Procédures légères
Interaction d’une bactérie pathogène avec l’intestin chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Des souriceaux de quatorze jours reçoivent par gavage une bactérie responsable de sepsis et de méningites chez les nouveau-nés. 157 souris vont être utilisées, dont 141 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue, les mères après leurs petits parce que l'exposition à la bactérie interdit de les réutiliser. Les mères gestantes passent en outre environ sept jours en hébergement individuel. Pour 141 animaux classés en souffrance sévère, le porteur ne décrit les atteintes attendues qu'en une phrase, un stress et une douleur dans les 24 heures suivant l'inoculation, sans dire quels signes cliniques l'infection provoque ni à quel stade elle est arrêtée.
Objectifs
Certaines bactéries pathogènes peuvent être présentes dans les voies vaginales et digestives des individus. Alors que le portage est asymptomatique chez l’adulte, elles peuvent causer des infections graves chez les nouveau-nés (sepsis, méningite). L’infection peut survenir au cours de la première semaine de vie (syndrome précoce) ou plus tardivement (syndrome tardif, 7 à 89 jours de vie). Au cours des syndromes tardifs, l’infection survient après le franchissement de la barrière intestinale par les bactéries, et plus précisément après la traversée de cellules spécialisées. Le but de ce projet est d'identifier et d'analyser à l'aide d'un modèle murin d’infection néonatale tardive, i) les cellules immunitaires recrutées après l'infection et ii) la réponse des différentes cellules de l'intestin à l’infection.
Bénéfices attendus
Nos résultats fourniront des informations précieuses sur les cellules et les gènes impliqués dans le franchissement de la barrière intestinale par les bactéries pathogènes, ainsi que la réponse immunitaire intestinale à l'infection. À terme, le projet permettra d’identifier de nouvelles cibles pour le développement de stratégies préventives et thérapeutiques contre les infections néonatales bactériennes.
Procédures
Toutes les souris gestantes adultes seront en hébergement individuel pour une durée d'environ 7 jours. Tous les souriceaux seront soumis à un gavage oral d'une durée de 5 à 10 secondes réalisé sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L'hébergement individuel est susceptible d'entraîner un léger stress et des modification du comportement. Le développement des bactéries sera susceptible de générer un stress et de la douleur chez l’animal dans les 24h qui suivent l’inoculation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Des prélèvements post-mortem seront effectués chez les souriceaux pour analyse. Les mères ayant été exposées à une bactérie pathogène (niveau A2) ne pourront pas être réutilisées et seront mises à mort après mise à mort de l'ensemble de leurs souriceaux.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas de récapituler la complexité de la barrière intestinale ni d'étudier l'ensemble des types cellulaires présents.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum en homogénéisant strictement les conditions expérimentales. Nous utiliserons des animaux obtenus chez le même fournisseur afin de limiter au maximum la variabilité expérimentale.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement par les expérimentateurs pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress et nous avons raffiné la méthodologie par l’introduction de points limites entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire l’infection néonatale bactérienne, du franchissement de la barrière intestinale jusqu’à la dissémination par voie sanguine et la méningite. Le modèle souris permet d'étudier les différents organes impliqués dans la physiopathologie de l'infection humaine. Nous utiliserons des souris adultes gestantes car c'est une étude sur leur progéniture avant sevrage. Nous utiliserons des souriceaux de 14 jours à un stade de développement équivalent à celui de nouveau-nés humains âgés de 7 à 89 jours de vie.
Etude de l’interaction entre le dysfonctionnement métabolique et l’inflammation chronique dans un modèle murin de la dégénérescence maculaire liée à l’âge
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
6 500 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à six électrorétinogrammes de 30 à 45 minutes et six imageries de la rétine sous anesthésie générale, 500 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 1 750 modéré et 4 250 léger. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes entiers. Un lot est hébergé jusqu'à quatre mois sous lumière intense, cotons de nidification retirés de la cage pour les empêcher de se cacher de la lumière, un autre subit l'ablation du nerf vague combinée ou non à celle de la rate, un autre des injections dans l'œil au risque d'inflammation et de micro-saignements. Le porteur écrit avoir limité les effectifs au maximum et fixe cinq animaux par groupe comme minimum statistique, sans expliquer par quel enchaînement de groupes on parvient à 6 500 souris.
Objectifs
La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est une maladie de la rétine provoquée par une dégénérescence progressive de la partie centrale de la rétine, qui apparaît le plus souvent à partir de 65 ans. En France, environ 1,5 million de personnes seraient atteintes de DMLA. Dans cette pathologie, un processus inflammatoire caractérisé par l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires et un processus de dysfonctionnement métabolique participent de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Ce projet permettra de comprendre comment ces processus essentiels interagissent, améliorant ainsi notre compréhension de la pathogenèse de la DMLA. De plus, il permettra d’évaluer si le traitement de la réponse inflammatoire pourrait avoir un effet thérapeutique lorsque la cause principale de la maladie est un dysfonctionnement métabolique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer notre compréhension de la pathogenèse de la DMLA (dégénérescence maculaire liée à l’âge). De plus, il permettra d’évaluer si le traitement de la réponse inflammatoire pourrait avoir un effet thérapeutique lorsque la cause principale de la maladie est un dysfonctionnement métabolique.
Procédures
Un lot d’animaux subira des explorations fonctionnelles de la rétine : enregistrements d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, jusqu’à 6 fois) sous anesthésie générale avec analgésique, une imagerie rétinienne (10 minutes, jusqu’à 6 fois) sous anesthésie générale. Un lot d’animaux sera hébergé sous une lumière intense (jusqu’à 4 mois maximum) et subira des explorations fonctionnelles de la rétine : enregistrements d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, jusqu’à 3 fois) sous anesthésie générale avec analgésique, une imagerie rétinienne (10 minutes, jusqu’à 3 fois) sous anesthésie générale. Un lot d’animaux subira une chirurgie d’ablation du nerf vague combinée ou non à une ablation de la rate (durée de l’intervention 10 minutes) sous anesthésie générale et analgésiques administrés en préopératoire et postopératoire. Un lot d’animaux recevra des régimes alimentaires spécialement formulés pendant 4 semaines et subira des explorations fonctionnelles de la rétine : enregistrements d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, jusqu’à 2 fois) sous anesthésie générale avec analgésique, une imagerie rétinienne (10 minutes, jusqu’à 2 fois) sous anesthésie générale. Un lot d’animaux sera soumis à une injection de molécules thérapeutiques par voie intraoculaire sous anesthésie générale avec analgésique (durée : moins de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Lors des anesthésies, il y a un risque de mauvaise réaction à l’anesthésiant (difficultés respiratoires, anxiété), un risque d’hypothermie ainsi qu’un risque d’arrêt cardiaque. Lors des injections intraoculaires, il y a un risque d’inflammation localisée (œil rouge) et de micro saignements visibles instantanément lors du geste. Lors de la procédure d’illumination, les animaux peuvent ressentir un stress lié à l’exposition à une lumière de (animaux agités pendant moins d’une heure), et leurs fonctions visuelles peuvent baisser au cours du temps. Lors des imageries de l’œil, les animaux peuvent également ressentir un stress lié à la préhension et contention lors de l’administration des collyres (durée de quelques secondes seulement). Lors du changement d’alimentation (mise à disposition des croquettes spécifiques à notre projet), les souris peuvent subir une perte de poids transitoire en réponse au changement de nourriture. Une hémorragie peut se produire au cours des chirurgies, ce qui peut entrainer le décès de l’animal. Après les chirurgies, les sutures pourraient s’irriter ou être retirées prématurément par l’animal. Après l’opération, il peut y avoir des douleurs postopératoires.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem. Cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux, car nous avons besoin de prélever des organes entiers pour les analyser dans leur globalité.
Remplacement
Les études in vitro ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cellules isolées.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser 6500 animaux pour réaliser cette étude. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 5 animaux défini par groupe est le minimum requis pour l'application de tests statistiques de significativité fiables et l'obtention de résultats interprétables et fiables, selon nos expériences antérieures. Pour les injections intraoculaires, nous prévoyons d’injecter le traitement dans un œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle ce qui permettra de limiter la variabilité entre animal et de réduire ainsi le nombre d’animaux de l’étude.
Raffinement
Les animaux en provenance de l’extérieur observent une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant d’entrer en expérimentation. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation pour l’espèce concernée (cages ventilées standard avec enrichissement). Le nombre de souris par cage est limité à 5 individus adultes. Lors de la mise des animaux sous illumination, les animaux sont placés dans une pièce différente, mais restent dans leurs cages de stabulation normale, selon les mêmes conditions, hormis la luminosité et les cotons qui sont retirés pour éviter que les animaux ne se cachent de lumière. Ils auront accès illimité à l’eau et à la nourriture. Des points limites ont été définis et les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par les membres de la structure bien-être de notre établissement utilisateur. L'euthanasie de l'animal serait un dernier recours. Le personnel assure le suivi du bien-être des animaux à l’aide d’un système d’étiquettes et de pastilles. Des points limites précoces et prédictifs ont été mis en place pour s'assurer de réduire la souffrance et la détresse des animaux au maximum. Les animaux bénéficieront si besoin d'une anesthésie générale fixe ou gazeuse ainsi qu'une anesthésie locale de la cornée et l'humidité cornéenne sera maintenue à l'aide d'une goutte de gel ophtalmique. Après la chirurgie nous mettons à disposition une gelée post-opératoire nutritive avec des croquettes mouillées dans le fond de la cage pour aider à l’alimentation et à l’hydratation. En plus de l’analgésie préopératoire, des injections d’analgésiques postopératoires seront administrée après la chirurgie pour toute douleur postopératoire potentielle. Le poids corporel des animaux sera mesuré la veille, deux jours après et une semaine après la chirurgie. Une grille de scoring a été créée pour suivre les poids des animaux et les autres observations postopératoires. Le poids des animaux nourris avec des croquettes formulées avec un composé sera également surveillé chaque semaine pendant toute la durée de l’alimentation (mise en place d’une fiche de suivi pour vérifier ce paramètre).
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Nous utilisons des modèles génétiquement modifiés qui sont plus susceptibles à l’induction d’une inflammation pathogène, mimant la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Les animaux sont âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale. C’est l’âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel elle est susceptible de développer la maladie étudiée.
Exploration de la perméabilité de la barrière hémato encéphalique au cours de l’encéphalopathie associée au sepsis et l’accélération du déclin cognitif post-sepsis chez la souris – EU 2/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Porteuses de mutations qui leur font développer une maladie neurodégénérative avec l'âge, les souris de ce projet reçoivent en plus un sepsis provoqué par chirurgie, à six mois ou à douze mois. 200 d'entre elles vont être utilisées, 96 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 64 modéré et 40 léger, toutes tuées à l'issue. Après l'opération, elles présentent pendant 24 à 48 heures une baisse d'activité, le poil hérissé et parfois des diarrhées liquides, avant d'être transportées vers un second établissement pour une imagerie cérébrale sous anesthésie profonde. Les souris qui servent à produire les cohortes sont tuées à la fin de leur période de reproduction, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent pas être réutilisées du fait de leurs modifications génétiques.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome clinique fréquent et potentiellement mortel provoqué par un dérèglement de la réponse à l'infection. Au diagnostic, une altération de l’état de vigilance également appelé encéphalopathie associée au sepsis (EAS), est fortement associé au risque de mortalité. En outre, les troubles cognitifs à long terme sont l'une des séquelles majeures observées chez les survivants du sepsis, entraînant une réduction substantielle de la qualité de vie et une augmentation des coûts de santé. En effet, malgré une amélioration substantielle de la survie hospitalière des patients présentant un sepsis ou un choc septique, le suivi à long terme des patients révèle que 30 à 50 pourcents des survivants auront des altérations cognitives un an après la sortie de réanimation avec un retentissement significatif sur le retour à l’emploi, les activités de la vie quotidienne et la qualité de vie. Ces altérations persistantes ont donc un impact sociétale majeur. Cependant, l'association mécanistique entre les infections systémiques sévères, l’EAS et l’accélération du déclin cognitif n'est pas encore claire. L’hyperperméabilité de la barrière hémato encéphalique est une des voies biologiques les plus probablement impliqué dans cette dysfonction cérébrale aigue et chronique précipitant potentiellement l’apparition de démences neurodégénératives. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la prise en charge et le pronostic des patients atteints de sepsis. Ce projet se déroule sur deux établissements afin de disposer d'équipement d'imagerie adapté à la question scientifique.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans la physiopathologie des troubles neurologiques aigue et neurodégénératifs associés au sepsis, dans le but de développer et d’évaluer des approches innovantes d’immunothérapie pouvant modifier l’évolution naturelle de la maladie ainsi que des biomarqueurs immunitaires sanguins à valeur diagnostique et/ou pronostique. Les données actuelles suggèrent que la barrière hémato encéphalique (BHE) est l’élément clé qui intègre les signaux du cerveau et de la périphérie au cours du sepsis. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique de l’interface entre le compartiment sanguin systémique et le système nerveux central pourrait influencer la prise en charge thérapeutique et le pronostic des patients atteints de sepsis.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale permettant d’induire le modèle de sepsis sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire associé à un traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) dans un premier établissement. Par la suite, les animaux seront transférés dans un second établissement et impliqués dans un examen d’imagerie effectuée sous anesthésie générale avec injection d’un radiotraceur (30 min d'anesthésie au total). A l’issue de ces étapes les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Concernant la procédure chirurgicale elle-même, la phase post-opératoire précoce est à risque de manifestations correspondant à un syndrome douloureux lié à l’acte technique par lui-même : posture voutée, fourrure sale, décharge oculaire. Concernant le modèle de sepsis, il peut potentiellement engendrer des symptômes d’inconfort et des modifications du comportement en situation de pathologie. Ce « comportement maladie » est un ensemble coordonné de changements de comportement adaptatifs qui se développent chez les animaux malades au cours d'une infection ou d’un état inflammatoire non septique. Au cours des 24 premières heures suivant l’induction d’un sepsis les animaux présentent habituellement une réduction de leur mouvement exploratoire, une réduction globale d’activité et ont habituellement le poil hérissé. Certains animaux présentent des diarrhées liquidiennes associée à ce syndrome inflammatoire. Ces symptômes régressent progressivement au-delà de 24 à 48 heures. La réalisation de l’imagerie cérébrale se fait sous anesthésie générale profonde pour éviter tout mouvement qui générait l’acquisition d’image. Cette anesthésie présente un risque de stress thermique et d’arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproductive et ne pourront être réutilisés du fait de leurs modifications génétiques. Les souris analysées dans le cadre de ce projet seront euthanasiées à la fin des actes in vivo et l’ensemble des tissus récupérés pour les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Un organisme vivant intégré est nécessaire pour étudier les anomalies de fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique lors des phases d’encéphalopathie aigue et de dégénérescence cognitive retardée associés au sepsis. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors d’une réaction inflammatoire du système nerveux central et systémique. L’exploration de conséquences à long terme nécessite par ailleurs un suivi longitudinal individuel des animaux, qu’il n’est pas possible de modéliser in silico.
Réduction
Nous utiliserons un maximum de 200 animaux sur la durée du projet. La standardisation des procédures expérimentales et des conditions d’hébergement des animaux est une préoccupation majeure pour limiter les facteurs de biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives. Les procédures expérimentales ont été affinées pour limiter au maximum l'utilisation des souris : - Les modèles de choc septique utilisés sont ceux dont la reproductibilité est la plus élevée - Chaque expérience sera dessinée pour favoriser la comparaison entre deux groupes de manière à conserver une puissance statistique suffisante pour un faible effectif d’animaux. - Les organes prélevés feront l’objet des multiples analyses. - Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. - Les animaux utilisés proviennent de lignées consanguines avec un fond génétique contrôlé afin de limiter la variation expérimentale et donc le nombre d’animaux. A noter qu’il est possible que la méthode d’imagerie utilisée ne mette en évidence aucun signal pathologique. Aussi, s’il s’avère que notre hypothèse de travail est erronée et qu’aucun résultat pertinent n’est mis en évidence après 2 séries de 20 animaux l’étude sera suspendu avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux.
Raffinement
Les procédures de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, tout en respectant le bien-être animal, et en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi). La principale contrainte concerne la chirurgie mise en œuvre pour induire le modèle sepsis. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible du projet : anesthésie locale/générale, analgésie, asepsie, plateau chauffant, soins pré- et post-opératoires. Les animaux disposent d’une litière douce en postopératoire, associée à de la nourriture molle pour faciliter la récupération et la réhydratation. Pour le transport entre les deux établissements, celui-ci sera effectuée dans une boite de transport filtrée adapté au modèle animal et contenant de l’eau, de l’aliment et de l’enrichissement pour limiter le stress lié à cette étape. Enfin, l’imagerie sera effectuée sous anesthésie profonde contrôlé avec maintien de la température pour réduire le stress thermique associé à l’anesthésie générale. Afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins), et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris Mus musculus musculus est l’espèce de choix pour notre protocole expérimental pour de multiples raisons : - Grande conservation des mécanismes de l’immunité innée et adaptative entre les mammifères. - Espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. - Espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux de sepsis et de pathologies neurodégénératives étudiées dans ce projet. - Expérience des investigateurs en expérimentation animale sur modèle murin. - Plateforme d’imagerie du petit animal adaptée aux modèles murins. Nous utiliserons plusieurs modèles transgéniques développant des déficits cognitifs (modèles de Maladie d’Alzheimer). Justification des stades de développement : Nous utiliserons uniquement des animaux adultes. L’induction du sepsis aura lieu à 6 mois (précoce) ou 12 mois (tardif). L’âge de 6 mois, correspond sur le plan immunologique à une phase de stabilité immunitaire qui reste asymptomatique (pas encore de déclin cognitif marqué). L’âge de 12 mois, correspond à un stade bien plus avancé de pathologie neurodégénérative associé à une phase de vieillissement immunitaire. Ce stade sera étudié dans un second temps et permettra d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato encéphalique (BHE) à un stade de démence établie.
Etude de la vascularisation au cours de la démyélinisation dans un modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 70 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 30 d'un niveau léger. Une encéphalomyélite auto-immune leur est provoquée par deux administrations sous anesthésie, puis une injection sur animal vigile deux jours plus tard. Les troubles de la marche, de la coordination, la faiblesse musculaire et la perte de poids s'installent en deux semaines et culminent trois à cinq jours. L'objectif reste descriptif, caractériser la chronologie des modulations de la vascularisation cérébrale, et le porteur affirme que ce travail exige l'"organisme entier" parce que les modèles ex vivo ne rendent pas les échanges entre tissu nerveux et cellules immunitaires du sang.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neurodégénérative chronique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une démyélinisation et une dégénérescence axonale. La forme la plus courante de la maladie est la forme récurrente-rémittente (RRMS), dans laquelle des poussées répétées de symptômes neurologiques sont suivies de périodes de récupération partielle ou complète. Les altérations de la structure et de la fonction du système vasculaire jouent un rôle essentiel dans les troubles neurodégénératifs chroniques telle que la sclérose en plaques. Au début de la maladie, la barrière hémato-encéphalique perd son imperméabilité, ce qui permet l'infiltration ultérieure de cellules immunitaires périphériques qui provoquent une démyélinisation neuronale et des dommages axonaux. Des études récentes réalisées en imagerie cérébrale sur des cohortes de patients atteints de SEP ont décrit le remodelage vasculaire pendant la formation et l'évolution des lésions). En particulier, une augmentation du débit sanguin cérébral précède l'apparition des lésions et la démyélinisation. Les mécanismes cellulaires impliqués dans le remodelage vasculaire dans les maladies démyélinisantes n'ont pas encore été entièrement définis. L’objectif de ce projet sera donc de caractériser précisément les modulations de la vascularisation et leur chronologie dans un modèle murin de la SEP, notamment l’étude de l’angiogénèse, la prolifération des cellules endothéliales et vasculaire et l'expression de facteurs d’hypoxie dès l’apparition des premiers symptômes.
Bénéfices attendus
La sclérose en plaque (SEP) est la seconde cause de handicap chez l’adulte jeune en France, elle touche plus de 120 000 personnes en France, et plus de 2 millions dans le monde. Il n’existe présentement aucun traitement curatif pour cette pathologie. Ce projet permettra d'étudier des processus pathologiques et réparateurs dans un modèle murin de Sclérose en plaques dans l'organisme entier et ainsi compléter et valider des mécanismes qui semblent d’intérêt dans la pathologie d’après les études IRM récemment obtenues chez l’homme. Cela pourrait permettre notamment de mieux comprendre le rôle de la vascularisation et sa modulation dans la physiopathologie de la SEP.
Procédures
Les animaux, sous anesthésie générale, recevront deux administrations d’un produit pour la mise en place de notre modèle pathologique et du groupe contrôle (10 minutes maximum). 2 jours après ils recevront une deuxième injection (une fois, durée inférieure à 1 minute par animal, vigile). Afin de tester la perméabilité cérébrale, nous injecterons une molécule 1h avant l’euthanasie des animaux (une fois, durée inférieure à 1 minute par animal, sous anesthésie générale).
Impact sur les animaux
Après induction de notre modèle pathologique, les souris peuvent développer des troubles de la marche, de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids. Ces symptômes s’installent progressivement au bout de 2 semaines environ et atteignent un pic durant 3-5 jours, puis sont suivis d’une récupération partielle ou complète en quelques jours. L’anesthésie gazeuse mise en place pour minimiser le stress lié à la manipulation lors de l’induction de la pathologie sera très courte (inférieure à 10 minutes) et sera donc associée à un risque infime de détresse cardio-respiratoire et d’hypothermie. Les injections génèreront un stress et une brève et légère douleur au point d’injection. Lors des injections d’induction de la pathologie, il existe également un risque de lésion cutanée du point d’injection dû à la molécule injectée, prise en charge par la stérilisation du lieu d’injection avant manipulation.
Devenir
Des analyses seront réalisées post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux pour le prélèvement des tissus d’intérêt.
Remplacement
Dans un effort de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles ex vivo. Les modèles murins in vivo sont nécessaires pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la réparation tissulaire dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux et cellules immunitaires sanguines, ainsi que les apports métaboliques en lien avec le réseau sanguin, qui sont des composantes essentielles à étudier de cette pathologie, d’après les travaux en imagerie effectués chez le patient.
Réduction
Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés, estimés à 100 maximum, et de ne pas sur-dimensionner le nombre d’animaux étudiés lors de nos expériences : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul statistique après la première expérience. Les données obtenues seront analysées avec les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Un environnement enrichi leur est fourni, comprenant nidification (coton de nidification, kraft), et bâtonnet à ronger. Nous respecterons une période d’acclimatation d’une semaine à l’arrivée des animaux dans l’animalerie avant toute inclusion dans la procédure. Les animaux sont observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci est transmise à l’équipe de recherche, à la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et au vétérinaire afin de mettre en place une prise en charge rapide et adaptée pour éviter toute souffrance de l’animal. Ils seront également surveillés de manière spécifique par l’équipe dès l’induction de la pathologie : afin de suivre l’évolution des signes cliniques une grille de score adaptée à notre modèle est utilisée quotidiennement voir bi-quotidiennement lors de la phase aiguë de la pathologie. Nous mettrons en place une assistance nutritionnelle dès l’apparition de difficultés motrices (alimentation humide ou en gelée, facilement accessible dans la cage). L’induction de la pathologie sera réalisée sous anesthésie pour minimiser le stress et la douleur des animaux. On s’assurera du maintien de la température physiologique des animaux tout au long de l’anesthésie (chambres d’induction et de réveil chauffées, tapis chauffant) et on appliquera un gel oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire. L’injection intraveineuse avant euthanasie sera également réalisée sous anesthésie générale afin de réduire le stress induit pour les animaux. L’euthanasie médicamenteuse sera ensuite réalisée après une pré-sédation des animaux pour éviter tout stress ou douleur lors de l’injection létale. Des points limites seront définis et respectés pour éviter toute souffrance animale non nécessaire pour la procédure.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proche de l'Homme. Le modèle de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) chez la souris est un modèle classique de sclérose en plaques (SEP), permettant de reproduire en partie l’aspect inflammatoire observé chez les patients, et qui apporte une approche intégrée des déficits observés dans la pathologie. Il s’agit donc d’un modèle particulièrement adapté pour notre objectif scientifique de suivi de l’évolution de la vascularisation au cours du développement des lésions de SEP. Des animaux adultes de souche commerciale, âgés de 10-12 semaines au moment de l’induction de l’EAE (de même pour les contrôles), seront utilisés pour cette étude. Après une semaine d’acclimatation, les animaux sont tatoués. L’âge adulte est requis pour pouvoir induire l’EAE. L’usage de jeunes adultes reproduit par ailleurs les conditions d’initiation de la SEP chez l’humain et limite les risques d’artefacts liés au vieillissement de l’animal.
Effet d’un mélange d’huiles essentielles sur la colonisation de Campylobacter en poulet de chair
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
365 poulets de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes. Ils reçoivent Campylobacter jejuni par voie orale, un mélange d'huiles essentielles dans l'eau de boisson, et sont pesés chaque semaine sous contention, jusqu'à trente-cinq jours, l'âge auquel les poulets de chair partent à l'abattoir. L'objet est de limiter la contamination des élevages, la volaille étant la principale source de campylobactériose humaine. Le porteur annonce n'attendre aucun effet indésirable, l'infection passant selon lui inaperçue chez les oiseaux, et développe en parallèle un modèle in vitro dont la validation passe justement, écrit-il, par des essais sur poulets jugés "indispensables".
Objectifs
L’objectif du projet vise au déploiement d’une stratégie de gestion Campylobacter spp. en élevage de poulet de chair, grâce à des alternatives naturelles telles que les huiles essentielles (HE). Cette procédure sera mise en place afin d’étudier l’effet d’HE sur la colonisation de Campylobacter jejuni chez le poulet de chair et son impact éventuel sur le microbiote du poulet. Les résultats obtenus seront utilisés pour les comparer à ceux d’un nouveau modèle prédictif in vitro en cours de développement qui à terme pourrait permettre de réduire à terme l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Les HE sont connues pour leurs effets bénéfiques sur les animaux en élevage. Différentes posologies de ces HE dans l'eau de boisson seront évaluées afin d’optimiser l’effet sur la colonisation de Campylobacter. Par ailleurs, les animaux témoins utilisés dans cette procédure seront également utilisés pour des analyses préliminaires visant à étudier l’impact de Campylobacter sur l’axe intestin-cerveau du poulet. Le lien entre microbiote intestinal et fonction cérébrale est de plus en plus reconnu, mais reste peu documenté chez cette espèce. Les prélèvements permettront d’évaluer ses effets sur l’intestin, le microbiote, l’inflammation et certains marqueurs neurobiologiques. Ces données poseront les bases de futurs projets de recherche.
Bénéfices attendus
Ce travail est réalisé dans le but de proposer un moyen de lutte plus efficace contre la contamination à Campylobacter dans les élevages. En parallèle, l’effet des HE sur le microbiote du poulet pourra amener de nouvelles connaissances à ce sujet. Par ailleurs à la fin de ce projet, les résultats obtenus sur l’effet anti-colonisateur des HE sur le modèle poulet seront comparés à ceux obtenus par un nouveau prédictif du modèle et ainsi valider son utilisation comme modèle alternatif à l’expérimentation animale. Parallèlement, sur les lots témoins, des prélèvements supplémentaires seront effectués pour mettre en place de nouvelles techniques d’analyses permettant l’étude de l’impact de la colonisation par Campylobacter sur l’axe intestin-cerveau chez le poulet de chair. Ces résultats préliminaires permettront de répondre à de futurs appels à projets pour apporter de nouvelles connaissances à ce sujet.
Procédures
Les animaux seront soumis à une contention d'une durée inférieure à 1 minute lors de l’inoculation par voie orale de Campylobacter jejuni ou de Tryptone Sel ou lors des pesées des animaux hebdomadaires. Le seul effet indésirable attendu lors de cette procédure est le stress induit à la contention lors de la pesée hebdomadaire des animaux et lors de l’inoculation orale.
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendu d’effet indésirable tout au long de cet essai. Les infections à Campylobacter chez les volailles passent généralement inaperçues et asymptomatiques. Les campylobacters se multiplient dans le tube digestif des oiseaux et peuvent être excrétées en grande quantité dans les déjections. La souche de C. jejuni utilisée dans cette étude a déjà fait l’objet d’essais in vivo et aucun effet indésirable n’a été observé. Les HE sont classées parmi les produits GRAS (Generally Recognized As Safe) par la FDA (US Food & Drug Administration) et dans la pharmacopée Française. Ces dernières, sont considérées d’un point de vue réglementaire comme des additifs sensoriels, celles-ci sont connues pour leurs propriétés antimicrobiennes, antioxydantes et anti-inflammatoires en élevage. Le choix de la dose finale appliquée dans l’eau de boisson se base sur les connaissances internes en termes d’acceptabilité et d’appétence du produit, mais également sur les recommandations de l’EFSA : dans ces dosages, les apports totaux journaliers maximums sont respectés pour les poulets en engraissement. Toutes les interventions seront réalisées par des personnels expérimentés dans la réalisation des différents actes pour limiter au maximum le stress. Si toutefois, une altération de l’état de santé était observée quelle que soit la raison, l’évaluation des points limites sera réalisée afin de décider la mise à mort des animaux concernés.
Devenir
Les prélèvements des différents organes nécessitent la mise à mort des animaux, c’est pourquoi tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale.
Remplacement
La volaille et notamment le poulet de chair représente une source importante de campylobacterioses pour l’Homme. Ainsi, il est nécessaire de contribuer au développement d’un moyen de lutte contre Campylobacter dans la filière avicole afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par cette bactérie. Aucune méthode alternative n’est disponible à ce jour, toutefois dans le cadre de ce projet, le développement d’un modèle d'infection in vitro est en cours afin de réduire, à terme, l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Pour valider ce modèle, le recours à des essais sur poulets de chair est toutefois indispensable.
Réduction
Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. Des tests de comparaison de moyennes seront effectués pour analyser les résultats des différents lots à chaque date de prélèvement. En raison de la variabilité interindividuelle importante du microbiote intestinal et des niveaux de colonisation par Campylobacter, il a été déterminé qu’un nombre minimum de 14 animaux par condition était nécessaire pour chaque temps donné afin d’assurer la robustesse des tests statistiques. Compte tenu de la mortalité qui peut avoir lieu au cours de l’essai et de problèmes techniques qui peuvent survenir au cours des manipulations, un nombre de 15 animaux par condition sera prélevé à chaque point de prélèvement pour s’assurer que le nombre minimum de 14 animaux sera atteint. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, dans les lots 7 et 8, seulement 30 animaux seront mis en place. Par ailleurs, cinq animaux seront utilisés au début de l’étude pour vérifier l’absence de contamination par Campylobacter. Au total de 365 animaux seront utilisés.
Raffinement
Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer des conditions d’hébergement limitant l’inconfort potentiel des animaux. Quatre animaleries seront utilisées. Chaque lot de poulets sera installé dans des parcs au sol entourés par des panneaux en bois. La litière sera composée de copeaux de bois (qui sert d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière. Les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment réservé aux poulets de chair spécifiques à leur âge. Afin de stimuler les poussins à s’alimenter dans leurs premières heures de vie, des alvéoles en carton de plateaux d’oeufs seront disposés sur les copeaux de bois avec de l’aliment et des cartons seront apposés sous les mangeoires. Les alvéoles en cartons servent également d’éléments de grattage et de picotage. Les paramètres d’ambiance utilisés sont préconisés pour les élevages de poulets de chair. Les installations sont équipées de lumières électriques programmables, d'un chauffage électrique automatisé et d'une ventilation. Les pesées hebdomadaires et l’inoculation individuelles des animaux seront réalisées conjointement par deux personnes habilitées dans le but de réduire la durée de la contention et de l’intervention sur l’animal pour réduire le stress induit (par exemple, la contention de l’animal sera réalisée par une personne, pour que l’autre puisse l’inoculer plus facilement). Les animaux seront observés quotidiennement par les animaliers. En cas de la présence de symptomes chez plusieurs animaux (diarrhees, troubles respiratoires…), le responsable du service d’expérimentation (vétérinaire) et les responsables du projet seront contactés (mail/téléphone) pour décider de la conduite à tenir. En cas d’atteinte des points limites suivants : blessure grave, prostration, absence de réaction après sollicitation (absence de réponse à des stimuli tactiles et visuels), anorexie ou impossibilité de s’abreuver ou de s’alimenter, les animaux concernés seront mis à mort.
Choix des espèces
Les campylobacterioses humaines sont principalement attribuées à la filière avicole. Ce projet a pour objectif de développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Campylobacter dès l’élevage afin de réduire la charge qui arrive sur la chaine alimentaire. Par conséquent, le poulet de chair est l’espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de cette procédure. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 35 jours (âge d’abattage des poulets de chair pour la consommation).
Etude chez la souris de l’impact de l’hypergravité sur la biodisponibilité relative et absolue d’un composé utilisé en prévention du mal de l’espace, et sur les performances de mémoire à court terme
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Ajuster la dose d'un antinauséeux pour les astronautes et le personnel des vols paraboliques : 160 souris vont être utilisées, 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 80 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur plasma et leur cerveau. La moitié passe trente minutes en centrifugeuse en hypergravité, l'autre moitié est placée dans une nacelle à côté pour subir le bruit et le stress de la machine. Le porteur décrit une sensation d'alourdissement, une modification de la température centrale, une baisse de la prise alimentaire et une réduction de l'activité locomotrice à la sortie, puis annonce un test de mémoire à court terme de cinq minutes sans préciser lequel. Les bénéfices avancés tiennent à la sécurité des astronautes et à la nécessité de "rentabiliser au mieux possible les investissements humain et financier colossaux" des vols paraboliques.
Objectifs
Ce projet est situé dans le domaine de la recherche expérimentale. Il vise à étudier les conséquences d’une altération du champ gravitationnel sur la pharmacocinétique d’un médicament utilisé pour le traitement du mal de l’espace. Ce médicament est une molécule d’origine naturelle, extraite principalement de plantes. Elle agit en bloquant certains récepteurs aux neurotransmetteurs. A faible dose, elle est utilisée pour traiter le mal des transports, notamment les nausées et les vomissements – que ce soit sous forme de patch ou en sous-cutané dans le cadre des campagnes de vols paraboliques. A forte dose, ce médicament présente de nombreux effets indésirables centraux, tels que des hallucinations, une confusion mentale et une amnésie. Cette molécule est d’ailleurs utilisée comme modèle pharmacologique de troubles cognitifs induits, que ce soit chez l’animal ou chez l’homme. Du fait de l’hypergravité, une augmentation de perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) a été décrite à la fois chez l’homme et chez l’animal. D’un point de vue théorique, l’augmentation de la perméabilité de la BHE pourrait modifier la posologie du médicament dans une indication du traitement préventif du mal de l’espace. Ainsi, l’objectif de notre étude est de mesurer plus particulièrement l’impact de l’augmentation de la BHE sur la biodisponibilité à la fois absolue (plasmatique) et relative (centrale) du médicament. In fine, il s’agira d’émettre des recommandations d’adaptation posologique du fait de la prise en compte de l’environnement de gravité modifiée lors d’une prescription de ce médicament pour le traitement du mal de l’espace.
Bénéfices attendus
2/3 des astronautes subissent les symptômes du mal de l’espace lors des 72 premières heures en orbite. Par ailleurs, la durée des missions spatiales s’est allongée ces dernières années pour mieux préparer les premiers voyages vers Mars. La prise en charge optimisée du mal de l’espace permet aux astronautes de travailler dans des conditions de sécurité et de santé optimales, ce qui est primordial au vu de leur préparation longue et rigoureuse, et des investissements mis en place pour ces missions. Les conséquences néfastes du mal de l’espace s’appliquent également aux vols paraboliques, durant lesquels le personnel de recherche se doit de rentabiliser au mieux possible les investissements humain et financier colossaux. Si l’hypergravité augmente la distribution de la molécule au niveau cérébral, induisant secondairement des altérations cognitives, une adaptation posologique devra s’imposer pour rester dans la fenêtre thérapeutique. Des travaux d’optimisation des doses administrés devront alors être entrepris. A terme, les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’impact de l’hypergravité à court terme sur la perméabilité de la BHE des souris, et de savoir si son altération provoque des modifications de la distribution de la molécule, induisant/aggravant ou non un phénotype comportemental de déficit de mémoire spatiale à court terme. Ainsi, pour de futurs travaux, si notre hypothèse est validée, il s’agira de déterminer par exemple une gamme de dose qui sur terre est suboptimale, mais qui avec l’altération de la BHE, reste efficace et non-toxique. Par ailleurs, ce champ de recherche trouve également un domaine d’application sur terre. En effet, le corps humain en apesanteur subit des changements accélérés comparables à ceux observés au cours du vieillissement. La recherche en pharmacologie spatiale pourrait aider à une meilleure prise en charge thérapeutique des maladies liées au vieillissement.
Procédures
- Tous les animaux recevront une injection unique d’une durée de 1 minute - La moitié des animaux sera soumise à une session de centrifugation d’une durée totale de 30 minutes. La 2ème moitié des souris sera placée dans une nacelle à proximité de la centrifugeuse, afin de les exposer au bruit et au stress engendré par la centrifugation. - Tous les animaux seront soumis une fois au test comportemental de mémoire à court terme, pendant une durée de 5 minutes. - Enfin, l’ensemble des animaux seront exposés à une intervention terminale (prélèvement sanguin) d’une durée inférieure à 5 minutes, menée sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les nuisances seront : a) L’administration nécessitant une contention. Un stress physique et une douleur légère dus à l’injection sont attendus lors de cette manipulation (nuisance légère). b) La mise en gravité modifiée des animaux induit une sensation d’alourdissement / d’allégement modifiant les capacités de l’animal à se déplacer, une modification de la température centrale et une altération de prise alimentaire induisant un ralentissement de la prise de poids des animaux. Au vu de la courte durée d’exposition à l’hypergravité, les animaux n’ont pas le temps de s’habituer aux variations d’intensité gravitationnelle (passage en hypergravité puis retour en gravité normale en 30 minutes). Ces variations rapides sont source d’une augmentation importante du niveau de stress et d’une réduction de l’activité locomotrice en sortie de centrifugation (nuisance modérée). c) Le prélèvement sanguin sous anesthésie générale (acte sans réveil).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le plasma et les cerveaux pour des investigations post-mortem.
Remplacement
Ce projet vise à étudier l’impact d’une modification de gravité sur les caractéristiques pharmacocinétiques (biodisponibilité et concentration plasmatiques et sanguines) d’un médicament utilisé dans le cadre du mal de l’espace. L’étude des caractéristiques pharmacocinétiques nécessite de faire appel à une approches in vivo. De plus, l’évaluation des performances de mémoire ne peut être réalisée que sur un organisme capable d’effectuer une tâche cognitive (ici test évaluant la mémoire de travail à court terme). Ainsi, aucun remplacement par des modèles in vitro ou in silico (modèles mathématiques, bio-informatiques) ne peut être réalisé.
Réduction
Le nombre d’animaux prévus dans cette étude a été réduit au maximum – au regard du test comportemental envisagé (test comportemental de mémoire à court terme) pour lequel le laboratoire possède une expertise internationale ainsi que sur la base de la littérature. Tous les animaux utilisés pour les études comportementales seront utilisés pour les études post-mortem ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. De même, afin de réduire le nombre d’animaux, chaque souris se verra prélever sang et cerveau. Le calcul de taille d’échantillon prend en compte la nécessité d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure sur les effets observés. En effet, un calcul d’effectif nous a permis d’aboutir à ce nombre (n=10 par groupe et par sexe) sur la base de données précédentes acquises au laboratoire. Par ailleurs, l’utilisation des 2 sexes permettra d’obtenir de potentielles différences de résultats entre les mâles et les femelles, ce qui peut éviter la réalisation d’une étude supplémentaire pour cet aspect.
Raffinement
Les cages d’hébergement seront enrichies avec du kraft et une maison en papier mâché. Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation des animaux à l’animalerie et à l’expérimentateur sera mis en place sous la forme de handling (1 semaine) dès l’arrivée des animaux au sein de notre animalerie. Ceci aura principalement pour but de réduire le stress lors de la manipulation et de la contention nécessaires à l’injection. Les souris seront placées 30 minutes dans la pièce de la centrifugeuse pour acclimatation, et un délai d’au moins 90 minutes séparera la fin de la centrifugation et le début du test de mémoire à court terme. De la nourriture humidifiée sur le sol ainsi que de la gélatine seront mis dans les cages pour permettre aux animaux de se nourrir et de s’hydrater facilement au début de l’exposition à l’hypergravité (il en sera de même pour les animaux témoins, qui seront placés dans une nacelle à proximité de la centrifugeuse, dans la même pièce). Les animaux seront surveillés par un système vidéo dans la centrifugeuse. De plus, un responsable des animaux vérifiera l’apparence physique externe (poils hérissés, blessures…) ou des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement ou réagissant de manière inhabituelle à l’expérimentateur, réduction importante de l’activité motrice…) des animaux en permanence, et particulièrement à la sortie de la centrifugeuse. Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude (non réalisation du test comportemental) et une discussion sera entreprise avec des membres de la SBEA (Structure chargée du Bien-Etre Animal) concernant son éventuelle mise à mort selon des points limites précoces. De plus, une anesthésie générale sera réalisée sur les animaux pour les prélèvements sanguins.
Choix des espèces
Des souris âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées. La plupart des études auxquelles nous nous sommes référés utilisent des souris du même âge. La souris est un bon modèle car il est de petite taille, peut être maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse et supporte bien une modification de la gravité. De plus, leur génome est connu et, des modifications de celui-ci sont possibles et pourraient nous être utiles par la suite (Animaux Génétiquement Altérés (AGA)). C’est aussi une souche qui est beaucoup étudiée au laboratoire et sur laquelle nous avons donc une importante base de données.
Evaluation de la propriété analgésique de la mycolactone chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Une injection de mycolactone dans le coussinet plantaire, puis la mesure de l'épaisseur du pied deux fois par jour pendant soixante-dix-huit heures : 300 rats au maximum vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués au plus tard quatre-vingt-seize heures après l'inoculation, leurs pattes prélevées pour histologie. Le protocole consiste à augmenter la dose de groupe en groupe jusqu'à ce qu'un gonflement apparaisse, ce gonflement signalant que la dose maximale tolérée est atteinte. Le porteur cite parmi les effets attendus une altération de la démarche, boitement ou gêne locomotrice. Il décrit par ailleurs la mycolactone comme un analgésique plus puissant que la morphine, dont les propriétés pro-inflammatoires sont précisément ce que ce protocole cherche à faire apparaître.
Objectifs
Nous étudions une molécule appelée mycolactone, produite par une bactérie. La mycolactone présente un fort pouvoir analgésique, supérieur à celui de la morphine. Injectée sous la peau, elle peut soulager la douleur pendant plus de 24 heures en bloquant la transmission du message nerveux. Grâce à ses effets prolongés et localisés, elle pourrait être utile pour traiter les douleurs après une opération chirurgicale. Avant de tester son efficacité dans ce contexte, nous devons vérifier qu’elle est bien tolérée chez le rat, notamment au niveau de la peau où elle serait injectée. L’étude a pour but de déterminer les doses qui ne provoquent pas de réactions indésirables. Elle constitue une étape indispensable avant de poursuivre le développement de cette molécule comme futur traitement contre la douleur.
Bénéfices attendus
Nos résultats antérieurs ont montré que la mycolactone présentait des propriétés analgésiques lorsqu’elle était administrée par injection en sous cutanée chez des souris naïves. Compte tenu de l’ensemble des résultats positifs obtenus ces derniers mois, il nous semble judicieux d’évaluer les propriétés analgésiques de la mycolactone dans le traitement de douleurs postopératoires dans le modèle rat mais qui nécessite au préalable de déterminer les tolérances chez le rat. Ce projet se justifie puisque l’arsenal thérapeutique contre les douleurs reste limité.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : 1. L'inoculation dans le coussinet plantaire des formulations à tester. L’inoculation des formulations à tester durera moins de 20 secondes par animal. 2. La mesure de l’épaisseur du pied qui sera réalisée 2 fois par jour pendant 3 jours. La mesure de l'épaisseur du coussinet plantaire durera moins de 30 secondes par animal
Impact sur les animaux
L’inoculation de la mycolactone (sous différentes formulations) pourrait entraîner les effets suivants : 1. Surinfection au site d’inoculation : malgré nos précautions, une surinfection pourrait survenir. Une surinfection pourrait être diagnostiquée par un gonflement du coussinet, une rougeur ou un changement de comportement marqué de l’animal. Selon notre expérience, la surinfection est très rare
Devenir
A la suite de la dernière mesure, tous les animaux seront euthanasiés et les pattes seront récupérées pour des études histologiques.
Remplacement
Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude mais nous ne pouvons à ce stade nous passer d'utiliser des animaux. En effet, la phase d’étude réalisée chez les animaux permettra de sélectionner les formulations (tout particulièrement la concentration de principe actif) qui pourront être évaluées dans un deuxième temps (ne concernant pas la présente demande), dans un modèle de douleur postopératoire.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour cette étude a été calculé pour obtenir des résultats fiables, tout en évitant d’utiliser plus d’animaux que nécessaire. Chaque groupe sera composé de 6 rats, ce qui permet d’observer des différences significatives entre les conditions testées. Si une dose ne provoque pas d’inflammation locale (mesurée par l’épaisseur de la patte), une dose un peu plus élevée sera testée chez un autre groupe. Dès qu’un gonflement visible sera observé, l’objectif sera atteint : cela indiquera que la dose maximale tolérée a été trouvée. À partir de ce moment-là, les doses suivantes ne seront pas testées, ce qui permettra d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires. Cette étape est essentielle pour pouvoir, par la suite, tester la molécule dans un modèle plus complexe de douleur postopératoire. Des doses croissantes seront utilisées dans différents groupes d’animaux pour limiter au maximum leur nombre, conformément aux principes de réduction et de raffinement. Le nombre total prévu est de 300 rats, mais ce chiffre représente un maximum. Il est probable qu’un nombre inférieur suffise à atteindre les objectifs de l’étude.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des rats, un suivi adapté des animaux a été instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'elles pourraient éprouver. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Un suivi régulier sera effectué sur l'ensemble des animaux (2 fois par jour sur la durée de l’expérience (72h)) et des indicateurs comportementaux et physiques sont prédéfinis et constituent les points limites. Pour éviter toute souffrance ou stress lors du protocole expérimental, un anesthésique volatil (isoflurane) sera utilisé au moment de l’inoculation des formulations dans le coussinet plantaire postérieur gauche. Pour réduire le risque de souffrance, les doses de principe actif (mycolactone) seront évaluées séparément par ordre croissant. Une anesthésie gazeuse sera aussi employée pour la mesure de l’épaisseur des pieds. Le nombre d’animaux prévu est de 300 ; il s’agit du nombre maximal, il sera probablement réduit. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et, est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
De nombreuses études visant à identifier de nouveaux analgésiques pour la prise en charge de la douleur post-opératoire utilisent « l’espèce rat ». En effet, le modèle de Brennan est le modèle de référence pour évaluer des analgésiques sur la douleur postopératoire. Dans ce contexte, notre étude visant à déterminer les doses maximales tolérées, se justifie chez le rat. Les animaux utilisés pour ce protocole devront, à l’initiation de l’expérimentation, être âgés de 7 à 9 semaines (maturation immunitaire et maturation du système nerveux).
Etude du stade hépatique et de l’initation du stade sanguin du paludisme faisant des rechutes et évaluation pré-clinique d’un vaccin dans un modèle de souris humanisée pour le foie et le sang. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Les souris utilisées sont greffées d'hépatocytes et de globules rouges humains et privées de système immunitaire, ce qui les rend plus vulnérables aux infections. 1 695 d'entre elles vont être utilisées, 690 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 1 005 un niveau modéré. Elles sont infectées par Plasmodium vivax sous une anesthésie de quarante-cinq minutes, puis subissent jusqu'à seize prélèvements de sang, chacun compensé par une injection de perfusion ou de globules rouges humains, le porteur reconnaissant que cette fréquence peut provoquer une anémie et une perte de poids. Toutes sont tuées pour prélever le foie et y chercher le parasite, y compris ses formes dormantes.
Objectifs
Le paludisme reste un défi majeur en santé publique, avec environ 250 millions de cas cliniques chaque année et près de 600 000 décès. Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax sont les deux espèces de parasites les plus répandues. Bien que P.vivax soit moins mortel que P.falciparum, il touche plus d'un tiers de la population mondiale à cause de sa capacité à former des hypnozoïtes, des formes dormantes dans le foie. En effet, les formes sporozoïtes injectées par les moustiques gagnent le foie puis, certaines infectent rapidement les globules rouges (paludisme) alors que d'autres restent inactives pendant des mois ou des années dans le foie. Leur réactivation provoque des rechutes de la maladie, compliquant ainsi la lutte contre l'infection. Actuellement, il n'existe aucun vaccin contre P. vivax. Une grande initiative Européenne vise à développer des vaccins de nouvelle génération offrant une protection contre ce parasite. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer la protection apportée par les anticorps produits après vaccination chez un modèle spécifique de souris et chez les volontaires humains. Ce projet représente une opportunité précieuse de déterminer si ce modèle de souris peut prédire l'efficacité́ des futurs vaccins avant qu'elle ne soit évaluée chez l'Homme. MODIFICATION : l'ajout d'une procédure pour déterminer un modèle efficace pour étudier l'infection au stade sanguin (en plus du stade hépatique) et l'efficacité de futurs vaccins sur ce stade nécessite une modification du projet intial avec augmentation du nombre d'animaux
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer la pertinence prédictive d'un modèle spécifique de souris en offrant une occasion unique de comparer la protection conférée par les anticorps générés par un vaccin entre les participants des essais cliniques et les souris. Les résultats obtenus fourniront des informations essentielles sur l'efficacité de ce modèle et sa valeur en tant que référence, pouvant être utilisée à l'avenir pour évaluer l’efficacité de nouveaux candidats vaccins.
Procédures
Pour ce projet, une partie des animaux recevra un sérum par deux voies différentes (animal anesthésie 45 minutes, 1 fois, 5 minutes par acte OU animal vigile, 1 fois, 1 minute). Tous les animaux seront infectés (animal anesthésié 45 minutes, 1 fois, 5 minutes par acte). (MODIFICATION) Certains animaux recevront des injections pour moduler leur statut immunitaire (animal vigile, 4 fois, 1 minute). Une partie des animaux sera soumise à des prélèvements sanguins de petit volume (animal vigile, 16 fois maximum, 5 minutes). Pour compenser le volume prélevé lors des prélèvements sanguins et pour permettre une meilleure récupération de certains animaux, une injection de solution de perfusion sera réalisée après chaque prélèvement (animal vigile, 16 fois maximum, 1 minute). (MODIFICATION) Un autre groupe d'animaux recevra une injection de globules rouges humains (animal vigile, 16 fois maximum, 1 minute) qui servira également de compensation aux prélèvements sanguins. Tous les animaux auront un prélèvement sanguin de volume plus élevé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute) qui interviendra juste avant l'euthanasie des animaux par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les animaux sont immunodéprimés, par conséquent ils sont plus sensibles aux infections. (MODIFICATION) L'infection avec le parasite du Plasmodium au stade sanguin uniquement pourra engendrer une réponse inflammatoire et une perte de poids. Les animaux pourront avoir des administrations qui pourront engendrer une douleur légère de courte durée au point d'injection et des douleurs abdominales pour les injections répétées. Les animaux seront soumis à des administrations et à un prélèvement sanguin sous anesthésie : l’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Plusieurs prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile, cela pourra engendrer une douleur légère de courte durée lors du prélèvement et dans de rares cas un hématome. La fréquence des prélèvements pourrait engendrer une anémie et une perte de poids. Les différentes manipulations des animaux pourront engendrer un léger stress.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire car il est nécessaire de prélever différents organes et principalement le foie afin de vérifier la présence et le stade de développement du parasite.
Remplacement
Plasmodium vivax étant un parasite strictement spécifique à l'homme, il n'est pas possible, à l'heure actuelle, de remplacer ce modèle de souris humanisée. Cependant, pour ce qui est de la prédiction de protection, la réalisation d'expériences in vitro en parallèle avec celles in vivo nous permettra de déterminer si le modèle in vitro que nous développons est tout aussi efficace que le modèle in vivo de souris humanisée pour prédire la protection. En conséquence, ces études pourraient éventuellement permettre de ne plus avoir recours à ce modèle murin dans ce contexte spécifique à l'avenir.
Réduction
1695 animaux au maximum seront utilisés dans ce projet dont 570 pour valider le modèle de souris et 1125 pour tester des sérums et anticorps sur les 5 ans du projet. Les tests d'efficacité des vaccins seront réalisés uniquement si le modèle murin est validé. Sur la base d'autres études réalisées avec le même type de modèle de souris, des groupes expérimentaux de 5 souris sont suffisants pour répondre aux questions posées. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. A la fin du projet, différents organes seront prélevés afin de valoriser au maximum l'utilisation des animaux.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Pour limiter l'expression du phénotype dommageable des animaux qui sont immunodéprimés, tout le matériel en contact avec eux est stérilisé. Les administrations qui pourraient stresser modérément les animaux sont réalisés sous anesthésie. Le réveil des animaux est réalisé dans un environnement chaud avec un accès facilité à l'eau et la nourriture. Les yeux sont protégés avec un gel ophtalmique jusqu'au réveil. Les prélèvements sanguins seront compensés par des administrations de solution de perfusion pour faciliter la récupération et l'hydratation (MODIFICATION) ou par des administrations de globules rouges humains. (MODIFICATION) Le poids des animaux sera controlé régulièrement pour limiter la perte de poids par la mise en place d'actions. Ainsi, la douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris est le modèle le mieux développé et connu pour les greffes de cellules provenant d'une autre espèce. Les lignées immunodéficientes et transgéniques pour les gènes d'intérêt permettant la greffe d'hépatocytes et de globules rouges d'autres espèces n'existent que chez la souris. Les animaux seront des animaux adultes qui seront utilisés entre 3 et 5 mois d'âge car la transplantation des hépatocytes humains se fait à 2 mois et nécessite 4 à 6 semaines pour que le modèle soit efficace.
Mesures métaboliques (test de sensibilité à l’insuline et dosages lipidiques) chez la souris
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Une souris par binôme et par procédure, pour quarante étudiants de master : le projet est un travail pratique de physiologie animale. 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Les étudiants apprennent le prélèvement de sang à la queue sur animal vigile et l'injection intrapéritonéale d'insuline, qui expose les souris à un risque d'hypoglycémie. Le porteur affirme que le remplacement est impossible parce que l'objectif du travail pratique est justement de confronter les étudiants "à la manipulation d'animal vigile", et juge essentiel de les sensibiliser tôt aux 3R.
Objectifs
L'objectif du projet est de réaliser un TP dans le cadre d'enseignement de physiologie animale. Ce TP comportent différets tests métaboliques qui sont 1_ la mesure de sensibilité à l'insuline sur échantillons sanguins et 2_ des dosages lipidiques plasmatiques. Il s’agit d’un TP dans le cadre d’un module obligatoire d'ateliers pratiques où la pratique en laboratoire est développée. Comme ce TP s'adresse à des niveaux Master 1, cette expérience pratique peut influencer positivement leurs choix ultérieurs de cursus et de stage en Master 2.
Bénéfices attendus
Les étudiants seront formés au prélèvement sanguin caudal, aux prélèvements tissulaires ainsi qu'à l'analyse de résultats expérimentaux autour du métabolisme des lipides chez la souris. D'autre part, les étudiants seront sensibilisés à l'expérimentation animale et à l'intérêt du bien être et du respect de l'animal dans ces conditions. Etant donné qu'il s'agit d'étudiants intégrés dans un cursus de physiologie animale, il semble essentiel de les confronter très tôt aux notions des 3R.
Procédures
prélèvement de sang caudal sur animal vigile pour les deux procédures. Injection intrapéritonéale d'insuline.
Impact sur les animaux
La nuisance attendue sur les animaux peut être le stress lié à la manipulation et à l'injection d'insuline. Un faible risque d'hypoglycémie suite à l'administration d'insuline est possible dans l'ITT.
Devenir
Quelle que soit la procédure, tous les animaux sont mis à mort pour prélèvements d'organes
Remplacement
l’objectif du TP est d'étudier une grande fonction physiologique de l'organisme et de confronter les étudiants à la manipulation d’animal vigile. On ne peut par conséquent pas le remplacer par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour un groupe de TP (40 étudiants) nous envisageons 1 souris par binome et par procédure.
Raffinement
Peu de manipulation seront réalisées sur les animaux. Seules les injections d’insuline et la mise à mort peuvent induire du stress lors de la contention. Il est donc nécessaire que l’ensemble de ces deux gestes soit réalisé par un manipulateur expérimenté. Les prélèvements de sang ne nécessitent pas de contention. Les étudiants vont apprendre en procédure 1 un geste de prélevement de sang caudale qui va leur servir en procédure 2. D'autre part afin d'éviter toute souffrance inutile de l'animal, nous appliquerons un antalgique local au bout de la queue 10 min avant incision.
Choix des espèces
Les paramètres métaboliques mesurés par les étudiants seront confrontés à des données bibliographiques issus d'études réalisées sur des souris adultes. Ainsi il est nécessaire de réaliser ces mesures sur ce modèle animal. Les souris utilisées seront des souris de 3 à 6 mois.
Impact de la mutation du gène responsable de la maladie rare de l’aniridie sur la cornée
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Une éraflure volontaire de la cornée, que le porteur compare à un grain de sable dans l'œil, attend une partie des souris de ce projet. 252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, l'autre modérée. Elles portent une mutation qui les prive d'iris ou leur donne des yeux anormalement petits, et dont la cornée s'opacifie avec l'âge, pour étudier une maladie humaine qui touche une personne sur 100 000. Le porteur conclut qu'"aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l'animal", tout en décrivant des douleurs passagères après l'abrasion et l'administration systématique d'antidouleurs.
Objectifs
L’aniridie est une maladie génétique très rare qui touche environ 1 personne sur 100 000. Une des caractéristiques principales de la maladie est l’absence partielle ou totale de l’iris, la partie colorée de l’œil. Elle peut aussi entraîner une sécheresse oculaire et une opacification progressive de la cornée, la couche transparente à l’avant de l’œil. Cela peut provoquer une baisse importante de la vision au fil du temps. Chez les personnes atteintes d’aniridie, la cornée est souvent plus fine, moins bien protégée et moins bien "innervée", c’est-à-dire moins bien reliée aux nerfs. Cela peut entraîner une perte de sensibilité et, dans les cas avancés, une opacification qui rend la vision floue. Beaucoup de patients deviennent malvoyants à partir de la soixantaine, même s’ils gardent souvent une perception de la lumière et des couleurs. Aujourd’hui, il n’existe pas encore de traitement pour guérir cette maladie. C’est pourquoi il est important de mieux comprendre comment cette mutation affecte l’œil, en particulier la cornée et son environnement. Dans notre laboratoire, nous étudions l’aniridie à l’aide d’un modèle animal (la souris) mimant ou reproduisant la maladie humaine. Nous allons analyser différents éléments de l’œil de ces souris : la composition des larmes, la pression à l’intérieur de l’œil, et l’état des fibres nerveuses de la cornée. Ces analyses nous aideront à mieux comprendre comment l’aniridie perturbe le fonctionnement normal de l’œil et à identifier, à terme, de nouvelles pistes de traitement.
Bénéfices attendus
Dans l’aniridie, la perte de vision s’aggrave lentement au fil du temps. Cela donne une chance précieuse d’intervenir avant que les dégâts ne deviennent irréversibles. Malheureusement, les traitements disponibles aujourd’hui sont très limités. À un stade précoce, certains collyres (gouttes pour les yeux) peuvent soulager les symptômes. Mais lorsque la maladie est plus avancée, la seule option est souvent une greffe de cornée. Or, cette opération est lourde, comporte des risques de rejet, et n’apporte parfois qu’un soulagement temporaire. Face à ce manque de solutions, notre projet de recherche a pour but de mieux comprendre ce qui ne fonctionne pas dans la cornée dans le cadre de cette maladie. Ainsi, nous espérons découvrir de nouvelles pistes pour développer des traitements innovants, plus efficaces et moins invasifs. Nous cherchons notamment à comprendre en détail les réactions en chaîne, au niveau moléculaire, qui mènent à la dégradation de la cornée. Ce travail devrait aussi donner lieu à des publications scientifiques, et peut-être à des dépôts de brevets, contribuant ainsi à faire avancer la recherche dans ce domaine encore peu exploré.
Procédures
Les souris seront manipulées pour permettre la mesure de certains paramètres importants, comme la sensibilité de la cornée ou la pression à l’intérieur de l’œil. Ces examens sont similaires à ceux réalisés régulièrement chez l’humain lors de consultations ophtalmologiques. Nous effectuerons une éraflure volontaire et contrôlée de la cornée, dans le but d’étudier l’étape de cicatrisation chez les souris malades. Cette blessure est légère, équivalente à un grain de sable dans l’œil, et guérit spontanément en trois jours. Durant toute cette période, les animaux sont suivis, et des antidouleurs leur sont administrés en cas de nécessité afin de garantir leur bien-être.
Impact sur les animaux
L’aniridie est une maladie génétique rare qui touche principalement les yeux. Pour mieux l’étudier, nous utilisons un modèle animal (la souris) qui mime cette maladie. Elle est caractérisée par une absence de l’iris, la partie colorée de l’œil et/ou par des yeux d’un volume anormalement petit. Ces animaux développent progressivement une opacification de la cornée due à la maladie, entraînant une diminution de leur acuité visuelle. Cela n’impacte pas leur comportement ni leur espérance de vie. Tout comme les patients, ces animaux ne présentent pas de signes de douleur liés à la maladie. Pendant les expériences, certaines manipulations sont nécessaires, comme mesurer la sensibilité de la cornée ou réaliser une blessure sur celle-ci. Cette blessure, appelée abrasion cornéenne, est faite sous anesthésie générale. Chez l’Homme, l’abrasion de la cornée est la première étape des traitements de la myopie au laser. L’abrasion est un modèle de blessure pouvant induire des douleurs passagères équivalente à une irritation dû à un grain de sable dans l’œil. Elle est superficielle et guérit spontanément en trois jours. Des médicaments antidouleur sont systématiquement administrés après chaque intervention, pour garantir le bien-être des animaux tout au long de l’étude. Les souris seront manipulées par les expérimentateurs, ce qui pourra générer du stress. La durée et la répétition des expérimentations sont rigoureusement réfléchies, afin de limiter au maximum les contraintes pour les animaux, notamment en évitant toute anesthésie générale répétée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin d’étudier l’effet de la maladie sur les structures de l’œil : la cornée, les larmes, l’iris et le cristallin.
Remplacement
Les méthodes en laboratoire sur des cellules seules ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organe entier comme l’œil, avec toutes ses parties et son fonctionnement. C’est pourquoi il est nécessaire d’utiliser un modèle animal, en particulier des souris porteuses d’une maladie rare comme l’aniridie. Ce modèle nous aide à mieux comprendre la maladie et ses effets sur l’ensemble de l’œil, un organe complexe.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires à cette étude a été rigoureusement déterminé à l’aide de logiciel permettant de calculer statistiquement le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats robustes. Sur l’ensemble de la durée du projet (5 ans), un maximum de 252 souris sera utilisé. Parmi les animaux utilisés, la moitié sera porteuse de la maladie et l’autre moitié sera saine afin de comparer les résultats.
Raffinement
Pendant la période d'acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiennes par les soigneurs, hébergement en groupe de 2 individus minimum, environnement adapté et enrichi. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée de l’intervention, avec l’utilisation d’antidouleurs et anesthésiques adaptés. Par conséquent, aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l’animal.
Choix des espèces
Le système visuel de la souris ressemble beaucoup à celui de l’humain, ce qui en fait un bon modèle pour étudier l’aniridie, une maladie rare de l’œil. Nous travaillons sur des souris adultes de 12 semaines, âge auquel l’œil a fini de se développer. Pour compléter, nous étudions aussi l’impact de la maladie au cours du développement, donc sur des souris plus jeunes : de 2, 3 et 4 semaines.
Etude d’une protéine impliquée dans l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à la fin pour que leur cerveau soit prélevé, 774 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 346 d'entre elles inhalent un agent convulsivant cinq jours de suite, 146 reçoivent des injections pendant cinq jours, l'ensemble servant à créer deux lignées génétiquement modifiées pour étudier une protéine liée à l'épilepsie. Le porteur affirme qu'aucune douleur n'accompagne les crises, par analogie avec la perte de conscience décrite chez l'humain, tout en signalant que les souris épileptiques meurent subitement dans moins de 5 % des cas et que les crises provoquées pourraient augmenter cette fréquence. Il conclut que le recours à des animaux vivants est "absolument nécessaire".
Objectifs
L’épilepsie est une maladie cérébrale qui se manifeste par des crises soudaines et répétées. Ces crises sont causées par une activité électrique anormale dans les neurones. L’objectif de ce projet est de générer deux modèles de souris génétiquement modifiée afin d’étudier les mécanismes neuronaux impliqués dans cette pathologie à différents moments de la vie et lors des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
Cette recherche pourrait aider à mieux comprendre les causes de l’épilepsie afin de développer de nouveaux traitements qui restaureraient l'excitabilité neuronale normale et atténueraient l'activité épileptique.
Procédures
Une injection sera faite pendant 5 jours sur 146 animaux. 346 animaux seront soumis à l’exposition répétée (5jours consécutifs) à un agent convulsivant par inhalation.
Impact sur les animaux
Une légère douleur de courte durée et de faible intensité peut survenir au moment du prélèvement de la biopsie au niveau de la queue. Les injections peuvent entrainer un stress et un inconfort ainsi que des lésions ou de l’inflammation sur le site d’injection. Aucune douleur n’est associée aux crises d’épilepsie qui se traduisent par une « extinction » de la conscience chez les humains, ce qui est très probablement la même chose chez les souris. Les crises induites artificiellement et les crises spontanées apparaissant chez les animaux devenus épileptique sont absolument de même nature, elles ont une durée inférieure à 1 minute, suivi d'une période d’immobilité d’environ 1 minute. Les animaux épileptiques ont un comportement normal pendant leur élevage mais meurent soudainement avec une fréquence faible (moins de 5%). Les inductions artificielles de crises pourraient augmenter la fréquence des morts soudaines. Aucun autre comportement ou effet indésirable n’est attendu.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, et seront ensuite utilisés afin de récupérer le cerveau pour des analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Remplacement
L’épilepsie est un syndrome complexe avec des mécanismes de mise en place (épileptogenèse) peu connus qui impliquent le système nerveux central, le système nerveux périphérique, le système cardio-vasculaire et probablement le système immunitaire. Il est donc impossible d’étudier ces mécanismes dans des systèmes cellulaire et l’utilisation d’animaux vivants est absolument nécessaire.
Réduction
Nous utilisons indifféremment les mâles et les femelles qui seront randomisés dans les groupes d’étude, soit une perte minimale due au genre. En effet, il n'a pas été constaté de différences entre les sexes concernant les troubles épileptiques dans les modèles murins d'épilepsie. Les schémas d’accouplement ont été optimisés afin que la quasi-totalité des animaux à phénotype dommageable produits soient utilisés dans les procédures expérimentales ; Le nombre minimum d’animaux nécessaires a été calculé pour utiliser le moins d’animaux possibles tout en répondant à la question scientifique.
Raffinement
Les animaux seront stabulées avec un abri, de la ouate et une buchette pour leur permette des activités variées et éviter toute souffrance ou inconfort. Une grille d'observation est utilisée par le personnel pour surveiller attentivement l'état des animaux pendant l'expérimentation. Toute modification visible de leur apparence ou de leur comportement est notée. Les animaux concernés sont alors suivis chaque jour et peuvent recevoir un traitement contre la douleur si nécessaire. Si certains signes de mal-être persistent plus de 48 heures, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèce (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies dont l’épilepsie. Les crises peuvent être induite sans limite à partir du 19eme jour postnatal jusqu’à l’âge adulte. Nous utiliserons les animaux dès le sevrage à l’âge de 3 semaines pour avoir des animaux assez robustes et mimer l’apparition des crises chez les jeunes ainsi qu’a l’âge adulte.
Etude du rôle de la vitamine D sur le bien-être de ouistitis hébergés en animalerie confinée
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Des lampes UV doivent corriger la carence en vitamine D de primates enfermés en animalerie sans accès à la lumière du soleil, l'enfermement lui-même restant hors du champ du projet. 48 ouistitis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, tous gardés en vie et réutilisés ensuite dans d'autres protocoles. Ils sont capturés, transportés jusqu'à la salle de prélèvement, anesthésiés quinze à trente minutes pour deux prises de sang, et deux prélèvements de poils. Le porteur indique que la réduction du nombre d'individus est "difficilement applicable" ici, et attend des résultats qu'ils garantissent "des données de haute qualité lorsque ces animaux seront impliqués dans des projets de recherche".
Objectifs
Aujourd'hui, l'utilisation des ouistitis en recherche biomédicale est en pleine expansion et la nécessité d'une gestion adaptée des conditions d'hébergement de colonies de ouistitis requiert une attention accrue. Parmi d'autres paramètres, la nutrition est un aspect majeur de l'élevage moderne ; les besoins nutritionnels individuels doivent être satisfaits à chaque étape de la vie, pour la santé et le bien-être des animaux en élevage. Ces bonnes pratiques contribuent également à réduire et à limiter le risque de résultats de recherche erronés ou variables dus à une mauvaise gestion. L'alimentation des animaux tout au long de leur vie influence les risques de morbidité et de mortalité dues à diverses maladies. L'alimentation des jeunes animaux influence également le phénotype des ouistitis, notamment leur croissance et leur développement. Il est à noter également que la plupart des centres d'élevage de ouistitis et de recherche actuelles sont situées en intérieur. Le manque d'accès à la lumière UV naturelle chez cette espèce est susceptible de provoquer des maladies osseuses métaboliques. De plus, de nombreux autres aspects potentiels du bien-être pourraient ne pas être satisfaits dans ce contexte. Par exemple, sans lumière naturelle et rayons UV, les ouistitis pourraient ne pas être capables de synthétiser la vitamine D3. Outre une supplémentation alimentaire en vitamine D3 (utilisée dans certains centres d'élevage et de recherche), l'accès à la lumière directe du soleil et/ou aux rayons UV en animalerie limiterait, voire préviendrait, la carence en vitamine D chez ces animaux. C'est pourquoi ce projet comporte plusieurs objectifs que sont: (i) évaluer les effets de la mise en place de lampe UV sur le maintien des niveaux de vitamine D3 dans 4 établissements utilisateurs de ouistitis, (ii) raffiner les meilleurs indicateurs de bien-être pour cette espèce et (iii) valider scientifiquement la vitamine D3 comme indicateur de bien-être pour les ouistitis.
Bénéfices attendus
Les données acquises permettront d'aider au management de la colonie de ouistitis en termes de gestion des besoins vitaminiques. Les techniques d’amélioration qui seront validées et les nouveaux indicateurs de bien-être animal qui seront acquis permettront d’obtenir ultérieurement des données de haute qualité lorsque ces animaux seront impliqués dans des projets de recherche. Aussi, il s’agira de s’assurer que les ressources mises en œuvre permettent de répondre non seulement au bien-être de ces animaux, mais aussi de déployer des études et des projets de recherche cohérents et solides sur le plan scientifique. De plus, notre approche pourrait être ajustée ultérieurement et testée sur d'autres espèces de primates non-humain. Nous menons cette étude sur quatre sites différents afin de renforcer la fiabilité et la portée de nos résultats : chaque établissement pouvant présenter des conditions de lumière UV, de supplémentation en vitamine D ou de gestion des animaux légèrement différentes, en comparant ces contextes variés, nous nous assurons que nos conclusions ne sont pas spécifiques à un seul environnement. Grâce à un échantillon plus large et diversifié, nous obtiendrons des données plus solides et représentatives, ce qui nous permettra de valider que les effets observés (positifs ou négatifs) sont vraiment liés aux interventions étudiées et non à des variations locales. Travailler sur plusieurs établissement utilisateurs favorise en outre la standardisation des protocoles, la vérification croisée des pratiques et l’échange d’expertises, ce qui garantit des résultats plus robustes, applicables à d’autres colonies de marmosets dans divers environnements.
Procédures
L'ensemble des interventions seront menées chez le ouistiti et mise à part les observations comportementales, toutes les interventions de prélèvements de substrat seront réalisées sous anesthésie. Les interventions sur les animaux seront les suivantes : (1) deux prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale, anesthésies d’une durée de 15 à 30 minutes max, durée du prélèvement de 5 minutes max, (2) deux prélèvements de poils pendant l’anesthésie (durée 2 minutes max).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, des effets bénéfiques sont attendus tels qu'une amélioration du bien-être animal sur le long terme du fait d’une meilleure métabolisation de la vit D. Toutefois des nuisances sont également attendues telles qu'un stress provoqué par la réalisation de certains gestes techniques tels que la capture des animaux, le transport de la zone d'hébergement à la pièce de prélèvement, l'injection de l'anesthésique avant la réalisation des prélèvements sanguins, conséquences potentielles du prélèvement sanguin (hématome localisé).
Devenir
Tous animaux seront gardés en vie à la fin du projet, l’obtention de résultats dans ce projet ne nécessite pas la mise à mort des animaux.
Remplacement
L’objectif de l’étude est l’amélioration du bien-être des ouistitis hébergés en captivité dans nos colonies et une amélioration de leurs conditions de vie. Le ouistiti constitue ici l’objet même du projet et pas seulement le modèle utilisé pour atteindre l’objectif. Il n’est pas possible de remplacer l’espèce étudiée par des alternatives non-animales dans ce contexte.
Réduction
Ce projet visant l'amélioration des conditions d'hébergement sur le bien-être des ouistitis de nos colonies. Le principe de réduction est difficilement applicable dans ce contexte puisque les mesures s'appliquent à l'ensemble des individus.
Raffinement
L'ensemble des animaux sont hébergés dans une animalerie confinée pour laquelle l'ensemble des conditions réglementaires sont appliquées et respectée. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux ou en famille en volières ou en cages avec des enrichissements structuraux (hamac, tunnel, branche, etc.) et alimentaires favorisant les comportements naturels (insectes vivants, gomme arabique). Les animaux impliqués dans ce projet proviennent de notre élevage et sont habitués dès tous petits à la présence humaine. De plus, les animaux qui participeront au projet sont régulièrement entraînés par conditionnement opérant et sont nourris à la main quotidiennement par ces mêmes personnes en charge de leur bien-être. Lors des phases expérimentales et l'observation, les captures et manipulation seront effectuées par les personnes assurant leur suivi au quotidien de manière à limiter le stress lié à la manipulation. Lors des phases de prise de sang les animaux seront anesthésiés et leur réveil sera surveillé tout comme les interactions sociales seront monitorées dans les heures et jours suivants l’intervention pour s’assurer qu’aucun conflit ne survienne ; dans le cas contraire une surveillance accrue sera initiée. Nous envisageons de réaliser des prélèvements sanguins et de poils pour permettre de comprendre et de confirmer le prélèvement de poils comme méthode de remplacement pour déterminer certaines hormones (cortisol et ocytocine) et le taux en vitamine D. Les résultats obtenus pourraient permettre à termes de réduire et limiter le nombre de prélèvements sanguins nécessaire pour suivre des paramètres hormonaux étudiés .
Choix des espèces
Le projet a pour objectif l’amélioration du bien-être d'animaux d'une colonie de ouistitis hébergés en animalerie intérieure n'ayant pas d'accès extérieur et par conséquent aux rayons solaires. La pertinence de l'espèce animale est ainsi en lien avec les besoins spécifiques de l'espèce en termes de conditions d'hébergements, amélioration du bien-être et besoins vitaminiques. Tous les individus de notre colonie de plus de 1 an seront étudiés pour obtenir des résultats sur des classes d’âge différentes chez des adultes. Nous exclurons de l’étude les femelles adultes gestantes ou allaitantes puisque le niveau de vitamine D change également avec l’état physiologique de l’animal.