Procédures légères

4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 3 840 d'entre elles en modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes dans le muscle pendant quatre jours, jusqu'à dix prélèvements de sang à la queue, un régime enrichi en graisses pendant quatre semaines, deux heures de course sur tapis roulant et cinq jours d'hébergement individuel. Le porteur décrit des micro-lésions musculaires et un inconfort modéré pendant quelques jours après l'exercice, et annonce des dispositifs assurant le "confort" des animaux, mot qu'il place lui-même entre guillemets. Sur le remplacement, il indique avoir exploré des cultures de cellules musculaires et des analyses informatiques, et conclut que l'animal reste "nécessaire" pour comprendre la régénération du muscle.

Objectifs

L'activité physique est reconnue pour ses effets bénéfiques sur la santé et son rôle dans la prévention de certaines maladies. Avec l'âge, la perte de force et de masse musculaire peut réduire l'autonomie des individus. Le maintien d'un bon fonctionnement musculaire, notamment grâce à l'exercice, contribue à préserver la mobilité et l'indépendance des personnes âgées. Dans nos travaux, nous avons étudié des substances produites par les muscles lors de l'exercice, qui pourraient jouer un rôle dans la régénération musculaire. Deux d’entre elles semblent particulièrement impliquées dans ce processus et pourraient avoir un effet bénéfique sur la récupération musculaire après un effort ou une blessure. Afin de mieux comprendre son rôle, nous avons développé des animaux transgéniques, permettant d'observer son action dans un organisme vivant. L'objectif de ce projet est d'explorer comment ces mécanismes pourraient être utilisés pour améliorer la santé musculaire, en particulier chez les personnes âgées ou celles souffrant de maladies affectant les muscles. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, en fonction du matériel qui est à disposition dans les établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les muscles se réparent après un effort ou une blessure. Il s'intéresse particulièrement à certaines substances produites par l'organisme qui pourraient jouer un rôle clé dans ce processus. Pour cela, des études sont menées sur des animaux transgéniques afin d'observer leur impact sur la récupération musculaire. En intégrant des facteurs comme l'âge et le sexe, cette recherche permettra d'affiner les approches existantes pour étudier la régénération musculaire, avec une meilleure prise en compte des situations rencontrées dans la réalité. À terme, ces travaux pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour préserver la force musculaire et lutter contre les effets du vieillissement sur les muscles. Ils pourraient aussi avoir des applications pour certaines maladies qui altèrent la masse et la fonction musculaire.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, différents types d'interventions pourront être soumis aux animaux en fonction de la procédure à laquelle ils sont ratachés. Voici les différents types d'interventions : un hébergement individuel pendant cinq jours ; des injections uniques ou quotidiennes sur une durée de quatres jours, n’excédant pas 10s par injections ; 10 prélèvements sanguins sur animal vigile à l’extremité de la queue n’excédant pas deux min ; une alimentation enrichie en lipides durant maximum 4 semaines consécutives ; un seul exercice sur tapis de course d’une durée de 2h maximum ;placées une fois dans un système d’imagerie optique pendants 5mins ; placées une fois dans un appareil de mesure par résonance magnétique nucléaire pendants 2mins.

Impact sur les animaux

Certaines étapes de ce projet peuvent entraîner un inconfort temporaire pour les animaux : L’hébergement individuel peut causer un stress aux animaux. Les injections nécessaires pour l’étude peuvent provoquer une douleur locale et une inflammation passagère au niveau du muscle durant un à deux jours. De même, l’administration des molécules étudiées peut entraîner un inconfort léger et temporaire (légère inflammation dû à l'injection dans le muscle). Les exercices physiques réalisés sur tapis roulant peuvent entraîner des micros lésions musculaires, associées à un inconfort modéré pendant quelques jours. Les tests fonctionnels, comme la course ou l’évaluation de la force musculaire, peuvent également induire un stress temporaire, mais ils restent non invasifs. Un régime alimentaire particulier, plus riche en graisses, est utilisé dans certaines expériences. Bien qu’il puisse entraîner une prise de poids, celle-ci reste contrôlée pour ne pas affecter la mobilité des animaux. Enfin, certains tests nécessitent des prélèvements sanguins ou des mesures comporelles. Les prises de sang, réalisées peuvent générer un stress modéré. Les mesures de composition corporelle demandent un bref placement des souris dans un dispositif de contention, provoquant un stress léger qui ne dure que quelques minutes.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récolter des tissus d'intérêts.

Remplacement

Avant de recourir à des modèles animaux, différentes approches ont été explorées pour étudier la régénération musculaire. Des expériences en laboratoire sur des cellules musculaires ont permis d’analyser certains mécanismes impliqués dans ce processus. De plus, des analyses informatiques ont aidé à identifier des molécules potentiellement impliquées dans la réparation des muscles. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions qui se produisent dans un organisme vivant. C'est pourquoi l'utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour mieux comprendre comment les muscles se régénèrent et comment certaines substances pourraient aider à améliorer ce processus. Tout au long du projet, le recours aux animaux est strictement encadré et limité au minimum nécessaire. Leur bien-être est une priorité, et toutes les mesures sont prises pour réduire leur inconfort.

Réduction

Ce projet a été conçu pour utiliser le moins d'animaux possible, tout en garantissant des résultats fiables. Le nombre d'animaux a été déterminé sur la base d'études précédentes et de tests préliminaires, afin de s'assurer que chaque expérience apporte des informations précises tout en limitant leur recours. Pour réduire encore davantage le nombre d’animaux nécessaires, des analyses informatiques ont été réalisées en amont afin de mieux cibler les molécules d’intérêt. De plus, si certains résultats sont obtenus plus rapidement que prévu, les tests seront ajustés afin d’éviter toute utilisation inutile d’animaux. Tout au long du projet, une attention particulière est portée à l’optimisation des protocoles afin de concilier progrès scientifique et respect du bien-être animal.

Raffinement

Le bien-être des animaux est une priorité dans ce projet. Ils seront surveillés chaque jour par des professionnels afin de détecter rapidement tout signe d'inconfort. Leur poids, un des reflets de la bonne santé de l’animal, sera contrôlé chaque semaine . Les souris seront hébergées en petits groupes dans des cages adaptées, avec du matériel leur permettant d’exprimer leur comportement naturel (papier, bâtonnets de bois, abris). Elles ne seront pas isolées, sauf si cela est strictement nécessaire pour certaines expériences, et elles resteront toujours en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Dans le cadre de transport, les animaux sont transportés selon une charte de transport définie par la zootechnie de départ et garantissant le bien-être des animaux. Ils sont transportés dans leur cage d'origine avec leurs congénères pour éviter tout stress supplémentaire pendant le transport. Les interventions prévues dans ce projet ont été soigneusement étudiées pour limiter leur impact. La majorité des injections sera réalisée sous anesthésie et avec des dispositifs permettant d'assurer le « confort » des animaux. De même, les exercices physiques seront adaptés aux capacités des animaux afin d'éviter toute contrainte excessive. Les animaux hébergés individuellement recevront le maximum d’enrichissement comme il est le cas dans leur cage d’origine, ici la roue d’activité est également considéré comme un enrichissement en plus pour les animaux. De plus, des grilles de scoring ont été faites pour chaque procédure afin d'établir des points limites important au bien être des animaux.

Choix des espèces

Ce projet utilise la Souris comme modèle d’étude, car il s’agit de l’animal le plus couramment étudié en recherche biomédicale. Son organisme présente des similitudes avec celui de l’être humain, ce qui permet d’obtenir des résultats pertinents pour mieux comprendre certains mécanismes biologiques. Pour que ces recherches soient encore plus représentatives, différents paramètres sont pris en compte, comme l’âge (3mois et 24mois), le sexe (mâle et femelle) et l’alimentation des animaux. De plus, certaines souris utilisées dans ce projet ont été modifiées génétiquement afin d’étudier plus précisément le rôle de certains gènes impliqués dans la régénération musculaire.

Jusqu'à 365 administrations de composés et 52 prélèvements de sang sur animal vigile, pour un même individu : 1 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Il s'agit de suivre le devenir de candidats médicaments dans le corps de souris saines, étape que les autorités de santé réclament avant tout essai chez l'être humain. Le porteur ramène les nuisances à un stress mineur, de petits hématomes au point de piqûre et une douleur légère de quelques secondes. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour des analyses immunologiques et histologiques.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier le devenir des agents pharmacologiques in vivo chez la souris saine qui est une étape essentielle dans le développement d’un candidat médicament afin d'étudier sa bio-distribution et biodisponibilité dans un organisme vivant. En effet pour développer un composé, il est indispensable d’étudier sa pharmacocinétique et de vérifier l’absence de toxicité sur un modèle animal . Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Cette caractérisation des paramètres pharmacocinétiques permet par la suite de déterminer entre autres les voies d’administration et la posologie.

Bénéfices attendus

Les études de pharmacocinétique (PK) chez l'animal sont nécessaires et demandées par les autorités de santé afin de pouvoir réaliser des études cliniques avec un maximum de sécurité. Elles permettent de déterminer les doses, la fréquence des administrations et de calculer la marge de sécurité. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l’animal afin de pouvoir passer ultérieurement aux essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

Prélèvements de sang : maximum 52 prélèvements (30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/souris). Administrations de composés : maximum 365 administrations, durée : 30 secondes/injection.

Impact sur les animaux

Les contentions des animaux vigiles pour administrer les molécules thérapeutiques peuvent engendrer un stress mineur à l’animal. L’administration de molécules par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des molécules entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés (au maximum 3 micro-prélèvement en 24h ) ce qui peut générer du stress et de l’inconfort se traduisant par une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Aucun problème de toxicité n’a été relevé sur les composés testés lors du précédent projet.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.

Remplacement

Nous proposons dans ce projet d’étudier in vivo la bio-distribution et biodisponibilité des molécules thérapeutiques ainsi que vérifier l’innocuité de nouvelles thérapies chez la souris. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale (culture cellulaire, modélisation informatique) ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament. Ces tests sont nécessaires avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle substitutif n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la pharmacocinétique de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses immunitaires.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement (pour les études de plus de 24h) pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. Si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajoutés dans les cages et le vétérinaire en sera informé. Certains types de traitements seront effectués sous anesthésie gazeuse. Un suivi et scoring quotidien seront effectués. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Pour les projets longs, au cours des précédents projets nous avons varié les enrichissements au cours de l’étude (tunnel, dômes, frisures de carton, cylindre de coton, morceau de bois à ronger) afin d’améliorer le bien-être des animaux (curiosité, diminuer l'ennui). Nous allons continuer de procéder ainsi dans ce projet.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Nos modèles d'études ont été développé sur des fonds génétique de souris dont les génomes possèdent 99% de similitude avec le génome humain, et ne présentent aucun gène manquant ou supplémentaire pouvant modifier l’intensité de la réponse immunitaire attendu. - La souris est un animal pour lesquel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. - Ces souris sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).

Une artère cérébrale leur est bouchée définitivement sous anesthésie pour provoquer un accident vasculaire, puis un antiagrégant plaquettaire est ajouté à leur eau de boisson jusqu'à la mise à mort : 810 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Il s'agit de savoir si les plaquettes participent à la réparation du cerveau après un AVC, et si les médicaments qui bloquent leur activation gênent la récupération des patients qui en prennent. Le porteur revendique une mortalité "extrêmement faible" dans ce modèle et annonce des points limites stricts. Il mentionne des tests comportementaux générateurs de stress et d'anxiété, ainsi qu'une évaluation neurologique de cinq minutes, sans préciser lesquels ni ce qu'elle mesure.

Objectifs

En France, l’accident vasculaire cérébral (AVC) reste une cause majeure de handicap, de troubles cognitifs et de mortalité. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament ou d’un dipositif permettant de dissoudre le caillot de sang responsable de l’accident vasculaire cérébral. Seule une minorité de patients ont accès à ces traitements en raison de la fenêtre thérapeutique étroite, du nombre limité de centres spécialisés et des contre-indications. Aucun traitement ne prévient les troubles cognitifs post- accident vasculaire cérébral, qui touche 25% des patients. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements qui permettraient de traiter un plus grand nombre de patients d’une part et de prévenir les troubles de la mémoire qui se développent au décours de l’AVC d’autre part. Certains patients non traités peuvent s’améliorer spontanément suggérant ainsi l’existence d’une plasticité cérébrale c’est-à-dire d’une autoréparation. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques. Au-delà de leur rôle dans la formation du caillot sanguin, les plaquettes sont de plus en plus reconnues comme des modulateurs de processus physiopathologiques importants, tels l'inflammation et la régénération tissulaire. Cependant, leur contribution à la réparation dans l’accident vasculaire cérébral n’a été que très peu étudiée et uniquement à la phase précoce. Cette question est d’autant plus cruciale que de nombreux patients sont traités par des médicaments qui empêchent la formation de nouveaux caillots en empêchant l’activation des plaquettes pour prévenir la survenue d’un second accident vasculaire cérébral. Or, il semble qu’il y ait un plus grand nombre de troubles cognitifs chez les patients traités par antiagrégants plaquettaires. L’objectif de ce projet sera de déterminer la contribution des plaquettes et des médicaments qui empêchent leur activation dans la réparation neurovasculaire post – accident vasculaire cérébral à long terme. Le projet se deroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2)

Bénéfices attendus

L’hypothèse de ce projet est que les plaquettes contribuent à la réparation cérébrale après un accident vasculaire cérébral et qu'un traitement anti-coagulant, administré à la phase tardive pourrait avoir un impact négatif ou positif selon la cible pharmacologique sur cette récupération post-ischémie cérébrale. Au-delà des seuls domaines de la biologie plaquettaire et de la physiopathologie de l'accident vasculaire cérébral, cette approche originale fournira la base fondamentale pour les futures études précliniques sur la réparation post-ischémie cérébrale. De plus, les résultats pourraient avoir des implications cliniques importantes car la thérapie anti-plaquettaire est utilisée pour la prévention secondaire de l'accident vasculaire cérébral, avec pour seul objectif d’empêcher la formation d’un nouveau caillot mais sans aucune connaissance sur la réparation à plus long terme.

Procédures

Dans cette étude, un modèle murin d’accident vasculaire cérébral induit par une occlusion permanente procédure réalisée systématiquement sous anesthésie et analgésie sera utilisé. L’intervention chirurgicale dure environ 10 minutes. Chaque animal recevra deux injections (analgésie) ainsi que deux prélèvements sanguins (réalisé à J3 et le jour de la mise à mort). L’injection dure en moyenne 10 secondes, tandis que le prélèvement sanguin ne dépasse pas 2 minutes. Toutes les souris feront l’objet d’une évaluation neurologique qui dure environ 5 minutes. Ce modèle sera combiné à une administration dans l’eau de boisson d’un des traitements anti-plaquettaire dès l’induction de l’accident vasculaire cérébral jusqu’au jour de la mise à mort. L'intervention chirurgicale, l'évaluation neurologique, l'administration des traitements ainsi que les prélèvement sanguins seront réalisés dans l'EU1. L'enregistrement électrophysiologique sera réalisé dans l'EU2.

Impact sur les animaux

- Les injections d'anesthésiques et d'analgésiques causent un stress et une douleur modérée de courte durée les prélèvements sanguins causent un stress et une douleur modérée de courte durée. - L’induction de l'ischémie cérébrale provoque aussi une douleur modérée chez l’animal de courte durée lors de l’incision de la peau. - La prise des traitements anti-agrégants peut induire un risque de saignement. - Les tests comportementaux induisent un stress et de l’anxiété modéré et de courte durée.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques.

Remplacement

Le modèle in vitro ne permet de rendre compte de la complexité des évènements qui se mettent en place à long terme dans le cerveau (plasticité cérébrale) après l’ischémie cérébrale. L’utilisation de souris déficientes en plaquettes ou de ses différents récepteurs permettra d’étudier leurs rôles respectifs dans le remodelage neurovasculaire post-ischémie cérébrale à long terme. Les modèles murins d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'accident vasculaire ischémique chez l'homme.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude statistique a été réalisée au préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Les groupes ont été conçus de manière optimisée, basée sur des études antérieures, garantissant ainsi l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. De plus, le modèle d’accident vasculaire cérébral utilisé est bien maîtrisé par l’équipe, avec une mortalité extrêment faible ce qui permet de mener les recherches de façon rigoureuse et éthique. Pour analyser les résultats, des méthodes statistiques adaptées seront appliquées, garantissant une interprétation fiable des données tout en respectant l’engagement à réduire l’usage des animaux.

Raffinement

Le bien-être des animaux est une priorité dans l’étude. Leur suivi sera assuré par une équipe qualifiée : un soigneur spécialisé s’occupera d’eux chaque jour, et un chercheur expérimenté effectuera un contrôle approfondi deux fois par semaine. Les souris seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, équipées de materiel pour leur permettre de construire des nids et d’améliorer leur confort. Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé attentivement grâce à une grille de scores définie, prenant en compte des points limites stricts et adaptés au projet. Cette méthode permettra de détecter rapidement toute souffrance et d’y remédier. En cas de douleur, un traitement adapté sera administré, et si nécessaire, une mise à mort sera réalisée selon les réglementations en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature et notre laboratoire. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 12 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés et dans une perspective translationnelle, l’accident vasculaire cérébral survient à l’âge adulte.

Les souris dont l'état ne peut plus être rétabli pourront être tuées avant terme, sur la base d'une grille de mesure de l'inconfort. 430 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées au plus tard huit mois après la greffe. Une partie de leurs propres cellules de foie est détruite par injection, une fois ou une fois par semaine pendant neuf semaines, puis des hépatocytes humains leur sont greffés sous la membrane du rein ou dans la rate, avant des prélèvements sanguins répétés pendant huit mois. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est décrite pour cette destruction partielle du foie, et présente le projet comme un moyen de diminuer à terme le nombre d'animaux utilisés dans les tests de toxicité.

Objectifs

Les atteintes du foie ou atteintes hépatiques sont une des raisons principales du retrait de médicaments du marché et de l’échec de nouvelles molécules en développement au cours des essais cliniques. Les études pré-cliniques de toxicité hépatique et de pharmacocinétique sont des éléments essentiels pour réduire ces retraits et échecs et les conséquences médicales graves parfois observées chez les patients ainsi que pour accélérer le développement de nouveaux médicaments. Le foie est principalement constitué de cellules appelées hépatocytes dont l’une des fonctions est la biotransformation et la détoxification des médicaments et toxines. Ainsi, la culture de cellules de foie humain constitue le modèle de référence pour prédire le métabolisme et la toxicité hépatique des médicaments en développement. Cependant, leur accès est limité et ils présentent l’inconvénient majeur d’une grande variabilité entre donneurs. Ainsi, les laboratoires se tournent vers des modèles animaux ou de lignées cellulaires modifiées éloignés de la physiologie humaine. L’objectif général du projet est de développer des lignées d’hépatocytes humains hautement fonctionnels à la manière de ce que nous avons précédemment réalisé avec des cellules du pancréas actuellement considérées comme un modèle in vitro de référence des cellules sécrétrices d'insuline humaines. Afin de parvenir à cet objectif, le projet nécessite tout d’abord de mettre au point un protocole de greffe d’hépatocytes humains dans la souris. En effet l’amplification et la sélection initiale des cellules dans l’animal a été un élément décisif de la génération des lignées de cellules béta humaines fonctionnelles. Puis dans un second temps le projet consistera à générer plusieurs lignées d’hépatocytes à partir de tissus issus de patients qui seront ensuite caractérisées in vitro afin de sélectionner les lignées d’hépatocytes fonctionnels adaptées aux études pré-cliniques.

Bénéfices attendus

Le développement d’hépatocytes, les cellules actives du foie, humains et fonctionnels, aurait des conséquences directes positives sur la santé humaine tout en diminuant l’utilisation de modèles animaux. Des hépatocytes humains, représentatifs des différences de métabolisme et de toxicité des médicaments entre individus, permettraient la caractérisation fiable et précoce des nouveaux médicaments en développement, réduisant les échecs et accélérant le développement de nouvelles thérapies. De plus cette caractérisation du métabolisme et de la toxicité des molécules en développement faite sur des cellules humaines, permettrait de rendre les médicaments plus sûrs en amont des essais cliniques, augmenterait la sécurité des médicaments mis sur le marché et diminuerait les risques de toxicité chez les patients. Enfin, l’accès à de tels hépatocytes humains prédictifs diminuerait l’utilisation d’animaux dans les études de métabolisme et de toxicité. En effet, alors même que les modèles animaux utilisés en recherche pharmaceutique sont seulement partiellement prédictifs, ils sont utilisés du fait de l’absence d’une alternative. La validation de la capacité de prédiction de la toxicité et du métabolisme des cellules que nous allons générer, qui est prévue comme un objectif principal du projet, aurait pour conséquence immédiate une diminution de l’utilisation d’animaux. Finalement, ces cellules humaines fonctionnelles accélèreraient la recherche sur la physiologie des cellules du foie et sur les mécanismes des maladies du foie. Elles faciliteraient ainsi grâce à leur reproductibilité et au fait que ce soit un modèle humain, l’identification de cibles thérapeutiques.

Procédures

Un groupe de 60 animaux maximum subira une élimination partielle de leurs hépatocytes nécessitant 1 injection (30 animaux) ou 1 injection par semaine pendant 9 semaines (30 animaux), réalisées à l’état vigile. Puis ces animaux subiront des prélèvements sanguins au rythme de 1 prélèvement par semaine pendant 2 semaines puis 2 prélèvements par mois pendant un maximum de 3 mois. Ces prélèvements seront réalisés à l'état vigile. La durée individuelle de ces actes d’injection et de prélèvement est de 30 secondes. Un second groupe de 370 animaux maximum subira l'élimination partielle de leurs hépatocytes nécessitant, selon les résultats des groupes pilotes, 1 injection ou 1 injection par semaine pendant 9 semaines, réalisées à l’état vigile. Les animaux subiront ensuite la greffe d’hépatocytes humains. Cette procédure de chirurgie sera effectuée sous anesthésie et dure environ 15 minutes. Puis les animaux subiront 3 injections d’analgésique post-chirurgie (30 secondes par acte). Ces injections seront réalisées à l'état vigile. Enfin, les animaux subiront des prélèvements sanguins. Le nombre de prélèvements sera de 1 prélèvement par semaine pendant 4 semaines puis 2 prélèvements par mois pendant un maximum de 8 mois. Ces prélèvements seront réalisés à l'état vigile. La durée individuelle de ces actes d’injection et de prélèvement est de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Lors de ce projet, les souris seront soumises à une élimination partielle de leurs hépatocytes, induite chimiquement, puis à une chirurgie pour greffe d’hépatocytes humains sous la membrane qui entoure un de leur rein ou par injection dans la rate et enfin à des prélèvements sanguins et échographies afin de mesurer la multiplication des hépatocytes humains. Plusieurs nuisances liées à la procédure de greffe des hépatocytes pourraient être subies par les animaux. Il s’agit de douleur et de stress liés à la chirurgie et de gêne et/ou douleur occasionnée par la plaie. Il pourrait s’agir également d’une hypothermie liée à l’anesthésie ou d’une infection suite à la chirurgie. Par ailleurs les animaux pourraient subir une gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections. Enfin les animaux pourraient subir une gêne et du stress lors des prélèvements de sang pour le suivi des cellules implantées. Enfin, il n’y a pas de nuisances décrites induites par l'élimination partielle des hépatocytes. Il n’y a pas non plus de nuisances attendues en conséquence de la multiplication des hépatocytes humains greffés étant donné que la taille du greffon restera très modeste d’après notre expérience sur les précédents types cellulaires générés.

Devenir

Les animaux utilisés pour les études pilotes de déplétion des hépatocytes endogènes seront euthanasiés au maximum 3 mois après la procédure afin de confirmer la déplétion des hépatocytes. Ils ne pourront pas être ré-utilisés pour les expériences de greffe d’hépatocytes humains car ces greffes doivent être effectuées quelques jours après l’induction de la déplétion. Les animaux utilisés pour la greffe d’hépatocytes humains seront euthanasiés au plus tard 8 mois après la greffe, ce qui est le temps nécessaire pour permettre la croissance d’une lignée d’hépatocytes.

Remplacement

Les travaux prévus dans ce projet ne peuvent pas être transposées dans des modèles in vitro par exemple en culture cellulaire. En effet, notre expérience de génération de précédentes cellules humaines fonctionnelles montre qu’une étape essentielle est la greffe des cellules humaines dans l’animal pour une multiplication sélective de cellules qui conservent leur fonction. Ainsi, lors du développement du modèle de cellules sécrétrices d'insuline, aucune stratégie in vitro n’a permis la sélection de cellules qui maintenaient leur fonction. De plus plusieurs travaux décrivant l’immortalisation in vitro de cellules du foie humain ont été publiés par d’autres équipes, mais aucune de ces lignées de cellules n’a abouti à des cellules avec des caractéristiques fonctionnelles proches des cellules du foie, principalement en ce qui concerne leur capacité à détoxifier les toxines, ce qui empêche leur utilisation dans les études de toxicologie et de pharmacologie. Pour ces raisons, la greffe initiale des hépatocytes humains à des souris apparait indispensable pour pouvoir assurer l’obtention de cellules similaires aux cellules présentes dans le foie.

Réduction

Le principe de réduction du nombre d’animaux est appliqué dans ce projet en premier lieu via l’estimation précise du nombre d’animaux permettant de garantir l’interprétabilité des résultats. Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé par une approche statistique. Une analyse précise des protocoles publiés a également été réalisée afin de sélectionner les conditions expérimentales favorables et ainsi réduire le nombre de conditions expérimentales à comparer ainsi que le risque d’échecs et par conséquence le nombre d’animaux qui seront utilisés. Par ailleurs, le projet est construit en incluant des étapes pilotes afin d’éliminer toute utilisation inutile d’animaux. Nous procéderons ainsi lors de l’étape 1 à la comparaison de 2 modèles d'élimination partielle des hépatocytes du foie de l'animal. Seul le modèle permettant l'élimination partielle la plus reproductible sera conservé pour les étapes suivantes. Lors de la seconde étape, deux protocoles de greffe des hépatocytes seront comparés. Seul le modèle permettant la greffe reproductible sera conservé pour la troisième étape de génération des cellules à partir de foie humain. De plus, nous veillons très attentivement à ce que toutes les personnes impliquées dans le projet, que ce soit la partie animale mais aussi les parties cellulaire et biochimique de préparation des cellules et d’analyse, soient parfaitement formées aux procédures employées, ceci de façon à réduire au maximum le risque d’échecs, mais aussi de nuisance pour les animaux en ce qui concerne le travail in vivo, et ainsi le nombre d’animaux qui seront utilisés. Enfin, nous procéderons dans toutes nos étapes à une surveillance des animaux pour les nuisances possibles, de façon à les minimiser et ainsi garantir une plus reproductibilité optimale de nos résultats et conséquemment une diminution du nombre de répétitions des expériences et ainsi du nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

La démarche de raffinement de ce projet implique notamment un personnel précisément formé aux procédures afin de limiter les nuisances ou la survenue de complications, ainsi que la surveillance des nuisances possibles à toutes les étapes afin de minimiser les effets néfastes et la souffrance. Un système de mesure objective du niveau d'inconfort, de stress ou de souffrance des animaux est mis en place pour évaluer le bien-être et prendre des actions au plus tôt. Par ailleurs, différentes actions de raffinement seront également menées. Afin de réduire le stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation avant de les manipuler. Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets pour enrichir leur environnement. Lors de la chirurgie, avant la procédure, les animaux recevront un traitement analgésique, puis une anesthésie générale. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera utilisé et l’animal couvert. Dans la phase de réveil, celui-ci sera placé dans une cage séparée dans un environnement également chauffé par un tapis. Sa température corporelle, son hydratation et l'absence de douleur seront suivies. Et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, un traitement analgésique sera administré en préventif pendant 3 jours. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées autour de 10 jours après la chirurgie. Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les conditions classiques et surveillé tous les jours. L’apparition d'éventuels signes d’hypothermie, de douleur, stress, perte d’activité, déshydratation ou absence de prise de nourriture, perte de poids, infection ou ulcération de la plaie sera surveillée. Si une limite prévue par le système de mesure objective est atteinte, des actions de traitement seront prises en accord avec la structure chargée du bien-être des animaux et avec le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il n’est pas possible de rétablir ou de soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée.

Choix des espèces

Le choix d'utiliser des souris est lié à l’existence de protocoles de greffe d’hépatocytes humains chez cet animal, à la disponibilité de lignées de souris immuno-déprimées qui favorisent l’implantation des cellules humaines ainsi qu’à notre expérience passée de génération de lignées de cellules humaines hautement fonctionnelles via la greffe de cellules primaires immortalisées dans des souris. Les lignées cellulaires que nous avons précédemment générées (principalement cellules béta pancréatiques) ont depuis été adoptées par plusieurs centaines de laboratoires travaillant sur le diabète ou sur la physiologie du pancréas dans le monde. La même stratégie sera appliquée ici à l’amplification et à la maturation d’hépatocytes humains pour lesquels il n’existe pas de modèle cellulaire humain complet. La procédure expérimentale de dérivation de cellules fonctionnelles n’a été testée que sur la souris rendant nécessaire le choix de la souris pour mener le projet concernant les hépatocytes. Enfin, les souris qui seront utilisées auront entre 7 et 12 semaines au moment de l’implantation des cellules ou tissus humains transduits, ceci afin que l’animal ne soit pas trop petit et pour ainsi faciliter et garantir la réussite de la procédure de chirurgie.

Pour évaluer si un râtelier de luzerne compressée limite les morsures de queue en élevage porcin, 240 porcs à l'engrais vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Si les épisodes spontanés ne sont pas assez nombreux sept semaines après l'entrée en engraissement, le porteur appliquera lui-même des facteurs de stress, d'abord en ralentissant l'air entrant pour créer des courants d'air froids pendant sept jours au maximum, puis en privant les animaux de nourriture pendant quatorze heures. Il indique que les morsures ainsi favorisées sont susceptibles de provoquer des lésions modérées à graves, et que les porcs y restent exposés environ trois jours après le déclenchement d'un épisode. Aucun animal n'est tué dans le cadre du projet, tous rejoignant le cycle habituel de production de l'élevage, qui les mène à l'abattoir vers 115 kilos.

Objectifs

La caudophagie est un phénomène récurrent en élevage de porcs, dont l’un des facteurs de risque est un défaut d’enrichissement dans les cases. Les matériaux les plus attractifs et les plus efficaces pour prévenir ou freiner les morsures sont, par exemple, les fourrages ou la paille, distribués en quantité importante. Toutefois, des problèmes d’évacuation des lisiers rendent leur utilisation difficile en élevage sur caillebotis. La solution testée dans cette étude vise à apporter de la luzerne déshydratée, sous forme compressée dans un râtelier, afin de limiter les pertes directes à travers les caillebotis et de prévenir et/ou interrompre des épisodes de caudophagie en engraissement.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à évaluer l’efficacité de la luzerne compressée comme solution d’enrichissement comparativement à un enrichissement classique pour prévenir et interrompre les épisodes de caudophagie chez les porcs à queue entière. Elle permettra d’identifier si cet objet limite l’apparition de ce comportement anormal et favorise un retour rapide à un état stable après un épisode. Le protocole d’intervention gradué testé apporte aussi des données utiles pour la gestion pratique en élevage. Les résultats pourront guider les choix d’enrichissement pour les animaux dans les élevages conventionnels.

Procédures

Ils peuvent être exposés à un stress susceptible d’induire un comportement de caudophagie, lui-même à l’origine de plaies et de douleurs. Grâce au suivi rigoureux quotidien et au protocole d’intervention mis en place, les animaux ne sont exposés à ces comportements délétères que pour une durée d’environ trois jours après le déclenchement de l’épisode.

Impact sur les animaux

Dans le cas où le nombre de cases présentant des épisodes de caudophagie 7 semaines après l’entrée des animaux en engraissement est insuffisant, des facteurs de stress seront appliqués de manière contrôlée. Le premier facteur de stress consistera à réduire la vitesse d’entrée d’air. Cela n'affecte pas le renouvellement d’air mais ralentit l'air entrant et modifie sa vitesse et sa trajectoire dans la salle. De ce fait, il se mélange moins bien avec l'air présent qui est à la température de confort des animaux (22°C) et crée des courants d'air dans la salle. En conséquence les animaux sont exposés à un air plus froid de quelques degrés. Les porcs, sensibles à la vitesse et à la température de l’air (pilosité réduite), ressentiront un inconfort générateur de stress. C'est la diminution rapide plus que la température de l'air ainsi que l'effet courant d'air qui génère cet inconfort. Ce premier facteur de stress sera maintenu pendant un maximum de sept jours. Si, après cette période, peu de cases ont eu de la caudophagie, un stress alimentaire sera appliqué dans les cases concernées sous la forme d'une mise à jeun de 14 heures. Cela induira une frustration alimentaire, source de nuisance pour les animaux. Ces interventions visent à induire un stress suffisant pour favoriser l’apparition de comportements de caudophagie. Ces comportements sont susceptibles de provoquer des lésions modérées à graves.

Devenir

Tous les porcs seront gardés en vie à la fin des procédures. Ils intègreront le cycle habituel de production de l'élevage.

Remplacement

Le projet portant sur l’efficacité d’un moyen de prévention de l’apparition d’un comportement anormal chez le porc, aucune méthode de substitution ne permet d’éviter l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

Au maximum 30 cases, soit 240 porcs, pourront être concernées par un épisode de caudophagie. Cet effectif a été déterminé sur la base d’études similaires, afin de pouvoir tirer des conclusions sur l’efficacité des objets d’enrichissement tout en limitant le nombre d’animaux impactés.

Raffinement

Une surveillance quotidienne renforcée sera assurée par des animaliers préalablement formés à la détection des lésions caudales liées à la caudophagie. En cas d’épisode de caudophagie, une intervention est déclenchée selon la gravité des lésions observées sur les queues des porcs avec une intervention sur les animaux et des interventions sur l'environnement : - Morsures de niveau 1 (coups de dents mais pas de plaie) : Un enrichissement supplémentaire est immédiatement ajouté. Le matériel déjà présent est remplacé s’il est dégradé. Les facteurs de risque environnementaux (accès à l’eau, température, distribution de l’aliment, etc.) sont contrôlés. Si un mordeur compulsif est identifié, il est marqué pour un suivi. - Morsures de niveau 2 : queue rouge et tuméfiée ou plaies de taille réduite avec saignement. Toutes les mesures précédentes sont répétées. En complément, un protocole de soins est appliqué sur les porcs blessés de la case. - Morsures de niveau 3, le porc présente une lésion sévère (plaie importante ou perte d'une partie de la queue). Les mesures des niveaux 1 et 2 sont maintenues, et les animaux les plus touchés sont isolés en infirmerie. Si les morsures persistent avec l'application des traitements (apport d'enrichissement) le porc à l'origine des morsures sera retiré de la case.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible des traitements qui seront testés. Les animaux seront utilisés entre sur l’ensemble de la période d’engraissement, de 70 jours d’âge (environ 35 kg) au départ à l’abattage à environ 115 kg.

310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections dans l'abdomen et sous la peau tous les trois à quatre jours pendant cinq semaines, puis des prélèvements sanguins sous anesthésie tous les quinze jours pendant trois mois, le temps qu'une arthrite se développe dans leurs articulations. Le bénéfice annoncé reste un modèle murin destiné à évaluer plus tard des traitements ciblés, aucun essai clinique n'étant en vue. Sur le remplacement, le porteur décrit des tests sur cellules isolées suivis d'un passage chez l'animal, et présente la souris comme le modèle approprié pour observer la coopération cellulaire dans un "organisme entier".

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune caractérisée par une inflammation au niveau des articulations aboutissant à la déformation des articulations et, à terme, une perte de qualité de vie des patients. Certaines personnes sont plus à risque de développer cette maladie, notamment celles qui possèdent un certain type d’anticorps. Ces anticorps apparaissent parfois avant les premiers symptômes et sont liés aux formes les plus sévères de la maladie. Les traitements actuels sont basés sur l’immunosuppression : ils freinent l’ensemble du système immunitaire pour limiter l’inflammation. Mais cela peut aussi affaiblir les défenses naturelles du corps, augmentant le risque d’infections graves. Notre équipe développe une nouvelle approche : cibler uniquement les cellules immunitaires responsables de la production de ces anticorps particuliers, sans toucher aux autres cellules immunitaires. Pour cela, il est essentiel de tester ces thérapies sur des modèles expérimentaux fiables. Notre projet consiste à développer un nouveau modèle murin reproduisant les caractéristiques de la PR, notamment la présence de ces anticorps. Ce modèle unique nous permettra ensuite de tester avec une plus grande fiabilité des traitements innovants qui ciblent uniquement les cellules malades, pour une approche plus précise, plus efficace et avec moins d’effets indésirables.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mettre en place un nouveau modèle murin d’arthrite, reproduisant la pathologie humaine, avec la présence des anticorps spécifiques à cette maladie. Ce modèle unique permettra d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cellules pathogènes spécifiquement pour limiter les effets secondaires des traitement actuels.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs injections intra-péritonéales (

Impact sur les animaux

Douleur légère due aux injections intrapéritonéales et sous-cutanées. Douleur modérée due au développement de l’arthrite ou à une réaction immunitaire exacerbée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures pour analyser les cellules immunitaires présentes et l’impact des molécules testées sur les cellules exprimant/sécrétant les anticorps spécifiques de la pathologie.

Remplacement

Nos recherches visent à trouver de nouveaux traitements pour la polyarthrite rhumatoïde, une maladie où le système immunitaire attaque les articulations. Nous cherchons à développer des thérapies capables de cibler et détruire uniquement les cellules du système immunitaire qui fabriquent les anticorps responsables de ces attaques. D’abord, nous testons ces approches en laboratoire sur des cellules isolées (in vitro). Les plus prometteuses seront ensuite testées sur des modèles vivants (in vivo) pour vérifier leur efficacité avant d’envisager des essais sur l’humain. Pour cela, nous devons créer des modèles expérimentaux qui reproduisent le système immunitaire humain, y compris les cellules qui provoquent la maladie. Ces modèles permettront ensuite d’évaluer concrètement les nouvelles molécules thérapeutiques que nous aurons sélectionnées.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avec un logiciel adapté pour nous permettre d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Seules les molécules ayant démontré une activité in vitro seront évaluées in vivo, afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les animaux seront observés régulièrement selon de nombreux critères : paramètres comportementaux et perte de poids. Le développement de l’arthrite sera suivi 3 fois par semaine pour évaluer le bien-être animal et adopter les mesures de raffinement appropriées. Un enrichissement des cages sera réalisé en utilisant des copeaux de litière et des igloos, et de la nourriture humidifiée dans la cage.

Choix des espèces

La souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Ces modèles permettent d’évaluer l’effet des molécules développées, leur efficacité sur les pathologies mais également l’identification d’effets secondaires potentiels. Les souris doivent être utilisées à l’âge adulte pour avoir un système immunitaire mature.

768 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir une toxine bactérienne sous la peau, cinq injections quotidiennes d'un composé, une chirurgie de trente minutes pour injecter un virus dans les ventricules du cerveau et quatre heures de test de la miction, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique que le lipopolysaccharide déclenche un état de maladie avec anorexie, somnolence et évitement social, qui culmine six à dix heures après l'injection, et classe la poutre d'équilibre et le tapis roulant parmi les tests les plus stressants. 624 souris sont tuées pour prélever leur moelle épinière, 144 autres partent vers d'autres projets ou vers la reproduction. Les retombées annoncées, des biomarqueurs dans le liquide céphalo-rachidien et des stratégies protégeant la barrière de la moelle épinière, sont renvoyées au moyen et au long terme.

Objectifs

Le canal central de la moelle épinière est bordé par une barrière qui régule les échanges entre le liquide céphalo-rachidien (LCR) et le tissu nerveux environnant. Cette interface est en contact étroit avec plusieurs types de cellules spécialisées. Lors d’épisodes neuro-inflammatoires, la structure et la perméabilité de la barrière peuvent être altérées, ce qui risque de modifier la composition du LCR, de perturber la communication entre les cellules nerveuses, et d’entraîner des troubles des fonctions sensorimotrices et autonomes, par exemple le contrôle de la vessie. Les mécanismes de plasticité de cette barrière restent encore largement méconnus, en particulier dans un contexte inflammatoire. Mieux comprendre comment cette interface se remodèle et interagit avec les cellules nerveuses est essentiel pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et mieux prendre en charge les patients présentant des troubles des fonctions autonomes (par ex contrôle de la vessie) liés à une inflammation de la moelle épinière. Notre projet a pour objectif de déterminer comment une inflammation induite par une toxine bactérienne, le lipopolysaccharide (LPS) modifie la morphologie et le fonctionnement de cette barrière. Nous chercherons à déterminer quels changements cellulaires et moléculaires surviennent au niveau de cette barrière et quelles sont les conséquences sur la dynamique du LCR et la régulation des fonctions sensorimotrices et autonomes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre la plasticité de la barrière qui régule les échanges entre le liquide céphalo-rachidien (LCR) et le tissu nerveux environnant en contexte neuro-inflammatoire. À court terme, les travaux permettront de caractériser les modifications cellulaires, moléculaires et fonctionnelles (miction (action d'uriner), locomotion) induites par une inflammation aiguë, grâce une combinaison d’approches techniques. À moyen terme, les résultats permettront d’identifier de nouvelles cibles susceptibles d’être mobilisées pour restaurer ou protéger l’intégrité de la barrière. L’étude des conséquences fonctionnelles, notamment urinaires et locomotrices, apportera des éléments déterminants pour comprendre la genèse de symptômes observés dans les pathologies inflammatoires de la moelle épinière, telles que la sclérose en plaques ou les myélites. À long terme, ce projet contribuera à la mise en évidence de biomarqueurs dans le LCR permettant de suivre l’évolution et la réponse aux traitements des affections inflammatoires de la moelle épinière. Les connaissances acquises ouvriront également la voie à des stratégies thérapeutiques visant à limiter les effets délétères de l’inflammation et à favoriser la régénération tissulaire.

Procédures

# Injection-sous cutanée d’une toxine bactérienne (LPS) : moins d’une minute. # Injections sous-cutanées d’un composé pharmacologique une fois par jour pendant 5 jours : moins d’une minute. # Injection d’un virus (non pathogène) dans les ventricules du cerveau sous anesthésie : chirurgie 30 minutes ; surveillance après l'opération : 1h ; l’animal est en dehors de la zone de stabulation pendant 2 à 4h. # Prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie (acte terminal) : 15 minutes. # Injection d’un traceur dans les ventricules du cerveau sous anesthésie (acte terminal) : 15 minutes. # Test comportementaux : - Etude la miction : 4h. - Activité locomotrice spontanée : 40 minutes. - Poutre d’équilibre : 3/5 x 5 minutes. - Tapis roulant : 30 minutes.

Impact sur les animaux

1\ L’injection aigue de lipopolysaccharide est classiquement utilisée pour induire une neuro-inflammation aiguë chez les animaux. Ce traitement engendre un état de maladie transitoire dont les symptômes (anorexie, hyper ou hypothermie, inactivité, somnolence, évitement social, …) culminent à 6-10h post injection et se résolvent en 24h. 2\ Les injections sous-cutanées quotidiennes d'une substance pharmacologique pendant cinq jours consécutifs peuvent provoquer du stress et de l’inconfort en raison des manipulations répétées. 3\ Les interventions chirurgicales (injections dans les ventricules du cerveau) menées sur les animaux sont susceptibles de générer des douleurs et du stress après l'opération. La chirurgie proprement dite durera environ 30 minutes et le suivi immédiat durera au minimum 1 heure. 4\ Les tests comportementaux peuvent également induire du stress lié à la nouveauté de l’environnement et à la manipulation des animaux. Chaque test induit un stress plus ou moins important selon sa nature (par exemple, l’étude la miction ou la mesure de l’activité locomotrice spontanée sont peu stressantes alors que la poutre d’équilibre et le tapis roulant sont plus stressants). 5\ Afin de mettre au point la caractérisation génétique des animaux transgéniques utilisés dans notre projet, nous allons réaliser des biopsies de queue ce qui engendrera un stress et une douleur au niveau de la queue des animaux.

Devenir

624 souris seront mises à mort pour prélèvement de la moelle épinière et analyses. La moitié des souris (ie 144 souris) qui auront été caractérisées génétiquement sont inclues dans les 624 souris qui seront mises à mort et l'autre moitié (ie 144 souris) sera ré-utilisée dans d'autres projets ou pour de la reproduction.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier la plasticité de la zone de la moelle épinière qui est à proximité du liquide céphalo-rachidien (LCR) en contexte neuro-inflammatoire et ses conséquences sur différentes fonctions de l’organisme telles que la fonction urinaire et la fonction locomotrice. Ces phénomènes impliquent des interactions complexes entre les différents types cellulaires et la circulation du LCR qui ne peuvent être reproduites ni in vitro, ni informatiquement. De plus, la fonction urinaire et la fonction locomotrice ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants. Ce projet ne peut pas être réalisé chez l’Humain puisque nous avons besoin d’extraire les moelles épinières pour nos analyses. L’utilisation de la souris, espèce pour laquelle il existe de nombreux outils génétiques adaptés à nos objectifs, est donc indispensable.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés soit à partir de notre expérience, soit à partir d’analyses de puissance statistique afin de limiter au maximum le nombre d’animaux. Les animaux engagés dans les tests comportementaux (miction et locomotion) seront ensuite utilisés pour des analyses post-mortem maximisant ainsi les données obtenues.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages collectives (2-4 animaux par cage) et enrichies (maison, buchettes, tunnel, …). Nous leur fournirons une grande quantité de matériel de nidification quelques jours avant l’injection de la toxine bactérienne (LPS) afin qu’ils puissent avoir des zones de température différentes au sein de la cage. Après l’injection de LPS, ils auront accès à des friandises et/ou du gel nourrissant et/ou des croquettes mouillées en plus de leur nourriture habituelle. Toutes les injections (hormis les injections dans les ventricules du cerveau) se feront par voie sous-cutanée afin d’éviter la voie intrapéritonéale, plus douloureuse et moins reproductible. Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie appropriée avec analgésie systématique par du personnel expérimenté. Pour limiter le stress et l’inconfort liés aux injections sous-cutanées quotidiennes de composés pharmacologiques sur cinq jours, nous essaierons de mettre en place l’administration volontaire par micro-pipette (composé dilué dans une solution appétente). Pour les tests comportementaux, les animaux seront habitués à la pièce / cage d’expérimentation la semaine précédant les tests (3 séances de 30 min – 1h). Nous ferons attention à ce que les animaux soient toujours en présence d’odeurs familières (litière de leur cage d’origine).

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus pertinente pour notre étude car (1) ce modèle est largement maîtrisé au sein de notre équipe et au laboratoire, et (2) notre projet repose sur l’utilisation de lignées transgéniques spécifiques permettant le marquage ou la manipulation ciblée de différents types cellulaires. L’existence d’outils génétiques adaptés chez la souris permet d’atteindre nos objectifs expérimentaux avec précision tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires. Les animaux utilisés seront des souris adultes (60-90 jours) au démarrage de l’expérimentation. Le choix de ce stade de développement est guidé par la volonté de réaliser des expériences chez la souris adulte, post-pubertaire.

Hébergés seuls pendant tout le protocole, placés 48 heures en cage métabolique puis 72 heures en calorimétrie, soumis à dix prélèvements sanguins à la queue en deux heures, 170 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 120 d'entre eux et léger pour 50, tous tués pour prélèvement d'organes. Les mères subissent en plus un prélèvement de lait sous anesthésie générale aux 2e et 20e jours de lactation, et un jeûne pouvant atteindre seize heures avant certains tests. Le projet évalue si des farines de ténébrion transmettent leurs contaminants à la descendance, le porteur ayant déjà détecté quatre pesticides et six métaux lourds dans ces farines pourtant autorisées en alimentation humaine. Les tests comportementaux sont nommés, Rotarod et labyrinthe en croix surélevé, mais le calcul d'effectif ne justifie que douze ratons par groupe sans expliquer comment on arrive à 170 animaux.

Objectifs

Une nutrition optimale avant, pendant la grossesse et durant l’allaitement est essentielle pour la santé de la mère et de l’enfant. De nos jours, à l’échelle mondiale, la malnutrition maternelle constitue un défi majeur, aux répercussions importantes sur l’incidence des maladies aiguës et chroniques et des coûts économiques pour l’individu et la société. Les aliments à base de protéines animales sont les meilleures sources de micronutriments biodisponibles comme le fer et le zinc, et depuis de nombreuses années, l’élevage des bétails constitue une source majeure pour répondre aux besoins de l’homme en protéines et en micronutriments. Cependant, en raison de la croissance démographique, du coût de la production et de la raréfaction des sources naturelles, on a tiré la sonnette d’alarme sur un déficit de l’approvisionnement de protéines animales dans un futur proche. Dans les pays à faible revenu où les sources de protéines alimentaires se limitent largement aux aliments végétaux en raison du coût élevé des protéines conventionnelles, ce déficit prévu de l’approvisionnement en protéines animales pourrait accroître l’incidence de l’insécurité alimentaire. Dans le cadre des nombreuses stratégies et suggestions décrites pour surmonter cette pénurie prévue, il a été question d'encourager l’entomophagie. Les insectes comestibles constituent une source de protéines particulièrement respectueuse de l'environnement, offrant un parfait équilibre entre bénéfices nutritionnels et impact écologique. Leur élevage demande en effet moins de matières premières, d'eau et d'espace comparé aux sources de protéines traditionnelles. De plus, ils produisent moins de gaz à effet de serre. Les insectes représentent une ressource alimentaire sous-exploitée avec un potentiel significatif en tant qu'aliment innovant, offrant de nombreux avantages nutritionnels dans l’alimentation humaine.

Bénéfices attendus

La composition nutritionnelle et l’accumulation de contaminants ont été préalablement évaluées dans nos farines d’insectes ainsi que dans les régimes alimentaires formulés à partir de celles-ci. Nous souhaitons désormais aller plus loin en étudiant la biodisponibilité des nutriments notamment les minéraux, les vitamines, les acides aminés et les acides gras essentiels pendant les périodes précoces de la vie, un aspect encore jamais exploré à ce jour. Nous pensons que le statut nutritionnel en minéraux, oligo-éléments, vitamines, acides aminés, acides gras essentiels et le statut antioxydant de ces farines d’insectes sera similaire à celui des produits animaux et végétaux traditionnellement consommés et représentant l’apport protéinique dans notre alimentation. Ceci mettra en évidence un potentiel bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu’elles puissent être utilisées en alimentation humaine à base de farine d’insectes il est nécessaire de s’assurer de la sécurité sanitaire des farines d’insectes et donc d’étudier leur contamination en contaminants de l’environnement et résidus de pesticides, leur accumulation dans un organisme entier et les effets à long terme. De plus, cette étude prend en compte les types d'alimentation donnés aux insectes durant leur élevage et donc permettra de pouvoir ensuite optimiser les conditions d’élevage des insectes pour optimiser les avantages nutritionnels et limiter les impacts sanitaires. De même, dans l’idée d’assurer une sécurité sanitaire à cette consommation, cette étude sur les différents modes de production d’insectes pourra être une aide à la détermination de limites maximales résiduelles dans les insectes élevés pour la consommation humaine.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs interventions expérimentales. Ils seront placés en hébergement individuel pendant 48 heures dans des cages métaboliques pour recueillir urines et fèces, et pendant 72 heures d’acclimatation en cages classiques et 72 heures de mesure dans des cages de calorimétrie indirecte afin d’évaluer l’impact de leur alimentation sur le métabolisme. Des tests comportementaux seront également réalisés, incluant un test de motricité (Rotarod) et un test d’anxiété (labyrinthe en croix surélevé). Des prélèvements sanguins de 10 secondes seront effectués au niveau de la queue sur des animaux vigiles, avec dix prélèvements espacés sur une durée totale de 2 heures lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline. Un gavage oral de quelques secondes sera réalisé pour administrer une solution glucosée lors du test de tolérance au glucose, tandis qu’une injection intrapéritonéale d’insuline sera pratiquée pour le test de tolérance à l’insuline. Chez les mères, un prélèvement de lait maternel sera effectué sous anesthésie générale aux 2ᵉ et 20ᵉ jours de lactation, pour une durée maximale de 15 minutes par prélèvement. Enfin, une mise à jeun ne dépassant pas 16 heures consécutives sera appliquée avant certains tests et avant l’euthanasie.

Impact sur les animaux

Les interventions prévues dans ce projet peuvent entraîner des nuisances légères à modérées pour les animaux. L’hébergement individuel en cages métaboliques ou calorimétriques, bien que temporaire, peut provoquer un stress lié à l’isolement et au changement d’environnement. Les prélèvements sanguins répétés au niveau de la queue, bien que brefs, peuvent causer une gêne passagère. Le gavage oral et l’injection d’insuline, nécessaires aux tests métaboliques, peuvent également générer un stress léger et une légère douleur. Les tests comportementaux, notamment le labyrinthe en croix surélevé, peuvent induire une réaction de stress transitoire chez les animaux, en particulier lors de la première minute d’exposition. Enfin, la mise à jeun de 16 heures maximum avant certains tests ou l’euthanasie peut entraîner un inconfort temporaire.

Devenir

A l’issue du protocole expérimental, tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement des organes destinés aux analyses biochimiques.

Remplacement

L’approche comparative nous a permis d’obtenir des informations précieuses sur les tendances générales d’accumulation des contaminants en fonction de la source d’apports protéiques, mais elle ne permet pas à elle seule de prédire leur devenir in vivo, notamment en termes de bioaccumulation, de biotransformation, de transfert vers le lait maternel et d’impact sanitaire. L’étude soumise ici fait suite à une étude in vitro réalisée de notre projet. Les résultats de cette étude in vitro n’ont pas encore été publiés. Ils démontrent une faible toxicité en test de viabilité cellulaire pour une exposition à certaine fraction d’insectes. Ainsi, même si ces farines sont autorisées en alimentation humaine, il est important d’étudier les effets d’accumulation des polluants à long terme sur un organisme entier. De même, aucun modèle de simulation ne pourra reproduire la complexité de l’organisme et il n’existe pas, dans ce cas-là, d’alternative expérimentale permettant de mimer le process de la grossesse et de l’allaitement. Les polluants lipophiles peuvent par exemple s’accumuler dans les graisses maternelles, puis être relargués dans le lait lors de la lactation. Ainsi, ils peuvent être détectés dans le lait même s’ils sont indétectables dans les farines. Cependant, nous insistons sur le fait que nos expériences préliminaires ont montré la présence d’un certain nombre de polluants (4 pesticides et 6 métaux lourds) dans ces farines et qu'ils sont donc susceptibles de se retrouver dans le lait. Aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés, le rat est un modèle approprié et bien validé pour les études en nutrition et le modèle qui a été utilisé dans notre premier protocole, et donc cela permettra des comparaisons et de s’appuyer sur les différences qui ont pu être obtenues. De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres. Les résultats actuels montrent des perturbations métaboliques et comportementales ainsi que des effets nutritionnels intéressants liés aux farines d’insectes. Ils justifient donc la poursuite du projet pour évaluer la balance bénéfice-risque pendant la gestation, la lactation et la croissance précoce.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi, il ressort que 12 ratons/ groupe seront nécessaires. Etant donné qu’il y a des évidences de métabolismes différents chez l’humain et aussi rapporté entre rats mâles et femelles sur les paramètres étudiés, les ratons des 2 sexes seront explorés. Des lots homogènes de mâles et de femelles seront comparées.

Raffinement

Les rats seront nourris avec un régime standard contenant de la farine d’insectes qui permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels et caloriques des rats. Ce protocole nécessite l’hébergement individuel tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Les femelles seront avec les mâles pendant l'accouplement et avec les petits pendant la gestation et la lactation. Le milieu sera enrichi et le prélèvement du lait est réalisée sous anesthésie générale. De même, les cages des animaux seront placées dans une même salle de stabulation et les animaux pourront se voir et se sentir tout du long du protocole. Les animaux seront mis en cages collectives une fois par semaine pendant au moins 1 heure de temps pour réduire le stress induit par l’hébergement individuel et seront pesés 1 fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués dans le protocole.

Choix des espèces

Le modèle du rat a été choisi en tenant compte de la littérature récente et des études de biodisponibilité et de toxicologie, qui ont pour la plupart été réalisées sur des modèles de rat. De même, nous comptons appuyer nos résultats sur des études déjà réalisées chez le rat. Au vu des similarités des fonctions cognitives qu’il y’a entre le rat et l’homme. Le choix de cette espèce assurera la transposabilité des résultats des tests comportementaux à l’homme. Les mères auront 12 semaines dans l’étude et auront l’âge de 24 semaines à la fin de l’étude. Les petits auront 8 semaines à la fin de l’étude. Il nous faut des femelles n’ayant encore jamais été gestantes donc jeunes mais en âge de procréer (plus que 12 semaines) et soumises aux différents régimes alimentaires pendant un temps assez conséquent. Il faut également le temps qu'elles s'accouplent, qu’elles soient gestantes et qu'elles allaitent pour que nous soyons en mesure de les utiliser. Elles auront donc au minimum 12 semaines dans l’étude. Les petits continueront le même régime du groupe des mères car nous voulons surtout évaluer l’impact de l’adoption d’une alimentation particulière pendant la grossesse et l’allaitement et les premiers de la vie sur la descendance. Nous nous sommes appuyés sur l’étude réalisée sur les rates gestantes, dans notre laboratoire pour mettre au point ce protocole.