Procédures sans réveil

147 animaux seront gardés vivants et réutilisés dans un autre projet, 90 autres tués sans reprise de conscience pour doser le produit dans leurs organes: 237 rats et lapins vont être utilisés pour tester des agents de contraste IRM à base de fer. Chaque animal reçoit une injection unique de produit et passe trois séances d'imagerie sous anesthésie générale. Le porteur présente ces agents au fer comme une alternative au gadolinium, jugée plus sûre pour les patients en insuffisance rénale. Il justifie l'étape animale par les preuves précliniques exigées avant tout essai chez l'humain.

Objectifs

Les agents de contraste pour l’Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) sont des molécules destinées à améliorer la qualité des images en réhaussant le signal là où elles sont présentes (hypersignal). Cela permet, lors d’un examen par IRM, de mettre en évidence certaines régions difficiles à visualiser. Actuellement, les agents de contrastes commerciaux sont basés sur le gadolinium. L’instabilité de certains agents provoque un relargage du gadolinium dans le corps, ce dernier s’accumulant dans différents organes provoquant des maladies chroniques chez les patients en insuffisance rénale sévère. En conséquence, de nombreux produits ont été retirés du marché européen et les radiologues font désormais preuve d’une pharmacovigilance renforcée en ce qui concerne l’utilisation des produits restants, également basés sur du gadolinium mais supposés plus stables. L’utilisation de ces derniers est désormais contre-indiquée chez certains types de patients lorsque d’autres subissent des examens à répétition, et donc une exposition répétée. De plus, avec l’accélération du vieillissement de la population, il est nécessaire de développer des alternatives aux agents à base de gadolinium dans le cadre de l’IRM. L’équipe de recherche qui fait la présente demande d’autorisation de projet développe depuis plus de 15 ans des agents de contraste basés sur du fer. Le fer est présent en grande quantité dans le corps humain qui possède donc des mécanismes de régulation, d’utilisation et d’élimination d’ions fer libres, contrairement au gadolinium qui est absent de celui-ci. Les agents de contraste basés sur du fer comporteront un risque moins élevé chez les patients atteints d’insuffisance rénale sévère. Dans le cadre de ce projet, une preuve de concept in vivo chez la souris a été obtenue et confirme l’efficacité des produis ainsi que l’absence de toxicité aiguë. Le projet doit étendre sa phase d’étude préclinique afin d’évaluer les produits dans des conditions d’utilisation réelles (IRM préclinique) chez le rat et le lapin avant d’envisager une utilisation chez l’humain. L’obtention de ces images permettra la mise en évidence du potentiel de molécules candidates comme alternatives aux produits de contraste commerciaux.

Bénéfices attendus

Les acquisitions d’images réalisées illustreront et exemplifieront le brevet en cours de rédaction, qui constitue la base de la propriété intellectuelle nécessaire pour développer le projet. Ces études précliniques représentent une étape cruciale, en démontrant l’intérêt médical et la faisabilité pratique de la technologie. Les résultats précliniques apportés sont essentiels pour obtenir les autorisations réglementaires nécessaires au développement d’un agent de contraste destiné à l’humain. Les images recueillies valideront pré-cliniquement la structure des molécules testées, permettant ainsi de sélectionner la molécule candidate pour la suite des démarches réglementaires. En définitive, ces résultats favoriseront l’avancement du projet vers son autorisation réglementaire afin de bénéficier aux centaines de milliers de patients en Europe qui souffre d’insuffisance rénale chronique pour leur permettre un diagnostic IRM sans risque.

Procédures

Les animaux seront exposés à trois séances d'imagerie IRM sous anesthésie générale et une injection unique de produit de contraste lors de la première séance (3 heures); deux séances supplémentaires (30 minutes) sont prévues trois et sept jours plus tard afin de vérifier l'élimination complète du produit (une unique injection de produit, trois anesthésies sur un total de sept jours, trois poses de cathéter pour le lapin et une seule pour le rat). L’injection de produit sera réalisée de manière systémique 30 minutes après l’induction de l’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux inscrits dans ce projet seront exposés à une procédure modérée avec un temps d’anesthésie inférieur à trois heures. Les agents de contraste, bien que supposés non toxiques, peuvent avoir des effets indésirables sur la santé de l’animal, notamment si le produit est retenu dans un tissu particulier. Une attention particulière sera portée sur le comportement de l’animal post-injection (respiration, gonflement, rythme cardiaque). Les effets indésirables attendus, bien que rares, sont de même nature que pour une injection de produit de contraste commercial : hypersensibilité, réaction anaphylactique, allergie cutanée, vasodilatation, malaise, fièvre, nécrose tissulaire, phlébite au point d’injection. Nuisances : 1) L’induction de l’anesthésie générale peut entraîner un stress physique modéré et/ou une détresse légère à modérée de courte durée. Elle sera soumise trois fois pour chaque animal à trois jours d’intervalle minimum. 2) La piqûre d'une aiguille pour la prémédication chez le lapin peut entraîner une douleur légère de courte durée. Elle sera soumise trois fois pour chaque animal à 3 jours d’intervalle minimum. 3) L’injection intraveineuse d’agents de contraste peut entraîner un stress physique léger ou réactions hémodynamiques (tachycardie, hypotension) de courte durée. Elle ne sera soumise qu’une seule fois par animal.

Devenir

Un nombre de deux animaux par produit sera euthanasié pendant le protocole d’imagerie afin d’extraire les organes d’accumulation du produit et doser ce dernier dans les tissus. Les trois animaux de contrôle seront également euthanasiés. Cela représente 63 rats et 33 lapins. Les interventions effectuées sur les animaux sont compatibles avec un maintien en vie des animaux. Le groupe d’animaux maintenus en vie pourront être réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

Ce projet, à la frontière entre la recherche fondamentale (de par la totale nouveauté des concepts moléculaires développés) et la recherche appliquée (valorisée par un futur brevet), a permis la réalisation d’une preuve de concept in vitro et in vivo. Dans une optique de développement du concept moléculaire vers un agent d’imagerie à destination de l’humain, effectuer des tests de biocompatibilité, de performance et de pharmacocinétique in vivo de molécules sur différents modèles animaux est une étape indispensable avant le passage chez l’humain (essais cliniques réglementaires). Dans ce but, aucune autre procédure ne peut remplacer cette étude.

Réduction

Le nombre total estimé d'animaux nécessaire est basé sur le nombre maximum d'agents de contraste à tester avec au plus cinq animaux par agent (dont deux seront euthanasiés pendant la première imagerie), cinq étant un chiffre jugé suffisant par l’équipe de recherche pour conclure sur l’intérêt d’un produit et juger de la répétabilité des données sur au minimum trois animaux sur cinq. C’est la raison pour laquelle le projet n’utilisera pas d’animaux de réforme, afin de garantir une comparaison fiable des données avec le nombre limité d’animaux utilisés. Les animaux gardés en vie seront imagés à deux reprises pour vérifier la présence ou non d’hypersignal dans certains tissus plusieurs jours après l’injection. L’IRM étant une technique d’imagerie non-invasive, elle permet de réduire par trois le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront suivis de manière quotidienne, manipulés par le zootechnicien pour réduire toute forme de stress. Ils seront pesés pour un suivi de gain de poids qui permettra le bon calcul des doses à administrer le jour de l’expérimentation. Le raffinement est appliqué, par l’utilisation de boxes/cages enrichis : foin, abris, bâton et bloc de cellulose à ronger sont fournis aux lapins. Tunnel, abri, nid et bloc de bois à ronger sont fournis aux rats. Ceux-ci leur permettent d’exprimer au mieux leur comportement naturel. La règle de raffinement est aussi mise en place au cours de la procédure avec l’utilisation d’une grille de suivi et des points limites adaptés. Les animaux seront exposés à une procédure modérée avec un temps d’anesthésie inférieur à trois heures. Les animaux seront conditionnés dans un lit dédié à l’exploration anatomique, chauffé par thermorégulation par système de circulation d’eau chaude avec monitoring de la respiration et suivi de température. On instillera une goutte d’Ocrygel dans chaque œil de l’animal pour prévenir de la dessication oculaire. Notre attention sera portée sur les gestes expérimentaux pouvant causer un stress ou une douleur telle que l’injection intraveineuse d’agents de contraste.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce la plus adaptée pour évaluer pré-cliniquement les agents de contraste sur l’instrument d’IRM préclinique 7 Tesla pour petit animal utilisé pour cette étude. Le faible volume corporel du rat permet une imagerie précise et résolue du corps entier. En effet, l’instrument est adapté à l’imagerie de petits rongeurs en disposant d’une cavité adaptée et d’un lit adapté. De plus, le faible volume sanguin du rat implique un faible volume d’injection et donc la production d’une quantité d’agent de contraste acceptable. Le rat est plus adapté à l’étude des produits de contraste en IRM que la souris car le temps de demi-vie dans le sang est plus long (20 min contre 5 min respectivement) ce qui permet un suivi plus précis de la biodistribution des produits dans les premiers instants après l’injection. Le lapin est l’espèce la plus adaptée pour notre étude sur les instruments IRM cliniques 1.5 Tesla et 3 Tesla utilisé pour cette étude. En effet, le lapin est l’animal le plus petit utilisable sur ces instruments normalement adaptés à l’humain ou aux grands animaux. Le lapin est également l’espèce de choix pour réaliser des études en angiographie. Les animaux seront commandés au stade de développement « jeune-adulte » pour garantir un métabolisme et une morphologie adéquats pour l’étude. Cela permet également une taille et un poids adaptés aux instruments. Enfin, leur âge précoce permet d’envisager leur réutilisation dans d’autres projets.

Onze brebis vont être utilisées, toutes tuées, pour tester la pose d'un dispositif d'abord vasculaire destiné à l'hémodialyse humaine, mis au point par un commanditaire. Cinq sont opérées une à deux heures puis tuées sans réveil, les six autres réveillées et suivies un mois avant d'être tuées pour explanter le dispositif et disséquer les vaisseaux. La modification du projet ajoute jusqu'à trois animaux, le commanditaire ayant constaté que le dispositif nécessite encore des ajustements. Le porteur retient l'espèce ovine parce que les vaisseaux des membres postérieurs ont un diamètre proche des vaisseaux humains du bras.

Objectifs

Dans le monde, l’hémodialyse reste la modalité de dialyse prédominante pour plus de 2 millions de patients souffrant d’insuffisance rénale terminale. Cependant, il est nécessaire d’améliorer les dispositifs et les méthodes permettant d’atteindre les vaisseaux (artères et veines) utilisés pour réaliser l’hémodialyse afin de réduire les risques associés à la mise en place et au maintien de la dérivation vasculaire, de minimiser les complications et de simplifier la procédure d’hémodialyse. Ceci permettra d’améliorer la qualité de vie des patients et de minimiser les coûts. Le dispositif développé par le commanditaire du projet devrait permettre d’éliminer la plupart des problèmes associés aux dispositifs classiques. De plus, la procédure est moins lourde puisqu’elle est réalisée à travers la peau, sans nécessiter de grande incision. Avant d’évaluer l’efficacité du dispositif chez le patient humain, le commanditaire du projet souhaite évaluer son fonctionnement sur modèle animal. Ainsi les objectifs de ce projet sont d’évaluer la faisabilité de poser le dispositif et de faire fonctionner le dispositif sur brebis, en situation aiguë et au cours d’un mois après implantation.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d'évaluer le fonctionnement d'un nouveau dispositif d'hémodyalise sur modèle animal avant d'évaluer son efficacité chez le patient humain. Les bénéfices attendus du projet sont, à plus long terme, de proposer un dispositif d'hémodyalise permettant de réduire les risques associés à la mise en place et au maintien de l'abord vasculaire, de minimiser les complications et de simplifier la procédure d'hémodialyse.

Procédures

L'animal impliqué dans la première procédure sera soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie, d'une durée d'une à deux heures, à l'issue de laquelle il ne sera pas réveillé. Les animaux inclus dans la seconde procédure seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie, d'une durée d'une à deux heures, à l'issue de laquelle ils seront réveillés afin d'effectuer un suivi d'un mois. Pendant le suivi, une échographie et un test de fonctionnement du dispositif seront réalisés une à deux fois par semaine sur animal vigile. Cela représente entre quatre et huit suivi de moins d'une demi-heure chacun.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront éprouver du stress lors de l'isolement nécessaire à l'induction de l'anesthésie, aux manipulations pour les échographies, et au nettoyage des cathéters. Ce stress sera de courte durée puisqu'il cessera lorsque les animaux seront remis en groupe. Les animaux subiront une chirurgie qui pourra entrainer une douleur légère lors du réveil pour les animaux de la seconde procédure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin d'explanter le dispositif, d'évaluer macroscopiquement l'intégrité des vaisseaux au niveau des sites d'implantation et de disséquer les zones implantées pour analyses histologiques.

Remplacement

La réalisation de ce projet nécessite un environnement tissulaire et fonctionnel complexe en conditions réelles de flux qu’il n’est actuellement pas possible de reproduire sur simulateur ou in vitro. Le choix d’un modèle animal possédant une anatomie et une physiologie proche de l’homme est essentiel car il permet de tester le dispositif dans sa version finale, identique à celle qui pourra être utilisée chez l’Homme. Le modèle ovin a été retenu car les vaisseaux dans les membres postérieurs sont rectilignes et ont un diamètre proche des vaisseaux humains utilisés pour les fistules au niveau du bras. Ces conditions sont essentielles pour évaluer le fonctionnement du dispositif dans une situation de pose proche de celle qui sera réalisée chez l’Homme.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. L’implantation du dispositif n’a jamais été réalisée sur ovin. Ainsi un test d’implantation sera réalisé sur un animal pour valider la faisabilité avant de passer au suivi sur 30 jours. Si le test est positif, un seul animal sera utilisé, sinon un second animal pourra être utilisé pour améliorer cette première procédure. MODIFICATION // A l'heure actuelle, ce test a été réalisé sur deux animaux à 4 mois d’intervalle permettant des mises au point du dispositif médical entre les deux sessions. Néanmoins, lors de la dernière session, le commanditaire s’est aperçu que le dispositif nécessite encore quelques ajustements avant d’envisager un suivi de son fonctionnement. Il semble donc indispensable d'ajouter jusqu'à 3 animaux supplémentaires à cette phase du projet afin de valider les modifications apportées au dispositif en amont d’une nouvelle implantation pour un suivi à moyen terme. Cela sécuriserait le fonctionnement du dispositif sur les animaux réveillés et maintenus en vie pendant 1 mois après le déploiement du dispositif.\\ Deux animaux seront ensuite utilisés pour le suivi à 30 jours. Si les résultats sont satisfaisants, il n’y aura pas d’autres animaux impliqués dans cette procédure. Si nécessaire, deux autres paires d’animaux pourront être utilisées successivement.

Raffinement

Les animaux arriveront sur place une semaine minimum avant les procédures pour leur permettre de s’habituer aux lieux et aux manipulations et ainsi diminuer leur stress. Ils seront hébergés par groupe sociaux (au minimum 2) dans un box sur litière de paille et disposeront d’une alimentation adaptée à leurs besoins. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et sous analgésie. Les contrôles hebdomadaires se feront par imagerie (échographie) ce qui représente une approche non invasive et qui n’est pas source de douleur. Le bien-être des animaux sera contrôlé en veillant aux conditions d’hébergement et au comportement des animaux. Des observations biquotidiennes, basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits, etc.), seront réalisées par une personne formée. Ces contrôles permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Tout constat d’un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux et au responsable du projet pour examen approfondi, traitements adaptées et/ou consultation du vétérinaire référent.

Choix des espèces

Le modèle ovin a été retenu car les vaisseaux dans les membres postérieurs sont rectilignes et ont un diamètre proche des vaisseaux humains utilisés pour les fistules au niveau du bras. Ces conditions sont essentielles pour évaluer le fonctionnement du dispositif dans une situation de pose proche de celle qui sera réalisée chez l’Homme. Les animaux utilisés seront adultes (physiologiquement stables) et pèseront environ 60 kg afin de présenter une taille similiaire à l'homme.

Cinquante rats opérés sous anesthésie et tués sans réveil, quarante autres porteurs d'un implant cérébral pendant douze mois : 90 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour ceux qui sont réveillés. Les seconds subissent une chirurgie d'implantation d'une heure et demie, des enregistrements hebdomadaires et une perfusion intracardiaque terminale. Le projet développe des électrodes destinées à des interfaces cerveau-machine pour redonner la parole à des personnes lourdement handicapées. Cette étape chez le rat précède des essais sur des mini-porcs, eux-mêmes préalables à un usage humain.

Objectifs

Cinq millions de personnes dans le monde ont un déficit sévère de la parole suite à des traumatismes, lésions vasculaires, ou des maladies neurodégénératives. L’objectif des interfaces cerveau-machine pour la parole (BCI parole) est de permettre à ces personnes de communiquer à nouveau grâce au contrôle d’une synthèse vocale à partir de leur activité́ cérébrale enregistrée à l’aide d’implants cérébraux. L’objectif de ce projet est de : i) développer de nouveaux implants à haute densité pour enregistrer de larges zones corticales ou intra-corticales, ii) tester ces nouveaux dispositifs en préclinique pour mieux comprendre les liens entre les signaux de surface et/ou intra-corticaux, ainsi que la dynamique des circuits corticaux pour développer des stratégies de décodage plus efficaces. Cette étude menée chez le rat en amont des études menées chez le mini-porc permettra : 1) d’évaluer la fonctionnalité de ces implants et en particulier la qualité et la stabilité des signaux enregistrés et des stimulations du cerveau sur plusieurs mois (jusqu'à 12 mois) ; 2) comparer la performance de ces nouveaux implants par rapport à celles des implants commerciaux; et 3) évaluer la biocompatibilité de ces nouveaux implants.

Bénéfices attendus

À long terme, ce projet de recherche s’inscrit dans un projet plus vaste destinés à développer des interfaces cerveau-machine pour redonner la capacité de communication à des personnes présentant un déficit sévère de la parole. Pour y parvenir, il est essentiel de disposer de grilles de multi-électrodes biocompatibles, stables et très performantes. À court terme, cette étude servira à vérifier que les nouveaux types d’électrodes implantées dans le cerveau n’occasionnent pas de lésions ou d’effets indésirables, garantissant ainsi la sécurité et la tolérance des dispositifs implantés chez l’homme.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : La chirurgie d’implantation d'une durée d'environ 1h30 sera effectuée sous anesthésie. Afin de tester la qualité des implants,des stimulations pourront être délivrées au niveau de zones du cortex impliquées dans le contrôle des muscles, sous anesthésie et analgésie, sans réveil de l'animal. Pour les animaux implantés de façon chronique, l'activité neuronale sera enregistrée 1 fois par semaine pendant 1 à 2 heures sur une durée maximale de 12 mois. Pour les animaux implantés de façon chronique, une perfusion intracardiaque sera réalisée à la fin de la série d'expérimentation.

Impact sur les animaux

Des nuisances pourront être associées : 1) à la chirurgie d’implantation : hypothermie, douleurs si l’anesthésie et l’analgésie sont mal dosées pendant la chirurgie et les stimulations électriques, des douleurs, un inconfort du fait de la présence d’une protection des connecteurs positionnée sur leur tête, un risque d’infection au niveau de la zone d’implantation pendant quelques jours après la chirurgie, l’isolement physique de l’animal post-opératoire jusqu'à son complet rétablissement et cicatrisation pourra également générer un stress, 2) au rejet ou un mauvais positionnement des implants, 3) à l'isolement temporaire des animaux implantés lors des séances d'enregistrement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation. Une partie importante de l’étude concerne la biocompatibilité des implants. Afin d’étudier la structure du cerveau des rats qui ont été implantés de façon chronique ainsi que le comportement des implants, ces animaux devront donc être mis à mort (soit 40 animaux). Les 50 autres animaux serviront à des études d'enregistrement et/ou de stimulation électrique sous anesthésie. Ces animaux ne seront pas réveillés après la chirurgie.

Remplacement

Avant tout test chez l’animal, les performances des implants seront tout d’abord évaluées in vitro dans des solutions tampon. Cela permettra de vérifier les propriétés électriques et électrochimiques des électrodes afin d’en optimiser le mode de fabrication. Une fois leur fabrication optimisée, des dispositifs seront alors testés chez l’animal pour évaluer leur performance in vivo dans le temps. Il n’existe pas à l’heure actuelle d’alternative au modèle animal pour effectuer ce travail. En effet, les mécanismes étudiés mettent en jeu des réseaux complexes de cellules que la culture cellulaire ne saurait reproduire. De plus, avant leur utilisation chez l’homme, les nouveaux types d’implants nécessitent une validation préclinique in- vivo.

Réduction

L'efficacité des implants d'enregistrement de l'activité cérébrale sera évaluée sur des critères incluant la qualité du signal enregistré (amplitude, rapport signal/bruit, stabilité temporelle). Ces paramètres seront comparés entre groupes expérimentaux (différents implants) avec un test t ou de Mann-Whitney et au cours du temps chez un même animal pour mesurer la stabilité de l'implant par un test ANOVA à mesures répétées. Cette approche permettra une évaluation quantitative et reproductible de l'efficacité des implants in vivo. Pour une puissance statistique fixée à 80% et des effets attendus de l'ordre de d = 1.50 (très forts à considérables), le nombre minimal d'individus par groupe optimal à utiliser pour mettre en évidence des résultats significatif est de 10 individus, pour un risque alpha = 5% et en prenant en compte une perte potentielle de 20% d'individus au cours de l'expérience (SHADE). Pour les tests de biocompatibilité, chaque animal sera son propre contrôle (hémisphère implanté versus hémisphère non implanté). Les implants testés dans cette étude seront ensuite validés chez le miniporcs (projets financés au niveau national). Conformément au principe de réduction des 3R, une étude préclinique préalable chez le rat permettra de valider la faisabilité, la sécurité et les performances des implants. Cette étape permettra d'optimiser les protocoles expérimentaux et à terme, de réduire le nombre de miniporcs nécessaires à l'étude.

Raffinement

Durant leur séjour à l’animalerie, tout sera mis en œuvre pour que les animaux préservent au maximum une interaction sociale afin de diminuer leur stress. Au cours de la chirurgie d’implantation, les animaux seront placés sur une couverture chauffante afin d’éviter l’hypothermie. Les fonctions cardio-respiratoires seront monitorées. Pour le bien-être des animaux, des traitements prophylactiques à base d’antibiotique et d’analgésique (adapté au niveau de douleur et à base d’anti-inflammatoire non stéroïdiens et/ou de morphiniques) seront administrés pendant et les jours suivant la chirurgie. Un suivi clinique journalier des animaux sera mis en place durant toute la durée des expérimentations. Il visera à détecter d’éventuels états de souffrances pour mettre en place une gestion médicalisée de la douleur si nécessaire. Une grille de score associée à des points limites adaptés permettra d’intervenir rapidement dès l'apparition de signes cliniques en post-opératoire et/ou dans les mois suivants. Toutefois, pour les animaux implantés en chronique (procédure 1 uniquement), après la chirurgie d’implantation, les animaux devront être isolés pendant 24H (maximum 72H) ; il seront gardés dans des grandes cages près de leurs congénères; cela leur permettra d’interagir notamment visuellement, olfactivement et auditivement quand ils sont séparés. Des jeux et dispositifs seront mis à disposition des animaux afin de leur créer un milieu enrichi.

Choix des espèces

Le rat est le modèle standard pour les études de biocompatibilité d’implants offrant une taille de cerveau suffisante. Ils permettent en particulier de s’affranchir de l’utilisation de gros animaux à ce stade exploratoire de l’étude. Les animaux utilisés seront des adultes : réception et réalisation des implantations entre 12 et 20 semaines (250-350g) et suivi post-implantation sur une période allant jusqu’à 12 mois. En effet, la taille de cerveau doit être suffisante pour les études de biocompatibilité des implants.

Soumises à l'occlusion d'une artère cérébrale pendant une heure, parfois doublée d'une hyperglycémie provoquée par injection de glucose, 990 souris vont être utilisées, dont 900 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 90 sous anesthésie sans réveil. Une partie est observée au microscope puis tuée dans l'heure et demie, l'autre gardée jusqu'à 24 heures pour des tests neurologiques mesurant la sévérité de l'accident vasculaire cérébral. Le projet veut établir le rôle d'une protéine sensible au flux sanguin dans l'inflammation, sur des souris porteuses d'une mutation qui la suractive. Le porteur prévoit d'avancer la mise à mort si plus d'un tiers d'un groupe atteint les points limites dès 6 à 16 heures, et affirme que le recours à l'animal reste "non remplaçable" car les phénomènes se jouent à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Ce projet s’intéresse à l’accident vasculaire cérébral, première cause de mortalité en France. Il en survient un toutes les 4 minutes et ses conséquences sont souvent graves : environ 25 % des patients en meurent, 40 % gardent un handicap, et 25 % développent une démence. La grande majorité des accidents vasculaires cérébraux sont dus à l’obstruction d’un vaisseau sanguin du cerveau. Lorsqu’une artère cérébrale est bouchée, cela entraîne une réaction qui associe la formation de caillots sanguins et une réponse inflammatoire. Cette réaction joue un rôle délétère pendant les premières étapes de l’accident vasculaire cérébral. Elle semble se produire surtout dans les zones où le sang circule mal, ce qui suggère l’implication de protéines appelées mécanotransducteurs. Ces protéines détectent les contraintes mécaniques (pression, étirement, frottements du sang) et les traduisent en signaux à l’intérieur des cellules. On s’intéressera à une de ces protéines, soupçonnée de jouer un rôle dans d’autres maladies inflammatoires comme l’athérosclérose. Les patients atteints d’une mutation qui active anormalement cette protéine sont par ailleurs exposés à des complications de la circulation sanguine. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre le rôle de cette protéine sensible au flux dans l’activation des principales cellules impliquées dans l’accident vasculaire cérébral. Pour cela, un modèle d’occlusion d’une artère sera utilisé chez la souris afin de reproduire les perturbations du flux sanguin observées chez l’Homme. L’étude portera sur des souris présentant soit une protéine anormalement active (gain de fonction), soit au contraire partiellement absente. Enfin, l’utilisation de souris est indispensable pour mener ce projet : aucune méthode sur cellules isolées ne permet de recréer l‘interaction entre l’ensemble des acteurs (cellules, circulation sanguine et contraintes mécaniques) impliqués lors d’un accident vasculaire cérébral.

Bénéfices attendus

Ce projet est essentiel pour mieux comprendre les accidents vasculaires cérébraux ischémiques (c’est-à dire dus à l’occlusion d’un vaisseau sanguin). Il permettra de déterminer l’implication de la protéine étudiée dans cette pathologie. Les résultats obtenus grâce à ce modèle d’accident vasculaire cérébral appliqué à des souris permettront de faire progresser les connaissances sur les coomplications causées par les perturbations du flux sanguin cérébral. A plus long terme, ces connaissances pourront être appliquées à l’Homme afin de réduire les conséquences de l’accident vasculaire cérébral ischémique et d’autres perturbations du flux sanguin.

Procédures

Pour cette étude, nous utiliserons un modèle d’accident vasculaire cérébral induit par une occlusion d’1h, réalisée sous anesthésie et analgésie, d’une artère cérébrale chez la souris. La chirurgie dure environ 30 minutes. Ce modèle sera combiné à une injection de glucose pour provoquer une hyperglycémie aiguë 20min avant le début de la chirurgie. Au total, 990 souris seront utilisées dans cette étude. Elles seront toutes soumises à la chirurgie, avec (770 souris) ou sans (220 souris) occlusion de l’artère cérébrale pendant 1h et avec (450 souris) ou sans (540) hyperglycémie aiguë. Un premier groupe de 285 souris recevront une injection de marqueurs cellulaires (50 µl) afin d’étudier en temps réel les cellules impliquées dans l’accident vasculaire cérébral par microscopie intravitale, dans un délai maximum de 1h30 après l’occlusion. Cela sera suivi de la mise à mort immédiate des souris. Toute cette procédure sera faite sur des souris sous anesthésie et analgésie. Un deuxième groupe de 705 souris sera étudié à distance de l’occlusion avec évaluation de leur état 6h et 16h après la fin de l’occlusion (et la fin de l’anesthésie-analgésie). A 24h, elles seront soumises à des tests neurologiques visant à déterminer la sévérité de l’accident vasculaire cérébral. Sur la totalité des souris, des prélèvements sanguins seront réalisés à différents temps (jour 7 avant la chirurgie, J0 avant et après l’injection de glucose et avant la mise à mort). La durée maximale pour effectuer les prélèvements chez la souris est d’environ 2 minutes. Toute procédure invasive sera faite sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront mis à mort en fin d'étude et les tissus seront prélevés et stockés pour les analyses biologiques.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de sang cause un stress modéré et de courte durée chez l’animal. L’injection de buprénorphine (analgésie) cause une douleur courte et modérée. La chirurgie d’accident vasculaire cérébral induit une douleur peropératoire et une perte sensorimotrice modérée jusqu’à la mise à mort. Une déshydratation peut également être attendue, en particulier chez les animaux hyperglycémiques. Enfin, les tests comportementaux et la préhension peuvent être une source de stress légère à modérée dans son intensité et sa durée pour les souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures 1 et 2, afin d’éviter toute souffrance inutile. Les animaux de la procédure 3 seront aussi mis à mort afin de permettre le prélèvement des cerveaux et d'un important volume de sang, nécessaires pour répondre à nos hypothèses.

Remplacement

Nous avons commencé par étudier l’impact de la suractivation de notre protéine sur des cellules humaines impliquées dans la thrombose et l’inflammation (plaquettes, cellules endothéliales). Aucune approche in vitro ne permet de rendre compte de l’impact du gain de fonction ou inversement de l’absence de cette protéine sensible au flux sur les phénomènes ayant lieu après un accident vasculaire cérébral. L’utilisation d’un modèle animal n’est pas remplaçable pour le moment car les phénomènes étudiés surviennent à l’échelle de l’organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant en accord avec notre expérience sur ces modèles. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés en particulier one-way et two-way Anova. Si l’impact du gain de fonction de la protéine est mis en évidence dans le modèle sans hyperglycémie, le modèle hyperglycémique ne sera pas effectué, réduisant le nombre total d’animaux utilisée à 720.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur, les animaux recevront un traitement antalgique avant l’opération. Avant la chirurgie, ou tout prélèvement sanguin, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée sous une anesthésie générale adaptée. Après l’opération, une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil, qui aura lieu dans une chambre thermostatée. Un suivi clinique et une surveillance des animaux à l’aide d’une grille de score seront réalisés régulièrement durant les procédures. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score. Enfin, le bien-être animal sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu : les cages seront notamment pourvues de coton. Compte tenu de l’aggravation potentielle de l’accident vasculaire cérébral chez les souris présentant un gain de fonction de la protéine sensible au flux, un temps précoce de mise à mort est prévu pour les lots concernés et leurs lots contrôles. Ainsi, si plus d’un tiers des animaux d’un groupe, correspondant à un minimum de cinq individus, atteignent les points limites et doivent être sacrifiés 6 ou 16 heures après la chirurgie, l’évaluation du score neurologique et la mise à mort de l’ensemble des lots du modèle seront avancées. Enfin, l'acquisition des gestes techniques sera initiée par le visionnage de support pédagogiques.

Choix des espèces

La souris permet de modéliser l’accident vasculaire cérébral et ses conséquences. Le modèle choisi sur les souris est déjà maitrisé par certains membres de notre équipe. De nombreux outils sont développés autour de ce modèle animal, ce qui nous permet de réaliser l’ensemble des tests pour répondre à nos questions. Enfin, nos modèles d‘expression d’une des mutations humaines entrainant une suractivité de la protéine étudiée, ou à l’inverse qui ne l’expriment pas dans les plaquettes ont été développés sur des souris de fonds génétique C57BL6/J. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), auquel le modèle d’accident vasculaire cérébral utilisé est validé et maitrisé au laboratoire. Notre étude est indépendante du développement, de la croissance ou de la vieillesse de l’animal.

258 souris génétiquement modifiées pour reproduire un trouble neurodéveloppemental humain vont être utilisées, dont 248 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 10 opérées sous anesthésie sans réveil. Une partie subit une chirurgie de 45 à 60 minutes, d'autres une injection sous contention, avant que toutes soient tuées pour récupérer leurs tissus. Les procédures ne sont décrites que sommairement, sans que soient précisés les tests cognitifs employés. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne remplace l'animal et que la souris est le seul mammifère modifiable génétiquement en routine.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes impliqués dans les déficits cognitifs chez un modèle de troubles neurodéveloppementaux. Cette recherche s’appuie sur des travaux antérieurs relevant les altérations au niveau du fonctionnement du cerveau de ces animaux. Nous cherchons à approfondir ces observations en explorant les facteurs à l’origine des changements observés. Pour des raisons techniques, le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs : EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes sous jacents certains troubles de neuro-développement qui affectent la vie quotidienne d’environ 6 à 8 % de la population. En étudiant un modèle animal largement utilisé, notre travail permettra d’identifier les facteurs à l’origine des changements observés. Cette approche permettra de relier nos resultats à des stratégies thérapeutiques potentielles, ouvrant la voie à de nouveaux traitements ciblés. Ces connaissances sont essentielles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et pour soutenir l’inclusion des personnes concernées dans un milieu social ou professionnel. À terme, ce projet contribuera à améliorer la compréhension scientifique de ces conditions et à proposer des pistes concrètes pour en améliorer à quotidien la vie des personnes concernées.

Procédures

Certains animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie d'une durée d' environs 45 à 60 minutes. Certains animaux reçoivent une injection d'un produit médicamenteux sous contention (durée d'environs 5 à 10 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de cette procédure comprennent des douleurs postopératoires minorées par des antalgiques, une possible perte de poids et un risque d'infection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet vise à mieux comprendre les altérations biologiques à l’origine des troubles cognitifs. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental qui soit : i) suffisamment complexe et intact, ii) génétiquement modifiable, iii) doté d’un cerveau présentant une organisation comparable à celle de l’être humain, et iv) compatible avec des approches comportementales avancées ainsi qu’avec des techniques expérimentales invasives. À ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico permettant de remplacer l’utilisation d’animaux pour ce type d’étude. Par ailleurs, des études directement menées chez l’être humain ne sont pas envisageables en raison du caractère invasif des procédures nécessaires et une population fragile.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons soigneusement estimé le nombre strictement nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Cette estimation repose sur des études déjà publiées, une analyse de la littérature scientifique et des calculs statistiques permettant d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d’animaux. Nous nous engageons ainsi à n’utiliser que le nombre minimal d’animaux indispensable pour atteindre les objectifs de l’étude. Pour cela, nous avons mis en place une stratégie expérimentale qui permet d’anticiper et de prévenir toute utilisation inutile. Des études pilotes sont réalisées afin de vérifier que la méthode fonctionne correctement et de perfectionner les gestes techniques avant le lancement complet de l’étude. Cette approche permet d’ajuster le nombre d’animaux en fonction des premiers résultats et d’identifier rapidement d’éventuels problèmes, afin de modifier la procédure si nécessaire dans un objectif de réduction. Les résultats obtenus seront ensuite analysés à l’aide de méthodes statistiques adaptées, afin de garantir des conclusions fiables et rigoureuses.

Raffinement

i) Vérification de l'état de l'animal : Avant chaque manipulation, l'état de l'animal sera vérifié selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. ii) Critères d’évaluation de la souffrance : L’apparence générale et le comportement de l’animal seront observés pour détecter tout signe de souffrance, douleur ou détresse. Tout signe de souffrance déclenchera une réponse immédiate et appropriée, comme des mesures adaptées. Si aucune amélioration n'est constatée après ces interventions, l'expérimentateur consultera le vétérinaire iii) Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. iv) Manipulation quotidienne : Les animaux seront manipulés avant les expériences pour réduire leur niveau de stress. v) Conditions d’hébergement adaptées afin de permettre l'intégration d'une approche de manipulation qui vise à réduire le niveau de stress.

Choix des espèces

Actuellement, la souris est le seul mammifère pour lequel il est possible, de manière routinière, de modifier le génome, et pour lequel les modèles développés ont été caractérisés de manière approfondie et correspondent de façon fiable à certaines conditions humaines. Nous utiliserons des souris adolescentes (âgées de 5 à 8 semaines) au début des expériences, parce que la condition étudiée est une condition neurodéveloppementale.

258 souris adolescentes vont être utilisées, toutes tuées, dont 10 opérées sous anesthésie sans jamais être réveillées et 248 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie de 45 minutes à une heure, avec des douleurs postopératoires, une perte de poids possible et un risque d'infection, une autre reçoit une injection sous contention. Le RNT ne nomme ni le gène, ni le modèle, ni le produit administré, et présente l'objectif comme l'approfondissement d'altérations cérébrales déjà relevées dans des travaux antérieurs. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut remplacer l'animal et que des études chez l'être humain sont exclues, la population concernée étant "fragile".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes impliqués dans les déficits cognitifs chez un modèle de troubles neurodéveloppementaux. Cette recherche s’appuie sur des travaux antérieurs relevant les altérations au niveau du fonctionnement du cerveau de ces animaux. Nous cherchons à approfondir ces observations en explorant les facteurs à l’origine des changements observés. Pour des raisons techniques, le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs : EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes sous jacents certains troubles de neuro-développement qui affectent la vie quotidienne d’environ 6 à 8 % de la population. En étudiant un modèle animal largement utilisé, notre travail permettra d’identifier les facteurs à l’origine des changements observés. Cette approche permettra de relier nos resultats à des stratégies thérapeutiques potentielles, ouvrant la voie à de nouveaux traitements ciblés. Ces connaissances sont essentielles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et pour soutenir l’inclusion des personnes concernées dans un milieu social ou professionnel. À terme, ce projet contribuera à améliorer la compréhension scientifique de ces conditions et à proposer des pistes concrètes pour en améliorer à quotidien la vie des personnes concernées.

Procédures

Certains animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie d'une durée d' environs 45 à 60 minutes. Certains animaux reçoivent une injection d'un produit médicamenteux sous contention (durée d'environs 5 à 10 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de cette procédure comprennent des douleurs postopératoires minorées par des antalgiques, une possible perte de poids et un risque d'infection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet vise à mieux comprendre les altérations biologiques à l’origine des troubles cognitifs. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental qui soit : i) suffisamment complexe et intact, ii) génétiquement modifiable, iii) doté d’un cerveau présentant une organisation comparable à celle de l’être humain, et iv) compatible avec des approches comportementales avancées ainsi qu’avec des techniques expérimentales invasives. À ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico permettant de remplacer l’utilisation d’animaux pour ce type d’étude. Par ailleurs, des études directement menées chez l’être humain ne sont pas envisageables en raison du caractère invasif des procédures nécessaires et une population fragile.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons soigneusement estimé le nombre strictement nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Cette estimation repose sur des études déjà publiées, une analyse de la littérature scientifique et des calculs statistiques permettant d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d’animaux. Nous nous engageons ainsi à n’utiliser que le nombre minimal d’animaux indispensable pour atteindre les objectifs de l’étude. Pour cela, nous avons mis en place une stratégie expérimentale qui permet d’anticiper et de prévenir toute utilisation inutile. Des études pilotes sont réalisées afin de vérifier que la méthode fonctionne correctement et de perfectionner les gestes techniques avant le lancement complet de l’étude. Cette approche permet d’ajuster le nombre d’animaux en fonction des premiers résultats et d’identifier rapidement d’éventuels problèmes, afin de modifier la procédure si nécessaire dans un objectif de réduction. Les résultats obtenus seront ensuite analysés à l’aide de méthodes statistiques adaptées, afin de garantir des conclusions fiables et rigoureuses.

Raffinement

i) Vérification de l'état de l'animal : Avant chaque manipulation, l'état de l'animal sera vérifié selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. ii) Critères d’évaluation de la souffrance : L’apparence générale et le comportement de l’animal seront observés pour détecter tout signe de souffrance, douleur ou détresse. Tout signe de souffrance déclenchera une réponse immédiate et appropriée, comme des mesures adaptées. Si aucune amélioration n'est constatée après ces interventions, l'expérimentateur consultera le vétérinaire iii) Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. iv) Manipulation quotidienne : Les animaux seront manipulés avant les expériences pour réduire leur niveau de stress. v) Conditions d’hébergement adaptées afin de permettre l'intégration d'une approche de manipulation qui vise à réduire le niveau de stress.

Choix des espèces

Actuellement, la souris est le seul mammifère pour lequel il est possible, de manière routinière, de modifier le génome, et pour lequel les modèles développés ont été caractérisés de manière approfondie et correspondent de façon fiable à certaines conditions humaines. Nous utiliserons des souris adolescentes (âgées de 5 à 8 semaines) au début des expériences, parce que la condition étudiée est une condition neurodéveloppementale.