’interactions entre plusieurs types cellulaires (notamment hépatocytes et cellules immunitaires). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé comme celui permettant de démontrer une différence statistiquement significative de 30 % du paramètre étudié (aire de nécrose). Les résultats seront analysés grâce à un test statistique non paramétrique.
Raffinement
Le bien-être animal sera garanti par des conditions d’élevage appropriées, incluant le contrôle de la température et de l’hygrométrie. Les souris seront hébergées dans des locaux adaptés, avec un enrichissement systématique (papier kraft, carrés de coton pour la construction de nids, dômes en cellulose). Elles seront maintenues en groupes de 5 individus par cage, favorisant leur comportement social. Toutes les manipulations, y compris la mise à mort, seront réalisées par du personnel formé, dans le strict respect des règles éthiques et réglementaires. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les zootechniciens. Ce suivi permettra de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de stress (prostration, négligence de la toilette, blessure). Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée.
Choix des espèces
Le modèle murin d'hépatotoxicité du paracétamol reflète étroitement la physiopathologie humaine et est pertinent pour l'identification de cibles thérapeutiques potentielles. De plus, les sites actifs de CypA et CypD présentent une homologie de 100 % entre la souris et l'humain. Des souris mâles adultes (âgées de 8 à 12 semaines) seront utilisées, car les femelles sont moins sensibles au surdosage de paracétamol en raison d'un taux de synthèse du glutathion plus rapide, ce qui se traduit par une toxicité moindre de paracétamol par rapport aux mâles pour une dose donnée de paracétamol. Dans ce projet, l’objectif est d’évaluer les effets hépatoprotecteurs d’un nouvel inhibiteur de cyclophilines dans le contexte de l’intoxication par le paracétamol chez l’adulte. Pour cette raison, seules des souris adultes seront utilisées. L’âge choisi (8–12 semaines) correspond à une phase de maturité physiologique où le métabolisme hépatique est pleinement fonctionnel, ce qui permet de reproduire de manière pertinente la situation clinique observée chez l’adulte humain.
Entrainement et mise au point de procédures expérimentales d’échographie (EU1/2)
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Rats : 220
592 souris et 220 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 212 d'entre eux réutilisés ensuite, les autres tués. Les anesthésies gazeuses se répètent jusqu'à trois fois à un jour d'intervalle, durent jusqu'à une heure quand un cathéter veineux est posé, et atteignent dix séances quotidiennes de trente minutes chez les femelles gestantes suivies pendant les vingt et un jours de gestation. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère jusqu'à quinze minutes, ce qui peut provoquer son rejet ou son agressivité à la réintroduction dans la cage. Le porteur annonce un "catalogue de prestations techniques" destiné à former d'autres équipes, et conclut que malgré des fantômes d'agarose utilisables pour les mises au point préliminaires, le recours aux animaux reste "indispensable".
Objectifs
L’objectif de notre projet vise à prendre en charge la mise au point expérimentale de l’exploration de différents organes et phénomènes biologiques, physiologiques ou pathologiques, par échographie sur le rongeur. Une large partie de cette mise au point sera consacrée à l’exploration cardiaque où la reproductibilité des mesures est primordiale pour étudier les dysfonctions ou le vieillissement cardiaque. L’échographie sera également mise en œuvre pour la détection et le suivi du cancer (foie, pancréas, colon, sein, etc..), l’exploration du muscle (orientation, longueur de fibres, volume), l’étude de la perfusion cérébrale ou encore suivi du développement embryonnaire et du nouveau-né. Nous souhaitons également mettre au point des interventions guidées par échographie (administration et/ou prélèvement de substances dans des organes profonds) susceptibles de remplacer certaines interventions chirurgicales. La mise au point pourra aussi porter sur l’utilisation d’agents de contraste pour l’échographie (microbulles) pour mieux visualiser certaines structures ou étudier la perfusion sanguine dans de nombreuses situations. L’un des systèmes dont nous disposons permet de mesurer des différences de dureté tissulaire à l’intérieur d’un même organe et ainsi mettre en évidence de façon ultra précoce l’apparition de certaines lésions. Si cette application a été bien prise en main par les spécialistes du cancer du pancréas utilisant quotidiennement l’échographie dans le cadre de leurs recherches, nous devons la déployer sur d’autres thématiques pour la rendre accessible à des équipes non spécialistes en échographie. Notre ambition est de mettre en place un catalogue de prestations techniques aussi complet que possible et évolutif pour, in fine, pouvoir former les utilisateurs ou prendre en charge leur projet en tant qu’experts. Nous nous attacherons également à diffuser les méthodologies validées pour en faire un référentiel pour la recherche préclinique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Cette mise au point de procédures expérimentales robustes et reproductibles d’imagerie non invasive par échographie ou échocardiographie à destination de la communauté scientifique vise à faciliter l’accès au plus grand nombre à une modalité d’imagerie non invasive, peu stressante, ne nécessitant pas d’intervention lourde sur l’animal et permettant leur suivi longitudinal. Nous espérons que cette expertise apportée aux chercheurs permettra d’augmenter le recours à l’échographie en remplacement de méthodes invasives ou terminales (dissections). Ceci aura donc un impact positif sur deux critères de la règle de 3R : 1. Réduction : Suivi d’une même cohorte au cours du temps, détection plus précise (chaque animal étant son propre contrôle) afin de réduire la taille des lots d’animaux 2. Raffinement : Modalité atraumatique, générant un stress limité puisque l’animal est sous anesthésie, détection plus précoce des pathologies pour réduire la dégradation du bien être dans le cadre de modèle chronique. Raffinement de certaines procédures précédemment réalisées par chirurgie (injection de cellules tumorales dans des organes profonds comme le pancréas).
Procédures
Pour la mise au point d’exploration échographie non invasive, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse de 20 minutes maximum et cette anesthésie pourra être répétée 3 fois à 24h d’intervalle minimum. Pour la mise au point de procédures d’échographie avec injection d’agents de contraste, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum avec pose de cathéter veineux (5 minutes) avant début des acquisitions échographiques. Pour la mise au point d’interventions sous contrôle échographique, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum et, durant cette anesthésie, des injections ou des prélèvements seront réalisés (30 minutes). Pour l’optimisation du suivi du développement embryonnaire par échographie, les souris femelles non anesthésiées subiront deux injections d'hormones. Après fécondation, elles subiront une anesthésie générale gazeuse quotidienne de 30 minutes maximum, soit 10 anesthésies maximum sur les 21 jours de gestation. Toutes ces interventions pourront être réalisées alternativement ou successivement (à minimum 24h d'intervalle) dans les établissements utilisateurs (EU) 1 et 2. Les femelles gestantes pourront être transférées d'une EU à l'autre, par voie routière, sauf durant le dernier tiers de la gestation (à partir de 14 jours). Une échographie pourra être réalisée sans anesthésie sur les nouveaux nés (souris et rats) durant leurs premières heures de vie (moins de 48h) mais les nouveaux nés ne seront pas séparés de leur mère plus de 15 minutes. Le suivi pourra se poursuivre jusqu’au sevrage à raison d’une échographie par semaine maximum (soit 2 à 3 échographies par animal de 48 h à 21 jours de vie). Les explorations pourront se faire dans l'EU1 ou l'EU 2 mais aucun transfert ne sera autorisé avant sevrage.
Impact sur les animaux
L’exploration échographique du rongeur dans le cadre de mises au point techniques nécessite une anesthésie générale d’une durée relativement longue (20 minutes à 1h selon la procédure). La phase d’induction s’accompagne d’une phase d’excitation qui est un stress de faible niveau. La phase de réveil est également un moment critique. Selon la durée de l’anesthésie, l’animal peut voir sa température corporelle chuter. Il peut se déshydrater et perdre un peu de poids. Selon les modèles qui seront mis en œuvre, nous serons amenés à travailler sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) susceptibles d’entrainer stress, gêne respiratoire, difficulté de locomotion et / ou douleur. Les injections intraveineuses d’agents de contraste échographique (microbulles) pourront induire douleur locale et inflammation au niveau du site d’injection. Dans le cadre de suivis gestationnels, l’administration d’hormones (synchronisation de l’œstrus, facilitation de la mise bas) pourra se faire sur animal non anesthésié, sous contention, susceptible d’induire un stress. L’échographie néonatale, impose de séparer le nouveau-né de sa mère et du reste de la portée pour la durée de l’exploration échographique ce qui peut induire des comportements de rejet et / ou d’agressivité de la part de la mère à la réintroduction du nouveau-né dans la cage. L’anesthésie néonatale peut entrainer une dégradation des fonctions respiratoires et cardiaques, de l'hypothermie et une hypoglycémie.
Devenir
Tous les animaux adultes impliqués dans ce projet seront mis à mort à la fin de chaque projet de mise au point expérimentale échographique. Les animaux nés au cours des projets de suivi du développement embryonnaire et/ou mise au point d'injections et/ou prélèvements sous controle échographique et dont l'état général (santé et bien-être) le permettra seront proposés pour réutilisation aux chercheurs propriétaires des lignées en question et titulaires d'une autorisation de projet en cours de validité.
Remplacement
Pour certaines applications, mesure de dureté des tissus en particulier, nous pourrions avoir recours, pour les mises au point très préliminaires, à des objets mimant les tissus vivants (fantômes d’agarose) mais l’échographie est une modalité d’imagerie clinique et préclinique reposant sur les différences d’échogénicités entre les différents organes, fluides et tissus, in vivo, le recours aux animaux reste indispensable y compris dans notre démarche de mise au point expérimentale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre moyen nécessaire et suffisant pour être en mesure d’évaluer la reproductibilité de nos mesures. Ce nombre sera ré-évalué pour chaque nouvelle fonction étudiée, en fonction des spécificités de chaque projet et sur la base de recherches bibliographiques. Afin de réduire le nombre global d’animaux mis en œuvre, les animaux dont l’état de santé et de bien-être général le permet seront, autant que possible, réutilisés lorsque la procédure pratiquée ne remet pas en cause le bien-être et / ou la survie des animaux. Ce sont par ailleurs les mêmes animaux qui seront suivis au cours du temps pour mise au point d’un protocole expérimental donné. Tous les résultats obtenus seront mis à disposition des équipes de recherche pour servir d’études pilotes aux projets de recherches qui s’appuiront sur ces nouvelles méthodes. Ils leur permettront de déterminer la taille de leurs lots d’essais par une approche statistique.
Raffinement
L'imagerie échographique permet d’explorer et mesurer les organes, la circulation et la perfusion sanguine sans douleur avec un stress minimal lié à l’induction de l’anesthésie (isolement et perte de connaissance). Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (à l'aide de grilles d’évaluation et de points limites adaptés à chaque modèle) sera strictement respecté et effectué quotidiennement en concertation avec les équipes de zootechnie. Pour ceux qui devront être transférés d’un établissement utilisateur à un autre, le transfert se fera par voie routière (15 à 30 minutes) dans le respect de la charte de transport établie par notre structure. Pour limiter le stress dû au transport les animaux seront transportés dans leur cage d’origine afin qu’ils conservent leurs repères olfactifs. Lors des explorations échographiques, les animaux seront maintenus sur un support d’imagerie chauffant pendant toute la durée de l’anesthésie générale. Dans le cas des nouveaux-nés, une attention particulière sera portée au maintien de l’environnement olfactif : 1/ pendant la procédure pour réduire le stress du nouveau-né et 2/ pendant la phase de réveil pour qu’il ne soit pas rejeté par sa mère après réintroduction dans la cage. Nous travaillerons sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) mais dans le cadre de ce projet la phase la plus critique des mises au point expérimentales se situera dans les phases les plus précoces et ne devrait donc pas induire de nuisance particulière pour les animaux autres que celles en lien direct avec la méthode expérimentale. Si malgré tout nous devions voir apparaitre des signes de souffrances non soulagés par des traitements vétérinaires classiques (réhydratation parentérale, administration d’antidouleur de type morphiniques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens), les animaux seraient mis à mort rapidement. Nous veillerons à limiter autant que possible le stress subi par les animaux en employant des méthodes de manipulation les plus adaptées (préhension sans contention, maintien de l'environnement olfactif pour les nouveaux nés). Tout stress causé aux animaux serait par ailleurs rédhibitoire pour prétendre mesurer des paramètres physiologiques tels que ceux caractérisant la fonction cardiaque. Certaines injections pourront se faire sur animal non anesthésié (injection d'hormones) mais la plupart seront faites sous anesthésie générale, durant la procédure d'échographie.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de mettre au point et standardiser différentes procédures expérimentales d’échographie, d’échocardiographie et d’écho-élastographie ce qui ne peut se faire que chez l’animal vivant en l’absence de modèles in vitro appropriés. L'utilisation de rongeurs tels que la souris et le rat permet de reproduire les pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, les cancers ou les maladies métaboliques ou encore le suivi du vieillissement. Le rat est plus particulièrement utilisé dans des applications de neurobiologie ou l’étude de la nécrose osseuse induite lors de radiothérapie du cerveau en particulier. Les rongeurs (souris et rats), grâce à leur courte durée de gestation (21 jours) sont également des modèles particulièrement adaptés pour mener des études de suivi de développement embryonnaire. L’échographie permet de détecter l’apparition de malformations éventuellement associées à certains génotypes et/ou observer le phénomène de résorption embryonnaire pouvant expliquer l’absence de certains génotypes à la mise bas (mortalité embryonnaire). Les animaux adultes seront âgés de 7 semaines minimum à réception dans nos zootechnies. Ils ne seront utilisés qu’après 5 à 7 jours de quarantaine. Les expériences seront majoritairement conduites chez de jeunes adultes de 8 à 12 semaines mais cet âge pourra varier en fonction de l’objet de l’étude (a minima après sevrage et jusqu’à 1 an). Une des procédures, qui nécessite la mise en œuvre de femelles gestantes. Ces femelles (souris et rates) seront mises en accouplement à partir de l’âge de 8 semaines. Les embryons pourront être objets de prélèvements et / ou injections guidées par échographie à tous les stades de développement donc y compris durant le dernier tiers de gestation. Les souriceaux et ratons issus de ces gestations pourront être imagés par échographie avant sevrage (de 1 à 21 jours).
Rôle de la protéine X dans le développement tumoral pancréatique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
78 souris sur 5 079 subiront la chirurgie qui fait l'objet du projet, une incision de l'abdomen sous anesthésie pour injecter des cellules cancéreuses dans le pancréas. Les 5 001 autres sont élevées et biopsiées à l'oreille, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et toutes sont tuées, les reproductrices à neuf mois, les opérées trente-cinq jours après l'implantation. Après l'opération, les souris sont palpées deux fois par semaine pour sentir la tumeur pousser sous la peau et portent des agrafes pendant sept jours, avec une douleur modérée sur un à deux jours puis une douleur légère liée à la croissance tumorale. Les souris utilisées sont dépourvues de la protéine étudiée, hyperlaxes, en difficulté pour s'agripper, ce que le porteur qualifie de léger tout en prévoyant une surveillance renforcée toute leur vie.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer peu fréquent (12ème cancer le plus fréquent), mais pour lequel le pronostic vital est extrêmement sombre. En effet, l'espérance de vie des patients, 5 ans après le diagnostic, est inférieure à 10%. La protéine d'intérêt de ce projet est présente dans le pancréas sain, est surproduite autour des lésions précancéreuses puis disparait totalement dans les stades avancés de la maladie. Des premiers résultats suggèrent que cette protéine est produite par les cellules saines du pancréas dans les stades précoces du cancer pour empêcher la multiplication des cellules tumorales et par la suite, les cellules tumorales éduquent les cellules environnantes pour empêcher la production de cette protéine d'intérêt et ainsi favoriser le développement de la tumeur. Notre projet vise donc à vérifier cette hypothèse. Pour cela, nous disposons de souris génétiquement modifiées dans lesquelles la protéine X est absente. Ces souris ont une espérance de vie similaire aux souris sauvages, se reproduisent normalement, mais présentent des difficultés lors de tests d'agrippements aux supports, ce qui implique une surveillance accrue de celles-ci tout au long de leur vie. Nous injecterons dans le pancréas de ces souris des cellules tumorales pancréatiques. Si notre hypothèse est vérifiée, les souris dépourvues de la protéine X devraient développer une tumeur plus rapidement que les souris sauvages.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de confirmer que la protéine X empêche la prolifération des cellules tumorales dans les premiers stades de développement du cancer du pancréas et donc d'envisager cette molécule comme une cible thérapeutique dont la production devra être réactivée pour permettre de contrer ce cancer hautement mortel.
Procédures
Un prélèvement d'un bout d'oreille (
Impact sur les animaux
Les souris génétiquement modifiées pourraient développer des difficultés très légères au déplacement et à l'agrippement. Le prélèvement d'un bout d'oreille peut engendrer un stress léger lors de la contention et une douleur légère 1 à 2 minutes après cet acte réalisé sur animaux vigiles. Les souris d'intérêt subiront une chirurgie sous anesthésie pouvant engendrer une douleur modérée sur 1 à 2 jours. Cette opération pourrait conduire à une baisse de la température corporelle des souris sur quelques heures. La douleur post-chirurgie peut conduire à des difficultés de déplacement sur les premières heures post-chirurgie. Une sécheresse occulaire peut être induite au cours de la chirurgie. La présence d'agrafes sur la zone de chirurgie peut causer une gêne légère jusqu'à leur retrait (7 jours). La croissance tumorale peut conduire à une douleur légère. Les palpations et pesées sur animaux vigiles n'excéderont pas 1 minutes par souris au total 2 fois par semaine et pourront induire un stress léger.
Devenir
Tous les animaux d'élevage seront mis à mort à 9 mois. Une reproduction au-delà de ce point de cinétique pourrait impacter le bien-être des animaux et pourrait conduire à une baisse de la fertilité. Pour l'analyse du rôle anti-tumoral de la protéine X : les animaux seront mis à mort à 8 semaines + 35 jours post-implantation de cellules tumorales pancréatiques maximum. A la fin de cette étude, le pancréas doit être collecté pour analyses ainsi que les organes potentiels de métastase (foie + poumons).
Remplacement
Au préalable de ce projet, différents travaux ont été réalisés sur des biopsies de patients atteints de cancer du pancréas et sur des cellules pancréatiques en culture. Cependant, le développement d'une cellule tumorale, la formation d'une tumeur et des métastases impliquent la participation de nombreux tissus environnants (vaisseaux sanguins, système immunitaire). Cette complexité tissulaire ne peut pas être reproduite dans des modèles cellulaires. Ainsi, le recours aux modèles murins génétiquement modifiés est nécessaire pour comprendre le rôle de la protéine X dans la carcinogenèse pancréatique.
Réduction
Pour l'élevage des souris génétiquement modifiées, le nombre de souris généré a été réduit au maximum pour pouvoir obtenir le nombre d'animaux suffisant à nos projets. La chirurgie (injection de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas de souris sauvages ou mutées) est très bien documentée dans la littérature. 12 souris par lot au maximum seront utilisées, ce qui correspond au nombre d'animaux minimal et suffisant pour conduire à l'obtention de résultats statistiquement interprétables. Ce projet a été établi de manière à réduire au minimum les gestes invasifs réalisés sur les animaux. En effet, les souris seront identifiées par simple marquage de la queue avec un stylo indélébile de couleur et le génotype des souris sera vérifié après la mise à mort en fin d'expérience.
Raffinement
Les souris déficientes en protéine X ne présentent pas de défauts de reproduction ou de vieillissement, ni de sensibilité à des pathogènes communs. Elles sont cependant hyperlaxes et présentent des difficultés légères mais significatives à l'agrippement, même si leur locomotion n'est pas altérée. Pour s'assurer du bien-être de ces souris, elles seront surveillées de leur naissance à leur mort 1 fois par semaine. Elles seront mises en reproduction de 6 semaines à 9 mois, âge max à leur mise à mort. Pour l'étude du rôle anti-tumoral de la protéine X au cours de la carcinogenèse pancréatique, la chirurgie sera réalisée sur des souris de 8 semaines, sous anesthésie générale supplémentée en analgésiques locaux et généraux. Les conditions de stérilité seront assurées par l'utilisation de matériel stérile (instruments, champs opératoire et gants stériles) et par l'utilisation de bétadine vétériniare pour éliminer les pathogènes sur la zone opérée. La chirurgie sera réalisée en plaçant la souris sur un tapis chauffant de manière à éviter la baisse de température corporelle. De même, les souris seront placées dans des cages placées dans des armoires chauffantes jusqu'au lendemain de la chirurgie. Du gel occulaire ophtalmique sera utilisé pour éviter le désèchement des yeux lors de la chirurgie. De la nourriture humide et de l'eau gélifiée seront déposées dans des coupelles au fond de la cage après la chirurgie pour favoriser la prise alimentaire et hydrique. Une surveillance étroite des souris sera réalisée post-chirurgie pour vérifier l'absence de douleur et une potentielle infection de la zone incisée. Cette surveillance s'attachera à observer le comportement de la souris, l'apparence de la plaie et le poids de la souris. Les agrafes seront enlevées à J7 sous anesthésie gazeuse et une pommade anlagésique sera appliquée sur la zone précédemment agrafée. Une surveillance des souris au cours de la croissance tumorale sera également réalisée 2 fois par semaine à partir de 15 jours post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort de l'animal (35 jours post-implantation max) pour détecter tout signe de mal-être potentiellement induits par la croissance de la tumeur. Hormis pendant les 24h après la chirurgie ou un tissu fin servira de litière, les animaux seront hébergés en groupe de 4-6 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, baton).
Choix des espèces
Notre objectif est de comprendre le rôle de la protéine X dans la carcinogenèse pancréatique. Le modèle murin est le modèle de choix pour les études en cancérologie. En effet, la proximité génétique et physiologique de la souris avec l’homme permet de reproduire de nombreux aspects de la biologie tumorale humaine, tant sur le plan moléculaire que cellulaire. Les souris seront utilisées (injectées) à 8 semaines de développmement. Nous voulons travailler sur des souris adultes, donc matures sexuellement pour standardiser notre modèle (éviter les variations dues à la puberté ou à l'âge) et cette maturité est atteinte chez le mâle et la femelle entre 5 et 7 semaines. Les souris génétiquement modifiées utilisées n'ont pas de problème de reproduction, ni de vieillissement, mais montrent des difficultés légères lors de tests d'agrippements et de suspension. Pour éviter leur mal-être induit par une période de reproduction avancée, elles ne seront mises en reproduction qu'à partir de 6 semaines jusqu'à 9 mois post-naissance.
Méthode de prélévement pour l’élevage de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une biopsie de moins d'une seconde, pratiquée une fois dans la vie de l'animal : c'est tout ce que le protocole décrit des gestes infligés. 10 800 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, élevées et génotypées par une animalerie qui héberge une soixantaine de lignées et environ 300 couples reproducteurs. Le but tient à la seule gestion de l'élevage, trier les souris au bon génotype pour les projets du campus, et le porteur précise que la majorité de celles qui n'ont pas le génotype recherché seront tuées, les autres partant vers d'autres protocoles. Le résumé ne dit ni quel tissu est prélevé, ni si une anesthésie est pratiquée, ni comment on arrive à 10 800 souris, et la rubrique raffinement se limite à la température et à l'hygrométrie de l'animalerie.
Objectifs
L’objectif du projet est de produire des souris génétiquement modifiées et d’effectuer les prélèvements (biopsies) ainsi que l’identification des animaux. Dans le cadre des projets de recherche, différents modèles de souris génétiquement modifiés sont utilisées pour des études portant sur l’infectiologie, l'immunologie, les maladies neuro dégénérative, la recherche sur le cancer. Une identification et un génotypage sont requis.
Bénéfices attendus
L'institut de recherche a des thématiques différentes telles que les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, inflammatoires, infectieuses, métaboliques ou encore la cancérologie La plateforme est une animalerie fournissant et utilisant des modèles in vivo. Nous hébergeons et produisons des souris génétiquement modifiées de modèles déjà existants. Nous comptons une soixantaine de lignées hébergées. En production moyenne nous hébergeons environ 300 couples Les modifications génétiques apportées aux animaux que nous produisons et/ou hébergeons sont contrôlées par génotypage. Le génotypage et l'identification permettent de sélectionner les animaux d'intérêts qui seront ensuite utilisés dans les projets scientifiques. La gestion de l'élevage par l'équipe d'animalerie permet une optimisation de la production qui ne dépent plus des équipes utilisatrices.
Procédures
Prélèvement par biopsie, une fois dans la vie de l’animal, moins d’une seconde
Impact sur les animaux
La contention des animaux peut générer un léger stress. Le prélèvement en lui-même peut induire une légère douleur et occasionner un léger saignement
Devenir
L'ensemble des animaux rentreront en utilisation pour les projets autorisés. Les souris ne présentant pas le génotype d'intérêt pourront être utilisés dans le cadre de formations par tutorat. La majorité des animaux n'ayant pas de génotype d'intérêt recherché seront mis à mort.
Remplacement
Certains projets de recherche sont réalisés in vitro. Les modèles murins ne sont utilisés qu'en dernier recours, pour les recherches exigeant un métabolisme complet.
Réduction
Le génotypage permet de sélectionner les animaux d’intérêts dans le cadre des projets développés sur le Campus. Dans le cadre de formation ou tutorat une partie des animaux de non intérêts sont utilisés. Le fait de gérer les élevages permet d’éviter la production inutile ou la surproduction d’animaux. Les utilisateurs doivent programmer leurs expérimentations et l’équipe d’élevage met en place la stratégie la plus opportune pour obtenir le nombre d’animaux demandés.
Raffinement
L'établissement est agréé les animaux sont hébergés avec un contrôle continu des températures (22°C +/- 2° C), également avec un contrôle d'hygrométrie 55% +/-15, un cycle de lumière 12/12 avec un accès ad libitum à la nourriture et l'eau de boisson. Les animaux bénéficient également d’enrichissements; Une surveillance quotidienne est effectuée journalière afin de vérifier l'état de santé des animaux.
Choix des espèces
Les équipes de recherche du campus ont des projets nécessitant l'utilisation de modèles murins. Les prélèvements (Biopsie) des souris génétiquement modifiées afin d'effectuer un génotypage permettent la sélection de lots stables. Pour l’élevage, les animaux utilisés sont des adultes de 8 semaines. Les animaux utilisés en recherche sont disponibles à partir de l’âge de 3 semaines après identification, prélèvement et génotypage.
Etude de l’influence du milieu tropical sur le microbiote intestinal chez le porc
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Comparer deux lignées de porcs pour savoir si la sélection génétique menée en climat tempéré tient en milieu tropical, l'objet est zootechnique avant d'être sanitaire. 240 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et rendus ensuite au circuit d'élevage. Chacun est saisi, contenu et retourné sur le dos environ trois minutes pour une prise de sang à 60 jours, avec un coton salivaire à mâcher, six pesées de la naissance à 160 jours et une mesure du gras dorsal aux ultrasons. Le porteur annonce comme bénéfice à long terme une sélection intégrant la composition du microbiote, un outil pour la filière porcine, et le suivi s'arrête à la fin d'engraissement.
Objectifs
Le terme microbiote désigne une communauté de microorganismes qui occupent une niche écologique, qui peut être partiellement décrite par l'ensemble des genres bactériens qui la compose. Les organismes vivants cohabitent avec de telles communautés. Chez les animaux, elles colonisent un certain nombre de surfaces et notamment les cavités orales, nasales ou intestinales. Un des microbiotes qui a plus particulièrement été étudié ces dernières années est celui de l'intestin, puisqu'il participe au processus de digestion et contribue à la santé de son hôte. Pour les animaux d'élevage, la compréhension des mécanismes qui interviennent dans l'installation, le maintien ou l'évolution du microbiote intestinal au cours de la vie d'un animal est essentielle. Dans ce projet, notre objectif est d'établir si la différence de composition des microbiotes des intestins induite par une selection génétique en milieu tempéré est affecté par l'élevage en conditions tropicales. Dans ce but, nous réaliserons différents prélèvements dans deux lignées de porcs connues pour avoir des microbiotes différents en milieu tempéré. Du sang sera prélevé pour l'étude de marqueurs génétiques et métaboliques du porc. Les fécès produits spontanément seront utilisés pour vérifier la composition du microbiote intestinal. Ces paramètres seront mis en regard de l'état de santé global des animaux.
Bénéfices attendus
A court terme, le projet amènera des informations sur la composition de différents microbiotes, leur évolution avec l'âge du porc et leur association à des marqueurs génétiques et métaboliqes du porc dans différentes conditions d'élevage. A plus long terme, d'un point de vue plus appliqué, ces connaissances pourront être utilisées en sélection pour améliorer, via la prise en compte de la composition du microbiote, la santé des animaux.
Procédures
Les animaux du projet sont pesés 6 fois, à la naissance, à 21 jours, à 28 jours au sevrage, à 70 jours, à 84 jours en fin de post sevrage, et en fin d'engraissement vers 160 jours d'âge, avec une mesure de l'épaisseur de gras dorsal par ultrasons. Une pesée dure une quinzaine de secondes. Au sevrage et en fin de post sevrage, elle est réalisée durant le changement de local des animaux. Une prise de sang est réalisée à 60 jours d'âge. Au même moment, il y a une collecte de fèces suite à une défécation spontanée. L'intervention impliquant la saisie de l'animal, sa contention et son isolement en position dorsale pour réaliser les prélèvements de sang et de fèces dure environ 3 minutes. Juste avant la prise de sang, un prélevement de salive par présentation d'un coton salivaire à machouiller est réalisé. Une collecte de fèces est réalisée à 120 jours à partir d'une défécation spontanée.
Impact sur les animaux
La saisie de l'animal provoque un stress léger et temporaire pour l'animal attrapé et pour ses congénères au niveau de la case d'hébergement. Le prélèvement de sang provoque une douleur légère et transitoire. Chaque pesée cause un stress léger et transitoire en raison de l'isolement et de la contention de l'animal nécessaire à une pesée individuelle.
Devenir
Les animaux sont remis en conditions d'élevage.
Remplacement
Les mesures sur le porc sont requises car il s'agit de l'espèce cible. L'objectif est d’explorer dans cette espèce l'influence du milieu tropical sur le microbiote intestinal et les relations avec les paramètres sanguins et la thermorégulation. Il n'existe ni modèle in vitro ni modèle in silico permettant d'obtenir ces résultats.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au minimum pour obtenir des résultats exploitables et fiables en terme statistique.
Raffinement
Les animaux sont élevés avec un enrichissement du milieu adapté au porc incluant des cordelettes, des sacs en toile de jute, des chainettes et des ballons. Pour la prise de sang, la saisie et la contention des animaux sont réalisées par les membres du personnel expérimenté en charge du soin des animaux, auxquels les animaux sont familiarisés. Les prélèvements de sang et de salive se font par des techniques maitrisées qui limitent la durée de contention de l'animal. Les points limites ont été établis en fonction d'une grille d'observation des animaux. Lorsqu'un point limite est atteint, le responsable d'élevage agit selon le plan établit avec le vétérinaire d'élevage, en accord avec le porteur du projet.
Choix des espèces
Le porc est l'espèce cible. Afin d'améliorer les conditions d'élevage du porc (bénéfice à long terme du projet), il est essentiel d'utiliser cette espèce. Les animaux sont étudiés entre la naissance et la fin d'engraissement. L'âge de 60 jours retenus pour le prélèvement de sang, de fèces et de salive, correspond à une phase précoce de stabilisation du microbiote intestinal après le passage à l'aliment solide au moment du sevrage. L'âge de 120 jours retenu pour le deuxième prélèvement de fèces correspond à la fin d'engraissement à un stade où les animaux ne sont pas encore pubères.
Caractérisation de la virulence des virus influenza chez la caille et exploration de stratégies thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Anesthésiées brièvement au gaz, 300 cailles reçoivent un virus influenza dans la cavité oculo-nasale, geste répété chaque jour pour celles qui servent aux tests de nanoparticules antivirales. Suivent les prélèvements quotidiens sur animal éveillé, écouvillons dans le bec et à l'orifice cloacal, prélèvements de plumes, isolement en boîte jusqu'à la défécation, plus une prise de sang. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 100 d'entre elles, modéré pour 100 et sévère pour 100, avec abattement, anorexie, difficultés respiratoires, atteintes neurologiques si le virus gagne le cerveau, et une hypothermie qui précède souvent la mort. Toutes sont tuées pour le recueil des organes, aucune ne pouvant rejoindre un élevage après une infection expérimentale.
Objectifs
Ce projet vise à caractériser la virulence de différents virus influenza chez la caille, un hôte aviaire susceptible de jouer un rôle de réservoir ou d’amplificateur. Il a également pour objectif de mieux comprendre ce qui rend le virus plus actif et comprendre comment le système immunitaire de l’animal réagit à l’infection. Par ailleurs, l’étude permettra d’évaluer l’efficacité de différents candidats thérapeutiques ou prophylactiques, incluant des antiviraux, des immunomodulateurs ou des vaccins, dans ce modèle aviaire. Enfin, un volet spécifique portera sur l’influence du microbiote intestinal, explorée notamment grâce à l’utilisation de cailles axéniques (dépourvues de germes), afin de déterminer son rôle dans l’évolution de l’infection et la modulation des réponses de l’hôte. Notre objectif est de mieux comprendre les virus qui infectent différents organes et causent des formes sévères d’infection. Ce modèle expérimental nous aidera à identifier les régions du corps les plus ciblées par le virus, à comparer la gravité de l’infection selon les souches virales, et à mieux comprendre comment certaines souches deviennent capables d’envahir des organes habituellement protégés. À terme, ce travail permettra d’anticiper les risques posés par certains virus de la grippe chez les oiseaux, y compris ceux pouvant infecter d’autres espèces comme les volailles domestiques ou même l’homme. Il contribuera également à développer des stratégies plus efficaces pour prévenir ou limiter la propagation de ces virus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains virus de la grippe aviaire parviennent à se disséminer dans l’organisme des oiseaux, au-delà des voies respiratoires, en franchissant des barrières physiologiques comme celle du cerveau. Les résultats attendus contribueront à identifier les facteurs viraux associés à une virulence accrue, ce qui permettra d’évaluer plus finement les risques pour la santé animale et, potentiellement, pour la santé humaine en cas de transmission interespèce. Ils permettront également de définir si la flore commensale bactérienne jour un rôle protecteur dans ce type de situation infectieuse et également de vérifier l’efficacité de médicaments nanoparticulaires in vivo. À terme, ce projet apportera des connaissances utiles pour la surveillance, la prévention et le contrôle des virus influenza chez les oiseaux.
Procédures
Les cailles seront infectées par instillation dans la cavité oculo-nasale sous anesthésie légère gazeuse. Cette voie d’administration sera également utilisée lors des tests d’efficacité des nanoparticules antivirales. Dans le cas de ces tests de médicaments, l’instillation intra-nasale pourra être répétée quotidiennement. Les animaux seront aussi l’objet de prélèvements de fientes qui seront récupérées en introduisant les cailles dans des boites individuelles jusqu’à l’apparition de fientes (quelques minutes). Enfin, des prélèvements quotidiens seront réalisés sur des animaux vigiles : emploi d’un coton-tige stérile pour recueillir des sécrétions, dans la cavité buccale ou au niveau de l’orifice intestinal de la caille, prélèvements de plumes, ainsi qu’une prise de sang ponctuelle réalisée en cours d’expérimentation. Ces gestes, sont de courte durée (quelques secondes à quelques minutes) et induisent un stress modéré.
Impact sur les animaux
Les effets attendus chez les animaux sont principalement liés à l’infection expérimentale. Selon la souche virale utilisée, des signes cliniques modérés à sévères peuvent apparaître, tels qu’un abattement, une diminution de l’activité, un ébouriffement du plumage, une perte de poids, une anorexie ou une difficulté respiratoire. Dans les cas les plus graves, des atteintes neurologiques peuvent survenir si le virus dissémine jusqu’au système nerveux central. Dans certains cas, une morbidité plus importante voire une mortalité peuvent survenir, en particulier avec des souches virulentes, dans ce cas une fièvre se produit en général les 1ers jours de l’infection et une hypothermie précédant la mort est souvent observée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, pour permettre le recueil des organes et tissus indispensables aux analyses prévues dans le cadre du projet. Par ailleurs, aucun des animaux ne pourra être réutilisé ni réintégré dans une colonie d’élevage, compte tenu de l’infection expérimentale par un virus potentiellement pathogène. Cette mesure vise à garantir la biosécurité et à éviter tout risque de dissémination non contrôlée de l’agent infectieux.
Remplacement
Certains phénomènes liés à l’infection ne peuvent être reproduits ni sur des cellules en laboratoire ni par ordinateur. L’étude du virus nécessite d’observer les réactions complexes de l’organisme entier, comme la fièvre, l’inflammation, le rôle de la flore intestinale ou la réponse immunitaire. La caille est un bon modèle pour comprendre ces mécanismes chez les oiseaux. Le protocole utilise le nombre minimal d’animaux, dans le respect du bien-être animal et des règles éthiques en vigueur.
Réduction
Le nombre de cailles utilisées a été soigneusement fixé pour obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum le recours aux animaux. Pour chaque condition étudiée, nous comparons deux groupes similaires de 15 cailles. Ce nombre permet d’avoir des groupes assez grands pour tirer des conclusions solides, sans utiliser plus d’animaux que nécessaire.
Raffinement
Les cailles vivent en liberté dans des cages spécialement aménagées, avec eau et nourriture à volonté. Le sol est recouvert de copeaux pour protéger leurs pattes et leur permettre de gratter et fouiller, comme elles le feraient dans la nature. Elles disposent aussi de cachettes et de matériaux pour construire un nid ou se replier, ainsi que d’objets à manipuler pour stimuler leur activité et réduire le stress. La densité des animaux est adaptée pour éviter les bagarres ou comportements agressifs. Une surveillance rigoureuse et des critères d’arrêt précis seront mis en place pour détecter toute aggravation clinique et limiter la souffrance animale. Les animaux atteignant les points limites prédéfinis seront euthanasiés.
Choix des espèces
La caille a été choisie car elle représente un hôte aviaire pertinent pour l’étude de souches influenza d’intérêt vétérinaire et zoonotique. Cette espèce est sensible à l’infection par ce virus ce qui en fait un modèle adapté pour étudier les tissus ou le pathogène se multiplie, la dissémination systémique et les barrières physiologiques spécifiques aux oiseaux. Les animaux utilisés seront des cailles juvéniles, âgées de 3 semaines car il est nécessaire que son système immunitaire soit mature. De plus, il permet une manipulation aisée des animaux et une observation optimale des signes cliniques et des réponses à l’infection.
Effets d’une carence gestationnelle en vitamine A sur la transmission dopaminergique mésocorticolimbique dans le contrôle de la prise de décision MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
306 souris reproductrices sont carencées en vitamine A pendant la gestation, puis tuées au sevrage de leurs portées, dont les descendants forment l'essentiel de l'effectif. 1 326 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de régions cérébrales, 546 sans jamais se réveiller, 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 300 un niveau modéré. Les descendants passent douze semaines en restriction alimentaire pour un conditionnement opérant, certains reçoivent des injections d'amphétamine, d'autres subissent une chirurgie stéréotaxique, et 120 sont soumis à des tests d'anxiété que le résumé ne nomme pas. Sur la réduction, le porteur explique multiplier les mesures sur un même animal, sans jamais indiquer d'où vient le chiffre de 1 326.
Objectifs
La carence en vitamine A au cours de la période périnatale, causée par un régime appauvri en vitamine A, reste un enjeu majeur de santé publique dans les pays en voie de développement. En effet, l’acide rétinoïque (AR), métabolite actif de la vitamine A est indispensable au développement cérébral du foetus et du nouveau-né mais joue également un rôle très important dans les fonctions cérébrales à l’âge adulte. En se fixant sur ses récepteurs nucléaires les RARs (Retinoic Acid Receptors) et les RXRs (Retinoid X Receptors) qui jouent le rôle de facteur de transcription, l’AR régule l’expression de nombreux gènes impliqués dans les processus de plasticité cérébrale. Ainsi, de faibles apports en vitamine A pendant la période périnatale conduiraient à une hypoactivité de la voie de signalisation de l’AR et des modifications d’expression de certains gènes comme le récepteur dopaminergique D2 (D2R) avec des conséquences néfastes sur les fonctions cérébrales associées (fonctions exécutives, planification motrice). Nous faisons l’hypothèse qu’un déséquilibre d’apports alimentaires en vitamine A durant la période périnatale altère le développement de la transmission dopaminergique et pourrait participer à l’étiologie de pathologies neurodèveloppementales qui impliquent des déficits des fonctions exécutives et motrices.
Bénéfices attendus
cette étude vise à proposer de nouvelles stratégies pour la prise en charge des maladies psychiatriques dont l’arsenal thérapeutique reste insuffisant. Ce projet va permettre de tester l’effet potentiellement protecteurs de molécules d’intérêts et donc de proposer de nouvelles stratégies curatives dans le contexte des maladies psychiatriques. Il va aussi permettre d’explorer les mécanismes par lesquels ces métabolites influencent la fonction cérébrale et le comportement. Cela permettra donc d’accroitre les connaissances dans un champ de recherche nouveau et prometteur.
Procédures
306 souris reproductrices seront euthanasiées au sevrage des animaux et 120 souris descendantes seront euthanasiés pour réaliser des enregistrements électrophysiologiques (426 sans réveil). 660 souris descendantes seront soumises à un conditionnement opérant (classe légère). Pour le test de conditionnement opérant, les animaux seront maintenus en restriction alimentaire légère (moins de 10% de perte par rapport au poids ad libitum) pendant toute la durée des expériences comportementales (12 semaines). Sur les 660 souris descendantes ayant été soumises au conditionnement opérant , 60 seront soumises à des injections intrapéritonéales d'amphétamine (classe modérée) et 240 seront soumises à des chirurgies stéréotaxiques (classe modérée). Afin d’évaluer le comportement de type anxieux, 120 souris descendantes seront soumises à des tests comportementaux qui peuvent engendrer un stress aigü (classe légère). Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré. 240 souris descendantes (dont 120 soumises au conditionnement opérant) seront perfusées pour réaliser des analyses immunohistochimiques (classe légère). Cette intervention dure 15 min par souris (480 classe legère).
Impact sur les animaux
De part sa nature et son objectif les tests comportementaux évaluant le comportement de type anxieux que nous allons utiliser entraine un stress aigü chez la souris. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré. Les souris seront de toute façon suivies comme suit : les animaux en cours de protocole sont surveillés chaque jour par l’expérimentateur et 2 fois par semaine par les animaliers. Pour le test de conditionnement opérant, les animaux seront maintenus en restriction alimentaire légère (moins de 10% de perte par rapport au poids ad libitum) pendant toute la durée des expériences comportementales (12 semaines). Pour cela, les animaux seront pesés chaque jour et la quantité de nourriture ajustée en fonction. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération.
Devenir
En fin de procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires. En fin de procédure 2, tous les animaux seront euthanasiés pour collecter des tissus fixés afin de réaliser de l'immunomarquage sur les tranches de cerveau. En fin de procédure 3 tous les animaux seront euthanasiés et le cerveau sera prélevé (comme tissu frais) afin de réaliser des enregistrements électrophysiologiques. En fin de procédure 4, tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires. En fin de procédure 5 et 6 , tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires.
Remplacement
L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques d’une carence gestationnelle en vitamine A . Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la cognition reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. L’objectif à long terme du projet étant de tester les effets comportementaux d’une supplémentation nutritionnelle en vitamine A dans le contexte des maladies neurodéveloppementales. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la seconde. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié
Raffinement
Concernant le raffinement différentes approches seront mises en œuvre. Les animaux seront hébergés en cages collectives avec un environnement enrichi (bâton à ronger, igloo, sizzle nest). Les animaux seront observés quotidiennement et pesés au moins 1 fois par semaine. Les animaux seront inspectés et si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin et coton), les animaux recevront une injection sous-cutanée d'analgésique si nécessaire et seront surveillés deux fois par jour. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Si l’animal apparaît malade ou avoir des douleurs (voir définition des points limites dans les procédures expérimentales), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera mis à mort dans les 24h. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Par ailleurs pour les procédures induisant de la douleur comme la perfusion intracardiaque nous utiliserons des associations d’anesthésiques et analgésiques afin de limiter la douleur chez l’animal. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Enfin, les protocoles réalisés sur les animaux sont au préalable soumis puis approuvés par l'équipe en charge de l'animalerie afin d'assurer les bonnes conditions d'expérimentation.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Les expériences de comportement et d’électrophysiologie sont facilement mises en oeuvre d’un point de vue technique sur les souris. La souche de souris utilisée (C57/Bl6J) constitue un modèle d’étude particulièrement intéressant et informatif dans le cadre des études sur l'impact des carences gestationnelles de nutriments sur la prise de décision , de ce fait les résultats de ce projet seront donc plus faciles à intégrer dans la littérature déjà existante. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet.
Architecture fonctionelle thalamocorticale de la prise de décision adaptative chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six heures de chirurgie cérébrale par animal, pour injecter des composés dans le cerveau et y implanter à demeure des électrodes et une fibre de verre. 60 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 10 d'entre eux et modéré pour 50, dix seulement pouvant être adoptés à l'issue, les autres étant tués pour prélèvement. Pendant jusqu'à quatre mois, chaque rat travaille une tâche de prise de décision de vingt minutes à une heure quinze par jour, maintenu trois mois durant à 90 ou 95 % de son poids pour que la faim entretienne sa motivation. Le porteur qualifie cette restriction d'impact très faible sur le bien-être, et retient le rat parce que des épreuves comportementales y modélisent des aptitudes cognitives complexes qu'il juge transposables à l'être humain.
Objectifs
La prise de décision est un processus essentiel du comportement humain. Ce processus complexe nécessite d’apprendre de son environnement afin d’emmagasiner des connaissances mais également de s’adapter aux changements. Une prise de décision adaptée nécessite ainsi un équilibre entre les comportements d’exploitation (utilisation des connaissances acquises) et d’exploration (recherche d’options plus favorables) qui peuvent être fidèlement modélisés chez le rat afin d’en établir les bases neurales. Le projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent une prise de décision adaptée dans un environnement changeant chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de voies connues pour être impliquées dans la prise de décision mais dont le role précis n’est pas encore décrit. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre les différentes régions, puis nous testerons leur implication fonctionnelle en procédant à des déconnexions réversibles, afin de déterminer leur rôle précis.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de préciser la connectivité des voies impliquées dans la prise de décision ainsi que de préciser le rôle d’une population neurone de cette voie. Une hypothèse majeure actuelle est que la prise de décision mal adaptive qui caractérise un grand nombre de pathologies mentales (par exemple la schizophrénie) est associée à un syndrome de dysconnectivité de ces régions, ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une tâche comportementale dont les sessions durent entre 20mn et 1h15 par jour pour une durée maximale de 4 mois. Ils seront soumis également à un rationnement alimentaire léger (permettant de conserver 90-95% de leur poids initial) qui durera maximum 3 mois. Les animaux des procédures 2-4 subiront une chirurgie d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation à demeure d’électrodes d’enregistrements et d'une fibre de verre très fine d’une durée maximale de 6 heures.
Impact sur les animaux
Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en régime alimentaire spécifique (90 à 95% de maintien du poids), ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire).
Devenir
Procédure 1 : les animaux pourront être adoptés à l'issue de la procédure et suivant l'avis vétérinaire Procédure 2 à 4 : les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour prélèvement biologique
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet combine une étude du comportement chez le rat pendant une tâche comportementale faisant intervenir des formes de prise de décision complexes et des enregistrements simultanés de plusieurs aires cérébrales. Il est à ce jour impossible de mimer des comportements aussi complexes impliquant le traitement d’informations fluctuantes dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connexions entre les différentes aires cérébrales.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. Ces tests puissants permettent d'inclure des animaux même en cas de données manquantes et de réduire le nombre d'animaux grâce aux mesures répétées.
Raffinement
Le haut niveau de complexité des chirurgies effectuées sur ces animaux permet de générer un grand nombre de données par animal et de maintenir une haute qualité d’enregistrement pendant plusieurs jours consécutifs. Dans ce projet, les enregistrements et modulations optogénétiques seront combinés à une tâche comportementale complexe qui a été validée dans l’équipe de notre collaborateur ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés pour protéger les implants. Or, l’isolement représente un stress majeur pour les rats. Nos étapes d’acclimatation et d’isolement ont donc été raffinées afin de limiter le stress des animaux, et ceci nous permet de maintenir les animaux au minimum par deux. Enfin, la prise en charge de la douleur pendant la chirurgie et en post-chirurgie est optimisée pour que les animaux ne ressentent aucune douleur et une habituation lente et progressive est effectuée afin de réduire au maximum le stress de l’animal. Des points limites clairs et objectifs ont été définis afin de limiter au maximum toute souffrance.
Choix des espèces
D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille entre individus.
SAMPLE: Prélèvements biologiques chez le rat et la souris de laboratoire non traités
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 1000
1 760 animaux seront tués pour qu'on leur prélève des organes ou plus de 20 % de leur volume sanguin, 200 seront réutilisés dans d'autres projets et 40 proposés à l'adoption. 1 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 800 d'entre eux, les 200 autres étant tués sans réveil. Ceux qui restent en vie peuvent subir jusqu'à dix microprélèvements sanguins, trois saignées de 15 % du volume sanguin, et jusqu'à quatre passages de seize heures en cage métabolique après gavage à l'eau. Aucun traitement expérimental ne leur est administré, ils sont exploités uniquement pour le sang, l'urine et les organes qu'on leur prend, et le porteur juge ce recours "indispensable" au motif que les banques de tissus existantes ne couvrent pas ses besoins.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’encadrer la réalisation de prélèvements sanguins, de bio fluides et/ou d’organes chez des rats et des souris de laboratoire n’ayant pas reçu de traitement, pour disposer d’échantillons biologiques afin de : • Mettre au point des techniques expérimentales (extraction, dosage, imagerie, etc.). Les prélèvements de matrices biologiques permettent d’optimiser des procédures expérimentales (notamment in vitro) avant leur application dans des projets scientifiques et/ou réglementaires afin de constituer un référentiel de données de base nécessaires pour des projets ultérieurs. • Valider de nouvelles méthodes analytiques (toxicologie, biochimie, histologie, omics, etc.) en disposant de matrices non traitées pour vérifier la sensibilité, la spécificité et/ou la robustesse des méthodes. • Utiliser les échantillons en recherche et contribuer à la constitution d'une banque de tissu et de bio fluides pour la mise au point et l’utilisation de modèles de cultures cellulaires primaires ou l’identification et la validation de nouveaux biomarqueurs par exemple. • Réduire l’utilisation future d’animaux : en consolidant en amont les méthodes et outils analytiques, ce projet contribue à limiter la répétition d’essais in vivo et donc à réduire le nombre total d’animaux nécessaires dans des études ultérieures.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de disposer d’échantillons biologiques de référence (non traité) pouvant contribuer à l’établissement d’une banque de tissu, ou afin de mettre au point et valider des méthodes analytiques (par exemple pour de la qualification d’équipement), d’améliorer la qualité et la robustesse des techniques expérimentales, et de développer de nouvelles applications telles que la culture cellulaire ou l’identification de biomarqueurs. Les prélèvements par animal seront optimisés afin d’éviter toute duplication inutile. Ceci contribue à réduire la répétition d’essais in vivo et donc le nombre total d’animaux utilisés, tout en répondant aux exigences scientifiques et réglementaires.
Procédures
Les animaux pourront subir des prélèvements sanguins sur animaux vigiles et/ou animaux anesthésiés. Ce prélèvement peut être unique ou répété en respectant les durées de la récupération physiologique. Chaque animal pourra faire l’objet d’un maximum de cinq microprélèvements sanguins (20 µL chacun) par jour, sans dépasser dix microprélèvements sur l’ensemble de la procédure. Jusqu’à trois prélèvements sanguins plus importants, correspondant chacun à un volume maximal de 15 % du volume sanguin total, pourront être réalisés, avec des périodes de récupération appropriées entre chaque prélèvement. Les prélèvements atteignant 20 % du volume sanguin total seront réalisés sous analgésie et anesthésie générale et sans réveil de l’animal. Des prélèvements d’urines pourront être effectués et nécessiteront une mise à jeun, un gavage à l’eau au préalable et une isolation en cage métabolique pour une durée maximale de 16h. Un prélèvement urinaire par semaine pourra être effectué par animal sans dépasser quatre prélèvements au cours de la procédure. Pour les prélèvements d’organes, les animaux sont mis à morts.
Impact sur les animaux
Les animaux ne subiront aucun traitement expérimental ni manipulation répétée. Un stress léger peut se produire lors de la manipulation ou de la contention. Les animaux pourront subir des prélèvements sanguins sur animaux vigiles et/ou animaux anesthésiés. Les prélèvements de sang peuvent induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prélèvement. Des prélèvements d’urines pourront être effectués et nécessiteront une mise à jeun, un gavage à l’eau au préalable à l’aide de sonde souples pouvant induire un inconfort et très rarement une irritation de l’œsophage, et une isolation en cage métabolique pour une durée maximale de 16h pouvant induire un stress léger. De faibles pertes de poids peuvent être observées. Pour les prélèvements d’organes, les animaux sont mis à morts.
Devenir
Dans le cas de prélèvements sanguins et/ou urinaires, les animaux ne seront pas mis à mort. Ils pourront alors être réutilisé dans le cadre d’autres projets ou être proposés à l’adoption. Tous les autres animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes ou de volume de sang supérieur à 20%.
Remplacement
Dans le cadre du présent projet, plusieurs solutions de remplacement ont été étudiées : - Échantillons commerciaux ou banques de tissus : leur utilisation est envisagée en priorité, mais leur disponibilité est limitée en quantité, qualité (fraîcheur, intégrité des organes) et homogénéité. Par ailleurs, ces ressources ne couvrent pas toujours les besoins spécifiques en termes de volumes sanguins ou de tissus entiers nécessaires pour certaines validations analytiques. - Modèles in vitro ou in silico : s’ils sont précieux pour la mise au point de certains tests, ils ne permettent pas de reproduire la complexité tissulaire ou la composition biologique complète d’un organisme entier, indispensable pour tester la pertinence et la transférabilité des méthodes dans un contexte réglementaire. En conséquence, et conformément aux exigences de validation méthodologique reconnues au niveau national et européen, le recours à des prélèvements animaux est indispensable.
Réduction
Le projet est conçu pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en répondant aux besoins scientifiques : - Optimisation des prélèvements par animal : afin d’éviter toute duplication inutile. - Mutualisation : la planification centralisée des prélèvements garantira que plusieurs techniques ou validations bénéficient des tissus issus d’un même animal. - Le prélèvement de certains organes permettra la réalisation d’essais in vitro (par exemple en culture cellulaire primaire), favorisant le criblage d’un plus grand nombre de molécules sans recourir à de nouveaux animaux. - Lorsque cela est possible, les animaux prélevés uniquement pour du sang pourront être réutilisés dans d’autres projets compatibles, sous réserve de l’évaluation du vétérinaire désigné. Enfin, les animaux non réutilisés et en bonne santé pourront être proposés à l’adoption, conformément à la législation en vigueur. - Encadrement réglementaire : en regroupant dans une même autorisation l’ensemble des besoins liés aux matrices biologiques, ce projet évite la multiplication de protocoles fragmentés et redondants, contribuant ainsi à réduire le nombre global d’animaux utilisés. Ces procédures se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux, un maximum de 200 rats et 200 souris par an est estimé nécessaire en se fondant sur l’expérience des besoins en prélèvements des années précédentes et sur les exigences statistiques encadrant la validation de nouvelles méthodes analytiques. Ce nombre d’animaux doit permettre un approvisionnement suffisant en matrices biologiques pour couvrir l’ensemble des besoins du site.
Raffinement
Les conditions d’hébergement enrichies, le personnel formé ainsi que l’utilisation d’une manipulation douce des animaux permettent de réduire le stress pré-procédural au strict minimum. Des points limites suffisamment prédictifs seront appliqués. Lors des prises de sang, l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Des micro-prélèvements pourront être privilégiés. Le jour précédent leur mise à mort les animaux sont déplacés dans une salle proche de la salle de nécropsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort. Afin d’éviter toute douleur, les animaux seront mis à mort après une analgésie à l’aide d’un opioïde de type méthadone suivi d’une anesthésie gazeuse à l’isoflurane. Par ailleurs, le développement et l’implémentation de modèles ex vivo (ou in vitro) issus de ce projet contribuent à améliorer le bien-être animal, puisque les animaux ne sont pas directement exposés aux composés. Ces approches permettent d’affiner la phase préclinique et de limiter le recours ultérieur à des études in vivo.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les modèles expérimentaux choisis en raison de leur durée de vie relativement courte, de leur utilisation fréquente dans les études pharmacologiques et toxicologiques, et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Les rongeurs sont recommandés par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précédemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec les espèces choisies. Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. De plus, les techniques doivent être validées avec les espèces les plus communément utilisées sur l’installation d’essai. L’utilisation conjointe des modèles rats et souris augmente la robustesse technique ainsi que la comparaison et la transférabilité des méthodes sur l’une ou l’autre espèce ainsi que pour des comparaisons in vitro/ in vivo. En général de jeunes adultes sont utilisés. Les animaux adultes jeunes offrent une meilleure homogénéité physiologique que des animaux très âgés ou en croissance rapide (moins de variation liée au développement) cela améliore la reproductibilité des validations. Toutefois pour certaines méthodes, il peut s’avérer nécessaire d’utiliser des animaux juvéniles. Si une méthode doit être validée spécifiquement pour des jeunes, une justification scientifique sera demandée et l’utilisation sera limitée à ce besoin. Seuls des animaux cliniquement sains seront utilisés. Un examen par le personnel zootechnique/vétérinaire sera réalisé avant inclusion. Quand cela sera possible, on utilisera les animaux déjà présents sur l’installation d’essai, dans les animaux de stock.
Prélèvements « invasifs » en routine pour la caractérisation génétique d’une lignée de souris transgénique d’un récepteur impliqué dans la régulation du poids corporel
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Créer et entretenir une lignée de souris porteuses d'une mutation humaine liée à l'obésité et au diabète de type 2, telle est la seule finalité déclarée de cette première phase. 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans aucune expérience métabolique à ce stade. Chaque souriceau subit entre le septième et le dixième jour la section d'un millimètre de queue sous anesthésie locale, pour le seul génotypage, et se trouve séparé de sa mère quelques minutes. Le champ réglementaire ne déclare aucun animal gardé vivant, alors que le texte annonce des reproducteurs conservés pour la lignée et des descendants triés par sexe et génotype pour alimenter les expériences suivantes.
Objectifs
L’obésité affecte une personne sur 8 dans la population mondiale et constitue un facteur de risque majeur pour plusieurs comorbidités, en particulier le diabète de type 2. Au Mexique, les taux d’obésité sont particulièrement élevés, quel que soit l’âge. Une mutation spécifique d'un gène impliqué dans la régulation de l'appétit, retrouvée uniquement chez les personnes d’origine mexicaine et présente chez environ 1 % de cette population, a été identifiée comme un facteur génétique important favorisant l’obésité et le diabète de type 2. Cette première phase du projet vise à établir une lignée de souris mimant une mutation humaine impliquée dans la satiété, l'obésité et le diabète de type 2. L'objectif direct ici est donc de générer et caractériser génétiquement la lignée de souris afin de disposer d'animaux correctement identifiés. Cette phase conditionne la production d'animaux d'intérêt pour les futures analyses métaboliques et comportementales à venir. Elle constitue donc un prérequis essentiel à la réalisation des objectifs scientifiques du projet global.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette étape sont (1) la constitution d’une colonie reproductrice, comportant les trois génotypes d’intérêt et (2) la caractérisation génétique complète des animaux produits, permettant une gestion optimisée des élevages. Ces souris serviront à mieux comprendre le lien entre gènes, obésité et diabète, et à explorer les mécanismes biologiques qui influencent la régulation du poids et de la satiété. A terme, ces travaux contribueront à améliorer les connaissances scientifiques sur les causes génétiques de l'obésité et à mieux cibler les stratégies de prévention et traitement.
Procédures
Toutes les souris seront soumises à une procédure invasive consistant en un prélèvement tissulaire caudal réalisé entre J7 et J10 sous anesthésie locale dans le but exclusif du génotypage. Aucune autre intervention, traitement ou manipulation n’est prévue dans le cadre de cette procédure. Les reproducteurs seront ensuite uniquement utilisés pour la reproduction, tandis que les descendants génotypés seront orientés vers les futurs groupes expérimentaux.
Impact sur les animaux
- section d’1 mm de l’extrémité de la queue entre J7 et J10 - séparation transitoire (quelques minutes) de la portée et de la mère
Devenir
Les reproducteurs seront maintenus pour assurer la continuité et la gestion de la lignée, les descendants génotypés seront répartis selon leur sexe et leur génotype afin d’être utilisés dans des projets expérimentaux ultérieures.
Remplacement
L’étude des effets de cette mutation spécifique d'un gène impliqué dans la régulation de l'appétit nécessite un modèle vivant capable de reproduire l’ensemble des interactions entre le métabolisme, le comportement, l’inflammation et le système hormonal. À ce jour, aucune méthode sur cellules, organoïdes ou modèle informatique ne permet de recréer ces mécanismes complexes de façon réaliste. L’utilisation d’un modèle murin est donc essentielle pour comprendre ces processus dans leur globalité, et la gestion de cette lignée vise à disposer d’animaux fiablement caractérisés sur le plan génétique pour les futures études expérimentales.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires aux phases expérimentales futures a été estimé à l’aide d’un logiciel de calcul statistique adapté aux élevages de lignées transgéniques, en tenant compte des futurs groupes expérimentaux (3 génotypes, 2 sexes, 3 régimes alimentaires et 3 stades d’âge). Le calcul prédictif indique qu'un effectif de 11 animaux par groupe expérimental est suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres étudiés. Cette phase du projet concerne uniquement la mise en place et la gestion de la colonie de souris nécessaires aux futures études. L’inclusion systématique des deux sexes permet d’éviter de dupliquer les expérimentations, et la répartition des tests sur les mêmes individus maximise la quantité de données collectées par animal, tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
À leur arrivée, les souris parentes auront deux semaines pour s’habituer à leur nouvel environnement avant le début des accouplements. Elles seront hébergées dans des cages confortables et ventilées, dans une animalerie maintenant des conditions stables de température et d’humidité. Les accouplements se feront en duo (un mâle et une femelle par cage). Les femelles gestantes resteront hébergées dans les mêmes conditions, avec une attention particulière pendant la gestation et la lactation. Les manipulations seront limitées au strict nécessaire pour ne pas perturber les mères. Après le sevrage, les jeunes souris seront hébergées en petits groupes de quatre par cage, avec différents éléments d’enrichissement (matériel pour faire des nids, abris, tunnels, morceaux de bois à ronger) afin de favoriser leur bien-être et leurs comportements naturels. L’état et le comportement des animaux seront observés chaque jour grâce à une grille de suivi validée dans l’établissement, permettant de repérer rapidement tout signe de malaise ou de souffrance.
Choix des espèces
Ce projet nécessite la génération et la gestion d’un modèle murin génétiquement modifié porteur d'une susceptibilité à l'obésité. La souris constitue l’espèce modèle de référence pour ce type d’approche, en raison de sa facilité de reproduction, de la disponibilité d’outils génétiques adaptés et à la validation internationale des protocoles métaboliques et comportementaux. Les adultes reproducteurs seront utilisés à maturité sexuelle (6-7 semaine d’âge) pour réaliser les accouplements nécessaires à la production des portées expérimentales tout au long du projet. Les souris seront génotypées entre J7 -J10 à partir d’un prélèvement caudal, puis sevrées à J21.
Evaluation de pharmacocinétique et la biodisponibilité de composés pharmaceutiques vétérinaires chez le chat et le chien
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Chiens : 45
Chaque chat et chaque chien subit jusqu'à treize prises de sang sur animal éveillé, en trois sites différents, après une administration orale ou injectable et jusqu'à seize heures de jeûne. 90 chats et 45 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 45 d'entre eux et modéré pour 90. L'objet est commercial, il s'agit de mesurer le passage sanguin de molécules candidates pour trier celles qui iront plus loin dans le développement d'antiparasitaires vétérinaires. Le champ réglementaire du devenir ne déclare aucune mort, 75 animaux réutilisés et 60 proposés à l'adoption, mais le texte précise que ceux qui sont réutilisés puis jugés non adoptables seront tués.
Objectifs
Ce projet a pour objectif l’évaluation précoce du profil pharmacocinétique et de la biodisponibilité orale de composés d’intérêts pour le développement de produits antiparasitaires ou thérapeutiques chez le chat et le chien. Ces études permettront de sélectionner les composés présentant les meilleurs profils pharmacocinétiques et d’obtenir des données en début de phase recherche précoces permettant de modéliser les résultats pharmacocinétiques et ainsi de pouvoir réduire le nombre d’animaux utilisés si le composé poursuit son développement.
Bénéfices attendus
La pharmacocinétique a pour but d'étudier le devenir d'une substance active contenue dans un médicament après son administration, et la biodisponibilité est le calcul de la fraction de substance active qui est absorbée et arrive réellement dans le sang après administration orale. Le projet a pour but d’évaluer de manière précoce le profil pharmacocinétique des composés sélectionnés afin de vérifier leur bonne biodisponibilité avant l’utilisation dans les autres phases de recherche et développement. Les données obtenues permettront également de pouvoir modéliser les résultats pharmacocinétiques et ainsi de pouvoir réduire le nombre d’animaux utilisés si le composé poursuit son développement. Les composés étudiés seront utilisés dans le développement de produit pharmaceutiques vétérinaires afin d’améliorer la prise en charge de certaines affections des animaux de compagnie ou de développer de nouveaux antiparasitaires efficaces.
Procédures
Tous les animaux ont une administration, une seule fois, en vigile. L'administration peut s'effectue par 2 voies différentes. Cet acte dure 1 à 3 minutes. Tous les animaux peuvent avoir au maximum 13 prélèvements sanguins. 3 sites de prélèvements sont possibles. Cet acte s'effectue sur animal vigile et dure environ 3 minutes. Tous les animaux ont un examen physique, une fois ou plus si jugé nécessaire. Cet acte s'effectue en vigile et dure environ 5 minutes. Durant les deux heures post administration, les animaux pourront être hébergés individuellement pour observer d’éventuels évènements contraires (vomissements, diarrhées…). Dans le cadre d'étude avec administration orale, les animaux peuvent être mis à jeun max 16h avant l'administration du produit.
Impact sur les animaux
On ne s’attend pas à des effets secondaires notables. Les composés sélectionnés sont préalablement testés chez la souris dans le cadre d’étude de Dose Maximale Tolérée et seuls les composés ayant démontrés une absence de signes cliniques à 100 fois la dose allant être administré chez le chien ou le chat seront testés dans ce projet. Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Stress dû à la contention - Douleur / inconfort suite aux injections ou aux prélèvements - Stress dû à l’hébergement individuel (inférieur à 4h) et/ou à la mise à jeun - Régurgitation / vomissements suite à l’administration orale
Devenir
Les animaux seront réutilisés à l’issue de chaque procédure. Les animaux réutilisés qui ne seront ensuite pas adoptables seront euthanasiés.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative au recours à l’animal permettant d’évaluer la pharmacocinétique des produits pharmaceutiques vétérinaires. Ces composés étant nouveaux, aucun modèle prédictif ne permet de remplacer l’utilisation de l’animal. Les composés sélectionnés ont d’abord démontré : - Une efficacité in vitro sur les parasites d’intérêts dans le cadre d’antiparasitaires ou sur la maladie d’intérêt (target blinding / taget occupency ; molécules d’intérêts déjà développés en vue de médicament humain…) - Un bon profil pharmacocinétique dans le cadre d’études pharmacocinétiques préliminaires chez le rongeur - Une absence signes à au moins 100 fois la dose d’intérêt dans le cadre d’études de Dose Maximale Tolérée chez le rongeur Après cette première étape, les études de pharmacocinétique ou pharmacodynamie nécessitent de travailler sur un organisme entier, mettant en jeu des interactions entre différents tissus/organes impliqués dans le métabolisme et le/les effets physiologiques et/ou thérapeutiques du futur candidat médicament.
Réduction
Ces études étant exploratoires dans le but de sélectionner des composés, trois animaux seront utilisés par composé et par voie d’administration. En fonction de l'arrivée des composés une étude peut être lancée par mois au maximum. Lorsque le statut des animaux le permet les animaux utilisés peuvent être issus de procédures (légère ou modérée) antérieures et peuvent ensuite être réutilisés dans une future procédure. La réutilisation permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Seuls les animaux ayant retrouvé un état de santé et bien-être complet, attesté par le vétérinaire désigné, sont réutilisables.
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique dont la durée optimale est de 7 jours, pouvant être diminuer à 4 jours si les animaux ne changent pas de d’environnement entre les études. Les animaux font l’objet d’un soin de qualité avec respect de leur bien-être. Les chats et les chiens ont à disposition des méthodes d’enrichissement afin de stimuler l’exercice physique et leurs activités cognitives (accès à des espaces extérieures, plateforme, jeux, dispositifs en hauteur pour les chats). Un training est réalisé en renforcement positif (friandises, caresses), afin de limiter le stress lié aux actes techniques (contention, administrations, prélèvements) et aux conditions d’études (hébergement individuel inférieur à 4h, alimentation…). La durée de ce travail est indéterminée, il sera réalisé jusqu’à ce que les animaux ne montrent plus de signes de stress contre-indiquant leur entrée dans la procédure (le cas échéant). Chez le chat, une habituation au sac de contention pourra être réalisé en amont, afin de les familiariser avec ce type de contention et pouvoir l’utiliser lors des prélèvements sanguins et/ou de l'administration. Pour réduire l’inconfort provoqué par l’administration et/ou les prélèvements, les opérateurs qualifiés réalisent une contention adaptée de l’animal (le sac de contention peut être utilisé chez le chat à condition qu’un training ait été réalisé en amont) et une analgésie et/ou un changement du site peuvent être mis en place. Les animaux sont observés quotidiennement, ou plus si jugé nécessaire, ce qui permet de détecter tout signe comportemental anormal (spontané ou provoqué) et/ou toute anomalie physique non attendue. En cas de déviation de l'état normal d'un animal, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte (en accord avec le vétérinaire désigné), décidera d'augmenter les fréquences d'observations, d'isoler l'animal et/ou d'envisager un traitement pour soulager l'animal.
Choix des espèces
Il s’agit des espèces cibles pour les composés évalués. Les chats et chiens utilisés ont plus de 6 mois. Dans le cas des études précoces sur un nombre réduit d’animaux, des animaux adults sont sélectionnés.
Formation en échographie abdominale du rongeur
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 40
Jusqu'à huit anesthésies gazeuses d'une heure et demie par animal, des injections de cellules tumorales et une chirurgie : 920 souris et 40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 580 d'entre eux et modéré pour 50, les 330 restants étant tués sans réveil. Rien de tout cela ne produit de connaissance, il s'agit d'apprendre à des personnels de recherche à manier l'échographe. Le porteur présente l'imagerie comme un moyen de réduire à terme le nombre d'animaux utilisés, et indique récupérer en priorité des souris d'élevage "de réforme" qui auraient été tuées de toute façon. La chirurgie infligée n'est décrite nulle part, ni sa nature ni son objet, et le résumé ne dit pas davantage ce qui est injecté lors des cinq injections annoncées.
Objectifs
L’imagerie est une méthode non douloureuse qui permet de détecter et caractériser les pahtologies. Elle permet de réduire le nombre d’animaux utilisés pour la recherche car elle permet un suivi non invasif de chaque animal en évitant les mises à mort à différents temps. C’est également une méthode qui parfois peut remplacer des méthodes invasives et douloureuses. L’échographie est une méthode d’imagerie in vivo non invasive et non irradiante qui nécessite une formation pratique pour pouvoir réaliser des acquisition et interpréter les images. Ce projet vise à former les personnels de recherche à l’utilisation de l’échographie du petit animal de manière autonome. Ceci permet d’augmenter le nombre de personnes capables de réaliser ces examens non-invasifs et de réduire à teme le nombre d'animaux utilisés dans les projets de recherche et de réduire la douleur pour certains actes.
Bénéfices attendus
Les personnes qui suivent cette formation sauront utiliser en pratique des échographes pour les projets de recherche utilisant les souris et les rats et les utiliser au mieux. A l'issue de la formation, elles auront appris à réaliser les gestes, prêter attention aux conditions expérimentales et exploiter au maximum les images acquises pour leurs projets de recherche. Ceci permet de contribuer à Réduire le nombre d’animaux grâce à l’imagerie dans les futurs projets et à améliorer les conditions d’expérimentation en évitant certains gestes invasifs grace à l'échographie.
Procédures
- les animaux pourront subir jusqu'à 8 anesthésie gazeuse d'une heure et demie. réparties sur 4 sessions. - pour la procédure 2, elles pourront subir en outre jusqu'à 5 injections de moins de 30 secondes, réparties sur 2 à 3 sessions. - pour la procédure 3, elles, pourront subir jusqu'à 3 injections de moins de 30 secondes et une chirurgie de moins de 40 minutes. 1 fois.
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront un stress léger de 10 minutes lié aux anesthésies gazeuses. Les animaux subiront un stress léger de 2 minutes lié à l’injection d’agent d’imagerie ou de médicament. Certains animaux subiront une douleur légère et de 2 minutes liée l’injection de cellules tumorales. Enfin des animaux subiront une douleur modérée de 30 minutes durant la chirurgie prévue.
Devenir
les animaux utilisés ne pourront pas être réhabilités et seront mis à mort.
Remplacement
La compréhension des images et l’explication du positionnement des objets dans l’image se fera d’abord sur des objets placés dans du gel échographique, avant de passer à l’animal. Il n’existe pas de fantôme de souris pour l’échographie, reproduisant les contrastes les textures, les mouvements (respiratoires et cardiaques) ou les flux permettant de se passer des animaux.
Réduction
Nous utilisons autant que possible les mêmes animaux plusieurs fois lors d'une session de formation Nous utiliserons autant que possible, des souris se portant bien mais qui auraient dû être mises à mort car issues d'élevage et non utilisées ou arrivées en fin de projet (souris témoins par exemple). Des souris seront commandées chez l'éleveur que s'il n'y a pas du tout ou pas suffisamment de souris de réforme.
Raffinement
Les échographies seront réalisées sous anesthésie gazeuse, les animaux placés sur une platine chauffante. Un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux des souris pendant l'anesthésie pour éviter toute lésion liée à un potentiel dessèchement de la cornée. La fréquence cardiaque et respiratoire et la température corporelle seront mesurées en permanence sur l’échographe. Un réchauffage additionnel est prévu par lampe infrarouge en cas de besoin. A la fin de l’examen, les animaux sont replacés dans leur cage d’origine elle-même placée sur un tapis chauffant. Pour les procédures douloureuses une analgésie adaptée sera employée. Une grille de score adaptée est utilisée et une analgésie est prévue en cas de douleurs modérées non-persistantes. En cas de douleurs persistantes l’animal sera mis à mort. Les animaux seront hébergés en groupe sociaux et disposeront d’un enrichissement adapté.
Choix des espèces
Cette formation est destinée aux personnes réalisant des examens sur les petits animaux, les deux modèles les plus répandus en échographie pré-clinique sont la souris et le Rat. Nous utiliserons des souris adultes de plus de 8 semaines, représentatives de l’anatomie des souris adultes observées en échographie Nous étudierons également des souris gestantes pour à des stades compris précoces (auxquels les embryons sont détectables sans ambiguïté) et tardifs (auxquels l’imagerie et la micro-injection guidées restent possibles). Nous utiliserons des Rats Adultes (12 semaines)