Procédures légères

Capturés au filet dans la nature à proximité d'élevages, 1 160 pigeons et moineaux sauvages sont tous relâchés sur leur site de capture, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque oiseau subit un écouvillonnage cloacal, un écouvillonnage de la gorge, une prise de sang à la jugulaire ou à l'aile et le retrait des parasites accrochés à ses plumes. Le porteur indique ignorer la vitesse normale de coagulation chez les oiseaux, l'estime à cinq minutes et prévoit de vérifier l'arrêt du saignement avant chaque relâche, les oiseaux étant maintenus en sac de contention à l'obscurité et réhydratés au glucose. Sur le remplacement, il écrit en une phrase que le projet porte sur la transmission d'agents infectieux chez ces espèces, qui ne peuvent donc pas être remplacées, et reprend mot pour mot la même phrase à la rubrique du choix des espèces.

Objectifs

Les élevages jouent un rôle clé dans l’émergence de zoonoses (e.g. SARS-CoV1, H1N1), en servant de ponts épidémiologiques entre les réservoirs d’agents infectieux de la faune sauvage et les populations humaines. Un cortège d’agents infectieux zoonotiques (e.g. bactéries leptospires), ou à potentiel zoonotique (e.g. virus influenza, coronavirus), a été identifié chez de nombreuses espèces animales sauvages, dont certaines sont commensales et vivent à proximité de l’homme (rats, souris, chauves-souris, pigeons). Au sein de la faune sauvage, certains de ces virus sont capables de passer la barrière d’espèce et de se transmettre entre espèces (e.g. Astrovirus entre les oiseaux et chauves-souris). Bien que les approches "One Health" préconisent d’intégrer les compartiments humains, animaux et leurs environnements, peu d’études arrivent à consacrer simultanément un même effort de recherche sur les trois compartiments. La surveillance des écosystèmes sauvages et domestiques est également essentielle pour évaluer les risques d'émergences. Les espèces peridomestiques, à l'interface entre la faune sauvage et les animaux de rente, peuvent avoir un rôle d'intermédiaire entre la circulation de virus dans ces deux compartiments. Ceci a été démontré par exemple pour les virus influenza aviaires, que l'on retrouve chez des espèces péridomestiques à proximité des fermes infectées. Ces espèces pourraient également avoir un rôle dans la maintenance locale de certaines épizooties. Dans ce contexte, nous proposons d'identifier le rôle épidémiologique des deux espèces péridomestiques particulièrement abondantes: le pigeon domestique (Columba livia) et le moineau domestique (Passer domesticus). Nous ciblerons en particulier (i) l'interface entre les oiseaux sauvages et les élevages de volailles et (ii) la transmission virale au sein des habitats occupées simultanément par des pigeons et chauves-souris (e.g. ponts). La détection des virus d'intérêt médical suivants sera réalisée par biologie moléculaire et sérologie: virus influenza, coronavirus, paramyxovirus, astrovirus. Aucune capture ou prélèvement biologique ne sera réalisée sur les chauves-souris.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances sur le rôle épidémiologique des espèces péridomestiques. Il permettra une meilleure articulation des problématiques de santé animale et humaine, et de protection de la biodiversité. Les connaissances acquises permettront d’éclairer les décisions politiques et réglementaires et participeront à une prise en compte plus intégrée des enjeux liés aux espèces exotiques, à la santé animale et publique.

Procédures

Quatre types de prélèvements seront effectués sur chaque animal : - Un écouvillon cloacal, réalisé à l'aide d'un écouvillon stérile (30 secondes). - Un écouvillon oropharyngé, réalisé à l'aide d'un écouvillon stérile (30 secondes). - Une prise de sang au niveau de la veine jugulaire ou brachiale (1 à 2 minutes). - La collecte de parasites hématophages attachés ou dans les plumes des oiseaux (30 secondes).

Impact sur les animaux

Toutes les procédures réalisées dans le cadre de ce projet sont de classe légères. De plus, compte tenu de la durée de contention et de manipulation relativement limitée (quelques minutes), nous n’attendons pas d’effets indésirables de type perte de poids, douleur, ou encore comportement anormal. Les manipulations seront effectuées par du personnel expérimenté et selon une chronologie standardisée et assurant une durée de contention minimale (mesures morphométriques, prélèvements de fèces et de salive, prise de sang). Afin de limiter le stress, des mesures de raffinement et des points limites adaptés à la manipulation d’espèces sauvages seront appliqués (stress engendré par la capture et la manipulation, stress lié à la réalisation de la procédure expérimentale, incapacité à rétablir un comportement normal suite à la capture, la manipulation ou la réalisation de la procédure expérimentale).

Devenir

Tous les animaux seront relâchés dans la nature, sur le site de capture.

Remplacement

Le projet porte spécifiquement sur la transmission des agents infectieux chez les espèces ciblées; elles ne peuvent donc pas être remplacées.

Réduction

La détection des agents infectieux dans les populations naturelles est dépendante d'une grande diversité de facteurs liés à l'hôte et à son environnement. L'estimation précise des prévalences d'animaux porteurs d'agents infectieux nécessite de tester un nombre élevé d'animaux, afin de pouvoir être validé statistiquement. Notre approche consistera à raisonner en termes de population (i.e. ensemble d'oiseaux appartenant à la même espèce, étudiés à une date donnée, sur un site donné). Pour chaque population, le nombre d'animaux utilisés sera de 30 à 50 individus (selon le succès de capture), ce qui permettra d'avoir un seuil de détection acceptable d'un point de vue statistique (prévalence de 2 %).

Raffinement

Afin de limiter le stress, les oiseaux capturés seront mis dans des sacs de contention, à l'obscurité. Les prélèvements biologiques seront réalisées à l’abri du soleil. Les captures seront conduites en évitant les heures les plus chaudes. Nous débuterons à l’aube, pour une durée maximale de quatre heures. Des captures pourront également être réalisées en fin d'après midi trois heures minimum avant le coucher du soleil. Nous éviterons de manipuler des oiseaux par temps de pluie, pour ne pas altérer l’étanchéité des plumes. Pour les prises de sang, la vitesse normale de coagulation pour les oiseaux n'est pas connue, mais est habituellement considérée d'une durée d'environ cinq minutes. Le stress et les températures élevées sont susceptibles d'affecter cette durée. La fin de l'écoulement sanguin sera vérifiée systématiquement avant le relâché des oiseaux. Enfin, l'hydratation des oiseaux sera réalisée systématiquement avec une solution de glucose. Des points limites adaptés aux espèces concernées seront également mis en place.

Choix des espèces

Le projet porte spécifiquement sur la transmission des agents infectieux chez les espèces ciblées; elles ne peuvent donc pas être remplacées. Les animaux seront classés en trois grandes catégories d'age pour ce projet : poussins, juvénile et adulte. Tous seront échantillonnés.

Gardés comme reproducteurs puis tués au bout de dix-huit mois, 12 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit, une fois, sous anesthésie générale, le prélèvement d'un fragment de moins de 2 mm2 de sa nageoire caudale destiné au génotypage, la moitié des poissons recevant en plus un analgésique une demi-heure avant et après, l'autre moitié servant de comparaison sans analgésie. Après l'intervention, ils passent dix minutes en test de locomotion, puis restent moins de vingt-quatre heures seuls, sans alimentation et dans un aquarium coupé de la circulation d'eau. Le porteur reconnaît que l'interaction entre les deux anesthésiques employés n'est pas documentée et que des effets indésirables peuvent survenir, et justifie la mise à mort à dix-huit mois par le risque sanitaire et les anomalies du vieillissement.

Objectifs

L’élevage et le maintien de lignées transgéniques sont nécessaires à de nombreux projets scientifiques qui mènent leurs travaux de recherche sur le poisson zèbre au stade embryonnaire. Pour que les animaux soient des reproducteurs intéressants nous devons les choisir en connaissant leur patrimoine génétique. Pour ce faire nous devons avoir accès à leur ADN. Ce geste consiste à faire une biopsie de moins de 2 mm2 de la nageoire des poissons. L’objectif de ce projet est de statuer sur la nécessité de mettre en place une analgésie péri-opératoire en plus de l’anesthésie générale lors de ce prélèvement. Nous vérifierons également que l’analgesiant utilisé n’entraine pas d’effet secondaire néfastes pour les poissons car elle contient des conservateurs. L’étude s’appuie sur un test comportemental et une évaluation du bien-être des poissons à l’aide d’une grille de score en post-intervention sur la période de récupération.

Bénéfices attendus

Le génotypage par prélèvement de nageoire est une pratique très courante et est aujourd’hui la méthode de référence pour connaitre le patrimoine génétique d’un poisson zèbre. Cette étude permettra d’apporter à la communauté scientifique les connaissances aujourd’hui manquantes de l’intérêt ou non de l’utilisation d’un analgésique lors d’un prélèvement de nageoire caudale inférieur à 2 mm2 chez le poisson zèbre. Ce projet pourrait permettre de partager par le biais d’une publication scientifique un protocole de génotypage chez le poisson zèbre qui réponde aux exigences réglementaires, environnementales, de bien-être animal tout en étant éprouvé dans sa mise en œuvre grâce à ce travail pour l’expérimentateur.

Procédures

Suivant le groupe auquel appartient l’animal, il est soumis ou non à un analgésique durant 30 minutes avant et après le prélèvement. Ce prélèvement est effectué sous anesthésie générale et ce une seule fois par animal. Le test comportemental effectué nous permet d’évaluer la locomotion du poisson ainsi que l’utilisation de la colonne d’eau durant 10 minutes. Au bout de 18 mois, les animaux seront mis à mort par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les poissons sont pêchés à l’épuisette provoquant un stress et un frottement sur le corps de l’animal. Une biopsie cutanée de moins de 2 mm2 est faite au niveau de la nageoire caudale provoquant un léger traumatisme pouvant générer un inconfort et une gêne de courte durée pour l’animal. Le risque lié à l’anesthésie, comme l’arrêt respiratoire, est présent mais reste limité car l’anesthésie n’est pas une anesthésie très profonde ni très longue (environ 2-3 minutes). Après le prélèvement de nageoire pour génotypage, les aquariums ne sont pas remis en circulation et les poissons ne sont pas alimentés et ce durant moins de 24h. Restant seuls durant ce laps de temps, ils peuvent montrer des signes de stress. Les dommages causés par une intéraction entre la lidocaine et la benzocaine n'étant pas documentés, des effets indésirables peuvent survenir.

Devenir

Les poissons étant utilisé pour l’élevage, ils seront mis à mort au bout de 18 mois afin de limiter le risque sanitaire et le développement d’anomalies liées au vieillissement.

Remplacement

Pour comprendre certaines maladies qui touchent l’être humain, les chercheurs ont besoin d’un modèle animal qui puisse se rapprocher le plus possible du génome humain. Il a été montré que le poisson zèbre possède 71 % de gènes similaires aux gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. Son élevage et le maintien de lignées transgéniques sont nécessaires à de nombreux projets scientifiques.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien ce projet et effectuer les tests statistiques nécessaires à l'analyses des données.

Raffinement

Les poissons sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les biopies sont réalisées sur animaux anesthésiés. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont définis.

Choix des espèces

Pour comprendre certaines maladies qui touchent l’être humain, les chercheurs ont besoin d’un modèle animal qui se rapproche le plus possible du génome humain. Le poisson zèbre possède 71 % de gènes similaires aux gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en fait un très bon candidat. Il présente l’avantage d’avoir des embryons uniformes et transparents qui se développent en dehors de la femelle. Il est également possible de le rendre transparent à l’âge adulte grâce à une mutation génétique. L’élevage et le maintien de lignées transgéniques (nécessitant une biopsie) sont donc indispensables pour de nombreux projets scientifiques. L’objectif de notre projet étant de récolter des données pour la mise en place de meilleures conditions de prise en charge lors de la réalisation d'un biopsie il est donc pertinent de travailler directement sur cette espèce. Les animaux seront prélevés entre 3 et 6 mois de vie. Cet âge assure une gestion plus facile de l’anesthésie par rapport aux stades plus jeunes et assure une meilleure récupération. Cela permet aussi d’avoir un pourcentage de prélèvement de tissu suffisamment faible par rapport à la taille totale du poisson.

Pour nourrir la gestion des stocks exploités par la pêcherie professionnelle à la palangre, 800 grands poissons pélagiques sont capturés en mer et tous relâchés sur leur lieu de capture, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Thons rouges, espadons, raies pastenagues violettes, poissons lunes, requins peau bleue, requins mako et marlins subissent une remontée à bord de moins de dix minutes, une biopsie de nageoire et la pose d'une balise, interne pour les thons, externe pour les autres. Le porteur indique que la récupération des données de ces balises est complètement fortuite et repose sur des pêcheurs ou des particuliers qui les retrouvent échouées. Six des sept espèces marquées sont des prises accidentelles de cette même pêcherie, dont il s'agit d'estimer le taux de survie après relâche.

Objectifs

Le thon rouge est une espèce emblématique ciblée par les pêcheries professionnelles à la palangre. Cette technique de pêche implique la capture accidentelle d’autres espèces pour lesquelles le taux de survie est mal connu. Ce projet prévoit la capture et la pose de balises électroniques en milieu naturel de sept espèces de grands poissons pélagiques : une espèce principale, le thon rouge « Thunnus thynnus », et six espèces capturés accidentellement, ou dites accessoires, l’espadon « Xyphias gladius », la raie pastenague violette « Pteroplatytrygon violacea », le poisson lune « Mola mola », le requin peau bleue « Prionace glauca », le requin mako « Isurus oxyrinchus », et le marlin « Tetrapturus belone ». La récupération des données de ces balises est complètement fortuite. Elle repose sur une communication internationale, la collaboration des pêcheurs qui retrouvent les balises sur les poissons ou des particuliers qui les retrouvent échouées sur une plage. Les objectifs du projet sont : (1) Mieux comprendre la migration du thon rouge dans un contexte de changement climatique ; (2) Développer un protocole fiable de marquage des raies avec des marques satellites dites « survie » ; (3) Estimer le taux de survie des espèces capturées accidentellement après avoir été relâchées dans leur milieu ; (4) Acquérir de nouvelles connaissances sur la biologie et l'écologie des espèces accessoires.

Bénéfices attendus

L’acquisition de données d'observation des migrations du thon rouge, et de leur évolution dans un contexte de changement climatique permettra de nourrir les approches de gestion des stocks de cette espèce. Le marquage et le relâché de six autres espèces de grands pélagiques qui comptent parmi les captures accidentelles de la pêcherie professionnelle au thon rouge, permettra d’établir le taux de survie des individus, notamment en fonction de l’espèce, de leur taille et de leur état. Cela répondra aux objectifs européens pour la durabilité de la pêche, spécifiquement concernant la problématique de réduction des impacts sur la faune marine des captures accidentelles. Les données acquises permettront par ailleurs de mieux comprendre les déplacements de ces espèces, pour l’heure très mal connus, et alimenteront les bases de données utiles pour le calcul d'évaluation des stocks.

Procédures

Chaque animal sera capturé, une biopsie de la nageoire sera effectuée, une balise interne sera implantée chez le thon rouge, et une balise satellite sur les autres espèces sera posée avec d'être relâché sur le lieu de capture. L'ensemble de la procédure, de la montée à bord jusqu'au relâche n'excède pas 4 minutes.

Impact sur les animaux

La capture et la contention des individus occasionnent un stress et une nuisance légère. La biopsie et le marque interne et externe occasionnent une gêne passagère.

Devenir

Les 800 poissons, au maximum, marqués sur les bateaux seront relâchés dans le milieu naturel, au plus proche du lieu de leur capture. La recapture est complètement fortuite.

Remplacement

Ces études doivent être réalisées sur le thon rouge et les espèces sélectionnées comme captures accidentelles, dites accessoires, et ce dans leur milieu naturel. Il n'est pas possible de les remplacer.

Réduction

Un nombre maximal de 100 thons marqués par an permettra d'explorer la diversité et la variabilité des routes migratoires, et ce pour toutes les classes de tailles. Pour les autres espèces parmi les captures accessoires, le nombre maximal de 50 individus par espèce permet d’intégrer une variabilité naturelle représentative sur une période de plusieurs saisons de pêche. Il permettra aussi de prendre en compte les effets aléatoires sur la survie, et de mieux comprendre la diversité de leurs déplacements après leur libération.

Raffinement

Le protocole de capture limite au maximum la souffrance et le stress des animaux grâce à des temps de pêche limité à 10 minutes, et une sortie de l’eau facilitée selon leur taille. Les grands thons seront montés à bord dans une civière. La méthode d'instrumentation des thons pour le suivi de leur migration est éprouvée. Les individus sont immédiatement positionné sur un tapis de réception, intubés avec un flux d'eau de mer oxygénée, et les yeux couverts d'un linge humide, la procédure durant moins de 2 minutes. Les individus retrouvent une activité tonique très rapidement. Pour les captures accessoires, la montée à bord du navire sera avec engin dédié (salabre sur mesure ou civière utilisée pour les thons). Les individus seront ventilés, les raies seront placées individuellement dans un bassin contenant de l’eau bien oxygénée, la procédure de marquage prend moins de 4 minutes.

Choix des espèces

Le thon rouge est une espèce emblématique exploitée par une pêcherie professionnelle. De nombreuses questions scientifiques importantes tant du point de vue fondamental qu'appliqué doivent cependant être résolues pour gérer de façon durable cette espèce. Les autres espèces sont parmi les plus représentées des captures accidentelles lors de la pêche du thon rouge à la palangre. Les thons seront des juvéniles et des adultes, nous avons besoin de comprendre les migrations de toutes les classes d'âge et que chaque poisson soit suffisamment grand pour porter la marque, soit supérieur à 10kg. Pour les raies, la taille des hameçons de la palangre limite les prises aux individus qui sont déjà des adultes matures. La marque survie doit aussi avoir un poids inférieur ou égale à moins de 2% du poids du corps de l’animal. Les autres espèces seront généralement beaucoup plus grosses que les raies et généralement matures. Pour le poisson lune, les individus pourront éventuellement être immatures.

Capturés puis anesthésiés par immersion, 25 poissons clowns subissent le prélèvement d'un carré de nageoire caudale de cinq millimètres de côté, chaque intervention durant une trentaine de minutes. Les prélèvements s'étalent sur trois jours, quatre individus le matin et quatre à cinq l'après-midi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objet est de mesurer la longueur des télomères chez des adultes de sept et quinze ans et des juvéniles d'un an, pour tester si elle explique une longévité qui dépasse vingt ans. Les 25 individus restent ensuite en captivité dans le service d'aquariologie, le porteur affirmant qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne permettrait de travailler sur des poissons dont l'âge est connu.

Objectifs

Les télomères sont des séquences répétées d’ADN qui sont situées à l’extrémité des chromosomes. Ces séquences d'ADN répétitives ne contiennent pas de gènes : elles sont là pour préserver l'intégrité du patrimoine génétique. Au cours du vieillissement, ces portions des chromosomes raccourcissent. L'objectif de notre projet est de mettre en relation la longueur des télomères et la longévité d’un organisme, ceci en utilisant le modèle biologique d’une espèce de poissons osseux particulièrement longévive. Dans ce but, nous mesurerons la longueur des télomères chez les poissons clowns car ce genre de poissons osseux se caractérise par une longévité exceptionnellement importante (supérieure à 20 ans). Les télomères seront extraits à partir d’un échantillon de nageoire caudale, un tissu facilement accessible par un prélèvement peu invasif. Ces échantillons seront traités dans le but de définir si la longueur des télomères varie avec l’âge et/ou le sexe des poissons clowns, ou si cette mesure est invariable. Ce projet permettra de comprendre les bases moléculaires et physiologiques de la longévité exceptionnelle des poissons clowns au regard de la majorité des téléostéens.

Bénéfices attendus

Ces résultats, de recherche fondamentale, serviront à tester une hypothèse encore non explorée : la longévité des poissons clowns peut s’expliquer par la longueur des télomères. Nos résultats bénéficieront à la communauté scientifique spécialisée dans le vieillissement et dans l’établissement du modèle poisson clown.

Procédures

Les animaux seront soumis à un prélèvement unique d’un échantillon de petite taille (5x5 mm) de nageoire caudale, après une anesthésie effectué par balnéation. L’intervention pour chaque poisson durera 30 minutes et sera faite successivement à raison de 4 individus le matin et 4 à 5 l’après midi durant 3 jours (total de 25 individus).

Impact sur les animaux

Des complications post-prélèvement sont envisageables, mais la taille du prélèvement de nageoire est suffisamment petite (5mm X 5mm) pour ne pas gêner les mouvements natatoires du poisson. Par la suite, le tissu de la nageoire caudale est régénéré en quelques jours. Le stress lié à la manipulation est minime car uniquement lié à la capture et les individus sont ensuite rapidement anesthésiés. En cas de complications, nous appliquerons les directives envisagées sur la grille de scoring.

Devenir

Les 25 individus seront gardés en captivité au sein de la structure d’élevage des poissons clowns du service d'aquariologie.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, il est crucial de connaitre l’âge des individus. Or, c’est le cas des individus sur lesquels nous proposons de travailler : les adultes sont élevés depuis plusieurs années (jusqu'à de 10 ans) et les juvéniles depuis 1 an. Ainsi, par la complexité de l'organisme vivant, aucune expérience in silico ou in vitro ne permet d’accéder à ce type de données. Par conséquent, il n’existe aucune méthode alternative à la réalisation de ce projet et l’utilisation du modèle animal est incontournable.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des poissons dont nous connaissons l’âge, des adultes et des juvéniles. Nous en utilisons un nombre nécessaire et suffisant pour pouvoir appliquer des méthodes statistiques sur la comparaison des résultats obtenus (comparaison de moyennes, test de student...). Trois catégories seront échantillonnées : - 5 couples (5 mâles et 5 femelles) âgés d’environ 15 ans. - 5 couples (5 mâles et 5 femelles) âgés d’environ 7 ans. - 5 juvéniles âgés d’environ 1 an.

Raffinement

Une observation des animaux utilisés sera menée durant 48 h après le prélèvement. Les prélèvements seront réalisés sur une période de 3 jours avec : 8 individus pour le premier et le deuxième jour et 9 individus durant le troisième jour, soit un total de 25 individus. Ce planning permettra d’observer chaque individu de manière attentive. L’expérience sera stoppée dès qu’un point limite sera atteint avec un individu par euthanasie.

Choix des espèces

Depuis plusieurs années, les poissons clowns sont un excellent modèle d'étude dans les domaines de l'écologie, de l'évolution et du développement. La longévité des poissons clowns (au moins 20 ans) pose question. Les poissons clowns sont donc des animaux modèles de choix pour appréhender les bases moléculaires et physiologiques de cette longévité. L'un des objectifs de ce projet est de définir si la longueur des télomères varie avec l’âge. Ainsi, nous comparerons, les valeurs de ces longueurs de télomères obtenues pour des animaux juvéniles et adultes.

Toutes tuées pour doser les acides aminés dans leur sang, leurs muscles et leur foie, 316 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux injections par jour pendant deux jours sous sédation à l'isoflurane, et sont mises à jeun, ce que le porteur rapproche du jeûne physiologique. L'objet est de vérifier qu'une enzyme bactérienne fait baisser la méthionine dans le sang et de mesurer combien de temps elle agit, la privation de cet acide aminé bloquant la croissance des cellules cancéreuses. L'effectif se décompose en une étude pilote de 56 souris puis 260 ou 130 selon qu'un effet du sexe apparaît, sans que le résumé indique ce qu'il advient des 130 souris d'écart entre ces deux scénarios.

Objectifs

La restriction en un acide aminé la méthionine (Met) induit l’arrêt de croissance et la mort des cellules cancéreuses, les cellules normales y étant beaucoup moins sensibles. Cet effet est décrit depuis des décennies. La méthionine étant un acide aminé indispensable pour l’homme, il est difficile de mettre en place un régime sans cet acide aminé. On peut obtenir efficacement une diminution du stock de Met avec une enzyme bactérienne absente chez l’homme et présente dans certaines espèces de bactéries. Certaines enzymes bactériennes ont été étudiées mais n’ont pas pu être développées car elles étaient rapidement dégradées dans le corps humain, Cette insuffisante stabilité est une limitation générale pour l’utilisation des enzymes bactériennes décrites jusqu’ici. Nous avons recherché des candidats d’intérêt thérapeutique plus stables, et nous avons caractérisé une enzyme, qui dégrade la méthionine. Elle présente des paramètres cinétiques favorables, avec une bonne efficacité de dégradation de la méthionine et qui est plus stable à des concentrations compatibles avec une administration en clinique. L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité de cette enzyme à induire une diminution des concentrations sanguines en méthionine et à étudier sa durée d’action in vivo chez la souris. Ceci permettra d’une part, d’un point de vue scientifique, de mieux comprendre les déterminants importants pour l’activité de l’enzyme sur des mammifères. Et il s’agira d’autre part d’une étape indispensable dans la poursuite du développement de cette enzyme comme candidat pour la thérapie anticancéreuse humaine.

Bénéfices attendus

Ces études fournissent des informations sur le métabolisme de la méthionine, dont les concentrations élevées jouent un rôle significatif et important dans le développement des tumeurs cancéreuses. Ces résultats sont importants pour évaluer la pertinence de poursuivre des études sur l’utilisation de l’enzyme en tant que médicament anticancéreux humain potentiel.

Procédures

Deux injections par souris sont prévues par jour, pendant 2 jours, durant la période expérimentale sur toutes les souris. Les injections seront réalisées en quelques secondes sous sédation pour réduire le stress.

Impact sur les animaux

Deux injections par souris sont prévues par jour, pendant 2 jours, durant la période expérimentale. Ces injections seront réalisées sous sédation à l’isoflurane et pourraient entrainer une légère douleur pour l’animal. Le jeune ne devrait entrainer qu’un stress léger puisqu’il correspond au jeûne physiologique.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour mesurer les concentrations en en acides aminés sanguines, musculaires et hépatiques.

Remplacement

Les expériences in vitro ont déjà été réalisées : dans du tampon, dans du plasma humain, et sur des lignées de cellules cancéreuses. Le développement de la nouvelle enzyme bactérienne qui dégrade la méthionine pour en faire un candidat utilisable en thérapie anticancéreuse nécessite des expériences in vivo chez l’animal pour étudier son efficacité et sa durée d’action. En effet, les résultats obtenus dans le plasma humain in vitro ne reflètent pas la stabilité de l’enzyme in vivo. Ces expériences sont nécessaires pour envisager l’utilisation de l’enzyme dans des traitement anti-cancéreux humains.

Réduction

Étant donné qu'aucune étude n'a encore été menée avec l’enzyme qui dégrade la méthionine, nous proposons donc de réaliser une première étude pilote avec 56 souris (première expérience n=8 par groupe, 4 mâles et 4 femelles) afin de déterminer la dose optimale de l’enzyme à injecter pour induire une diminution des concentrations plasmatiques en acide aminé. Pour la seconde étude, qui a pour objectif d’étudier la durée d’action de l’enzyme, nous estimons que le nombre doit être de 260 souris si un effet sexe est observé dans l’étude pilote ou 130 souris si aucun effet sexe n’est observé. Les effets du traitement seront étudiés à différents temps :2,3 et 8 jours. Un total de 316 souris sera nécessaire pour mener ce projet. Afin de déterminer la taille optimale de l’échantillon, nous avons utilisé des tests statistiques en prenant en compte l’effet attendu et le seuil de significativité. En utilisant ces paramètres, le calcul indique qu’un effectif d’environ 10 animaux par groupe est nécessaire.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe de 5 en cage collective. Les cages seront enrichies avec des tunnels transparents. L’expérimentateur ou le personnel animalier passera tous les jours pour vérifier l’état de santé des animaux et détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement, ainsi que la disponibilité de la nourriture et de l’eau de chacune des cages. Les injections seront effectuées par un manipulateur expérimenté sous sédation. Les points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront sortis des procédures.

Choix des espèces

Comme l’homme, la souris a un régime alimentaire très diversifié et est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie du système digestif de la souris présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. En outre, les souris sont les modèles utilisés dans les études de cancérologie et de toxicologie. L’espèce retenue pour ce projet est donc la souris qui sera le même modèle qui sera utilisé dans les études ultérieures pour étudier les effets de l’enzyme dégradant la méthionine sur le développement du cancer. Les animaux arriveront à l’âge de jeunes adultes (6 semaines, 25g), âge auquel les systèmes métaboliques sont matures, les besoins en methionine ne correspondent qu’au besoin d’entretien, ce qui nous permettra d’étudier vérifier la stabilité et l’efficacité de l’enzyme sur la dégradation de la méthionine.

Une injection d'hormone d'une trentaine de secondes, puis un massage du ventre le lendemain pour provoquer la ponte : dix femelles xénopes subissent ce protocole chaque année, et les 1 200 embryons ainsi obtenus servent aux travaux pratiques. Un mâle est anesthésié et tué chaque année juste avant le prélèvement de ses testicules, utilisables une quinzaine de jours. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger, la contention imitant la prise du mâle pendant l'accouplement, les yeux de la femelle recouverts pour réduire le stress. Les dix femelles sont réutilisées après six mois de récupération, celles qui ne pondent pas deux fois de suite étant mises à mort, et les étudiants n'interviennent qu'ensuite, sur des embryons déjà fixés.

Objectifs

Il s'agit de former les étudiants aux techniques courament utilisées en biologie du développement et de développer leur sens de l'observation afin de leur permettre de distinguer différents stades de développement durant l'embryogenèse chez l'amphibien Xénope, ou d'interpréter l'expression de différents gènes. Le nombre d'étudiants participant aux TP de M1 est au maximum de 20. Les TP de L2 regroupent 160 étudiants en plusieurs groupes. Ces TP nécessitent l'obtention d'environ 1200 embryons par année obtenus par stimulation hormonale de la ponte de femelles adultes suivie d'une fécondation in vitro. Il est a noté que les étudiants ne participent pas à la première phase du projet impliquant des animaux adultes. Les étudiants vont utiliser les embryons fixés obtenus durant cette phase préparatoire.

Bénéfices attendus

Acquisition par les étudiants de connaissances pratiques et du sens de l'observation dans le cadre d'un enseignement en biologie du développement.

Procédures

Il s'agit de stimuler la ponte d'ovocytes par les femelles de xénope afin de réaliser une fécondation in vitro. La durée de la stimulation hormonale est brève, environ 30 secondes. Le lendemain ces femelles sont massées une à deux fois pour induire la ponte des oeufs. Un male est anesthésié et les testicules sont prélevés. Le mâle est mis à mort juste avant l'opération. Compte tenu de l'efficacité relative de la stimulation hormonale et de la fécondation in vitro, une dizaine de femelles semble nécéssaire pour obtenir 1200 embryons par an, à raison d'une seule stimulation hormonale par femelle et par an. Un seul mâle sera euthanasié par an afin d'obtenir des testicules utilisables pendant 15 jours.

Impact sur les animaux

Stress induit par l'injection d'hCG pour les xénopes femelles. Stress induit par l'anesthésie pour le xénope mâle. Le jour de la fécondation in vitro, le ventre de la femelle est massé pour provoquer la ponte, par pression légère afin de mimer la pression naturelle apliquée sur l'abdomen par le mâle.

Devenir

A la suite de la stimulation hormonale, les femelles sont transférées dans un bac de réserve pour ne pas les mélanger avec les femelles qui n'ont pas encore été injectées et un délai de 6 mois de récupération est respecté avant une nouvelle injection. Les femelles qui ne pondent pas deux fois de suite sont mises à mort. Les autres femelles sont maintenues en vie tout au long du projet. Dans le cas d'animaux malades, des points limites ont été établis pour limiter la souffrance et permettre leur prise en charge adaptée.

Remplacement

La fécondation in vitro constitue la seule méthode permettant d'obtenir des embryons qui se développent de manière synchrone. Aucune méthode alternative n'a pour l'instant été mise au point permettant d'obtenir des embryons de xénope à différents stades du développement. Dans la mesure où il s'agit de travaux pratiques portant sur l'étude du développement , il est nécessaire pour les étudiants d'acquérir des compétences pratiques en effectuant les expériences d'hybridation in situ sur différents stades du développement.

Réduction

Les femelles xénopes pondent plusieurs centaines d'oeufs à chaque fécondation in vitro permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés et de préparer les embryons pour deux travaux pratiques. Les embryons qui se développent, sont systématiquement fixés et peuvent être conservés plusieurs années dans de l'éthanol à -20°C pour de simples observations morphologiques. Pour les expériences d'hybridation in situ, le temps de conservation est moins long. Nous allons conserver certains embryons expérimentaux d'une année sur l'autre et tester l'efficacité de l'hybridation in situ. Si l'hybridation in situ reste aussi efficace, nous pourrions prévoir une période de microinjection de 15 jours pour deux années de TP. Par ailleurs, les expériences sont effectuées sur une période de 15 jours permettant l'utilisation d'un seul xénope mâle pour le prélèvement des testicules.

Raffinement

la durée de l'injection est minimisée afin de limiter le stress. La contention de l'animal est réalisée en mimant la prise du mâle lors de l'accouplement et en cachant les yeux de la femelle pour réduire le stress. A la suite de la ponte les femelles sont laissées à l'isolement pendant 24 heures pour faciliter la récupération. L’observation des animaux permet de mettre en place des critères observables définissant des points limites afin d’évaluer la douleur de l’animal et d’entamer des procédures de soins ou d’euthanasier les animaux. L’euthanasie s’effectue par dose léthale d’anesthésiant évitant toutes douleurs à l’animal.

Choix des espèces

Le xénope est un modèle standard de l'étude de l'embryogenèse. La femelle pond des centaines d'ovocytes, permettant de réaliser une fécondation in vitro à l'aide d'un broyat de fragment de testicule. Le développement est externe et peut s'effectuer dans de simples bacs ou aquariums. La fécondation in vitro permet un développement synchrone des embryons. De plus, les oeufs de l'espèce utilisée, le Xenopus Laevis font 1.2 mm de diamètre. Les changements de morphologie sont facilement observables à l'aide d'une simple loupe binoculaire. La réalisarion d'expériences de gain ou de perte de fonction se fait à l'aide d'un sytème standard de microinjection dès le début du développement. Les embryons fournis aux étudiants sont fixés et sortent du cadre des dispositions d'expérimentation animale à des fins scientifiques. Notre projet s'appuie donc exclusivement sur le suivi et la prise en charges de xénopes adultes nécessaires pour la stimulation hormonale de la ponte d'ovocytes et la fécondation in vitro.