Procédures sans réveil
Étude du recablage axonal par un outil photo-inductible remodelant le cytosquelette des neurones.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
858 souris vont être utilisées, une partie opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil, les autres tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale de vingt à quarante minutes pour implanter une fibre optique, puis des stimulations lumineuses qui remodèlent les connexions des neurones, avant des tests de coordination motrice et le prélèvement du cerveau. L'objectif est de comprendre le recâblage du cerveau pendant l'apprentissage, les retombées médicales pour des maladies neurologiques ou psychiatriques restant lointaines et hypothétiques. Sur le remplacement, le porteur décrit un modèle de cerveau sur puce ayant réduit les conditions à tester, tout en concluant que l'animal reste "indispensable".
Objectifs
Apprendre un nouveau geste, comme faire du vélo ou jouer d’un instrument, repose sur la capacité du cerveau à se transformer. Cette capacité, appelée plasticité cérébrale, permet aux neurones de modifier leurs connexions pour s’adapter à de nouvelles situations. Ce projet de recherche s’intéresse à un réseau précis du cerveau, essentiel pour le contrôle des mouvements et l’apprentissage moteur. Dans ce réseau, les neurones peuvent parfois créer de nouvelles connexions ou, au contraire, en supprimer. Ce phénomène de « recâblage » du cerveau a été identifié récemment et reste encore mal compris. Pour mieux étudier ce mécanisme, les chercheurs ont développé une technologie innovante, qui permet de contrôler ce recâblage à l’aide de la lumière. Selon la version utilisée, cette technologie peut soit favoriser la croissance de nouvelles connexions entre neurones, soit provoquer leur disparition. Plusieurs versions de cet outil ont été conçues et testées, certaines encourageant la formation de connexions, d’autres leur retrait. L’objectif principal du projet est d’observer, chez l’animal vivant, comment ces outils influencent l’organisation des connexions cérébrales, comment ces changements évoluent dans le temps, et quelles sont leurs conséquences sur l’activité du cerveau et sur les mouvements. Dans un second temps, les chercheurs étudieront l’impact de ces modifications cérébrales sur l’apprentissage d’une tâche motrice. Ils chercheront à déterminer si certaines formes de recâblage facilitent l’apprentissage, tandis que d’autres pourraient le ralentir ou le perturber. Finalement, ce projet vise à mieux comprendre comment les changements de connexions dans le cerveau influencent nos capacités motrices, et à explorer le potentiel d’une nouvelle technologie permettant de moduler de façon ciblée les réseaux cérébraux.
Bénéfices attendus
LLe cerveau a une capacité remarquable à se transformer lorsqu’on apprend : ses cellules nerveuses peuvent modifier leurs connexions pour s’adapter à de nouvelles expériences. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre comment ces changements se produisent et comment ils influencent nos capacités sensorielles et motrices. Pour cela, les chercheurs ont mis au point une technologie innovante qui permet de contrôler, à l’aide de la lumière, la façon dont certaines connexions entre neurones se forment ou disparaissent. Cette technologie, agit sur des réseaux cérébraux bien définis, impliqués à la fois dans la perception et dans le mouvement. En utilisant cet outil dans le cerveau de souris adultes, le projet cherche à établir un lien direct entre les modifications des connexions neuronales, le fonctionnement des réseaux cérébraux concernés, et les performances individuelles dans des tâches comportementales. Ce lien est aujourd’hui largement soupçonné par la communauté scientifique, mais n’a jamais pu être démontré directement, faute d’outils adaptés. Notre technologie offre pour la première fois la possibilité de tester cette relation de manière directe. La validation de cet outil chez l’animal permettra d’explorer de façon nouvelle et ciblée la capacité du cerveau à se réorganiser. Au-delà de la recherche fondamentale, cette approche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour mieux comprendre les dysfonctionnements des circuits cérébraux et, à plus long terme, contribuer à l’identification de pistes thérapeutiques pour certaines maladies neurologiques ou psychiatriques, lorsque la plasticité du cerveau est altérée.
Procédures
Ce projet expérimental sera mené exclusivement sur des souris. Les animaux seront répartis en plusieurs groupes selon les procédures prévues. Un premier groupe sera soumis à une intervention chirurgicale d’une durée variant entre 20 et 40 minutes, sans réveil. Tous les groupes suivants seront tous soumis à la même intervention chirurgicale mais avec réveil, pour une période d'environ 2 semaines. A ce stade, les interventions pourront inclure, selon les besoins expérimentaux, des procédures terminales ou des manipulations préparatoires au cours desquelles les souris seront stimulées par la lumière, libres de leur mouvement dans une cage de test enrichie. Ces différentes expérimentations pourront induire un risque d’infection, un risque d’inflammation ou encore du stress. Les souris seront testées sur leurs performances afin d’évaluer leur coordination motrice ou sur leur motricité fine.
Impact sur les animaux
Les manipulations courantes (prise en main, transport, changement d’environnement) seront quotidiennes dès l’arrivée des animaux. Les chirurgies sont associées à un degré de sévérité modéré (risque d’infection, risque d’inflammation, stress), limité à la période autour de l’opération. Lors de la chirurgie, les animaux peuvent présenter du stress et un risque d’inflammation pendant plusieurs jours. Les tests comportementaux sont non invasifs, induisent un stress léger et temporaire lié à la mise en situation expérimentale, et seront réalisés une fois par jour pour chaque test lors des périodes expérimentales. Les procédures de stimulation par la lumière et un risque d’échauffement local du tissu. Aucun effet indésirable durable n’est attendu. Les expérimentations seront interrompues et l’animal retiré du protocole si un point limite clinique est atteint.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. Cet acte est justifié par l’un des points clés du présent projet, le but est de prélever le cerveau et d’identifier le degré de réarrangement du cerveau avec notre technologie.
Remplacement
Une phase de validation approfondie de notre technologie a été réalisée en laboratoire, à l’aide d’un modèle de cerveau sur puce développé sur place. Cette étape a permis de : • sélectionner les versions les plus efficaces de notre technologie, • déterminer les niveaux pertinents pour l’intensité lumineuse, • définir les modes de stimulation efficaces, • et optimiser les durées d’illumination (les durées longues étant plus efficaces que les courtes). Cette optimisation en laboratoire a considérablement réduit le nombre de conditions à tester chez l’animal. Cependant, l’objectif du projet est d’étudier l’effet du réarrangement des cellules nerveuses sur des comportements moteurs et des processus d’apprentissage, qui ne peuvent pas être reproduits de façon fiable sur des systèmes en laboratoire ou informatiques. L’utilisation d’un modèle animal demeure donc indispensable pour répondre aux questions scientifiques posées.
Réduction
Le projet a été conçu pour limiter le nombre d’animaux grâce à plusieurs leviers : • Optimisation préalable en laboratoire : La présélection des prototypes et des paramètres sur des modèles sans animaux permet de réduire le nombre de groupes à tester chez l’animal. • Contrôle interne bilatéral (lorsque possible) : Pour certaines analyses, une expression de notre technologie et une stimulation unilatérale permettront d’utiliser un hémisphère du cerveau comme condition test et l’autre comme contrôle, diminuant ainsi le nombre d’animaux. • Contrôle longitudinal individuel en comportement : Les souris seront testées en comportement avant la stimulation puis à différents temps après, ce qui permet d’utiliser chaque animal comme son propre contrôle pour les mesures comportementales. • Mise au point technique sur un nombre limité d’animaux : Trois souris par groupe seront utilisées pour calibrer les conditions d’expression et d’implantation lors des phases de mise au point. • Calculs de puissance statistique : Pour nos études, les données préliminaires indiquent un effet attendu d’environ 25 % avec une variabilité d’environ 10 %. Une analyse de puissance montre qu’un minimum de 15 souris par groupe est nécessaire pour détecter cet effet. Pour les études comportementales, les données suggèrent un effet d’environ 20 % sur la performance motrice, avec une variabilité d’environ 10 %. Les analyses de puissance indiquent qu’un minimum de 20 souris par groupe est requis pour atteindre la significativité.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie conventionnelle, dans des pièces où la température est contrôlée et dans des cages avec environnement enrichi. Le nombre optimal d’animaux par cage sera respecté et les animaux auront accès à l’eau et la nourriture sans limite. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures chirurgicales. Cette anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards, en ce qui concerne les pourcentages de gaz dans l’air lors des phases d’induction et de maintien. Elle sera accompagnée d’une analgésie locale et systémique afin de couvrir la douleur induite par ces interventions. Le maintien de la température corporelle sera assuré par un monitorage rectal associé à un tapis chauffant, et l’application d’un gel ophtalmique permettra de protéger les yeux des animaux pendant l’intervention. Un suivi post-opératoire rigoureux d’une durée de 7 jours, incluant une fiche individuelle de suivi, sera mis en place. Les fibres optiques implantées sont miniaturisées et adaptées à une utilisation murine. Leur conception limite la gêne potentielle lors des déplacements de l'animal dans la cage. Les tâches comportementales motrices présentent un stress léger chez l'animal, principalement dû à leur manipulation. Lors de chaque session, les animaux sont soigneusement manipulés et calmés par l’expérimentateur, constituant ainsi une interaction sociale positive pouvant être assimilée à une récompense. Tout le protocole vise à renforcer le confort de l’animal durant la réalisation des tâches et des interventions.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce projet. La zone cible de l’étude est bien caractérisé chez la souris et présente une organisation comparable à celle des mammifères supérieurs, permettant une analyse fiable du réarrangement des cellules nerveuses et de ses conséquences fonctionnelles. Les outils génétiques utilisés sont largement validés et couramment employés chez la souris, assurant une expression spécifique, stable et reproductible. Le petit gabarit de l’animal facilite les chirurgies et l’implantation d’une fibre avec un risque limité. Les tests comportementaux moteurs sont standardisés et bien établis chez la souris, garantissant des mesures robustes des effets. La majorité des lignées transgéniques pertinentes pour de futurs développements du projet sont disponibles chez la souris. Optimiser dès à présent l’ensemble des paramètres techniques dans cette espèce évitera de devoir réimplémenter les protocoles dans un autre modèle, limitant ainsi la durée et le nombre total d’animaux utilisés à long terme. Les animaux utilisés auront entre 30 et 90 jours, correspondant à des stades de jeune adulte. Les injections seront effectuées après le sevrage. À l’issue des différentes procédures expérimentales, les animaux seront âgés au maximum de 90 jours. À cet âge, le cerveau possède encore un degré de plasticité suffisant pour étudier le réarrangement des cellules nerveuses tout en présentant une organisation fonctionnelle stable. Ces caractéristiques en font une période optimale pour évaluer l’effet de notre technologie.
Étude de l’effet d’une nouvelle molécule thérapeutique en association avec une thérapie substitutive dans un modèle murin de maladie hémorragique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tuées sans réveil pour la plupart des actes finaux, faute de survie possible après une collecte importante de sang, 511 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sans réveil. Elles portent un modèle de la maladie de Willebrand, une maladie hémorragique humaine, et subissent des tests de saignement de trente minutes sous anesthésie. Le projet teste l'association d'une nouvelle molécule avec une thérapie substitutive. La preuve de concept annoncée pour de futurs essais cliniques reste au stade de perspective.
Objectifs
Les maladies hémorragiques familiales, telles que la maladie de Willebrand, restent assez méconnues. Ces maladies empêchent l’arrêt des saignements. En fonction des différentes anomalies génétiques, les patients présentent des formes plus ou moins sévères. Les traitements disponibles sont lourds (injections intraveineuses répétées) et pas toujours efficaces. Récemment, une nouvelle molécule thérapeutique administrée par voie sous-cutanée a été développée, pouvant augmenter la demi-vie des facteurs de coagulation, facteur Willebrand et facteur VIII, déficitaires dans la maladie de Willebrand. Par contre, la co-administration de cette molécule avec un concentré de FW/FVIII n’a jamais été testée. Notre projet va consister à tester chez un modèle de souris mimant la maladie de Willebrand humaine l’efficacité de cette nouvelle double thérapie en utilisant des tests de saignement bien standardisés.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de cette étude doivent permettre d'établir la preuve de concept de l'efficacité de cette double thérapie dans la maladie de Willebrand. A terme, ce projet devrait pouvoir servir de base pour la mise en place d'essais cliniques visant à déployer cette double thérapie , moins lourde que les thérapies actuelles, chez les patients.
Procédures
Toutes les souris sont anesthésiées. Un groupe reçoit un seul prélèvement rapide (moins d’une minute). Un groupe reçoit une ou deux injections rapides (moins de 15 secondes) suivies d’un test de saignement (30 minutes). Un groupe reçoit uniquement un test de saignement (30 minutes). Toutes les souris sont euthanasies en fin d’expérimentation selon une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Stress léger lors de la préhension des animaux. Douleur légère et transitoire après les injections et après les prélèvements du sang.
Devenir
Les actes expérimentaux finaux sont sans réveil du fait de la collecte de quantités importantes de sang, indispensables pour nos recherches scientifiques.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Afin de déterminer le plus petit nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse mathématique de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience en utilisant ces modèles en prenant en compte les variabilités de chaque test.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques. Les animaux ne sont jamais seuls dans les cages d’hébergement et ils ont un accès libre à la nourriture et à l'eau. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et l'acte expérimental aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les souris sont sous observation quotidienne (une fois pendant le weekend) et la quantification des points limites, susceptibles d'entraîner une procédure d’euthanasie immédiate de l'animal, sont strictement appliquée.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à un modèles murin des maladie hémorragique familiale permettant de tester un thérapie déjà utilisé chez les patients. Ces modèle ne manifestent pas des saignements spontanées. Les souris adultes, entre 8 et 30 semaines d’âge seront utilisées.
Evaluation du potentiel antithrombotique de vésicules exprimant CD39
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Anesthésiées, certaines souris subissent un prélèvement de sang puis une thrombose provoquée, d'autres deux chirurgies successives entrecoupées d'un réveil, d'autres encore une incision suivie deux semaines plus tard de trois injections et d'une inflammation. Sur les 422 souris utilisées, 84 relèvent d'un niveau de souffrance sévère et 194 d'actes sans réveil, l'accident vasculaire provoqué entraînant des troubles moteurs au réveil. Le projet teste des vésicules modifiées censées dissoudre les caillots après un AVC. Les animaux sont tués faute de survie possible après une perte de sang importante ou une thrombose.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique survient lorsqu’un caillot bloque une artère du cerveau. Cette obstruction empêche le sang et l’oxygène d’atteindre les cellules cérébrales, provoquant des lésions rapides et parfois irréversibles. Même lorsque la circulation est rétablie par un traitement, l’arrivée soudaine de sang peut déclencher une forte réaction inflammatoire au niveau cérébral et la formation de nouveaux caillots qui aggravent les lésions. Aujourd’hui, les traitements disponibles doivent être administrés très tôt après l’AVC et restent peu efficaces. Le projet a pour objectif de développer un nouveau traitement pour améliorer la reperfusion sanguine au niveau du cerveau. Pour cela, nous utiliserons des vésicules extracellulaires : de minuscules particules naturellement produites par certaines cellules et capables de transporter des traitements. Ces vésicules seront modifiées pour y intégrer une protéine ayant des propriétés antithrombotiques (dissolution des caillots) et anti-inflammatoires. Les vésicules seront testées dans des modèles cellulaires, tissulaires et animaux de formation de caillot et d’ischémie cérébrale afin d’évaluer leur efficacité et leur sécurité. Nous pensons que cette nouvelle stratégie pourrait faciliter la dissolution des caillots, atténuer l’inflammation, limiter la formation de nouveaux caillots et donc de limiter les lésions cérébrales après un AVC ischémique. Ces travaux pourraient préparer le développement de nouveaux traitements destinés à améliorer la prise en charge des patients victimes d’AVC.
Bénéfices attendus
Nous pensons que ce nouveau traitement pourrait faciliter la dissolution des caillots, atténuer l’inflammation, limiter la formation de nouveaux caillots et donc limiter les lésions cérébrales après un AVC ischémique. Ces travaux pourraient préparer le développement de nouveaux traitements destinés à améliorer la prise en charge des patients victimes d’AVC.
Procédures
Certaines souris sont soumises à un prélèvement sanguin sous anesthésie (15 minutes), puis à une thrombose sous anesthésie (1h). D’autres souris seront soumises à une injection et une thrombose sous anesthésie (1 h). D’autres souris seront soumise à une chirurgie sous anesthésie (45 min), sont réveillées (1h), soumises à une 2e chirurgie et une injection (45 min) puis réveillées pendant 23h. Les dernières souris seront soumises à une injection et une coupure sous anesthésie (40 min), puis 2 semaines plus tard à 3 injections et une inflammation (4h).
Impact sur les animaux
La contention de l’animal entraine un stress. Une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Les piqures par une aiguille pour les injections entrainent une douleur légère de courte durée au point d’injection. De plus, l’induction d’un AVC induit des troubles moteurs chez la souris au réveil. Dans les modèles de saignement, d’éventuels douleurs légères pourraient être ressenties au réveil de l’animal à cause de l’inflammation locale.
Devenir
A l’issue du prélèvement de sang en quantité importante, des thromboses, de l’AVC et de l’évaluation du risque de saignement, les animaux sont mis à mort car la perte de sang en quantité importante, le développement d’une thrombose ou le prélèvement de tissus ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact d’un nouveau traitement à base de vésicules modifiée sur la thrombose artérielle et l’inflammation dans le contexte de l’AVC. Ces mécanismes étant particulièrement complexes et faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, globules blancs, cellules endothéliales) ainsi que les conditions hémodynamiques (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité.
Réduction
Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum et permet l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Ce nombre est calculé par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation à la manipulation et à la contention est prévue au minimum 5 jours avant le début des expérimentations. Le stress et la douleur des animaux seront diminués au minimum : • Par l’hébergement en groupes sociaux. • Par l’enrichissement de l’environnement des cages avec du coton compressé, des frisures de papier kraft (construction de nid), des bâtonnets à ronger, des tunnels et dômes en cartons. Ce qui permet d’augmenter la diversité de leur comportement • Par une anesthésie avant et pendant la durée des procédures. • Par l’injection d’antalgique et d’anesthésique locaux lors des procédures. • Par l’application de gel ophtalmique afin de protéger les yeux pendant les anesthésies • Contre la déshydratation, une injection de sérum physiologique est réalisée avant la procédure. • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures et son réveil dans une chambre thermostatée pour les procédures avec réveil
Choix des espèces
- La souris est un modèle approprié pour cette étude car : les modèles d’étude sont bien connus, maitrisés et caractérisés. Aussi la majorité des mécanismes d’arrêt du saignement et de thrombose artérielle sont conservés et les médicaments antithrombotiques utilisés chez l’homme ont prouvé leur efficacité chez la souris. - Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période ou les souris sont pubères et ne présentent pas encore de vieillissement.
Prélèvements sanguins dans le cadre du développement et de la mise en place de méthodes analytiques chez les carnivores.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Chiens : 300
Pour caler des appareils de mesure et renouveler un stock de sang destiné au contrôle qualité de médicaments, 300 chiens et 200 chats sont soumis à des prises de sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Les prélèvements non terminaux renvoient l'animal au cheptel, où il sera prélevé de nouveau selon une rotation, tandis que quarante animaux subissent une prise de sang terminale sous anesthésie profonde et sont tués. Le porteur présente ces gestes comme déclenchés par des "demandes internes" des directions techniques. La réutilisation, mise en avant au titre de la réduction, prolonge de fait l'exploitation des mêmes individus sur plusieurs mois.
Objectifs
Paramétrer et qualifier des équipements de mesure analytique appartenant à des laboratoires rattachés au Département Recherche et développement, soit au Département Controle Qualité de l'établissement ; Développer et valider de nouvelles méthodes analytiques telles que le dosage de principes actifs ou de biomarqueurs (biochimie, hématologie, anticorps) ; Renouveler le stock de sang ou dérivés du sang nécessaire aux contrôles des lots de vaccins (Contrôle Qualité). La procédure est déclenchée suite à des demandes internes validés par les directions techniques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de disposer d'échantillons sanguins pour paramétrer et qualifier les équipements de mesure analytique, ainsi que pour valider de nouvelles méthodes de dosage de principes actifs ou de biomarqueurs. Ces échantillons alimentent également le stock de sang ou de dérivés du sang (hématies) nécessaire aux contrôles qualité de routine des médicaments. Les prélèvements par animal sont optimisés et la réutilisation des carnivores est privilégiée dans les limites éthiques. Ceci contribue à réduire le nombre total d'animaux utilisés tout en garantissant la fiabilité des études précliniques indispensables à l'élaboration de nouveaux médicaments.
Procédures
La prise de sang non terminale est toujours un acte unique (non répété sur la journée) effectué chez le chien vigile, chez le chat vigile ou anesthésié. La contention de l’animal dure environ 1 minute pour la réalisation d’une prise de sang qui comprend la tonte de la zone de prélèvement, la désinfection de cette zone et la prise de sang elle-même. La prise de sang terminale est un acte unique effectué chez un animal (chien ou chat) profondément anesthésié. Ce type de prélèvement sanguin dure au maximum 10 minutes y compris la tonte et la désinfection de la zone de prélèvement.
Impact sur les animaux
Les animaux ont été habitués à la manipulation et à la contention afin de réduire au maximum le stress et permettre ainsi la réalisation du prélèvement sanguin chez des animaux vigiles. Cependant, certains chats sont stressés par la contention qui nécessite, dès lors, une anesthésie pour le bien-être de l’animal et la sécurité du manipulateur. Les prises de sang entraînent, au plus, une douleur légère au point de ponction mais cette dernière disparaît chez l’animal anesthésié. Aucun effet indésirable n’est attendu excepté un hématome dans de très rare cas. En cas de dégradation de l'état général, qui n’a jamais été observé pour ce genre de prélèvement, l'animal sera immédiatement pris en charge par un vétérinaire afin d’établir un diagnostic et d’instaurer un traitement symptomatique.
Devenir
Tous les animaux, utilisés pour une prise de sang non terminale, retournent dans le cheptel. Tous les animaux, utilisés pour une prise de sang terminale, sont euthanasiés.
Remplacement
Il n’y a pas de méthode alternative à l’utilisation de sang (ou de ses dérivés plasma et sérum) pour la mise au point de méthodes d’analyse ou à la réalisation de test in vitro. De plus, ces dernières répondent à des exigences réglementaires BPL ou BPF ou à la Pharmacopée Européenne.
Réduction
Le projet est conçu pour limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés : 1) Optimisation du nombre d'animaux : le nombre nécessaire d'animaux est systématiquement justifié avant chaque procédure pour répondre aux besoins scientifiques tout en évitant toute duplication inutile. 2) Réutilisation éthique : la réutilisation des carnivores est privilégiée dans le respect du bien-être animal et sous réserve d'une évaluation de la sévérité réelle encourue lors des études précédentes. 3) Évaluation vétérinaire : le choix des animaux inclut une évaluation par le vétérinaire de l'établissement basée sur le cumul des procédures, l'état général, le comportement en colonie et le temps d'élimination des principes actifs: : possiblement present pour des animaux entrant dans d'autres projets et recevant des produits à longue remanencepossiblement interferents avec l'utilisation programmée du sang ou de ses dérivés. 4) Rotation des animaux : Une rotation des animaux prélevés est effectuée, car les prélèvements sont effectués sur des animaux non inclus dans des études. Celles-ci pouvant être faites à tout moment, la règle générale observée est qu’il est rare qu’un même animal soit prélevé deux fois de suite sur une période de l’ordre du trimestre.
Raffinement
Afin de limiter l'impact physiologique des prélèvements et de réduire le stress et la douleur au strict minimum, les mesures suivantes sont mises en œuvre : 1) Optimisation des volumes : les prélèvements sont réalisés selon les lignes directrices EFPIA / ECVAM afin de minimiser le volume et la fréquence. Innovation méthodologique : un volume minimal est déterminé pour chaque acte (ex : entre 3 et 10 mL pour le maintien du stock de sang dans une solution isotonique permettant la conservation des hématies, jusqu’à des quantités très faibles de « micro-échantillons de 0,5 ml pour les études de qualification pharmacocinétique selon les protocoles techniques. 2) Compétence du personnel : les prélèvements sont réalisés par du personnel formé et expérimenté, garantissant une procédure peu invasive et peu douloureuse selon les standards EFPIA / ECVAM. 3) Habituation et renforcement positif : les chiens et les chats sont habitués à la manipulation, à la contention et à l'acte de prélèvement pour prévenir le stress. 4) Récompense : une friandise est systématiquement administrée après l'intervention pour favoriser une association positive avec le personnel et la procédure. 5) Gestion du stress par la non-exposition : Le prélèvement est effectué dans une autre zone que celle de l’hébergement et un animal ne sera jamais prélevé en présence d’un autre animal afin de prévenir tout stress chez ce dernier. 6) Gestion du stress par l'anesthésie : bien que le prélèvement soit réalisé sur animal vigile, une sédation ou une anesthésie est pratiquée si la contention induit un stress ou pour prévenir des lésions vasculaires chez un animal agité (ex: jeune animal). 7) Prévention des hématomes : un point de compression manuelle est appliqué au niveau du point de ponction vasculaire immédiatement après le prélèvement. 8)Prévention des infections : la zone de prélèvement est tondue et désinfectée avant ponction veineuse. De plus, du matériel stérile à usage unique est utilisé. 9)Confort thermique : lors d'une sédation ou anesthésie, les animaux sont placés, pendant la phase de réveil, sur un matelas chauffant ou sous une lampe infrarouge afin de prévenir toute hypothermie. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil complet afin de s’assurer de leur bon état général. 10) Suivi clinique post-prélèvement : un suivi est instauré jusqu'au réveil complet avec une évaluation de l'état général et, en cas de doute, un examen spécifique des fonctions neurologiques par un vétérinaire
Choix des espèces
Les chiens et les chats sont les modèles expérimentaux choisis car l’établissement utilisateur développe spécifiquement des médicaments destinés aux carnivores domestiques. L'utilisation de ces espèces cibles est indispensable pour garantir la validation du matériel et des méthodes d’analyses employées lors des études d’innocuité et d’efficacité. Ces espèces sont recommandées par les instances réglementaires pour assurer la fiabilité des données pharmacocinétiques et bioanalytiques. L'utilisation des espèces cibles permet d'obtenir une qualité d'information optimale sur la réponse biologique réelle, facilitant ainsi la comparaison et la transférabilité des méthodes vers les études cliniques ultérieures. De plus, les techniques doivent être validées sur les espèces les plus couramment utilisées au sein de l'installation d'essai afin de maintenir un référentiel de données historiques robuste. Dans le cadre de ce projet, les animaux adultes sont privilégiés par rapport aux individus plus jeunes. Ce choix se justifie par le fait que le volume sanguin total d'un animal est directement proportionnel à son poids. Ainsi, l'impact d'un prélèvement sanguin sur l'état général est moindre chez un adulte plus lourd, ce qui constitue un raffinement physiologique important. Toutefois, en cas d'indisponibilité ponctuelle des animaux adultes (par exemple s'ils sont déjà inclus dans d'autres protocoles d'études), des jeunes adultes (à partir de 5 mois) pourront être utilisés de manière exceptionnelle pour répondre aux besoins analytiques du laboratoire. Seuls des animaux sevrés et cliniquement sains seront inclus dans les procédures. Un examen préalable par le personnel vétérinaire ou par le personnel technique qualifié sera systématiquement réalisé avant toute inclusion pour garantir le bien-être des sujets.
Identification des mécanismes de régulation fine du système dopaminergique et de leur rôle dans l’addiction
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 984 souris vont être utilisées, dont 3 190 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 1 650 opérées sans réveil, le devenir déclaré étant la mise à mort. Chaque animal génétiquement modifié passe environ deux mois isolé dans un dispositif de libre accès à l'alcool, une partie subissant une chirurgie d'injection virale, une voltamétrie cérébrale sous anesthésie ou une IRM. L'objectif est de préciser le rôle d'une protéine, OCT3, dans la dépendance à l'alcool. Le porteur évoque une cohorte d'imagerie qui pourrait être réutilisée, sans que le champ sur le devenir ne le confirme.
Objectifs
La consommation excessive d’alcool constitue un problème important de santé publique. Elle peut conduire au trouble de l’usage d’alcool, une forme de dépendance caractérisée par une perte de contrôle de la consommation et des conséquences négatives pour la santé physique, mentale et sociale. Malgré l’ampleur de ce problème, les traitements actuellement disponibles restent limités et ne sont pas toujours efficaces pour toutes les personnes. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui contribuent à la dépendance à l’alcool afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le cerveau joue un rôle central dans les comportements liés à la consommation d’alcool. Certaines régions cérébrales participent à la régulation de la motivation, de la prise de décision et de la sensation de récompense. Ces processus reposent sur l’action de molécules appelées neurotransmetteurs, dont la dopamine, qui est impliquée dans la sensation de plaisir et dans la motivation à répéter certains comportements. Des perturbations du système dopaminergique sont souvent associées aux comportements addictifs. Des études scientifiques récentes suggèrent qu’une protéine appelée OCT3 pourrait participer à la régulation de ce système dans le cerveau et influencer certains effets de l’alcool. Cependant, son rôle exact dans la consommation répétée et excessive d’alcool reste encore mal compris. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans les mécanismes cérébraux impliqués dans la consommation d’alcool. Pour cela, des études seront réalisées chez l’animal, ce qui permet d’examiner de manière contrôlée les effets de certaines modifications biologiques sur le fonctionnement du cerveau et sur le comportement. Nous analyserons notamment l’influence de cette protéine sur la consommation d’alcool, les comportements associés à cette consommation, ainsi que certains mécanismes biologiques dans le cerveau. Ces travaux permettront d’améliorer les connaissances scientifiques sur les mécanismes impliqués dans la dépendance à l’alcool. À plus long terme, les résultats de ce projet pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et au développement de stratégies innovantes pour le traitement des troubles liés à l’usage d’alcool.
Bénéfices attendus
Sur le plan scientifique, ce projet permettra de mieux comprendre comment la dopamine agit sous l'effet de l'alcool, grâce à deux protéines clés : le DAT et l'OCT3, qui joue un rôle complémentaire. Nous étudierons comment ces protéines captent la dopamine après sa libération, et comment les bloquer modifie les effets de l'alcool. Nous évaluerons également les impacts sur le comportement et sur certaines fonctions cérébrales des animaux ne possédant pas ces protéines, ainsi que les changements génétiques dans différentes zones du cerveau impliquées dans la régulation de la dopamine. Sur le plan applicatif, ces connaissances constitueront une base solide pour envisager des stratégies thérapeutiques ciblées sur OCT3 ou des transporteurs associés (comme le DAT) dans le traitement des troubles liés à l’usage d’alcool et, plus largement, des addictions aux substances psychoactives. En résumé, il s’agit d’un projet à forte valeur ajoutée, à la fois pour la compréhension de l’addiction et pour l’exploration de médicaments innovants.
Procédures
Les animaux issus des lignées transgéniques seront générés par reproduction ciblée, avec un génotypage effectué entre 10 et 21 jours d’âge. Une partie des animaux génotypés subiront une chirurgie (environ 30 minutes) permettant l’injection d’un vecteur viral spécifique. La consommation volontaire d’alcool sera évaluée selon un protocole d’accès intermittent à deux bouteilles, dont environ 50 % (2420) affectés à un groupe contrôle ayant accès uniquement de l’eau. La durée de cette phase sera de deux mois, à partie de la 5ème semaine d’âge. Pour la voltamétrie, les animaux (14ème semaine de vie) sont anesthésiés avec un anesthésique gazeux, afin d’implanter une électrode de stimulation et une électrode d’enregistrement. Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure qui dure 2 à 3 heures. Des sessions d’imagerie par résonance magnétique (IRM) de 1h seront réalisées sous anesthésie gazeuse, avec réalisation d’injection au cours de l’anesthésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus chez les animaux dans le cadre de ce protocole incluent principalement l’hébergement individuel tout en conservant un contact visuel et auditif avec les autres cages. Les manipulations comme les injections de molécules et les tests comportementaux seront réalisés après une habituation progressive, incluant des séances quotidiennes de manipulation et d’exposition aux dispositifs expérimentaux. L’état des animaux sera surveillé quotidiennement et toute anomalie fera l’objet d’une prise en charge adaptée. Le génotypage par biopsie de queue ou d’oreille chez des souris âgés de 10 à 21 jours est classé comme procédure légère. Cet inconfort temporaire se résout spontanément en quelques minutes sans traitement spécifique requis. Cette procédure sera réalisée par du personnel formé et expérimenté afin de minimiser le stress et la douleur. La voltamétrie utilise des micro électrodes implantées sous anesthésie générale et gestion de douleur appropriée. Les animaux sont euthanasiés à l'issue de la procédure. L'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) est réalisée sous anesthésie légère avec maintien strict de la température (température 37°C), monitoring respiratoire continu
Devenir
Mis à mort
Remplacement
Le remplacement par des méthodes alternatives n’est pas possible pour les objectifs de ce projet. L’étude des comportements volontaires liés à la consommation d’alcool requiert l’usage d’organismes murins, car ces comportements impliquent des processus neurobiologiques complexes (motivation, récompense, apprentissage) qui ne peuvent pas être reproduits de manière pertinente par des approches expérimentales ne faisant pas intervenir l’organisme entier. Les souris constituent un modèle bien établi pour l’étude des mécanismes neurocomportementaux et permettent une transposition fiable des résultats chez les mammifères. Les conséquences de l’exposition répétée à l’alcool sur le circuit de la récompense ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires. En effet, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité de l’organisation cérébrale et des interactions dynamiques entre réseaux neuronaux L’étude des modifications fonctionnelles des circuits cérébraux induites par l’alcool nécessite donc le recours à des organismes vivants et entiers.
Réduction
Le nombre d’animaux (4984 animaux) prévu a été déterminé sur la base d’analyses de puissance statistique et de données issues d’expériences antérieures avec des modèles de consommation volontaire d’alcool du laboratoire, afin d’identifier le nombre minimal nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Le nombre initial d’animaux prend également en compte les pertes prévisibles liées à l’acquisition de la consommation d’alcool et aux manipulations expérimentales, réduisant ainsi la nécessité de répéter les expériences. Les analyses par IRM seront réalisées sur une cohorte distincte d’animaux n’ayant pas participé au paradigme de consommation volontaire d’alcool. Afin de répondre au principe de réduction du nombre total d’animaux utilisés, ces sujets ne seront pas systématiquement euthanasiés à l’issue de l’IRM. Sous réserve de compatibilité avec leur état de santé et les exigences des autres protocoles, ils pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales autorisées ou transférés vers des projets complémentaires, conformément à la réglementation en vigueur et après validation par le comité d’éthique. Par ailleurs, tous les animaux seront surveillés quotidiennement pour garantir leur bien-être et prévenir toute perte évitable. Cette stratégie garantie l’utilisation du nombre minimal d’animaux nécessaire tout en maintenant la rigueur scientifique et la fiabilité des résultats.
Raffinement
À partir de la 5ᵉ semaine d’âge, les animaux seront hébergés individuellement pour permettre le suivi précis de la consommation d’alcool dans le paradigme de libre choix à deux bouteilles avec accès intermittent. Cet hébergement, limité à la durée du protocole (2 mois), permet une mesure fiable de la consommation tout en maintenant un contact visuel et auditif entre animaux. Le bien-être sera préservé grâce à des enrichissements adaptés (matériaux de nidification, abris, roue). Une période d’acclimatation (1 semaine) et d’habituation (5 jours) précédera toute manipulation afin de réduire le stress et d’améliorer la fiabilité des mesures comportementales. Les manipulations et injections seront précédées de séances progressives de familiarisation, incluant des manipulations quotidiennes et trois injections d’habituation de solution saline (même voie et volume que les injections expérimentales). Cette approche progressive vise à diminuer la réponse au stress et à garantir la reproductibilité des données. Les procédures chirurgicales (implantation de microélectrodes pour voltametrie) seront réalisées sous anesthésie générale et locale, associée à une prise en charge de la douleur avant et après l’intervention. La température corporelle sera maintenue sur un tapis chauffant jusqu’au réveil complet. Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. L’IRMf sera réalisée sous anesthésie légère, en veillant au bon fonctionnement des fonctions physiologiques (température maintenue à 37 °C, surveillance de la respiration). Cette technique, non invasive, ne provoque pas de nuisance mesurable ni d’altération tissulaire. Les effets potentiels liés à l’exposition à l’alcool (modifications transitoires de l’activité motrice) seront surveillés quotidiennement à l’aide d’une grille d’observation spécifique. L’ensemble de ces mesures – acclimatation, enrichissement, contrôle rigoureux de la douleur et surveillance continue – vise à minimiser le stress, la douleur et l’inconfort, conformément aux principes de raffinement et de bien-être animal.
Choix des espèces
Le choix de la souris OGM repose sur sa pertinence scientifique pour l'étude des mécanismes neurobiologiques et comportementaux impliqués dans la dépendance à l'alcool. Cette espèce est un modèle de référence en neurosciences comportementales et en pharmacologie permettant une approche complémentaire entre manipulations génétiques fines et études comportementales complexes. Cette espèce possède, par ailleurs, une proximité physiologique et génétique suffisante avec l’humain, essentiels pour comprendre les mécanismes de l'addiction, notamment ceux impliquant la neurotransmission dopaminergique. Enfin, leur taille, leur facilité d'élevage, ainsi que la disponibilité d'outils génétiques avancés font des modèles adaptés à des études précliniques rigoureuses, tout en respectant les principes éthiques des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner). Les analyses par IRM seront réalisées sur une cohorte distincte, n’ayant pas participé au paradigme de consommation volontaire d’alcool. Ces animaux recevront uniquement des injections aiguës d’alcool au cours de l’imagerie. Nous utiliserons des animaux à partir de la 5ème semaine d’âge. À ce jour, aucune alternative ne permet de reproduire de manière intégrées les interactions moléculaires, cellulaires et comportementaux les effets de la consommation d’alcool, ce qui rend indispensable le recours à ces modèles animaux.
Ouverture des barrières hémato-médullaire et hémato-encéphalique combinée à un traitement anti-inflammatoire dans plusieurs modèles murins de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
416 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à vingt-trois injections sur dix semaines, dont 336 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 40 opérées puis tuées sans réveil. S'y ajoutent l'ouverture répétée des barrières entre le sang et le système nerveux central par ultrasons sous anesthésie, des électromyographies et, pour certaines, une biopsie. Les modèles murins portent une sclérose latérale amyotrophique qui entraîne une paralysie progressive. Le porteur espère ralentir la maladie en faisant pénétrer des cellules immunitaires dans le système nerveux, un bénéfice pour les patients formulé au conditionnel.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative grave qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones au niveau du cortex et de la moelle épinière et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Le seul traitement utilisé en clinique, le Riluzole, ne permet de prolonger la survie que de 2 mois en moyenne. Les barrières entre le sang et le cerveau, hémato encéphalique et entre le sang et la moelle épinière, hémato médullaire sont des structures limitant le passage des molécules du sang vers le système nerveux central et représentent donc un challenge dans le traitement des maladies neurologiques et particulièrement de la sclérose latérale amyotrophique, qui ne trouve à ce jour pas de traitement satisfaisant. Il est aujourd’hui possible d’ouvrir cette barrière de manière transitoire et sans danger. Il a été montré que certaines cellules immunitaires dans des modèles murins de sclérose latérale amyotrophique permettaient de ralentir la progression de la maladie. L’objectif de notre étude sera de réaliser une approche combinée, avec une stimulation de ces cellules immunitaires associée à une ouverture transitoire des barrières hémato-médullaire et encéphalique, permettant d’augmenter leur infiltration dans le système nerveux central pour ralentir d’autant plus la progression de la maladie.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de chercher à ralentir la progression de la maladie, en induisant une immunomodulation locale par ouverture des barrières hémato-médullaire et encéphalique, et stimulation de certaines cellules immunitaires. A plus long terme, en cas d’efficacité, un passage en essai clinique chez l’homme est envisagé. Des méthodes existent déjà chez l’homme pour ouvrir la barrière hémato encéphalique et un dispositif d’ouverture adapté aux patients atteint de sclérose latérale amyotrophique pourrait voir le jour si l’étude préclinique s’avère positive.
Procédures
Les modèles murins de sclérose latérale amyotrophique et les souris non génétiquement modifiées commerciales seront soumis à plusieurs injections d’un traitement immunomodulateur (animal vigil, 23 injections sur 10 semaines, 1 minute), des prélèvements sanguins (animal vigil, 10 maximum sur 10 semaines, 1 minute), des mesures de force musculaire et ou d’endurance (animal vigil, 17 fois sur 17 semaines, 5 minutes), contrôle du poids (animal vigil, 1 fois par semaine pendant 17 semaines, 2 minutes). Une biopsie sera réalisée pour unne vérification du génotype des souris provenant de fournisseurs extérieurs (animal anesthésié/analgésie lors de la première anesthésie pour ultrasons, 1 seule fois, 30 secondes) Ouverture des barrières hémato-médullaire ou encéphalique (animal sous anesthésie générale et analgésie, pendant 1h, 1 fois toutes les 2 semaines pendant 7 semaines, 5 minutes pour la procédure d’ouverture). Mesures électromyographiques pour tester la fonctionnalité des neurones moteurs au stade symptomatique de la maladie sous anesthésie générale, avec une analgésie (procédure durant 8minutes).
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises à plusieurs injections qui pourront engendrer une douleur légère, de courte durée. Dans de rares cas, les injections répétées pourront, par exemple, engendrer une péritonite ou une inflammation au niveau oculaire. Les tests de mesure de force pourront engendrer un léger stress. Les prélèvements sanguins pourront créer un hématome. Le phénotype des animaux pourra entrainer une faiblesse musculaire conduisant à une paralysie. L’exposition aux ultrasons requiert un rasage et pourra engendrer un léger stress aux animaux. Cependant, toute la procédure, rasage et exposition aux ultrasons, se fait sous anesthésie générale. L’anesthésie pourra engendrer une hypothermie et un risque de détresse cardio-respiratoire. Le phénotype des modèles murin de sclérose latérale amyotrophique (SLA) se traduit par une perte de poids, une perte de force musculaire et une paralysie progressive, au cours de la maladie. Les sites d’injection et de prélèvement peuvent s’infecter. La manipulation des animaux pourra induire un stress. Les biopsies réalisées chez les souris provenant de fournisseurs extérieurs (sous anesthésie générale, lors de la première anesthésie pour ultrasons) pourront induire une douleur légère et de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour permettre le prélèvement des différents tissus d’intérêt qui sont affectés par la maladie, notamment le tissus nerveux, les nerfs, les muscles et les cellules sanguines, pour des analyses histologiques ou transcriptomiques.
Remplacement
Ces modèles animaux sont actuellement les seuls qui permettent de reproduire la paralysie progressive chez l’adulte dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique et donc de modéliser la physiopathologie humaine. Ils sont aussi le seul modèle permettant d’étudier un effet sur la progression de la maladie, raisons pour lesquelles notre projet nécessite l’utilisation de modèle de souris à progression rapide et lente. Divers travaux ont déjà mis en œuvre des expériences utilisant des cultures cellulaires pour montrer l’intérêt des molécules que nous souhaitons tester. Dans le cadre de ce projet combinant l’administration d’un traitement anti-inflammatoire et l’ouverture transitoire des barrières hémato-médullaire et encéphalique, il n’est pas possible d’évaluer leurs effets sur la progression de la maladie et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central avec de telles cultures cellulaires. L’intérêt du projet est de mesurer un effet de l’entrée de ces cellules protectrices dans le système nerveux central, par rapport à l’effet de la périphérie, afin de pouvoir augmenter l’effet bénéfique. Nous avons donc besoin d’un modèle ayant un système nerveux central, un système vasculaire et un système nerveux périphérique, donc, un système animal. Nous utilisons la souris car, c’est dans cette espèce que le modèle de SLA est le plus représentatif de la progression de la maladie qui se développe chez les patients atteints de SLA.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 416 souris dans ce projet, la taille des effectifs a été établie de façon à obtenir un résultat statistiquement significatif et d’obtenir une conclusion scientifique à l’ensemble de nos travaux. Le nombre de souris par groupe sera déterminé par un calcul de puissance utilisant les mêmes aspects méthodologiques nous ayant permis d’obtenir des résultats significatifs pour nos travaux précédents.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Acclimatation minimale de 7 jours pour les animaux provenant des fournisseurs extérieurs. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères du même sexe (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et l’état des animaux est vérifié quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Des petites maisons en carton et des carrés de coton seront intégrés dans les cages pour permettre de faire des nids. Si la maladie des souris n’est pas synchrone d’une souris à l’autre, les souris ayant du mal à se déplacer (pour cause de paralysie engendrée par la maladie) seront séparées pour éviter que les souris plus vives ne les piétinent. Elles seront alors placées en hébergement individuel ou avec les autres souris paralysées (2 à 5 souris par cage sauf cas exceptionnel et peu probable où il n’y aurait qu’une souris dans cet état). Un mélange de poudre de nourriture et d'eau (bouillie) sera proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une déshydratation et une dénutrition. Une attention particulière sera portée aux yeux des souris qui seront fréquemment nettoyés (à l’eau stérile) en cas de suintement, pour éviter toute infection. De la solution antiseptique sera utilisée si les yeux paraissent trop souillés comme désinfectant. Proche du stade terminal, les souris seront surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours de la semaine (week-ends inclus). Toutes les précautions seront prises afin de n’imposer aucune souffrance ou une contrainte minimale aux souris utilisées et nous avons, pour chaque procédure, défini un point limite.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la sclérose latérale amyotrophique (SLA), souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre différents types cellulaires et la communication entre des cellules immunitaires infiltrant depuis la périphérie, dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons, mouches, vers ne sont pas de bons modèles pour répondre à nos questions. Nous utilisons aussi des cultures cellulaires mais, celles-ci ne peuvent pas permettre d’évaluer un effet sur la progression de la maladie dans un modèle intégré et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central. Nous avons donc besoin d’un modèle ayant un système nerveux central, un système vasculaire et un système nerveux périphérique, donc, un système animal. Nous avons une grande expérience des souris et le modèle est mieux établi chez la souris que chez le rat, c’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. C’est dans l’espèce souris que le modèle de SLA est le plus représentatif de la progression de la maladie qui se développe chez les patients atteints de SLA. Les souris SLA seront utilisées à l’âge adulte entre 7 semaines et 24 semaines pour les modèles à progression rapide et entre 7 semaines et 52 semaines pour le modèle à progression lente. L’utilisation de modèles murins dans ce projet va donc permettre d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la maladie, et évaluer la possibilité d’un essai thérapeutique chez l’homme.
Essai d’efficacité et de sécurité de nouveaux dispositifs chirurgicaux en chirurgie mini-invasive – EU 1/2 MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles urogénitaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Répondant à des demandes de prestation de service pour valider des dispositifs médicaux, 380 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie opérée sans réveil. Chaque animal subit des interventions chirurgicales sous anesthésie pouvant durer jusqu'à quatre heures, des imageries répétées sur six mois et des prises de sang. Les bénéfices annoncés concernent la sécurité de dispositifs destinés à des patients humains. Tous sont tués en fin de projet pour l'autopsie, dans un cadre présenté comme une offre commerciale de recherche et de développement.
Objectifs
Ce projet de recherche et de développement vise à répondre à différentes demandes de validation préclinique de dispositifs médicaux (DM) innovants sur modèle porcin. Selon la réglementation, on entend par DM, tout instrument, implant, appareil, équipement, logiciel ou réactif utilisé, seul ou en association, à des fins médicales chez l’Homme. Ce projet détaille les procédures pouvant être utilisées chez les porcs pour évaluer des DM, en assurant leur prise en charge médicale selon les niveaux de complexité des interventions. La mise en œuvre du projet s’appuie sur l’expertise de nos équipes dans les approches chirurgicales mini-invasives, pour tester l'efficacité et la sécurité de DM en recourant à des méthodes et des équipements à la pointe de la technologie et de l’innovation. Dans le but de répondre à la demande de prestation de service aussi bien en recherche et développement que pour la réalisation d’études conformes aux BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoire), ce projet vise à couvrir de façon générale plusieurs DM dont la pertinence scientifique et la licéité de mise en œuvre chez l’animal auront été préalablement évaluées par le comité scientifique de l’établissement. Dans le cadre de ces tests réalisés pour des équipes internes ou externes, deux types d’événements sont explorés : ceux liés directement au DM testé et ceux qui sont en rapport avec la technique d’implantation ou opératoire. L’objectif est d’évaluer les principales complications pouvant apparaitre pour établir le rapport bénéfice/risque du dispositif médical testé. MODIFICATION : Des imageries supplémentaires (IRM, scanner et/ou angiographie) seront réalisées afin d’apporter une valeur ajoutée au protocole initial, en permettant une caractérisation plus précise des structures d’intérêt, une évaluation fine des modifications morphologiques et fonctionnelles induites par la procédure expérimentale, et la détection d’éventuelles complications. Les animaux seront transportés dans un autre établissement pour la réalisation de ces examens, dans des conditions sécurisées, sous anesthésie générale et avec un monitoring continu, afin de garantir leur sécurité et leur bien-être tout au long du transport et de la procédure.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus lors de ce projet concernent l’effiacité thérapeutique et la sécurité (éviter les effets secondaires) de dispositifs médicaux utilisables chez des patients humains principalement dans le domaine chirurgical.
Procédures
Les interventions se dérouleront sous anesthésie générale pendant la durée de l'intervention pouvant aller jusqu'à 4h maximum. MODIFICATION : Des imageries en plus des échographies seront réalisées un nombre défini de fois par animal, en fonction des objectifs expérimentaux, généralement en pré-opératoire pour obtenir une évaluation de référence et en post-opératoire pour suivre les modifications induites par la procédure. Sur une période de suivi longue durée suite à l‘implantation d’un dispositif, la position du dispositif pourra être contrôlé par imagerie de façon régulière (1à 2 fois par mois selon le dispositif sur une durée pouvant aller jusqu’à 6 mois). Ces examens d'imagerie sont d'une durée approximative de 15 minutes par animal. Des prises de sang sur animal anesthésié pourront également être réalisées afin de réaliser des bilans sanguins ou de suivre des paramètres biologiques spécifiques. Le nombre maximum de prises de sang et le délai entre chaque dépendra du volume prélevé. Ainsi ce délai pourra aller de 24h pour des petits volumes de sang jusqu’à 3 semaines si un volume de sang important venait à être prélevé.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les animaux sont liés aux actes suivants : - Anesthésie : injection intra-musculaire (douleur transitoire au site d'injection), pose de cathéter à la veine auriculaire (douleur locale au site d'insertion du cathéter, risque d'hématome), risque d’hyperthermie maligne liée aux anesthésiques, risque de défaillance cardiorespiratoire - Pose du dispositif ou test d’un instrument/équipement/réactif/logiciel : douleur et/ou infection au site de pose/test, réaction inflammatoire locale, saignement transitoire - injections : * intra-veineuses: elles sont faites dans le cathéter limitant ainsi la douleur locale (on ne pique qu'une fois) et le risque d'hématome. * sous-cutanées ou intra-musculaire : douleur locale. * Les susbtances injectées sont toutes médicamenteuses, un des rares effets indésirables potentiels serait une réaction allergique
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort en fin de projet car une autopsie doit être réalisée afin de prélever des organes et ainsi d’étudier l’effet du dispositif médical.
Remplacement
Toute évaluation d’un dispositif médical doit apporter des preuves suffisantes de son efficacité et de sa sécurité pour autoriser son utilisation sur des patients avec un taux de réussite optimal (durée d’intervention, efficacité du geste). L’étude initiale du DM sur simulateurs et modèles ex vivo permet d’en tester le concept et la faisabilité technique. Elle doit être souvent complétée par des études de compatibilité, d’efficacité et de sécurité qui nécessitent une phase d’expérimentation sur organisme entier vivant. Les procédures innovantes sont ainsi reproduites dans des conditions proches de la clinique, précliniques, qui incluent également les situations parfois difficiles liées aux voies d’abord, repères anatomiques, complications. Il n’existe pas de modèle ex-vivo ou d’autres possibilités de remplacement suffisantes pour valider intégralement l’efficacité et la sécurité de certains DM avant leur utilisation chez l’Homme, en particulier dans les contextes d’indications chirurgicales effectuées par des approches mini-invasives innovantes. A un stade de développement avancé, il devient nécessaire d’intervenir sur organisme entier vivant pour reproduire des situations cliniques, parfois complexes, de façon réaliste, en prenant en compte les complications éventuelles (voies d’abord, repères anatomiques, hémorragie, nécrose, viabilité des organes, compatibilité…). Les résultats des expérimentations animales permettront de rejeter des DM /procédures inefficaces et/ou dangereux en conditions « réelles », d’élaborer de manière optimale les protocoles de recherche cliniques en cas de résultats positifs et, à terme, de valider de nouveaux DM/ procédures cliniques innovantes utilisables chez les patients humains.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’envisager une application chez l’Homme. Les interventions sont réalisées par des chirurgiens experts, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaires en optimisant le taux de succès. Chaque DM sera testé préalablement sur un faible effectif d’animaux (2 à 6) avant d’engager une étude plus complète après avis d’experts et d’éventuelles améliorations du dispositif et/ou de la procédure. 380 porcs sont prévus. Ceci est une estimation a priori pour tester une trentaine de DM innovants sur la durée de ce projet. Le nombre requis précisément dépendra des caractéristiques de chaque DM, de son caractère innovant, de la complexité de la procédure, de l’expérience du chirurgien et des risques estimés. Nous ne faisons pas de tests statistiques car il s’agit de preuves de concept sur un très faible nombre d’animaux. Les usages sur le marché du DM et notre expérience montrent que 6 porcs sont généralement nécessaires pour les études de faisabilité et preuves de concept (principalement sans réveil, mais pouvant parfois être réalisées en survie sur un faible effectif), puis en moyenne 10 pour l’évaluation préclinique (sans réveil ou en survie). Nous estimons que sur les 30 DM testés en faisabilité, 70% pourraient passer en phase d’évaluation préclinique : les procédures seront d’abord soumises à un expert pour validation, puis réalisées étape par étape avec évaluations intermédiaires et propositions d’amélioration.
Raffinement
Le protocole prévoit des procédures mini-invasives réalisées sous anesthésie générale. Dans les études de faisabilité, de nombreux DM peuvent être évalués sans nécessité de réveiller l’animal en fin d’expérimentation. Dans les études de compatibilité, d’efficacité et de sécurité du DM, les animaux seront réveillés après l’intervention et seront soumis à un suivi clinique quotidien par du personnel qualifié, sous couverture antalgique dès que nécessaire, et hébergés dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie) et enrichi : Les porcs sont des animaux sociaux, propres, avec un instinct de fouissement et d’exploration des matériaux. L’enrichissement apporté pour favoriser leurs comportements naturels comprend une stabulation en groupe social lorsque possible, la mise à disposition de jouets à mâchouiller, à manipuler (balles, jouets, chainettes...), l’accès à des zones de repos distinctes des zones de défécation. L’environnement sonore en animalerie est aussi apaisé par la diffusion de musique. Toute altération de leur état général sera reportée au vétérinaire et au responsable de l’intervention médicale qui mettront en œuvre des traitements adaptés. Des critères d’arrêt anticipé en cas de survenue de complications sont définis et validés par la structure en charge du bien-être animal. Toutes les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec monitoring et gestion de la douleur. Une surveillance rapprochée des animaux permettra d’adapter le traitement à leur état clinique sur avis vétérinaire. Les modalités d’hébergement (paramètres environnementaux, alimentation, enrichissement, socialisation) sont contrôlées quotidiennement par des animaliers habilités. Si certains animaux présentaient des signes de souffrance ou de mal-être avant la fin de la période de survie, ils seraient euthanasiés et les données exploitables collectées. Le protocole sera alors revu avec les experts et affiné avant de recommencer une nouvelle série d’animaux. La SBEA (Structure du Bien-Etre Animal) est associée aux décisions relevant du bien-être des animaux en cours d’étude. A la fin du protocole, une étude rétrospective sera réalisée afin d’améliorer de façon continue nos protocoles et nos modèles. MODIFICATION: Les animaux seront transportés anesthésiés vers le deuxième établissement, avec monitoring des paramètres vitaux et maintien de la température à l’aide de couvertures de survie, assurant sécurité et confort.
Choix des espèces
Le Porc est un modèle de choix de par sa taille et son anatomie comparables à l’Homme, il permet l’utilisation d’instruments et équipements de chirurgie, endoscopie notamment, conçus pour l’Homme, et ainsi de reproduire de façon pertinente les procédures en clinique. Notre laboratoire dispose d’une forte expertise sur ce modèle avec de nombreuses données scientifiques disponibles (anatomie, chirurgie…). Des porcs, jeunes adultes entre 25 et 60 Kg, seront utilisés. La taille des organes des porcs à ce stade de croissance correspond déjà à ce qui peut être observé en clinique chez l’Homme, il offre les repères anatomiques recherchés par le praticien et permet d’utiliser les mêmes équipements et matériels chirurgicaux que chez le patient. Dans certains cas, en particulier pour les survies supérieures à 3 mois, le modèle « miniporc » (15-30 kg) pourra être retenu pour ses caractéristiques de croissance plus faible. Ce modèle de cochon « miniature » permet en effet de suivre sur du long terme un dispositif in situ sans qu’il soit trop impacté par la croissance rapide de certains organes (le porc charcutier « standard » peut prendre jusqu’à 800g par jour). Pour les porcs charcutiers, la durée de survie maximale a été fixée à 6 mois afin de limiter les contraintes zootechniques liées à la manipulation d’animaux pouvant dépasser les 100kg.
Evaluation de l’effet antithrombotique et de l’impact sur l’hémostase d’un agent thérapeutique ciblé amélioré
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumises à une chirurgie et à des injections, parfois jusqu'à une coupure de l'extrémité de la queue, 640 souris vont être utilisées dans des procédures dont la souffrance va de nulle sous anesthésie à sévère. Certaines subissent des interventions de 40 minutes à près de deux heures sans réveil, d'autres présentent apnées, respiration haletante ou saignements provoqués par les molécules de référence. L'objectif est de tester un agent antithrombotique censé réduire le risque de saignement par rapport aux traitements actuels. Ce bénéfice reste renvoyé au long terme, face à des thromboses et des hémorragies infligées ici et maintenant à 640 animaux.
Objectifs
La thrombose est un processus pathologique dû à du sang qui coagule, forme un caillot (ou thrombus) et obstrue le vaisseau. Il en résulte un défaut d’apport en oxygène, ou une accumulation de sang en amont et en fonction des organes atteints, comme le cœur, les poumons ou le cerveau, c’est une urgence vitale. Il existe des traitements comme les anticoagulants ou les thrombolytiques, qui visent à détruire le thrombus. Mais malgré les traitements actuels, l’efficacité reste limitée, avec un taux de mortalité ou de morbidité qui restent importants. Les complications chroniques sont fréquentes à cause d’un thrombus résiduel qui diminue drastiquement la qualité de vie du patient et est un fardeau économique pour la société. À cela s’ajoutent des effets indésirables des traitements comme le risque de saignement ou la toxicité cérébrale. L’objectif du projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique ciblée, fondée sur des agents améliorés. Ces agents, ciblant spécifiquement un composant du thrombus, la fibrine, et couplés à un anticoagulant ou à un agent thrombolytique, visent à traiter localement la thrombose tout en limitant le risque de saignement.
Bénéfices attendus
Cette étude devrait nous permettre : -De mettre en évidence une réduction de la thrombose dans des modèles expérimentaux. -De mettre en évidence un effet des agents améliorés sur l’hémostase moins important que celui des traitements de référence, donc un risque de saignement réduit et acceptable. -De déterminer la durée et l’intensité de l’action des agents améliorés. Ce projet pourrait permettre à long terme d’améliorer la prise en charge des patients atteints de thrombose et de réduire les séquelles associées.
Procédures
Un groupe de souris est soumis à une injection sur animal vigile (30 s). Certaines souris anesthésiées sont soumises à une chirurgie et deux injections, sans réveil de l’animal (entre 40 min et 1h45). Certaines souris anesthésiées sont soumises à une chirurgie, maximum deux prélèvements de sang et deux injections (30 min). Certaines souris anesthésiées sont soumises à une injection puis à une coupure de l’extrémité de la queue (35 min).
Impact sur les animaux
Pour toutes les procédures, un stress dû à la contention peut apparaître. Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que des risques de saignement au site d’incision. D’éventuelles douleurs peuvent apparaître lors du réveil de l’animal et dans les heures suivantes. Dans les procédures de thromboembolisme, une apnée de plus d’1 minute peut être observée. L’animal peut également présenter une respiration haletante. Dans la thrombose veineuse, on peut observer des douleurs au niveau de la plaie, une altération de la motricité et de la locomotion. Dans l’ensemble des procédures, des saignements dû à la nature des molécules de références peuvent apparaître.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux sont mis à mort. Les prélèvements réalisés ne sont pas compatibles avec un réveil des animaux suite aux PE.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer une approche thérapeutique ciblée améliorée, reposant sur le développement d’agents agissant sur la thrombose. Les deux pathologies étudiées (thrombose veineuse et artérielle) étant des processus particulièrement complexes faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que des conditions de flux (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de totalement substituer les modèles animaux par des modèles in vitro. Les principaux modèles in vitro permettent d’étudier la formation de thrombus sous flux contrôlés sur des surfaces induisant une thrombose, mais dans des conditions très simplifiées, sans endothélium fonctionnel et avec une architecture vasculaire artificielle. Ils ne peuvent donc pas reproduire la complexité d’un organisme vivant ni prédire de façon fiable la réponse globale des agents testés, ce qui justifie le recours à un modèle in vivo pour répondre à notre question scientifique. Les agents améliorés ont été préalablement testés dans des modèles in vitro sur sang humain afin de valider l’efficacité antithrombotique et anticoagulante des molécules avant de les tester in vivo. Obtenir des données chez la souris est nécessaire pour poursuivre le développement de ces agents, vers un potentiel essai clinique.
Réduction
Le projet se fera par étapes. Le nombre de souris par groupe est réduit au minimum pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Afin de limiter le nombre de souris, nous réaliserons une première procédure visant à mettre en évidence l’effet d’un de nos agents sur la thrombose déjà formée. Si aucun effet n’est observé, le développement de cet agent sera stoppé. De plus, lorsque des prélèvements sanguins sont nécessaires, ils ne seront effectués que si l’agent est encore présent dans l’échantillon collecté au temps précédent.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 14 jours entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation à la manipulation est prévue 5 jours avant le début des expérimentations. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : •Par l’hébergement dans des cages en groupes sociaux. Ces cages seront munies de divers enrichissement ce qui permet aux souris d’organiser leur environnement selon leurs besoins. •Par des mesures péri-opératoires permettant de réduire les douleur et souffrances à leur minimum. •Des points limites ont été établis, permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont maîtrisés, notamment les modèles d’hémostase et de thrombose. Elle est la plus adaptée pour ce projet, car les mécanismes de thrombose et d’hémostase y sont très bien connus et très proches de ceux de l’être humain. De plus, les médicaments contre la thrombose efficaces utilisés actuellement chez l’Homme ont prouvé leur efficacité dans des modèles de thrombose chez la souris, ce qui nous permet de comparer nos agents aux traitements actuellement utilisés en clinique. Dans toutes les procédures, les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Le vieillissement des animaux n’est pas souhaitable car il introduit des variabilités physiologiques majeures qui pourraient masquer les effets spécifiques de nos ADCs. Les animaux pubères sont préférables car ils présentent un système cardiovasculaire et hémostatique physiologique, sans comorbidités.
Formation réglementaire « Initiation à chirurgie expérimentale » : travaux pratiques sur rats pour l’apprentissage des bonnes pratiques chirurgicales avec réalisation d’ovariectomies sans réveil
- Formation professionnelle
Opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 50 rats vont être utilisés dans une formation à la chirurgie, dans des procédures menées sans reprise de conscience. Chaque animal, une femelle adulte, subit une ovariectomie et une ouverture de l'abdomen de 45 minutes pratiquée par un stagiaire, avec risque de délabrement des tissus, de saignement et d'hémorragie interne. La finalité n'est pas de produire des connaissances mais de remplir une obligation réglementaire de formation, à raison de deux sessions par an. Le porteur décrit les exercices sur silicone et cadavres comme un remplacement partiel, avant de conclure au maintien d'un rat vivant par stagiaire.
Objectifs
Notre organisme de formation propose des formations réglementaires et continues dans le domaine de la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Une demande d’approbation a été déposé auprès de la DGAL pour une formation réglementaire en chirurgie expérimentale et a reçu un avis favorable lors de la commission du 14 octobre 2025. La formation spécifique « initiation à la chirurgie expérimentale » est une formation réglementaire obligatoire pour toutes les personnes détenant le niveau concepteur ou applicateur et désireuses de mettre en œuvre des procédures chirurgicales. Est considérée comme procédure chirurgicale toute intervention invasive sur un animal impliquant l’ouverture d’une cavité corporelle (abdominale, thoracique, crânienne, articulaire) ou la manipulation directe de tissus ou organes internes. Cette définition s’appuie sur la directive 2010/63/UE (art. 3, annexe VIII), les arrêtés du 1er février 2013 relatifs à l’expérimentation animale, et le glossaire validé par la CNEA (2022). Cette DAP décrit le seul TP utilisant des animaux vivants. Le programme a été conçu dans le respect du principe des 3R tout en respectant les obligations réglementaires en termes de pédagogie initiale pour la pratique de la chirurgie expérimentale. Ce TP correspond à une ovariectomie chez des rattes femelles, sans réveil. Les objectifs du projet correspondent aux objectifs pédagogiques de ce TP c’est à dire : (i) préparation de l’animal à une procédure chirurgicale (ii) Gestion d’une anesthésie chirurgicale complète pendant une intervention (iii) respecter les bonnes pratiques et en particulier les principes d’asepsie, d’hémostase, de suture.
Bénéfices attendus
• Permettre au personnel concepteur et applicateur d’être en règle avec la réglementation et de connaitre les bonnes pratiques chirurgicales à appliquer dans les procédures chirurgicales • Favoriser la montée en compétences des personnes utilisant les animaux à des fins scientifiques : avec 2 sessions par an en moyenne, ce serait 40 concepteurs ou applicateurs formées à la chirurgie sur 5 ans
Procédures
- injection sous cutanée pour les rats en anesthésie fixe (une fois chaque rat, durée : 3 à 5 secondes) - anesthésie générale (une fois pour chaque rat, durée : 1h en moyenne) - chirurgie abdominale (une fois chaque rat, durée : 45 minutes en moyenne)
Impact sur les animaux
- stress lié à la contention et à l’induction de l’anesthésie (fixe ou volatil) - délabrement des tissus par les stagiaires et de douleur chez l’animal anesthésié (risque faible car couverture analgésique) - saignements et hémorragie interne, risque d’hypovolémie - hypothermie -détresse respiratoire en cas d’anesthésie trop profonde - sécheresse cornéenne
Devenir
la procédure étant sans réveil , tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.
Remplacement
Les principes de remplacement ont été appliqués dans les TD et TP réalisés sur des tissus non vivants. Les TD sur les sutures se feront sur des supports en silicone qui simulent la peau. Les TD et TP sur la préparation de l’animal et l’asepsie se feront avec des peluches et des champs opératoires pour simuler le poste opératoire. Un TD sur un modèle de rat en silicone PVC-rat permettra l’apprentissage des ligatures, de l’hémostase et de la technique globale du prélèvement d’organe. Un TP sera réalisé sur cadavres de rats pour l’apprentissage des techniques sur tissus animaux, ainsi que pour mettre en pratique la partie exploration interne, anatomie, manipulation des organes et tissus animaux avec instruments de chirurgie. Pour assurer une formation complète, nous avons tout de même choisi de ne pas remplacer l’animal vivant lors du dernier TP, mais de ne pas procéder à leur réveil après l’intervention.
Réduction
Le principe de réduction est appliqué en réduisant considérablement le nombre d’animaux à 1 par stagiaire. Les formations chirurgie seront réalisées avec un faible nombre de participants, limitant à 4 le nombre de stagiaire. Une démonstration sera faite par l’encadrant avant la séance, ce qui ramène à 5 le nombre d’animaux utilisés par session. Nous ne dépasserons pas le nombre de 2 sessions par an, soit un total de 50 rattes femelles utilisées tous les 5 ans. Dans un objectif de réduction, nous utiliserons tant que possible des femelles rats de réforme ou surnuméraires.
Raffinement
Nous proposons dans notre DAP plusieurs raffinements. - Organisation du déroulement : la démonstration de l’encadrant est réalisée sans présence d’autres animaux vivants dans la salle d’expérimentation, afin d’éviter le stress lié aux odeurs et aux vocalisations. - Habituation et réduction du stress : chaque animal bénéficiera d’un temps minimal de 10 minutes avec le stagiaire avant l’induction, afin de limiter le stress lié à la manipulation et à la contention. - Rythme adapté : la planification des gestes est réalisée pour limiter le temps d’attente et éviter le mélange des animaux non encore anesthésiés. - Examen clinique préalable : chaque ratte est examinée et pesée afin de s’assurer de son bon état général et d’exclure tout individu présentant un signe de fragilité (poil ébouriffé, prostration, pli cutané persistant). - Analgésie préventive : administration de buprénorphine (0,05 mg/kg SC) au moment de l’induction, pour assurer un effet analgésique avant toute incision. - Prévention des effets secondaires de l’anesthésie : surveillance attentive des signes de dépression respiratoire, hypoxie ou bradycardie ; ajustement des concentrations d’isoflurane ou administration complémentaire de kétamine si nécessaire. - Prévention de la déshydratation et de l’hypovolémie : injections sous-cutanées de NaCl 0,9 % adaptées au poids de l’animal, en particulier en cas de saignement. - Prévention de l’hypothermie : utilisation de plateaux chauffants adaptés et limitation de la durée d’exposition de la cavité abdominale. - Protection oculaire : application de gel ophtalmique pour éviter le dessèchement cornéen. - Asepsie rigoureuse : tonte large, aspiration des poils, triple désinfection (bétadine/alcool), matériel, instruments et fils de suture stériles. - Réduction des traumatismes : apprentissage des gestes doux de dissection, ligature et manipulation des organes, avec correction immédiate par l’encadrant. - Pas de réveil des animaux : tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure par injection IV de Euthasol Vet, conformément aux bonnes pratiques, évitant toute douleur post-opératoire. - Vérification de la mort : contrôle systématique de l’arrêt cardiaque et respiratoire avant toute manipulation ultérieure.
Choix des espèces
La formation « Initiation à la chirurgie expérimentale », conformément à la réglementation UAFS, est conçue pour être applicable à l’ensemble des espèces. Le rat a été retenu comme modèle privilégié car il s’agit d’une espèce de laboratoire couramment utilisée, suffisamment grande pour observer facilement les structures anatomiques, disponible à La Réunion, et pour laquelle l’établissement dispose déjà d’infrastructures adaptées (appareil d’anesthésie, plateaux chauffants, instrumentation chirurgicale, autoclave, chambre de réveil, etc.). Les animaux devront être des femelles adultes pour avoir un système reproductif mature, c’est-à-dire plus de 6 semaines d’âge. Nous allons réaliser des ovariectomies, il faut que les stagiaires puissent les visualiser facilement pendant la laparotomie (ouverture de la cavité abdominale).
Evaluation de dispositifs médicaux basés sur l’échographie chez des modèles porcins de maladies du foie.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
Tous mis à mort en fin de protocole, 31 porcs vont être utilisés pour tester des sondes échographiques sur des maladies du foie. Six sont opérés sans réveil, les 25 autres relèvent d'une souffrance modérée. Une maladie hépatique de type cirrhose leur est provoquée par chirurgie, puis suivie toutes les deux semaines par biopsies, prises de sang et échographies sous anesthésie, avant une intervention finale. Le RNT justifie la mise à mort en indiquant que garder vivants ces animaux rendus malades ne ferait qu'augmenter leur souffrance.
Objectifs
Ce projet présente plusieurs objectifs. L’objectif principal est de tester de nouvelles sondes échographiques pour améliorer le diagnostic et/ou traitement des patients souffrant de pathologies du foie. Actuellement, la détection des pathologies du foie (fibroses, cirrhose) se fait tardivement, notamment par une survenue tardive des symptômes cliniques qui conduisent les patients à passer une IRM, avec souvent des temps d’attente long, pour obtenir un diagnostic. L’échographie est un moyen accessible et rapide à mettre en œuvre et pourrait constituer une alternative intéressante au diagnostic des pathologies du foie, qui représentent un enjeu de santé majeur. En effet, les maladies chroniques du foie touchent des centaines de millions de personnes. Parmi elles, la fibrose hépatique, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire (CHC) constituent des stades successifs d’un même continuum pathologique, objet de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’explorer les mécanismes biologiques précoces de la fibrose et de l’évolution vers la cirrhose et ses complications, en identifiant les signaux échographiques exploitables pour un diagnostic en amont. Il offrira également une base robuste pour évaluer la sensibilité, la spécificité et la fiabilité de nouvelles technologies de détection échographique, afin d’améliorer le diagnostic des patients atteints de pathologies hépatiques, et d’adapter leur prise en charge le plus tôt possible. En effet, la détection tardive des maladies du foie constitue un obstacle majeur à une prise en charge efficace. Il représente ainsi une avancée concrète à la fois pour la recherche, le diagnostic médical et la santé publique.
Procédures
Un lot d’animaux aura une première chirurgie qui permettra d’induire une maladie du foie sous anesthésie générale. Dans le cas où le développement de cette maladie se ferait correctement, les animaux auront toutes les deux semaines, sous anesthésie générale, un contrôle (biopsies, prise de sang, échographie) permettant de vérifier l’évolution de la maladie et de tester des dispositifs médicaux. Enfin après 8 semaines, les animaux auront une chirurgie finale permettant de tester un autre dispositif dans les conditions cliniques similaires chez l’humain. Un second lot d’animaux aura une chirurgie finale sous anesthésie générale permettant de tester un dispositif de guidage lors d’une résection du foie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les animaux sans réveil sont liés à l’induction de l’anesthésie : stress à la contention, injection intramusculaire (douleur transitoire au niveau du site d’injection). Les effets indésirables pour le modèle chronique peuvent être en plus de l’induction à l’anesthésie : le réveil qui peut s’accompagner de nausées, désorientation, hypothermie, irritation trachéale. Les effets indésirables liés au développement du modèle peuvent être : une inflammation locale, une diminution transitoire de l’appétit et de l’activité, ainsi qu’un inconfort abdominal (ascite), fièvre, diarrhée, jaunisse.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour des analyses macroscopiques des organes ou encore des analyses histologiques. De plus, le modèle ayant pour but de rendre les animaux malades, cela ne serait qu’augmenter leur souffrance inutilement de les maintenir en vie.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle alternatif permettant de reproduire les différents stades de pathologies du foie autre que le modèle animal vivant. De plus, l’objectif du projet est de pouvoir tester des dispositifs médicaux permettant de détecter de façon précoce les signes de survenue des différents stades et d’éventuellement les traiter. Le modèle doit donc évoluer de façon à reproduire les pathologies humaines. Seul le modèle animal offre actuellement cette possibilité.
Réduction
Des tests préliminaires seront réalisés sur des cadavres de porc, ainsi que des organes explantés, afin de tester l’ergonomie des sondes et identifier les emplacements adéquats au préalable des tests sur modèles vivants. Les animaux ne répondant pas favorablement au traitement d’induction de la pathologie seront réaffectés à une autre partie du projet, réduisant ainsi le nombre total d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux donné est un nombre maximal. Dans le cas où la quantité de données est récoltée plus tôt, les animaux ne seront pas tous utilisés. Lorsque cela sera possible, des animaux issus d’autres projets pourront être réutilisés pour celui-ci après une récupération complète validée par la vétérinaire.
Raffinement
Toutes les procédures sont effectuées sous anesthésie générale avec couverture antalgique. Pour le modèle de cirrhose, les animaux seront surveillés très rigoureusement en animalerie afin de ne pas dépasser les points limites déterminés en amont. Les animaux sont surveillés quotidiennement, une grille d’évaluation de l’état de santé de l’animal est établie avec la conduite à tenir. Une vidéosurveillance 24h/24 permet un suivi des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance. Les porcs sont maintenus en groupe social dans un environnement contrôlé en température et hygrométrie. Ils reçoivent des jouets et dispositifs favorisant leurs comportements naturels comme le fouissage et mâchouillement. Un temps d’acclimatation avec douche tiède, promenade et distribution de récompenses permet l’habituation des animaux à l’homme et aux manipulations. La Structure en charge du bien-être animal accompagne la mise en œuvre des procédures. Avec le vétérinaire désigné, elle conseille les responsables du projet dans l’amélioration de leurs pratiques en faveur du bien-être des animaux et de l’application des 3R. Le protocole pourra être raffiner en fonction des résultats obtenus sur les premiers animaux. Les doses d’agents irritants, pourront par exemple être diminuée dans le cas où le traitement serait trop agressif pour les animaux.
Choix des espèces
Le porc charcutier représente un modèle animal très intéressant pour la mise en place de ce type de modèle car : - Sa taille et son anatomie montre de nombreuses similitudes à celle de l’Homme, ce qui rend les procédures compatibles avec les dispositifs médicaux existant. La vascularisation hépatique et portale est très comparable à celles de l’humain. Un porc charcutier de 3 à 4 mois, qui pèse entre 30 et 50 Kg, nous permet d’avoir un modèle hépatique et vasculaire pertinent pour réaliser différentes interventions dans les mêmes conditions que chez le patient (taille des instruments, volumes des organes, voies d’abord, ergonomie, orientation…) Pour des raisons de poids et de manutentions à la fin de la procédure, les animaux engagés dans la procédure 1 seront de l’ordre de 30 kg à J0. La croissance de jeune porcs charcutiers étant continue et rapide, des animaux trop lourds à J0 ne seraient plus transportable à la fin de la procédure.
Dynamique des activités neuronales dans le cortex cérébral et les noyaux à sérotonine au cours d’un arrêt de l’oxygénation cérébrale et lors d’une réanimation chez le rat-MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Électrodes implantées dans le cerveau sous anesthésie de deux heures, puis maintien sous anesthésie pendant dix-huit heures d'enregistrements pendant l'arrêt de l'oxygénation du cerveau: 448 rats subissent des variantes de ce protocole d'anoxie et de réanimation. Le RNT en classe 98 en souffrance sévère, 50 en modérée et 300 sans réveil. Le projet cherche des marqueurs de la mort cellulaire et un corrélat neuronal des expériences de mort imminente, rapprochées des effets de drogues psychédéliques. Tous seront tués à l'issue pour l'étude histologique de leur cerveau.
Objectifs
Un arrêt de l’apport en oxygène au cerveau total et prolongé, consécutif à un arrêt cardiaque et/ou respiratoire, est souvent responsable de graves lésions neurologiques et demeure l’une des principales causes de décès. Les processus neuronaux à l’origine des lésions et ceux accompagnant la récupération des fonctions cérébrales lors d’une réanimation réussie restent aujourd’hui mal connus. L'élucidation de ces processus représente un enjeu majeur en neurosciences puisqu’elle pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients. Les récentes recherches sur des modèles animaux reproduisant les conditions d’une privation en oxygène au cerveau ont cependant permis des avancées dans notre compréhension des changements électriques du cortex cérébral qui surviennent successivement dans l'électroencéphalogramme (EEG) lors d’une privation d’oxygène : une première bouffée d'activités rapides, suivie d’un ralentissement et une atténuation des activités qui finissent par s’annuler et être remplacées par un EEG plat. Survient alors une onde de grande amplitude, qui marque l’arrêt d’activité des neurones du cortex et le début des processus de mort cellulaire. Si le cerveau est rapidement réoxygéné, les neurones récupèrent leur activité. Cette restauration des activités du cortex se traduit par la survenue d’une deuxième onde EEG appelée « onde de réanimation ». Les activités rapides au début de l’arrêt de l’apport en oxygène que l’on retrouve chez les patients ressemblent à celles observées au cours de l’éveil alors que les patients sont visiblement inconscients. Il a donc été suggéré qu’elles pourraient constituer un corrélat neuronal pour les expériences de mort imminente (EMI), qui sont souvent associées à de vives perceptions sensorielles et un sentiment de bien-être profond. Il a par ailleurs été montré de fortes similitudes entre les EMI et les effets hallucinatoires des drogues psychédéliques agissant sur un des grands systèmes de neuromodulation, le système à sérotonine. L’ensemble de ces observations nous a conduit à émettre l’hypothèse d’une participation du système à sérotonine aux EMI et aux changements séquentiels d’activité dans le cortex. MODIFICATION : Le protocole a été ajusté pour intégrer la stimulation et l'enregistrement des systèmes de communication chimique (neuromodulation). L'objectif est de mesurer leur influence sur l'activité cérébrale durant le cycle complet de l'anoxie-réoxygénation (avant, pendant et après l'arrêt de l'oxygène).
Bénéfices attendus
L'anoxie cérébrale globale consécutive à un arrêt cardio-respiratoire ou à un accident vasculaire cérébral, est une cause majeure de décès et 57 pourcent des patients conservent des déficits neurologiques permanents de degrés divers, principalement causés par des lésions ischémiques/anoxiques corticales. Ce projet permettra tout d’abord de mieux comprendre les mécanismes cérébraux conduisant à la mort cellulaire lors d’une anoxie cérébrale et ceux qui sous-tendent la récupération des activités et fonctions cérébrales lors d’une réanimation. Nous espérons trouver des nouveaux marqueurs électriques permettant de prédire la capacité du cerveau à récupérer après une anoxie. Dans ce contexte, nos travaux de recherche fondamentale devraient ainsi permettre à plus long terme une meilleure prise en charge des patients qui arrivent à l’hôpital après un arrêt cardiaque. Notre étude nous permettra également de faire progresser nos connaissances sur les mécanismes neuronaux à l’origine des sensations et perceptions qui accompagnent les expériences de mort imminente. Nous déterminerons plus particulièrement le rôle d’un des grands systèmes de neuromodulation cérébrale dans ces phénomènes qui demeurent pour le moment mystérieux.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale (une fois par animal, durée environ 2h), avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptées, permettant la mise en place d’électrodes d’enregistrement au niveau de différentes régions cérébrales et la mise sous respiration artificielle. Les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant (MODIFICATION : 18h supplémentaires maximum), pendant lesquelles des enregistrements intracérébraux seront réalisés puis ils seront euthanasiés par une méthode règlementaire. Une autre partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptées (une fois par animal, durée environ 1h30) durant laquelle une injection intracérébrale de traceurs sera réalisée pour colorer certains neurones. Les animaux seront gardés en vie une semaine puis seront euthanasiés selon une méthode règlementaire. MODIFICATION : Enfin, la dernière partie des animaux sera soumise à une première procédure chirurgicale avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptées (une fois par animal, durée environ 2h) durant laquelle une à deux injections intracérébrales seront réalisées, et des dispositifs d’enregistrements ou de stimulation de l’activité cérébrale seront mis en place. Trois à quatre semaines après, une seconde procédure chirurgicale sera réalisée (une fois par animal, durée environ 2h), avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptées, permettant la mise en place d’électrodes d’enregistrement au niveau de différentes régions cérébrales, et la mise sous respiration artificielle. Les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant 18h supplémentaires maximum, pendant lesquelles des enregistrements intracérébraux seront réalisés en parallèle des stimulations et enregistrements via les dispositifs préimplantés, puis ils seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les interventions chirurgicales peuvent entraîner certains effets indésirables : un stress lié aux manipulations avant l'opération, de la douleur suite à l'acte chirurgical, ainsi qu'un risque rare de complications (saignements ou infections). L'anesthésie peut également impacter les fonctions vitales de l'animal, provoquant une baisse de la température corporelle (hypothermie), un ralentissement du cœur et de la respiration, ou encore une sécheresse oculaire. MODIFICATION : L’implant sur la tête des animaux pourra générer un inconfort et présentera un risque de perte et, ou, d’infection. une partie des animaux seront hébergés seuls pendant 4 semaines maximum, s’agissant d’animaux sociaux cela impliquera un stress.)
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales afin de réaliser des études histologiques sur leur cerveau.
Remplacement
Nous prévoyons de tester une partie de nos hypothèses en réalisant sur ordinateur un modèle biophysique des neurones enregistrés ce qui permet de remplacer en partie les expériences chez l’animal. Cependant, ce projet de recherche fondamental, qui vise à comprendre les évènements électriques cérébraux survenant pendant l’arrêt de l’oxygénation cérébrale mais aussi lors de sa restauration, requiert de réaliser des enregistrements électrophysiologiques à différentes échelles (extracellulaires et intracellulaires) chez le rat pour être mené à son terme. En effet, ce type de préparation in vivo est la seule permettant de maintenir intacte les propriétés des neurones individuels et des réseaux neuronaux, condition absolument nécessaire à la survenue spontanée des évènements électriques cérébraux produits lors d’un arrêt transitoire de l’apport en oxygène au cerveau.
Réduction
Une stratégie expérimentale méthodique a été mise en place pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous combinerons également différents protocoles d’enregistrements cellulaires (différents tests sur l’activité et les propriétés des neurones à l’échelle unitaire, enregistrements de longue durée et si possible de plusieurs neurones/animal) au sein d’une même expérience, ce qui nous permettra de n’utiliser que les animaux nécessaires à l’obtention de résultats fiables et reproductibles. Enfin, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance (448 animaux au total) et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’une à deux semaines à la zone d’hébergement est respectée après la livraison des animaux. Avant chaque expérience, une phase d’acclimatation de 30 à 40 minutes est observée, durant laquelle les animaux, placés seuls dans leur cage dans la salle d’expérimentation, ne sont pas manipulés afin de limiter le stress. Les animaux bénéficient d’un accès à la nourriture et à l’eau à volonté, ainsi que d’un environnement enrichi. Lors des enregistrements de l’activité cérébrale des animaux anesthésiés, une attention particulière est portée à la réduction de l’inconfort, de la douleur et du stress grâce à une surveillance continue des paramètres physiologiques (activité cérébrale, fréquence cardiaque, température, pression artérielle, saturation en oxygène). Des protocoles d’intervention adaptés, incluant l’utilisation appropriée d’anesthésiques généraux ou locaux et de myorelaxants, sont appliqués. MODIFICATION : Pour les injections intracérébrales et les implantations de dispositifs d’enregistrement ou stimulation chez des animaux anesthésiés, un protocole d’intervention sera mis en place pour chaque indicateur de souffrance (modification de comportement, signes identifiables de douleur ou d’inconfort, perte de poids, difficultés d’alimentation). La chirurgie sera réalisée avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée. La profondeur de narcose sera contrôlée tout au long de la chirurgie. La température de l’animal sera maintenue à partir de l’induction de l’anesthésie et jusqu’à son réveil complet (tapis chauffant puis chambre réveil chauffée à 37 degrés Celsius). Du gel oculaire sera appliqué pour prévenir toute sécheresse oculaire et du sérum physiologique sera injecté par voie sous-cutanée pour éviter toute déshydratation. Les zones d’incisions et de chirurgie seront préalablement aseptisées. Après la chirurgie, l’animal sera surveillé jusqu’à son réveil puis il sera transféré dans sa cage. Un suivi quotidien sera assuré en post-chirurgie pendant 3 jours minimum puis 2 fois par semaine jusqu’à la fin de procédure. Si la procédure nécessite un hébergement individuel, l’enrichissement sera complété et cet hébergement limité à 4 semaines. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Les expériences seront réalisées chez des rats. Le rat constitue une espèce de choix pour les enregistrements intracellulaires in vivo en raison de leur taille et d’une très bonne cartographie anatomique de leur cerveau permettant un positionnement précis des électrodes d’enregistrement dans les différentes structures cérébrales. Nous utiliserons des rats adultes (âgés de deux à trois mois). Ces critères nous permettent d’effectuer nos expériences sur des rats ayant terminé leur développement cérébral. Les rats adultes fournissent une représentation plus fiable des conditions cérébrales observées chez les adultes humains. Etant donné que la plupart des cas d‘anoxie cérébrale (par arrêt cardiaque) touchent des adultes, étudier les dynamiques cérébrales survenant lors de l’arrêt et la reprise de l’oxygénation cérébrale sur des rats adultes permettra de mieux comprendre ses mécanismes et ses conséquences au sein de cette population.
Role du GLP-1 dans l’homéostasie des cellules souches intestinales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris perdant plus de 20 % de leur poids en une semaine sont retirées et tuées. 800 souris vont être utilisées, dont 120 opérées sans réveil, l'ensemble classé entre souffrance modérée et sans réveil. Les chirurgies provoquent une ischémie de l'intestin, suivie ou non d'une reperfusion, avec injections et prélèvements de sang. Le projet étudie le rôle d'une hormone, le GLP-1, dans l'atteinte de la barrière intestinale, avec un brevet déjà déposé sur son usage possible comme biomarqueur.
Objectifs
L'intestin, au-delà de sa fonction d'absorption des nutriments, constitue une formidable barrière entre le milieu externe et le milieu interne. Une perturbation de cette fonction barrière, caractérisée par une altération de la perméabilité intestinale , est associée à des pathologies inflammatoires chroniques et aiguës telles que l'ischémie mésentérique aiguë (IMA). L'infarctus de l'intestin est une urgence médicale qui ne peut être diagnostiquée précocement. Il s'agit de l'évolution de l'IMA, provoquée par un apport sanguin insuffisant à l'intestin, entraînant la mort intestinale. Son taux de mortalité est de 60 à 90 % en raison de la gravité de la maladie et de l'échec d'un diagnostic rapide. Au cours des dernières années, d’importants efforts cliniques et précliniques ont été déployés pour trouver des biomarqueurs capables de prédire les dommages gastro-intestinaux avant qu’ils ne deviennent irréversibles et ne se propagent au reste du corps. Un diagnostic plus précoce de l'ischémie intestinale permettrait des interventions plus précoces, pouvant aboutir à : 1) éviter une intervention chirurgicale ; 2) moins de morbidité postopératoire et une survie améliorée si la chirurgie était indiquée. Cela aurait également un impact direct sur l'utilisation des ressources de santé postopératoires, tant au niveau des soins aux patients que de la prestation des services de santé. Identifier un biomarqueur spécifique de l’IMA, utilisable en cas d'urgence clinique, constituerait une avancée majeure. Nous avons récemment identifié un nouveau biomarqueur sérique pour l'IMA : le Glucagon-like peptide 1 (GLP-1). Bien que les peptides de type glucagon soient largement utilisés en clinique, ils ne sont toujours pas utilisés comme biomarqueurs en biologie clinique. Les objectifs du projet actuel sont de comprendre le rôle du GLP-1 dans la perturbation de la barrière intestinale au cours de l'IMA.
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. Le GLP-1 endogène sécrété lors d’une perturbation de la fonction barrière intestinale a-t-il un rôle dans cette fonction barrière notamment sur les cellules souches intestinales. ? Si oui, est il bénéfique ou non. ? 2. La sécrétion de ce GLP-1 vient il protéger les organes à distance de par ses propriétés anti-inflammatoires ? 3. Les agonistes GLP-1, actuellement utilisés en clinique humaine, pourraient ils être utilisés ou non lors de perturbation de la fonction barrière ? Ce travail présenté ici est la partie préclinique d’un projet de plus grande envergure pour lequel un brevet a été déposé et qui consiste à déterminer si ce GLP-1 pourrait être un biomarqueur de l’ischémie mésentérique. Comprendre pourquoi ce GLP-1 est sécrété de façon précoce lors de l’ischémie reperfusion et son rôle potentiel dans cette pathologie permettrait éventuellement, de pouvoir traiter de façon précoce les patients afin de réduire les conséquences drastiques sur l’intestin, conduisant le plus souvent à la mort de l’individu.
Procédures
L’ensemble des procédures décrites dans ce projet repose principalement sur des procédures chirurgicales dont l’objectif est d’induire une perturbation de l'homéosatsie des cellules souches intestinales en réalisant des ischémies mésentériques suivies ou non d’une reperfusion. La durée minimale de la chirurgie est de 30 minutes lors d’une ischémie et 20 minutes si elle est suivie d’une reperfusion. Certaines procédures vont nécessiter des injections intra-péritonéales (IP), ou des prélèvements de microgoutte de sang pour mesurer la glycémie. Ces manipulations se font soit sous anesthésie locale (prélèvement sanguin) soit sur animaux vigiles (injections IP) et ne prennent que quelques secondes quand réalisées par un opérateur maitrisant les gestes techniques ce qui sera le cas.
Impact sur les animaux
Les expérimentations d’ischémie et ou ischémie/reperfusion de ce projet se feront sur des animaux anesthésiés et il n’y aura aucun réveil de l’animal. Les seules manipulations sur animaux non anesthésiés seront les injections intrapéritonéales des molécules pharmacologiques ou les prélèvements de microgouttes de sang par la queue. Nous serons plus particulièrement attentifs lors des traitements chroniques de 2 semaines car il est parfaitement écrit dans la littérature que les molécules pharmacologiques utilisées réduisent la prise alimentaire. Ainsi un suivi de la masse corporelle toutes les 48h sera réalisé. Si aucun effet négatif ne sont décrits dans la littérature concernant les effets de ces molécules pharmacologiques nous seront également vigilants à tous signes susceptibles de traduire un inconfort voir une souffrance des animaux.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.
Remplacement
Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu une sécrétion hormonale (GLP-1) dont les effets peuvent avoir lieu localement au niveau de l’intestin lui-même mais également au niveau d’autres organes distants. Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : - Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests statistiques adéquats. En fonction de la distribution normale ou non des données, nous utiliserons des tests paramétriques ou non paramétriques sachant qu’il y a des variations individuelles des animaux, que ce soit dans les phases d’ischémie, de reperfusion ou bien lors de la mise en culture des cellules souches intestinales. L’utilisation de la dislocation cervicale réduit également considérablement la variabilité individuelle de tous les paramètres mesurés (Sanguins : cytokines, Perméabilité ; prélevement et Extraction de cellules souches intestinales...) engendrée par les difficultés de prélèvement chez les animaux ayant eu une ischémie.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec un enrichissement de leur milieu adapté comme des maisons leurs permettant de se cacher. Lors des traitements chroniques (2 semaines), ils bénéficieront d’un suivi de leur état général avec mesure de la masse corporelle toutes les 48h. Toutes les procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entraîner une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale (isoflurane 50mg/kg). En cas de perte de poids des animaux supérieure à 20% en 7 jours, ou tout autre signe suggérant une souffrance de l’animal (posture, absence de toilettage, craintif, etc) l’animal concerné sera retiré du projet (euthanasie par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane). Aucun animal ayant subi une ischémie avec ou sans reperfusion ne sera réveillé et seront tous euthanasiés encore endormis. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau intestinal. Elle exprime les mêmes protéines. En particulier le GLP-1 suit le même comportement chez l’Homme et la Souris. De plus nous avons vérifié que ce GLP-1 était également sécrété lors des ischémies expérimentales réalisées chez l’Homme. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous serons probablement amenés à travailler sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifique du gène codant pour le glucagon, Elles sont issues du fond génétique C57BL6/J. Ces souris n’ont pas un phénotype dommageable, elles se portent et se comportent bien et ont un état de santé général identique à des souris C57BL6/J non génétiquement modifiées. Il est également probable que nous utiliserons une lignée de souris OGM exprimant le marqueur des cellules souches intestnales (LGR5) couplé à une GFP. Cela permet de récuper spécifiquement les cellules souches (après un passage au Facs).