Procédures sans réveil
Altération des oligodendrocytes dans la sclérose latérale amyotrophique dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
578 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, vingt d'entre elles étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Les animaux portent une mutation qui provoque une perte de poids vers quatre-vingt-dix jours, puis une paralysie vers cent vingt jours et la mort vers cent trente jours, avec des difficultés à se déplacer, à boire et à manger. Ils reçoivent une injection dans les ventricules cérébraux, des injections intrapéritonéales quotidiennes, des prises de sang tous les quatorze jours et des tests de force musculaire et de coordination jusqu'au point limite, pour évaluer une thérapie visant les oligodendrocytes. Le porteur écrit que le modèle animal est "indispensable", précise que 416 des 578 souris ne seront utilisées que si la première partie du projet échoue, et garde en vie les souris d'élevage pour les réutiliser dans d'autres projets tant qu'elles n'ont pas atteint les points limites.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurologique fatale qui apparait à l’âge adulte. Elle est caractérisée par la perte progressive des motoneurones, menant à une paralysie puis au décès 3 à 5 ans après le diagnostic. Jusqu’à présent, il n’existe pas de traitement curatif, d’où la nécessité de développer une thérapie efficace. L’altération des oligodendrocytes est l’un des mécanismes pathologiques proposés dans la sclérose en plaque. On observe chez les patients souffrants de cette maladie une diminution du nombre d’oligodendrocytes myélinisantes adultes. Par ailleurs différentes études chez l'animal vivant ont montré que les précurseurs des oligodendrocytes (OPC) ne parviennent pas à subir l'étape finale de différenciation dans les modèles animaux. Notre projet vise à développer une thérapie ciblée vis-à-vis des oligodendrocytes, qui a pour but de stimuler la différentiation des oligodendrocytes et par conséquent, rétablir le nombre des oligodendrocytes matures myélinisantes. Cette étude nécessite l’emploi de souris qui présentent un phénotype proche de la sclérose en plaque (perte de poids, faiblesse musculaire, paralysie). Les animaux déclarent les premiers symptômes à 90 jours, puis leur état général se dégrade jusqu’à la mort, à environ 130 jours. Ce projet a deux approches : une approche cellulaire et une approche génique virale visant à stimuler la différentiation des oligodendrocytes chez l'animal vivant.. L’objectif est de tester une possible thérapie qui pourra être utilisée chez les patients atteints de sclérose en plaque liées aux mutations SOD dans le futur.
Bénéfices attendus
Nous émettons l’hypothèse que l’augmentation du taux d’oligodendrocytes matures et myélinisantes puisse représenter un outil thérapeutique utile pour traiter la sclérose en plaque. A court terme nous envisageons les bénéfices sur les souris traitées avec la thérapie cellulaire et la thérapie génique virale. Nous attendons des effets bénéfiques sur les symptômes de la sclérose en plaque ainsi que sur la survie. S’agissant de bénéfices à long terme, nous envisageons la mise en place d'études pré-cliniques et cliniques pour étudier les effets bénéfiques de l'administration de la thérapie cellulaire et la thérapie génique chez des sujets atteints de sclérose latérale amyotrophique.
Procédures
Les souris élevées pour ce projet sont susceptibles de développer un phénotype dommageable caractérisé par une perte de poids vers 90 jours puis une atteinte musculaire conduisant à la paralysie (vers 120 jours) puis la mort de l'animal. Les souris immunodéficientes sont plus sensibles aux infections car elles ne possèdent pas de systèmes immunitaires. Un prélèvement de queue sera réalisé sur ses souris vigiles afin de vérifier si elles sont ou non porteuses du gène qui nous intéresse. Une anesthésie locale sera réalisée par immersion de la queue de l'animal dans de l'éthanol refroidi. Ce geste ne nécessite que quelques secondes. 5 différentes interventions auront lieu au cours des différentes procédures dont 1 sur souris anesthésiée et 4 sur souris vigiles ; une unique injection intracérébroventriculaire à J60, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 30 minutes, une unique injection intracérébroventriculaire chez le nouveau-né, sous anesthésie locale, d’une durée de 2 minutes, des injections intrapéritonéales quotidiennes sur souris vigiles, d’une durée de moins d’une minute, des prélèvements de sang au niveau de la veine sous-mandibulaire sur souris vigiles, tous les 14 jours de J60 jusqu’au point limite (1 minute suffit pour réaliser ce geste) et, sur souris vigiles, tests comportementaux (pesée, test de force musculaire, score neurologique et test de coordination motrice) une fois tous les 14 jours de J60 (dans le cas de l’injection chez l’adulte) ou de J21 (dans le cas de l’injection chez les nouveaux-nés) jusqu’au point limite. Le temps total pour réaliser ces tests comportementaux n’excède pas 20 minutes par souris ; le score neurologique, qui permet de scorer les signes de déficience neurologique, et la pesée sont réalisés l’un après l’autre avec une durée totale d’environ 1min, suivi par le test de force musculaire, qui nécessite moins de 5 minutes pour les 3 mesures. Pour finir, le test de coordination motrice a une durée totale inférieure à 10 minutes avec 2 mesures (de 2minutes maximum) et avec 5 minutes de repos entre les 2. Concernant l'euthanasie, les animaux pour lesquels des prélèvements seront réalisés seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative des motoneurones de l'adulte qui se caractérise par une dégénérescence progressive des motoneurones. Elle provoque une paralysie progressive de l'ensemble des muscles. Les souris utilisées pour la survie présenteront donc des signes de dégénérescence comme la paralysie des pattes et/ou du bassin. Cela entraînera des difficultés pour se déplacer, s'hydrater et s'alimenter. Les animaux seront identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie de queue de quelques millimètres pouvant être source de stress et d’une douleur de courte durée. Les chirurgies impliquent une anesthésie pouvant entraîner une hypothermie ou un arrêt cardio-respiratoire et peuvent entraîner des douleurs post-opératoires. Un inconfort lié à la contention ainsi qu'une douleur de courte durée associée à l’introduction de l’aiguille lors des administrations ou les prélèvements sanguins sont à prévoir. Les tests fonctionnels réalisés chez la souris peuvent également entraîner un stress chez l’animal.
Devenir
Tout au long de ce projet les souris seront euthanasiées et leurs cerveaux et moelles épinières seront récupérés pour faire des analyses biomoléculaires et histologiques afin de valider l'efficacité ou non de nos traitements, sauf les souris impliquées dans la creation des colonies, qui seront réutilisées pour d'autre projet tant qu'elles n'ont pas atteint les points limites.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle in vitro n’existe pour pouvoir mener une étude pré-clinique dans la sclérose latérale amyotrophique. Le modèle animal est indispensable pour optimiser et développer nos approches de thérapie cellulaire et thérapie génique pour cette maladie. Ce modèle, particulièrement bien caractérisé, nous permettra de quantifier l’efficacité de nos traitements. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
Afin de limiter leur utilisation, un nombre restreint d’animaux sera utilisé en contrôle non injecté, un même animal servira pour différentes expériences et, pour chacune d’entre elles, le nombre d’animaux utilisés a été choisi pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement interprétables. De plus nous utiliserons des mâles et des femelles, ce qui nous permet d’utiliser l’ensemble des animaux générés par nos accouplements limitant ainsi d’autant le nombre de portées nécessaires. Il est également important de signaler qu'une partie du projet ne sera réalisé que dans le cas où la première partie ne fonctionne pas et que 416 animaux ne seront potentiellement pas utilisé sur les 578 animaux prévus.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Ainsi des croquettes ou de la bouillie pourront être placés directement dans la cage, ainsi que de l’hydrogel en cas de besoin. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante ou sous lampe radiante. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Une anesthésie sera réalisée et un contrôle post opératoire aura lieu dans les heures ainsi que les jours qui suivent afin de fournir une analgésie adaptée aux animaux. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement, de la naissance à la mort, et un contrôle du poids sera réalisé une fois par semaine avant l'apparition des symptômes de la maladie, puis autant de fois que nécessaire après l'apparition des symptômes afin de contrôler précisément les points limites qui, une fois atteint, entraineront automatiquement l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance excessive.
Choix des espèces
Dans le cadre de notre projet, nous utiliserons modèle murin transgénique pour la sclérose latérale amyotrophique. Cette souche reproduit les principaux symptômes de la sclérose latérale amyotrophique à partir de 90 jours due à l’accumulation de la protéine SOD entrainant la paralysie progressive, et éventuellement la mort aux alentours de 130 jours. Nous utiliserons les nouveau-nés et les souris adultes âgées de 90 jours afin d’évaluer l’efficacité du traitement précoce et plus tardivement
Autophagie et stimulation immunitaire précoce : effets neuro-inflammatoires et comportementaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 60 d'entre elles étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Dans leurs deux premières semaines de vie, les souriceaux reçoivent des injections intramusculaires de composés pro-inflammatoires sous anesthésie, séparés de leur mère, puis passent des enregistrements de vocalisations ultrasoniques, de l'actimétrie et un test de nidification. À trois mois, chaque animal est isolé pendant trois semaines avant le test d'interaction sociale, pour stimuler ses comportements sociaux. Le porteur présente ces tests comme "non invasifs" tout en décrivant par ailleurs le stress lié à la séparation maternelle, à l'hébergement individuel et aux prélèvements sanguins.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions différentes particules auxquelles l’organisme est exposé dans les premières semaines de vie. La toxicité de ces composés bio-persistants et fortement pro-inflammatoires a été montrée dans différentes études, notamment en lien avec un effet sur le neurodéveloppement. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autres par différents tests de comportements, à différents âges, chez un modèle souris pour lequel i) un gène de l’autophagie a été invalidé ; ii) une exposition précoce aux particules est réalisée. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes cellulaires et la mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs : enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte de séparation maternelle (5 minutes), enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte d’interaction sociale (8 minutes à trois stades : jeune, adolescent, adulte), actimétrie à 2 et 3 mois (2 heures d’enregistrement), test de nidification (suivi sur 24 heures). Les souris sont isolées pendant 3 semaines en amont de la session de test d’interaction sociale à l’âge de 3 mois, afin de stimuler les comportements d’interactions. Les injections intra-musculaires de composés pro-inflammatoires (durée du geste d’environ 10 secondes) sont réalisées sous anesthésie (5 minutes d’anesthésie) et ne sont pas de nature à impacter de manière durable le bien-être des animaux. Ils sont ensuite soumis à une chirurgie sans réveil de quelques minutes réalisée sous anesthésie et analgésie, se finissant par l’euthanasie de l’animal. Deux prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés à deux âges différents, le second prélèvement sera suivi d’une euthanasie.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables de stress sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, l’anesthésie gazeuse, les prélèvements sanguins (douleur légère liée à la piqûre de la veine et risque possible d’hémorragie), la mise en place d’une période d'hébergement individuel pour les animaux, les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques avant la chirurgie sans réveil, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. Pour l’anesthésie une détresse respiratoire et l’hypothermie des animaux est possible.
Devenir
Le projet décrit est réalisé sur des souris. L’ensemble des 1380 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie combiné à une perturbation inflammatoire précoce, sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 1380 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et ou la réalisation de séries de coupes pour les cerveaux prélevés, ce qui nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Les paramètres environnementaux comprennent une humidité de 50 pour cent plus ou moins 20 pour cent, une température constante entre 20 et 24 degrés Celsius. L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification ainsi que d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue, à l’aide d’une grille de suivi. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés. Les injections intramusculaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Le stress induit par la séparation est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation. Les travaux antérieurs menés au laboratoire ou par d’autres équipes indiquent que l’injection intramusculaire des molécules pro-inflammatoires d’intérêt n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les portées seront particulièrement observées après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation impactant potentiellement l’élagage synaptique et la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (test à 9 jours de vie), jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie). Les injections seront réalisées pendant les deux premières semaines de vie de l’animal, de manière à modéliser une situation d’exposition réaliste chez l’enfant pendant sa 1ère année de vie.
Evaluation d’un dispositif endoscopique chez le porc pour l’amélioration des traitements des tumeurs pancréatiques
- Recherche appliquée
- Cancers
Six cochons de 40 kg subissent une anesthésie de quatre heures et une ouverture de l'abdomen pour poser une sonde à ultrasons focalisés directement sur le pancréas, puis pour trois d'entre eux une incision de l'estomac, sans jamais se réveiller. L'équipe qualifie les traitements ultrasonores d'indolores et signale qu'un produit injecté par voie intraveineuse peut déclencher une réaction allergique. Tous sont tués pour vérifier que les ultrasons ont bien atteint le pancréas et le foie. Le porteur annonce un objectif de dix traitements réussis pour chacune des deux étapes, puis écrit que l'expérience s'arrêtera dès quatre succès.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un enjeu majeur de santé publique. Il est la deuxième cause de décès liée aux cancers en France. La chirurgie curative, à un stade précoce, est actuellement le seul traitement qui permet une survie à long terme, à environ 20% à 5 ans. Cependant peu de patients sont éligibles (30%). Le pancréas est situé derrière la partie inférieure de l’estomac. Utiliser un endoscope jusqu’à l’estomac paraît intéressant pour l’approcher. L’échographie par voie endoscopique est déjà un des meilleurs outils à ce jour pour diagnostiquer ce cancer. Un endoscope sur lequel a été adaptée une sonde qui génère des ultrasons focalisés qui peuvent entraîner à distance la modification de l’organisation de l’environnement de la tumeur cancéreuse et le rendre moins dense a été développé. Ainsi, l’entrée des traitements (chimiothérapie, radiothérapie ou immunothérapie) à l’intérieur de la tumeur est facilitée. L’efficacité est alors augmentée et les doses peuvent être ajustées, diminuant les effets secondaires. Des essais in vitro montrent que cette hypothèse est vérifiée. Ce projet a pour objectif principal d’évaluer si le dispositif (endoscope + sonde de traitement) permet d’appliquer les ultrasons au niveau du pancréas du porc à travers la paroi de l’estomac. Ceci sera réalisé en 2 temps : dans un premier temps, il sera vérifié la possibilité de réaliser le traitement via une chirurgie abdominale en positionnant la sonde directement sur le pancréas, puis, si cela fonctionne, la voie endoscopique sera testée pour s’assurer de la possibilité de réaliser le même traitement à travers l’estomac. Le modèle porc utilisé ne permet pas le passage de la sonde par voie œsophagienne (comme cela sera le cas chez l’Homme), il sera donc nécessaire d’introduire la sonde directement dans l’estomac via une petite incision pratiquée au niveau de l’abdomen.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra par la suite que la stratégie ultrasons + traitement anti cancéreux soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de cancer du pancréas pour qui le taux de survie à 5 ans est très faible.
Procédures
Une anesthésie de quatre heures avec une injection dans le muscle de la cuisse aura lieu. Lors de cette anesthésie une chirurgie sera pratiquée : une ouverture de l’abdomen dans un premier temps pour mettre la sonde en contact avec le pancréas (sur 3 porcs maximum), puis une petite incision au niveau de l’estomac pour introduire la sonde (sur 3 autres porcs au maximum si la première phase a réussi). Un produit facilitant le traitement pourra être injecté par voie intra-veineuse, ce produit peut potentiellement déclencher une réaction allergique chez le porc. Ces interventions sont réalisées dans le cadre de procédures sans réveil.
Impact sur les animaux
Au moment de l’anesthésie, certains porcs sont stressés. Les traitements ultrasonores réalisés au niveau du pancréas et du foie sont indolores. Un produit facilitant le traitement pourra être injecté par voie intra-veineuse, ce produit peut potentiellement déclencher une réaction allergique chez le porc.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin d’examiner le pancréas pour vérifier que les ultrasons ont bien atteint le pancréas et le foie.
Remplacement
Plusieurs questions de l’étude globale sont répondues grâce à l’étude in vitro sur cellules : les effets des ultrasons sur l’élasticité de la tumeur, amélioration de la diffusion de drogue après traitement aux ultrasons. Les paramètres de traitement aux ultrasons sont évalués en amont par simulations informatiques. Il est important après toutes ces étapes de pouvoir s’assurer que le dispositif fonctionne en condition réelle, que le pancréas est bien repérable et visible et que les ultrasons seront bien appliqués dans le pancréas.
Réduction
Ce projet ne nécessite pas d’étude statistique. Nous avons pour objectif de réussir le traitement à 10 reprises pour chacune des 2 étapes (directement sur le pancréas puis à travers la paroi gastrique). Dès que nous aurons atteint 4 succès l’expérience s’arrêtera. L’essai de traitement sur le foie ici permet de répondre à une question scientifique supplémentaire sans augmenter l’impact sur les animaux ni leur nombre. Les organes non prélevés dans le cadre du projet seront proposés à la communauté scientifique.
Raffinement
Bien que le traitement soit apparemment non douloureux, une analgésie est appliquée en combiné avec l’anesthésie. L’anesthésie est réalisée via un prolongateur ce qui évite d’avoir à effectuer une contention de l’animal. Outre la mise à disposition d’objets à mâchouiller et d’un ballon, les techniciens animaliers disposent d’un temps de jeu, d’échange avec les porcs, leur mettent à disposition des friandises dans la litière pour qu’ils puissent exprimer leur comportement naturel de fouissage. Ils sont régulièrement sortis de leur box pour pouvoir courir dans un plus grand espace de l’animalerie. Lors de l’ouverture de l’abdomen, en plus de la combinaison d’anesthésique et analgésique administrée en intraveineux, un anesthésique local sera injecté.
Choix des espèces
L’endoscope humain peut être utilisé chez le porc et l’anatomie interne est suffisamment proche de celle de l’homme pour répondre à l’objectif du projet. Les porcs pèseront 40 kg, ce qui correspond à une taille presque adulte (nécessaire pour le passage de l’endoscope dans les voies digestives) mais avant une prise de graisse trop importante.
Etude du cervelet dans un modèle murin d’ataxie cérébelleuse pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Porteuses d'une mutation du gène de l'ataxine-1, les souris de ce projet développent une ataxie cérébelleuse et une croissance ralentie par rapport aux témoins. 300 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 24 étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Chaque animal subit une biopsie d'oreille pour génotypage, puis une anesthésie terminale permettant de prélever le cervelet, à cinq semaines avant l'apparition des symptômes ou à vingt semaines quand ils débutent. Le porteur annonce par ailleurs 400 souris sur cinq ans, cent de plus que l'effectif déclaré, sans expliquer l'écart.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies génétiques rares qui affectent un groupe spécifique de neurones dans une partie du cerveau appelée le cervelet. Elles entraînent des problèmes de mouvement tels que des difficultés à marcher, à coordonner les mouvements et à maintenir l’équilibre. L’une de ces maladies est l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1), qui se développe généralement à un âge avancé et est causée par une mutation génétique. Cette mutation empêche une protéine appelée ataxine-1 de fonctionner correctement. Malgré les progrès, les causes précises de cette maladie et pourquoi seulement certains types de cellules du cervelet sont affectés restent encore inconnus. L’objectif de cette étude est d’utiliser un modèle de souris génétiquement modifié pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires. Le modèle souris utilisé porte une mutation du gène de l’ataxine-1 comparable aux mutations retrouvées chez les patients et développe des symptomes récapitulant fidèlement les caractéristiques de la maladie chez l'homme. Les objectifs détaillés de cette étude sont : - d’identifier le profil d’expression des gènes de chaque type de cellules du cervelet chez des souris mutantes en comparaison des souris controles afin de détecter les changements d’expression de gène induit par la mutation dans un ou plusieurs types de cellules du cervelet - réaliser cette étude de profil d’expression des gènes à deux moments du développement de la maladie : avant et au moment de l’apparitition des symptomes. Ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’apparition de la maladie SCA1.
Bénéfices attendus
Ce modèle murin présente les caractéristiques typiques de la maladie humaine SCA1, c’est pourquoi nous pensons qu’il est le bon modèle pour rechercher et étudier les voies moléculaires qui sont dérégulées. Trois bénéfices principaux sont attendus : - Identifier les voies moléculaires responsable pour le développement et la progression de la maladie qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. - Identifier les régions du cervelet qui sont le plus touchés par cette mutation, ce qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. - Identifier des défauts moléculaires précoces qui pourront être des nouvelles cibles thérapeutiques à long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes (toutes sont incluses dans la classe modérée) : - biopsie au niveau de l’oreille pour genotypage, 1x par souris. Cette procédure dure 1 seconde. - injection des analgésiques et anesthésie avant l’intervention chirurgicale nécessaire à la préparation du cerveau avant prélèvement pour analyse histologique. Ces procédures durent 15 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours de la période couverte par le plan expérimental, les souris porteuses de la mutation du gène SCA1 présentent une croissance ralentie par rapport aux souris témoins. De plus, une douleur légère et transitoire est attendue au moment de la biopsie au niveau de l’oreille ainsi que lors des injections d’analgésique et d’anesthésique.
Devenir
Pour les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques, une mise à mort est nécessaire à la fin de la procédure, en respectant les points limites et la progression de la maladie.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de caractériser la dérégulation moléculaire dans chaque type de cellules du cervelet. Pour ce faire, nous devons utiliser des modèles animaux car il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. Afin d’évaluer les modifications de transcription des gènes nous devons collecter des tissus (cervelet) de souris mutantes et sauvages.
Réduction
Pour mener à bien ce projet, nous prévoyons d'utiliser 400 souris sur une période de 5 ans, ce nombre comprenant la maintenance de la lignée et les procédures expérimentales. Toutes les procédures sont organisées de manière à réduire le nombre de souris, tout en tenant compte du nombre minimum d’animaux nécessaires pour appliquer des tests statistiques afin d'évaluer la robustesse des résultats finaux.
Raffinement
Les souris seront manipulées par contention douce (dans le creux de la main ou dans un tube en carton servant d’enrichissement). Les animaux seront surveillés au moins deux fois par semaine et l'état de santé sera évalué par un personnel compétent. Des points limites précis et adaptés au modèle ont été définis. Les souris seront soumises à une anesthésie générale avant la mise à mort. De plus, pour la procédure chirurgicale nécessaires à la préparation du cerveau avant prélèvement pour analyse histologique, les souris recevront un traitement antalgique avant l'induction de l'anesthésie terminale.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d’utiliser les souris car elles présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Nous prévoyons d'analyser les animaux à deux âges différents : à 5 semaines quand les souris n’ont aucun problème moteur mais avec des dérégulations moléculaires déjà présentes, et à 20 semaines quand les symptomes débutent. La comparaison des souris témoins et des souris mutantes à ces deux moments du développement des symptomes nous fournira des indications intéressantes sur les dérégulations moléculaires dans cette maladie, ainsi que sur les mécanismes impliqués dans la progression de la maladie.
Formations réglementaires concepteur, applicateur et chirurgie expérimentale sur poissons
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Deux stagiaires par animal opéré, avec rotation des rôles de chirurgien, d'aide et d'intendant : 370 truites vont être utilisées dans des formations réglementaires, 60 d'entre elles opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 250 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 60 d'un niveau modéré. Chaque animal est anesthésié une heure et subit un prélèvement de sang, la formation à la chirurgie ajoutant deux heures d'intervention pour un marquage ou la pose d'un transpondeur dans l'abdomen. Le porteur signale le stress lié à la pêche, à la contention et à la ponction veineuse, et décrit ces formations comme les formations de base "indispensables" de tout expérimentateur travaillant sur les espèces aquacoles. Ce projet ne produit aucune connaissance nouvelle, les truites étant utilisées pour faire répéter des gestes techniques, et toutes sont tuées en fin de procédure.
Objectifs
Ces formations sont obligatoires pour toute nouvelle personne étant amené à travailler sur des animaux vivants d'expérimentation. En complément des formations déjà existantes sur espèces mammifères (rongeurs, lapins, carnivores, porcs, oiseaux, ruminants, équidés), une forte demande concerne les expérimentateurs travaillant sur des modèles d'espèces aquacoles comme les poissons et les amphibiens. Les formations concepteur et applicateur sont les formations de base indispensables pour chaque expérimentateur en fonction de son niveau de formation initiale. La formation à la chirurgie expérimentale ne concerne que les personnels étant amené à réaliser des actes chirurgicaux dans ce espèces, comme le marquage avec une marque intra-abdominale ou la pose de transpondeur intra-abdominale.
Bénéfices attendus
La formation des personnels permet l'acquisition de compténces scientifiques et techniques afin de bien raisonner la mise en œuvre d'un projet sur animaux vivants dans les espèces concernées.
Procédures
Une anesthésie de l'animal (durée de 1 heure) avec un prélèvement de sang d'une durée de 5 minutes. Les interventions chirurgicales sont réalisées chez des animaux sous anesthésie générale avec analgésie et durent 2 heures.
Impact sur les animaux
Stress lié à la pêche, la contention, l'induction anesthésique et la ponction veineuse à l'origine d'un léger inconfort pour l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure.
Remplacement
L’utilisation de méthodes alternatives précède la mise en œuvre des techniques chirurgicales sur animaux vivants, notamment pour la réalisation des sutures sur matériaux inertes.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est restreint et l’organisation en groupe de travail est favorisée pour mutualiser (2 stagiaires pour un animal manipulé ou opéré avec rotation des stagiaires dans leur rôle - chirurgien, aide opératoire, intendant).
Raffinement
Les animaux sont observés deux fois par jour durant toute la durée du protocole, avec un suivi plus rapproché les deux premiers jours suivant chaque journée de prélèvement, lorsque les animaux seront les plus stressés et les plus affaiblis par les procédures expérimentales. Les points limites sont : (1) d’une part les paramètres d’ambiance de l’élevage (oxygène, qualité de l’eau). Les paramètres de températures et d’oxygénation sont mesurés en permanence via des sondes. Si les point critiques sont atteints et ne peuvent être rectifiés, l’expérimentation sera arrêtée. La qualité de l’eau est vérifiée chaque semaine. (2) d’autre part la santé des poissons. Les poissons moribonds seront retirés de l’expérimentation et euthanasiés par surdosage d’anesthésique.
Choix des espèces
Les stagiaires concernés par l'expérimentation sur poissons travaillent principalement sur des poissons zèbres, des poissons de bassin, de rivière ou de pleine mer (esturgeon). La truite est une espèce animale de taille moyenne qui facilite les premières étapes de l’apprentissage et dont l’approvisionnement et l’hébergement ne sont pas trop contraignants. Les truites utilisées pèseront autour de 300 g. Ce poids a été retenu pour deux raisons. D’une part, le volume minimal pour conduire les éventuels prélèvements sanguins est de 0,2 mL, ce qui représente 0,07% du poids vif d’une truite de 300 g. D'autre part, pour permettre l'abord chirurgical par laparotomie, une taille minimale permet d'effectuer un apprentissage des gestes techniques plus aisément.
Exploration de l’efficacité d’un inhibiteur de nécrose régulée dans un modèle de lésions hépatiques (chirurgie et greffe du foie) chez le modèle porcin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Une transplantation du foie, ou une interruption puis une reprise de la circulation artérielle hépatique, est pratiquée sur 71 cochons de 30 à 35 kilos. Cinquante d'entre eux relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, seize sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, cinq relèvent d'un niveau modéré. Chacun subit des biopsies du foie au poinçon de quatre millimètres avant, pendant et après l'ischémie, puis des prélèvements de sang une heure avant l'opération et à trente minutes, une heure, trois heures et chaque jour après la greffe, en cage individuelle. L'ensemble teste une molécule candidate contre les lésions d'ischémie-reperfusion, les cochons donneurs de foie étant tués immédiatement après la chirurgie et les receveurs sept ou quatorze jours après leur réveil.
Objectifs
L’ischémie correspond à la diminution ou à l’arrêt de la circulation artérielle dans un tissu ou organe, tandis que la reperfusion correspond à la reprise de cette circulation. Les lésions d'ischémie/reperfusion (IRI) hépatiques sont une complication majeure de la chirurgie du foie, notamment la résection (enlèvement) hépatique, la transplantation hépatique et la chirurgie traumatique. Ces événements physiopathologiques influencent considérablement le pronostic de la fonction hépatique et une méthode de prévention ou de traitement efficace fait toujours défaut. La mort cellulaire est un indicateur pathologique constant de l'IRI. Par conséquent, il semble probable que l’inhibition de la cascade de mort cellulaire associée à l'IRI pourrait constituer une nouvelle stratégie thérapeutique actuellement non satisfaite. L’objectif de ce projet est de tester les effets d’une nouvelle molécule (SBL01) appartenant à la famille des inhibiteurs de mort cellulaire. Au cours de ce projet, SBL01 sera évaluée comme candidat médicament pour le traitement des lésions hépatiques d’ischémie-reperfusion, sur des modèles d’ischémie hépatique et transplantation chez le modèle porcin.
Bénéfices attendus
Il n’existe pas actuellement de petites molécules proposées pour la protection du foie ou des greffons contre les lésions d’ischémie-reperfusion. La molécule d’intérêt, candidat médicament que nous souhaitons tester, trouverait de nombreuses applications dans le domaine de la chirurgie hépatique et de la transplantation. La plupart des solutions en développement se focalisent davantage sur les modalités de conservation des greffons dans l’objectif d’améliorer l’oxygénation des organes. La solution proposée dans ce projet, c’est-à-dire l’inhibition de la mort cellulaire par administration (supplémentation des solutions ou par voie systémique) d’une molécule thérapeutique serait pionnière.
Procédures
Des échantillons de sang de 0,5-1 mL seront prélevés 1h avant la chirurgie du foie, puis 30 min, 1h, 3h, et chaque jour après la transplantation. Des biopsies hépatiques seront prélevées à l'aide d'un poinçon stérile de 4 mm avant l'ischémie (arrêt de la circulation artérielle), à la fin de l'ischémie et après la reperfusion (reprise de la circulation artérielle), sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Douleur/lésion physique après intervention chirurgicale. Toxicité éventuelle du produit injecté pouvant induire un stress physique. Stress psychosocial léger du fait de l’hébergement en cages individuelles, même si les animaux ont toujours des contacts visuels et auditifs avec des congénères.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort soit immédiatement après chirurgie sous anesthésie générale (animaux donneurs de foie), soit 7 ou 14 jours maximum après le réveil post-chirurgie (animaux receveurs et selon la phase du protocole) afin de pratiquer des prélèvements post-mortem à des fins d'analyses biologiques.
Remplacement
Les objectifs de ce projet sont d’une part d’évaluer la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule pour atteindre une concentration plasmatique efficace qui permettra de réduire les lésions d’ischémie/reperfusion hépatiques (i.e. arrêt et reprise de la circulation artérielle) en inhibant la cascade de mort cellulaire associée, et d’autre part de tester les effets in vivo de cette molécule chez le modèle porcin au travers de deux modèles d’ischémie hépatique et transplantation. Cette nouvelle molécule doit impérativement être testée sur un modèle in vivo pertinent avant de l’appliquer à une étude clinique chez l’humain. Le porc est l’animal de référence pour l’expérimentation médicale sur les greffes d’organes. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont proches de ceux de l’humain.
Réduction
Comme précédemment validé et publié, un effectif de 5 animaux par traitement représente le strict minimum nécessaire pour observer des différences significatives entre groupes expérimentaux dans le domaine des modèles d’ischémie (arrêt de la circulation artérielle) et de transplantation hépatique, mais nous avons décidé d’inclure 8 animaux par groupe/traitement afin de garantir une puissance statistique satisfaisante tout en palliant d’éventuels imprévus.
Raffinement
Les techniques d’anesthésie et de chirurgie employées utilisent des appareillages de pointe et seront réalisées par des chirurgiens spécialistes de la transplantation hépatique chez l’humain, avec l’aide de personnels compétents en anesthésie et analgésie porcine. Le suivi et l’analgésie post-opératoires des animaux seront effectués par des personnels compétents de manière à réduire la douleur et la souffrance des animaux. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et respecteront la charte nationale d’éthique sur l’expérimentation animale. Une prise en charge de la douleur per- et post-opératoire sera effectuée avec un traitement analgésique adapté à l'espèce et aux procédures. Des points limites précis ont été établis et une grille optimisée pour l'évaluation de la douleur et du bien-être animal sera utilisée.
Choix des espèces
Le porc est l’animal de référence pour l’expérimentation médicale sur les greffes d’organes. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont particulièrement proches de ceux de l’humain. Porcs en croissance (30-35 kg)
Fourniture de spécimens issus de toutes espèces pour le développement de méthodes analytiques, caractérisation de modèles et développement de techniques d’analyses de laboratoire.
- Production de routine
- Tests réglementaires
Chiens : 80
Cochons : 100
Moutons : 10
Bovins : 50
Poules : 2750
Prélèvements sanguins en vigile, biopsies cutanées au punch répétées jusqu'à quatre fois, aspirations à l'aiguille fine, écouvillonnages des muqueuses oculaires, buccales, nasales, anales et vaginales : 3 070 animaux non-humains subissent ces actes, dont 2 750 poules étourdies puis saignées à mort pour un prélèvement total, 80 chats, 80 chiens, 100 cochons, 50 bovins et 10 moutons. Au bout du compte 2 800 sont tués, 190 réutilisés dans d'autres procédures et 80 chats et chiens proposés à l'adoption, les actes infligés aux animaux réveillés étant déclarés d'un niveau de souffrance légère. L'objet du projet est de fournir du sang et des tissus aux laboratoires pour leurs tests in vitro et la libération de lots pharmaceutiques. Le porteur écrit que le nombre d'animaux est fixé par les laboratoires selon leurs "besoins" et qu'il n'est "actuellement pas possible" de le réduire, sans indiquer ce qui commande ces volumes.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’effectuer la fourniture de sang et de tissus nécessaires aux laboratoires pour effectuer et valider les tests in vitro, la production de sous-produits sanguins comme par exemple la production de plasma pour son utilisation comme véhicule pour un médicament, mai aussi le prélèvement de tissus et de sang pour la caractérisation et le développement de méthodes analytiques et de modèles expérimentaux sains (obtention de valeurs de référence). Mais aussi d’être en adéquation aux exigences réglementaires du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de contrôles qualité ayant pour but la libération de lot. Les procédures seront effectuées sur des animaux en attente d’étude, ne participant pas une procédure expérimentale.
Bénéfices attendus
Ces prélèvements garantissent la qualité du produit pour les animaux et leur environnement. Ces tests permettent la libération de lots pharmaceutiques et immunologiques qui protègent efficacement les animaux contre les maladies, améliorent directement la qualité sanitaire des élevages et assurent un meilleur bien-être animal.
Procédures
Tous les animaux sauf les poulets sont soumis à des prélèvements sanguins en vigile. L’acte technique est inférieur à 1 minute. Les poulets sont étourdis pour le prélèvement total. L’acte est inférieur à 3 minutes. Les chiens chats peuvent être soumis à des biopsies cutanées punch sous anesthésie. L’acte technique est inférieur à 5 minutes et ne peut être répété plus de 4 fois. Les chiens, chats peuvent être soumis à une aspiration à l’aiguille fine en vigile pour des prélèvements de cellule de la peau. L’acte technique est inférieur à 5 minutes et ne peut être répété plus de 4 fois. Enfin tous les animaux sauf les poulets peuvent être soumis à des écouvillons au niveau des muqueuses (conjunctives, auriculaires, buccales, nasales, anales, vaginales). Cet acte technique s’effectue en vigile et est inférieur à 3 minutes. Plusieurs écouvillons peuvent être effectués
Impact sur les animaux
Un stress est attendu chez les animaux lié aux manipulations ainsi qu’une douleur légère de courte durée liée aux prélèvements
Devenir
Tous les animaux peuvent être réutilisés sauf les poulets qui subissent un prélèvement total et terminal après étourdissement. Les chiens, chats peuvent être adoptés si la SBEA identifie un adoptant sérieux
Remplacement
La réalisation des techniques d’analyses de laboratoire in vitro nécessite la production de sang et de tissus. Actuellement, cette production n’est possible qu’à partir d’un animal. Aucun modèle in vitro alternatif n’a pu être mis au point pour ce type de production.
Réduction
Les animaux concernés sont issus ou en attente de tests libératoires de techniques de contrôles ou de protocole R&D. Dans quelques cas rares, les ovins, bovins peuvent être commandés spécifiquement pour la production de sang afin de répondre aux demandes du laboratoire. Les chats et chiens sont systématiquement des animaux réutilisés. Les porcs peuvent être commandés spécifiquement, dans ce cas se sont des surnuméraires de notre colonie. Les poulets proviennent de lots témoins de libération de tests de contrôle qualité, ils sont pratiquement toujours réutilisés. Le nombre d’animaux est fixé par les laboratoires en fonction de leurs besoins et du type de techniques d’analyses nécessaire. Il n’est actuellement pas possible de le réduire.
Raffinement
Dans ce projet, un stress lié aux manipulations ainsi qu’une douleur légère de courte durée liée aux prélèvements sont attendus chez les animaux. Une anesthésie (locale ou générale) sera pratiquée avant la biopsie cutanée. Pour éviter un inconfort de l'animal pendant et après le prélèvement par biopsie, une analgésie adaptée pourrait être pratiquée avant/pendant/après l'opération. Des points limites généraux liés à l'espèce sont appliqués (Respiration agonique, perte de poids et absence de réaction aux stimulis pour les carnivores et animaux de production et respiration bec ouvert et cou tendu, cachexie ou absence de réaction aux stimulis pour les poulets). Les différents prélèvements ne seront pas cumulés sur les animaux. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Tous les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements du milieu ont été mis en place dans les hébergements. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
La production de globules est actuellement irréalisable sur un modèle In vitro. Il faut passer par le modèle in vivo. Les globules rouges et blancs produits entrent ensuite dans les contrôles in vitro réalisés permettant la libération d’un lot. L'obtention d'un spécimen de sang permet aussi d'évaluer les valeurs usuelles chez l'animal sain, de développer des modèles analytiques. Pour avoir les valeurs d'une espèce, nécessité de travailler in vivo sur l'espèce cible. Dans le cas d'une biopsie ou d'un prélèvement par écouvillon, un modèle produit in vitro n'offre pas la complexité d'un spécimen prélevé in vivo (microbiome, interaction des différentes cellules). Le ou les spécimens ainsi récoltés pourront servir dans le cadre de caractérisations (de la flore commensale par exemple) ou de créations de nouveaux modèles. Les prélèvements de sang et de tissus récoltés sont spécifiques et liés à l’espèce. Le stade de développement n'a pas d'incidence sur la fourniture de specimens. Les prélèvements s'effectuent sur des animaux adultes et présents dans l'établissement utilisateur. Les porcs seront âgés d’au moins 8 semaines et les bovins seront âgés d’au moins 1 mois. Les ovins sont âgés entre 2 et 9 mois. Les chiens et les chats doivent être âgés d’au moins 8 semaines. Les poulets sont âgés de 1 jour d’âge à 70 jours. Les porcs seront âgés d’au moins 8 semaines et les bovins seront âgés d’au moins 1 mois. Les ovins sont âgés entre 2 et 9 mois. Les chiens et les chats doivent être âgés d’au moins 8 semaines. Les poulets sont âgés de 1 jour d’âge à 70 jours.
Etude du rôle de la pression interstitielle sous-cutanée dans la fuite capillaire au cours du choc septique. Essai de traitement innovant sur un modèle de choc septique chez le porc.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
72 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Un choc septique leur est provoqué, puis ils restent sous anesthésie vingt-quatre heures, avec des cathéters posés en une heure de chirurgie, des prélèvements toutes les deux heures et jusqu'à 200 ml de sang retirés. Le but est de tester une compression élastique de la peau censée limiter la fuite de liquide hors des vaisseaux, un dispositif déjà employé en clinique humaine. Les cochons pèsent environ 60 kg, ce qui permet, écrit le porteur, d'utiliser les mêmes produits et les mêmes volumes de perfusion que chez un patient de réanimation, et il juge "nécessaire" ce passage par l'animal alors que la compression a déjà montré des résultats encourageants chez des patients humains.
Objectifs
Les formes sévères des infections communes (pulmonaires, rénales…) sont la première cause d’admission en réanimation (hors chirurgie). Les cas les plus graves évoluent vers un syndrome appelé « choc septique » qui se manifeste principalement par une défaillance circulatoire avec baisse de la pression artérielle, ainsi qu’une baisse de la perfusion sanguine des différents organes, entrainant la mort dans environ 40% des cas. Au cours du choc septique, il se produit une fuite de liquide à travers la paroi des petits vaisseaux sanguins, conduisant à une baisse du volume sanguin. Cette fuite capillaire explique en partie la baisse de pression artérielle et de perfusion des organes, et explique l’apparition rapide d’œdèmes importants. Ces œdèmes s’accumulent dans tous les organes, mais le volume le plus important est retrouvé au niveau sous-cutané. A ce jour, aucun traitement n’est efficace pour lutter contre les différents phénomènes conduisant au choc septique et il n’existe aucun traitement pour réduire la fuite capillaire et les œdèmes qui l’accompagnent. Ce projet vise à proposer une approche thérapeutique innovante qui repose sur l’application préventive d’une faible pression au niveau cutané pour empêcher l’apparition d’œdèmes et la fuite de liquide en dehors des vaisseaux : la compression interstitielle sous-cutanée (SIPT). Si ce traitement a pu montrer des résultats encourageants dans une petite étude sur des patients humains en choc septique, nous avons besoin de confirmer l’efficacité de la compression dans un modèle préclinique (preuve de concept). Notre objectif final est de démontrer que la SIPT permet une amélioration globale des défaillances d’organes et in fine, une diminution de la mortalité. Ainsi, si la preuve de concept était apportée au terme de notre étude, cela pourrait ouvrir la voie à un changement de paradigme dans le traitement du choc septique. Ce projet permettra aussi de mieux comprendre les phénomènes reliant la pression au niveau du tissu interstitiel et les transferts de liquides entre compartiments. Les paramètres mesurés chez les animaux pendant les expériences permettront d’augmenter les connaissances sur la maladie. D’autant que le choc septique est le plus souvent étudiée sur des modèles animaux beaucoup plus éloignés de la réalité car la prise en charge n'est pas réalisée avec les fluides de remplissage comme c’est le cas dans le modèle que nous souhaitons mettre en place.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est la démonstration de faisabilité de la compression interstitielle sous cutanée (SIPT) avec une réduction des défaillances d’organes et de ce fait, une diminution de la mortalité. Si les effets attendus de la SIPT sont confirmés, cela pourrait conduire à un changement de paradigme pour le traitement du choc septique. Par ailleurs, ce projet nous permettra également d’acquérir de nouvelles connaissances non négligeables dans le rôle de l’interstitium dans la fuite capillaire au cours du sepsis.
Procédures
Les animaux vigiles seront tout d’abord tranquilisés puis l’animal est intubé est placé sous anesthésie générale tout le long de l’expérimentation. Les différents gestes chirurgicaux (pose de cathéters) et tous les prélèvements seront réalisés sur un animal sous anesthésie (sédatif + analgésique). La partie chirurgicale correspondant à la pose des cathéters devraient durer 1 heure environ. Des prélèvements seront réalisés toutes les 2h maximum, à l’aide des cathéters mis en place. Le volume sanguin prélevé tout au long de l’expérimentation ne dépassera pas les 200 ml, ce qui correspond à moins de 5% du volume sanguin total d’un porc de 60 kg. La durée totale de l'anesthésie à partir de l'induction du choc est de 24h et les animaux sont surveillés en permanence pendant toute cette période.
Impact sur les animaux
Durant cette étude, la seule nuisance attendue est la procédure de tranquilisation qui nécessite une injection en intramusculaire. Par la suite, l'animal sera constamment placé sous anesthésie générale à l'aide d'une molécule hypnotique et d'un morphinique.
Devenir
A la fin des différentes procédures sans réveil, les animaux sont tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. En effet, nous avons besoin de prélever des organes afin de réalisés des dosages.
Remplacement
Afin de répondre aux objectifs du projet, il est nécessaire d’avoir un modèle permettant d’évaluer les effets de notre traitement sur la formation des œdèmes, les défaillances d'organes systémique, la microcirculation et les paramètres hémodynamiques ainsi que la mise en jeu du système immunitaire au cours du choc septique. Il n'est pas possible d'avoir ce type de réponse sur des modèles in vitro. La validation de méthodes d’investigation clinique ou leur application d’une espèce à une autre ne peuvent être réalisées par définition qu’in vivo à l’aide de modèles animaux. Le choix du modèle porcin est le plus pertinent car il permet de se rapprocher au maximum de la prise en charge clinique en utilisant le même matériel et les mêmes protocoles de prise en charge que chez le patient humain en service de réanimation. Ce modèle nécessite également une anesthésie de plus de 24 heures, qui est faisable chez le porc avec les mêmes protocoles que chez l’homme. De plus, l’intervention thérapeutique qui sera testée consiste à réaliser une compression sur la peau par des bandages élastiques, déjà utilisés chez l’homme en pratique clinique moins adapté sur d'autres espèces.
Réduction
Afin de réaliser cette étude nous procéderons par étapes afin de valider un protocole robuste, répétitif et reproductible. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaires nous nous sommes basés sur la littérature pour la mise en place du modèle ou sur le critère principal de la balance hydrique pour lequel nous avons réalisé un test statistique (test de puissance). A chaque étape, si les résultats sont satisfaisants avec un nombre plus faible d'animaux que le nombre d'animaux maximum prévu, la procédure s'arrête et le nombre d'animaux utilisé est alors automatiquement réduit. Par ailleurs, nous prévoyons de récolter et stocker des échantillons biologiques qui pourront servir pour d’autres projets de recherche scientifique.
Raffinement
Les animaux sont acclimatés à l’animalerie et maintenus en groupe tant que c’est possible. En effet, les deux premières procédures seront réalisées sur un seul animal à la fois. Ainsi, le dernier animal du groupe sera forcément hébergé seul pendant maximum 48h. Dans ce cas-là, nos visites quotidiennes seront plus nombreuses et un miroir pourra être fixé en dehors de la cage, de façon à ce que l'animal puisse y refléter son image sans risque de se blesser. Par ailleurs, pour le porc, la recherche de nourriture repose essentiellement sur le comprtement de fouissage dans le sol, c’est pour cela que nous enrichissant leur cage avec des copeaux et que nous parsemons une de la nourriture au sol. De même, nous disposons des jouets dans leur cage afin de diminuer leur stress. Par ailleurs, notre modèle expérimental est conçu pour limiter le stress et la douleur des animaux, dans un contexte de la mise en place d’un choc septique. Après la phase d’acclimatation, les animaux seront opérés. Il s’agit d’une intervention sans réveil pendant laquelle un suivi attentif de la douleur est réalisé avec une prise en charge de la douleur grâce à un traitement antalgique fort à base d'opiacés.
Choix des espèces
La plupart des études translationnelles sur le sepsis ont été réalisées chez des rongeurs et ne reflètent pas les mécanismes du sepsis humain ni le rôle des différents traitements tels que le remplissage vasculaire. Quel que soit l'effet qui sera observé avec le SIPT, ces données apporteront de nouvelles connaissances qui pourraient être traduites en applications cliniques. Les porcs utilisés dans cette expérimentation pèsent environ 60 kg, équivalent au poids humain. Ainsi, tous les produits utilisés lors de l’anesthésie, l’intubation seront similaires à ceux utilisés chez des patients humains. Il en est de même pour la prise en charge, en particulier le volume du liquide injecté afin de maintenir la PAM : en 24h, le volume total de liquide utilisé devrait atteindre 4 à 10 L, un volume qui permet de déceler une différence entre 2 groupes d’animaux et qui ne peut pas être appliqué chez des modèles de petits animaux. De plus, l’intervention thérapeutique qui sera testée consiste à réaliser une compression sur la peau par des bandages élastiques, déjà utilisés chez l’homme en pratique clinique. Ces bandages ne seraient pas adaptés à une autre espèce, que ce soit une espèce plus petite (rongeurs, félins, lagomorphes), ou une espèce à fourrure (mouton).
Etude comportementale et fonctionnelle de modèles murins des troubles du spectre autistique (TSA)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
6 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 760 sous anesthésie sans réveil et 2 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est marquée et génotypée par prélèvement d'un disque d'oreille de 1 mm, ou par amputation de deux phalanges au maximum avant huit jours de vie. Certaines subissent une nage forcée de six minutes, jusqu'à trois fois à une semaine d'écart, une chirurgie du crâne d'une trentaine de minutes pour implanter un cadre métallique, des électrodes intracérébrales ou une fibre optique, et jusqu'à neuf injections intrapéritonéales. Le porteur écrit que les dommages escomptés sont minimes puisque les animaux doivent être en bonne santé pour être soumis aux tests comportementaux, et signale des blessures auto-infligées par toilettage excessif, caractéristiques des lignées étudiées, qui conduisent à la mise à mort.
Objectifs
Les troubles du spectre autistique (TSA) touchent une personne sur 100. Il s’agit d’un trouble neuro-développemental caractérisé par des anomalies de la communication sociale ainsi que des comportements stéréotypés et des intérêts restreints. Cependant, derrière cette définition générale se trouve un spectre d’états, allant de légères anomalies de traits de personnalité à des incapacités sévères. Récemment, la piste d’une altération des fonctions synaptiques à l’origine d’une partie des cas de troubles du spectre autistique a été confirmée par l’identification, notamment dans notre laboratoire, de mutations dans des gènes codant pour des protéines synaptiques nommées neuroligines, neurexines et SHANK. Notre laboratoire étudie le rôle de plusieurs protéines synaptiques modifiées par des mutations associées aux TSA dont deux protéines d’échafaudage de la densité post-synaptique des synapses glutamatergiques, Shank2 et Shank3. Nous travaillons en collaboration avec des psychiatres pour obtenir des données cliniques, que nous combinons aux données génétiques issues des ADN des patients évalués pour identifier des gènes associés aux TSA. Des modèles cellulaires et murins ont été développés pour mieux comprendre et caractériser expérimentalement le rôle des protéines codées par ces gènes de susceptibilité dans les TSA. Nous étudions ainsi les conséquences fonctionnelles de ces mutations in vitro et in vivo. Enfin, au laboratoire, nous examinons l’anatomie cérébrale et le comportement des animaux modèles. Nous explorons donc, sous des angles très divers, les relations entre génétique et susceptibilité aux troubles du spectre autistique. Le présent projet concerne les études in vivo chez les modèles murins de l’autisme disponibles au laboratoire et portant des mutations dans les gènes Shank2 ou Shank3. Il prolonge et complète directement 2 autres projets autorisés.
Bénéfices attendus
L’autisme représente un enjeu majeur de santé publique. Il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour améliorer les symptômes des TSA. Ce projet nous permettra de décrire et comparer de manière quantitative et qualitative les modalités de la communication au cours des interactions sociales, en conditions normales et pathologiques et de mettre en évidence de nouveaux phénotypes chez les souris modèles d’autisme grâce au développement de nouvelles tâches comportementales plus complexes et plus éthologiques que celles étudiées habituellement. Il permettra aussi de mieux comprendre les bases neurales, moléculaires et cellulaires impliquées dans les déficits comportementaux que nous identifierons et de tester de nouveaux traitements potentiels pour aider les personnes atteintes de ces troubles.
Procédures
Tous les animaux génétiquement modifiés devront être marqués et génotypés. Pour cela, une toute petite partie de l’oreille (disque de 1 mm) sera prélevée sur les animaux vigiles, généralement au moment du sevrage. S’il s’avère nécessaire de faire un marquage et un génotypage précoce pour prélever le cerveau de jeunes animaux, une phalangectomie concernant au maximum deux phalanges pourra être pratiquée jusqu’à 8 jours de vie (si deux phalanges sont amputées, elles seront faites sur deux pattes différentes). Les animaux seront soumis à des tests comportementaux ponctuels et sur plusieurs jours (tâches comportementales automatisées avec utilisation de portes automatiques), élaborés pour générer le moins de stress possible aux animaux. Toutefois, afin de tester les effets du stress chez certaines souris, elles seront exposées à un stress de nage forcée pendant 6 minutes, avec un maximum de trois expositions à une semaine d’écart. Les tests comportementaux nécessitent l’implantation d’une puce d’identification sous la peau de l’animal. Ce geste est effectué sous anesthésie gazeuse avec analgésie. Certains animaux seront soumis à une unique procédure chirurgicale permettant d’implanter, soit un cadre métallique à la surface du crâne, soit un dispositif d’électroencéphalogramme/électromyogramme (corps du dispositif sous-cutané et électrodes intracérébrales et intramusculaires), soit une fibre optique intracérébrale. La chirurgie dure environ 30 minutes. Certains animaux recevront des injections intrapéritonéales de composés pharmacologiques. Les animaux recevront au maximum 9 injections, avec au moins 3 jours d’écart entre deux injections.
Impact sur les animaux
Les dommages escomptés pour les animaux sont minimes car nous mettrons tout en œuvre pour supprimer douleur et souffrance qui pourraient être induites par les différentes procédures, d’autant plus que les animaux doivent être en bonne santé pour être soumis aux différents tests comportementaux. On peut s’attendre cependant à voir l’apparition d’états d’inconfort, de douleur ou de stress passagers chez certains animaux soumis à un stress induit volontairement, ou à une chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car les cerveaux seront prélevés pour des expériences ex vivo.
Remplacement
Pour identifier les mécanismes cérébraux mis en jeu et les effets de composés thérapeutiques sur les phénotypes associés à l’autisme, il est essentiel de faire des études sur des modèles animaux sociaux ayant un système nerveux entier et fonctionnel, et d’étudier les comportements et les états émotionnels associés au fonctionnement exécutif au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’homme. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique intègre entre les différentes régions du cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisant pour en faire des modèles d’étude pertinents.
Réduction
Dans les études comportementales classiques, la variabilité inter-individuelle est élevée. Il est donc nécessaire d’analyser au moins 15 souris par génotype, sexe et condition pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Nos nouvelles techniques de phénotypage dans l’environnement d’hébergement nous permettent de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Nous avons donc besoin de moins d’animaux (une douzaine par groupe à la fin des expériences) pour obtenir des résultats de très bonne qualité. Nous prévoyons 15 animaux par groupe en début d’expérience pour prendre en compte une potentielle perte d’animaux analysable au cours de la procédure (perte de puce d’identification ou autre) et avoir au moins 12 animaux analysables à la fin des expériences comportementales. Les expériences fonctionnelles seront réalisées sur des groupes de 10 animaux par condition. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et lignées de souris qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle les mêmes lignées de souris sont couramment utilisées. Notre expérience en chirurgie intracérébrale, études comportementales et immunomarquages nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre génotypes, sexes et conditions (avec ou sans traitement/stress) pour comparer les groupes. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les individus seront soumis à plusieurs procédures comportementales lorsqu’il n’y a pas d’interférence entre les procédures. Plusieurs procédures impliquant un apprentissage opérant ne pourront pas être faites sur un même animal car un apprentissage influencera l’autre. Les procédures sans apprentissage pourront, elles, être effectuées séquentiellement sur les mêmes animaux. Certains animaux ne pourront pas être réutilisés car leurs cerveaux seront prélevés à l’issue des expériences pour effectuer des études histologiques, cellulaires ou moléculaires. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.
Raffinement
Les animaux modèles de TSA bénéficient systématiquement d’un dôme dans leur cage d’élevage en plus de l’enrichissement standard. Avant chaque expérience non automatisée, nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Pendant toutes les expériences de comportement, les animaux seront manipulés très régulièrement (presque tous les jours), ce qui permet de diminuer fortement leur réactivité émotionnelle à la manipulation mais également de détecter le moindre changement d’attitude ou d’état physique. Pour les expériences automatisées (environnements complexes avec portes automatiques), les animaux seront laissés tranquilles dans leurs environnements de test et surveillés à distance via des interfaces permettant de visualiser et contrôler l’expérience. Concernant les chirurgies, des antidouleurs seront appliqués localement au moins 30 min avant la chirurgie. En période postopératoire, l’état général et les signes de douleur des animaux seront évalués régulièrement, selon la grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort du comité responsable du bien-être animal. Les animaux seront examinés régulièrement pour détecter précocement tout signe de détresse (changements de posture, yeux plissés, manque de toilettage) et la zone opérée sera inspectée minutieusement pour détecter précocement tout éventuel signe d’infection. Si nécessaire, des doses supplémentaires d’analgésique seront données. Pour l’ensemble du projet, en cas de dégradation de l’état de l’animal avant atteinte des points limites, une pesée quotidienne et les traitements adéquats seront appliqués. Si nécessaire, l’avis du vétérinaire sera demandé. L’atteinte des points limites conduira à la mise à mort de l’animal. Ces points correspondent à : une prostration, dos courbé et expression faciale très altérée, ou dénutrition majeure, ou perte de poids supérieure à 20%, et, pour les chirurgies, signes de douleur malgré l’analgésie, poils hérissés, animal prostré, hypothermie. En cas de blessures sévères, auto-infligées (par auto-toilettage excessif, caractéristique des lignées étudiées) ou dues à des agressions inter-individuelles, les animaux seront mis à mort. En cas de blessures légères, les plaies seront désinfectées et le milieu enrichi dans les cas d’auto-toilettage excessif.
Choix des espèces
Les manipulations génétiques sont actuellement les mieux connues et les plus élaborées chez la souris, ce qui permet d’invalider un gène défini et donc de générer des modèles murins de l’autisme en invalidant des gènes bien précis (éventuellement uniquement dans certaines régions cérébrales spécifiques). Les comportements de la souris commencent à être de mieux en mieux connus, même si les aspects liés à la communication chez ce modèle demandent à être approfondis et les circuits neuronaux associés précisés (ce que ce projet vise à faire). Les animaux seront utilisés pour la grande majorité à l’âge adulte (à partir de 7 semaines), afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mature pour la réussite et la reproductibilité des interventions chirurgicales, et pour l’homogénéité de leur comportement. Selon les résultats obtenus chez les adultes, des animaux plus jeunes seront également nécessaires pour étudier le développement (foetal et postnatal) des structures cérébrales impliquées dans les TSA.
Evaluation in vivo d’une sonde de pression tissulaire en oxygène et en dioxyde de carbone chez le cochon anesthésié.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Trépanés sur quelques centimètres pour introduire des sondes dans le cerveau, après pose d'un cathéter dans la carotide et modulation forcée de la ventilation artificielle, 20 porcelets d'environ deux mois sont opérés sous anesthésie générale profonde et tués avant tout réveil. Les mesures portent d'abord sur le muscle, avec cinq animaux par procédure, puis sur le cerveau, avec dix animaux. Le projet vise à vérifier la justesse et la réactivité de capteurs de pression tissulaire en oxygène et en dioxyde de carbone, destinés à terme au monitorage de patients cérébrolésés. Sur l'effectif, le porteur reconnaît qu'il est difficile de donner prise à une justification précise du nombre de sujets.
Objectifs
La prise en charge spécialisée des patients souffrant de certaines pathologies neurologiques, comme le traumatisme crânien sévère, est notamment guidée par de nombreux paramètres reflétant l’état du cerveau, dont la pression tissulaire en oxygène (O2) et en dioxyde de carbone (CO2). Un certain nombre de dispositifs sont actuellement disponibles, en pratique clinique, pour la surveillance, souvent indirecte, de ces paramètres, et ces dispositifs sont en constante évolution afin de proposer des solutions de plus en plus directes, efficaces et/ou sécuritaires. Evidemment, avant de pouvoir être considérés dans le cadre d’une utilisation clinique, ces dispositifs doivent satisfaire à un certain nombre de tests techniques, in-vitro et souvent in vivo qui permettent de vérifier notamment la justesse et la réactivité des mesures dans des conditions physiologiques réalistes et tenant compte de la variabilité et de la variation d’un certain nombre de facteurs connus et décrits dans la littérature, comme les variations des niveaux de pressions partielles dans le sang en O2 ou en CO2 et la perfusion sanguine. Le projet que nous proposons a pour objectif d’évaluer, chez le cochon sous anesthésie générale profonde, les dispositifs de mesure de la pression tissulaire en O2 et en CO2. Dans un premier temps, les sondes seront testées dans le muscle avant d’être testées au niveau cérébral. En particulier, nous testerons la fiabilité et la réactivité des mesures fournies lors de variations contrôlées des niveaux sanguins d’O2 ou de CO2 (par modifications des paramètres de ventilation artificielle) et du débit sanguin tissulaire.
Bénéfices attendus
- Vérifier le fonctionnement in vivo des capteurs tissulaires d’oxygène et de dioxyde de carbone - Comparer la précision de meure des capteurs tissulaires d’oxygène et de dioxyde de carbone - Evaluer la réactivité des capteurs tissulaires d’oxygène et de dioxyde de carbone - Améliorer le design et l'interface du moniteur pour une utilisation plus ergonomique - A terme, application clinique dans le champ du monitorage des patients cérébrolésés en neuro-réanimation
Procédures
Mise à part la phase d'induction de l'anesthésie pas de geste en dehors de la sédation. Types d'interventions : - La sédation par voie intramusculaire à l’arrivée dans la structure d’expérimentation - La pose d’une voie veineuse périphérique de petit calibre sur une veine auriculaire, afin d’injecter les produits d’induction de l’anesthésie générale - L’intubation orotrachéale dont la douleur est limitée par les agents analgésiques préalablement administrés - La pose d’un cathéter artériel en carotidien (sous anesthésie générale) - L’incision cutanée, introduction du capteur et suivi des valeurs (pour les expérimentations sur le cerveau : trépanation de quelques centimètres pour pouvoir introduire les sondes dans le parenchyme cérébral) - Le maintien d’une sédation et d’une analgésie visant l’entretien d’une anesthésie générale profonde tout au long de l’expérimentation
Impact sur les animaux
Les nuisances seront limitées à : - La sédation par voie intramusculaire à l’arrivée dans la structure d’expérimentation - La pose d’une voie veineuse périphérique de petit calibre sur une veine auriculaire, afin d’injecter les produits d’induction de l’anesthésie générale - L’intubation orotrachéale dont la douleur est limitée par les agents analgésiques préalablement administrés - La pose d’un cathéter artériel en carotidien (sous anesthésie générale) - L’incision cutanée, introduction du capteur et suivi des valeurs (pour les expérimentations sur le cerveau : trépanation de quelques centimètres pour pouvoir introduire les sondes dans le parenchyme cérébral) - Le maintien d’une sédation et d’une analgésie visant l’entretien d’une anesthésie générale profonde tout au long de l’expérimentation
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les évaluation préalables in-vitro ne permettent pas de simuler de manière adéquate l’environnement réel d’utilisation des sondes (tissus spécifiques, vascularisation,…). Donc, un modèle animal, proche de l'Homme, comme le porc, est nécessaire pour évaluer la fiabilité des dispositifs médicaux in vivo avant de pouvoir évaluer leur applicabilité future potentielle chez les patients cérébrolésés pour monitorer certains paramètres cérébraux.
Réduction
Le nombre d’animaux étudiés sera réduit au minimum, en accord avec les principes des 3R, notamment le raffinement des méthodes expérimentales et la réduction du nombre d’animaux utilisés pour l’expérimentation, basée sur un plan statistique. Au vu des données disponibles dans la littérature, il semble toutefois difficile de donner prise à une justification précise du nombre de sujets. Aussi, cette justification repose sur les délais d’expérimentation, sur la stratégie considérée en termes de plan expérimental et sur une simulation en termes de puissance statistique permettant d’assurer la fiabilité des mesures recueillies, avant son utilisation éventuelle en pratique clinique. Un effectif total de 5 animaux par procédure expérimentale sur le muscle et 10 animaux pour les mesures sur le cerveau (soit un total de 20 animaux pour l’ensemble du projet) doit toutefois permettre d’assurer l’analyse de la réactivité et de la réaction des sondes aux épreuves prévues. Le choix de n’utiliser que 10 animaux pour l’ensemble des mesures cérébrales repose sur deux éléments. Le premier est que ces manipulations sont plus complexes et qu’il est possible que certaines manipulations n’arrivent pas à leur terme par suite de problèmes techniques. Deuxièmement, la destination finale de ces moniteurs étant le monitorage cérébral, nous souhaitons recueillir plus de données dans cette configuration intracérébrale.
Raffinement
En pratique, les animaux seront acheminés depuis l’établissement fournisseur, vers l’établissement utilisateur, le matin-même de l’expérimentation. Au sein de l’établissement utilisateur, l’angoisse des animaux sera limitée par l’utilisation d’un local adapté de stabulation, avec libre accès à l’alimentation et à une source d’eau jusqu’à 6 heures avant leur sédation intramusculaire en vue de leur inclusion dans le protocole de recherche. En particulier, les animaux ne seront maintenus en cages de dimensions adaptées à la réglementation (surface minimale par animal : 0,4 m2 ; hauteur minimale : 50 cm) et comportant des éléments d’enrichissement (environnemental : litière épaisse de paille ; occupationnel : jeux distractifs adaptés ; nutritionnel avec distribution auto-déclenchée des aliments), que le temps minimal strictement nécessaire, e.g. pour le transport des animaux jusque dans des enclos spécifiques au sein de l’établissement utilisateur (dimensions réglementaires des enclos : surface au sol minimale de 0,2 m2 par animal ; longueur minimale de mangeoire par tête de 0,2 m) et l’administration de la sédation intramusculaire par Azapérone avant réalisation d’une anesthésie générale par voie intraveineuse (soit au total environ 3 heures).
Choix des espèces
Le modèle porcin est le modèle le plus proche de l’Homme, hors primates non humains, motivant son utilisation pour évaluer in vivo ce dispositif destiné à une application clinique future. La réalisation des mesures physiologiques (hémodynamiques, respiratoires) et issues des sondes de de pression tissulaire en oxygène et en dioxyde de carbone nécessite une taille minimale des porcelets. Des animaux immatures seront suffisants. Les animaux seront âgés d’environ 2 mois et seront de sexe indifférent (selon l’établissement fournisseur).
Utilisation de sondes fluorescentes chez la souris pour une meilleure compréhension des mécanismes de distribution et d’internalisation des récepteurs
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une chirurgie du cou pour cathétériser l'artère carotide, avec un risque d'atteinte du nerf vague et de rupture de vaisseau, précède une perfusion de cinq minutes de sondes fluorescentes. 24 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur écrit que l'exposition aux sondes "sera rapidement suivie de la mise à mort des animaux ce qui devrait limiter toute nuisance potentielle", présentant ainsi la mise à mort comme une mesure de protection. Cinq des 24 souris sont affectées au "réapprentissage des gestes de chirurgie" et ne rejoignent le projet que si l'opération réussit, quatre servent à fixer la dose, et les quinze dernières aux trois sondes à tester.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) est la deuxième cause de décès et la troisième cause d'invalidité dans le monde. Lorsqu'une personne subit un AVC, une hormone appelée angiotensine II est produite en plus grande quantité. En se fixant sur son récepteur, cette hormone va induire une contraction des vaisseaux sanguins ce qui va réduire l’apport de sang au cerveau et donc augmenter la gravité de l'AVC. Certains nouveaux candidats médicaments sont capables de faire rentrer ces récepteurs hormonaux à l’intérieur des cellules, les rendant donc inaccessibles pour l’angiotensine II. Ceci permettrait de prévenir la contraction des vaisseaux sanguins cérébraux. Cette internalisation des récepteurs pourrait donc participer à une protection cérébrovasculaire en cas d’AVC. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons développé et testé sur cellules, des outils fluorescents spécifiques permettant de localiser avec précision ces récepteurs. L’objectif de ce projet est de tester ces outils fluorescents pour visualiser in vivo la distribution et l’internalisation des récepteurs dans les vaisseaux cérébraux notamment en définissant les doses des outils fluorescents à utiliser in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet préliminaire nous permettra de fixer la dose des sondes à utiliser in vivo puis de valider la méthodologie d’évaluation de la distribution des récepteurs. L’étude de cette distribution des récepteurs est importante pour comprendre et caractériser les mécanismes et les effets de certains traitements de l’accident vasculaire cérébral.
Procédures
Les souris subiront une chirurgie carotidienne pour cathétérisation de l’artère carotide puis une infusion de 5 minutes via ce cathéter sera effectuée. L’expérimentation n’excédra pas 1h.
Impact sur les animaux
risques d’atteintes du nerf vague lors du cathétérisme de l’artère carotide L’exposition à ces sondes (durée de perfusion de 5 minutes) sera rapidement suivie de la mise à mort des animaux ce qui devrait limiter toute nuisance potentielle dues à ces molécules.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et le sang pour des analyses.
Remplacement
Pas de remplacement possible car l’objectif est de visualiser et étudier la distribution des récepteurs de l'angiotensine II directement au niveau du tissu cérébral et cérébrovasculaire. Les outils fluorescents spécifiques que nous souhaitons tester ont été synthétisées et purifiées par des laboratoires partenaires. Leur caractérisation pharmacologique complète a été réalisée sur des modèles cellulaires et ex vivo (artère cérébrale isolée perfusée) qui permettent d’estimer les doses nécessaires à notre objectif.
Réduction
Afin de réduire au maximum l’utilisation d’animaux, la détermination de la dose à administrer sera déterminée dans un premier temps pour un seul outil fluorescent. La dose à utiliser pour les 2 autres outils fluorescents sera basée sur l’utilisation de la première car nos études préliminaires montrent une affinité équivalente pour nos 3 outils fluorescents. Le nombre total d’animaux pour ce projet sera de 24 : 5 souris dédiées au réapprentissage des gestes de chirurgie (si succès de la chirurgie, ces souris seront incluses dans le projet), 4 souris afin déterminer la dose des sondes à utiliser (2 souris pour 2 doses différentes) et enfin 15 souris (5 souris pour chacune des 3 sondes à tester). Ce projet étant un test préliminaire, aucun test statistique n’a été utilisé.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en portoir avec des cages ventilées et filtrées, à 5 souris par cage. Ces cages seront enrichies (tunnel en polycarbonate, buchette de peuplier…) – période d’acclimataion minimale de 1 semaine. Pendant toute la durée de la chirugie et jusqu’à la mise à mort de l’animal, la profondeur de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée par l’absence de reflexe de retrait de la patte aux pincements interdigitaux et absence du réflexe cornéen ; un anti-douleur sera administré 1 h avant le début de la chirurgie ; la température corporelle sera contrôlée via une sonde rectale et maintenue à 37°C; la cornée sera protégée par un gel ophtalmique ; la durée d’utilisation des animaux sera limitée à 1h sous anesthésie, avec contrôles des paramètres vitaux à des valeurs physiologiques. Les animaux seront mis à mort par surdose d’anesthésie en cas de lésion du nerf vague ou d’une rupture d’un vaisseau avec hémorragie trop importante lors de la chirurgie.
Choix des espèces
Les souris utlisées seront des C57Bl/6j mâles agées de 10 semaines, poids entre 20 et 30g). C’est ce même modèle de souris qui a été utilisé pour les études cérebrovasculaires et cardiovasculaires précedentes, afin de permettre la comparaison. Cet âge correspond à un stage adulte jeune chez qui la pose d’un cathéter dans l’artère carotide est facilitée par rapport à des animaux plus jeunes.
Etude du mécanisme d’entrée d’anticorps ciblant différentes protéines du cerveau chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil pour 666 d'entre elles, 1 088 souris vont être utilisées dans ce projet, les 422 autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les premières subissent une trachéotomie et la pose d'une canule dans la veine jugulaire, une demi-heure d'opération suivie de deux heures d'enregistrement au microscope. Les secondes reçoivent l'implantation d'une lentille dans le crâne, puis des injections de nanocorps de lama dans la veine de la queue ou derrière l'œil, et vivent isolées. Le porteur décrit la lignée génétiquement modifiée utilisée, déficiente pour un récepteur du glutamate, comme porteuse d'un phénotype "non dommageable", et affirme que le remplacement n'est pas envisageable puisque l'objet même de l'étude est le passage de ces molécules du sang vers le cerveau.
Objectifs
Le cerveau est protégé par des barrières physiologiques. Elles limitent le passage de molécules du sang vers les tissus cérébraux, et inversement. Elles rendent difficile l’adressage de biomolécules d’intérêt thérapeutique (protéines tels que des anticorps ou peptides) vers le cerveau. Franchir ces obstacles permettrait à ces biomolécules d’atteindre leurs cibles et d’offrir aux patients de nouvelles approches thérapeutiques. Au laboratoire, nous avons identifié des anticorps de lama, aussi appelés nanocorps, qui ont la capacité d’entrer dans le cerveau et donc de franchir ces barrières. Ces nanocorps reconnaissent spécifiquement des récepteurs particulièrement impliqués dans des maladies neurodégénératives. Le but de notre étude est de comprendre le mécanisme d’entrée de ces nanocorps dans le cerveau de souris. Pour cela, nous étudierons leur passage du sang vers le tissu cérébral dans plusieurs régions du cerveau par microscopie. Ces régions contiennent les différents types de barrières physiologiques.
Bénéfices attendus
Du fait de leur manque de spécificité, les petites molécules thérapeutiques présentent souvent des effets secondaires, d’où un intérêt grandissant pour les outils thérapeutiques biologiques. En 2019, 14 outils de ce type dont 8 anticorps ont été mis sur le marché. Cependant, ces outils ciblent uniquement les organes hors système nerveux central du fait des grandes difficultés rencontrées pour leur entrée dans le cerveau. En effet, l’accès au cerveau est dépendant de la taille mais il peut également dépendre des propriétés physico-chimiques de la molécule ainsi que de sa cible. Nos études ont montré jusque-là que des nanocorps, 10 fois plus petits que les anticorps classiques, passent dans le cerveau et ont une activité sur plusieurs jours dans le cadre de modèles de maladies psychiatrique et neurodégénérative. Cependant, les voies et le mécanisme jouant effectivement un rôle majeur dans leur entrée sont à ce jour inconnus. Les identifier permettrait de proposer de nouvelles stratégies pour franchir les obstacles que forment les barrières physiologiques du cerveau et d’augmenter la quantité de médicaments biologiques atteignant l’organe.
Procédures
Une partie des animaux sera soumis à une opération chirurgicale sans réveil, trachéotomie, avec une canulation via veine jugulaire pour l’administration des nanocorps, d’environ 30 minutes suivi des enregistrements microscopiques d’environ 2h. L’autre partie sera soumise à une chirurgie d’implantation d'une lentille d’environ 30-60 minutes. Ces animaux-là auront des injections (dépendant de leur groupe) via veine caudale ou rétro-orbital des nanocorps+sucres inertes (ces sucres sont aussi appelés dextran). Ces injections dureront moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Sont attendus : -une douleur légère produite par l’introduction d’une aiguille au cours de l’administration des analgésiques et des nanocorps ; -des douleurs post-chirurgicales ; -une augmentation du stress due à l’isolement des souris implantées avec une lentille.
Devenir
L’ensemble de l’effectif est destiné à être euthanasié afin de pouvoir prélever les structures d’intérêt pour analyse.
Remplacement
Le sujet de l’étude étant la pénétration des nanocorps dans le cerveau à partir du sang, le remplacement de l’animal n’est pas envisageable. Les voies d’entrée dans le cerveau et la complexité de l’organe ne peuvent être représentées exhaustivement par un modèle isolé de barrière hémato-encéphalique.
Réduction
Nos résultats préliminaires suggèrent que les nanocorps se comportent différemment dans leur accès aux régions du cerveau. De ce fait, il serait difficile de réduire le nombre de régions regardées. Cependant, le nombre d’animaux utilisés pour pouvoir tester l’ensemble des nanocorps que nous voulons tester a été réduit au minimum par le fait que nous pouvons tester plusieurs nanocrops sur un même animal. Cet effectif a été calculé avec un logiciel afin d’obtenir des analyses statistiques valides. De plus, étant donné que nos résultats ne montrent aucune différence d’entrée de nanocorps entre les sexes, nous utiliserons des mâles et des femelles dans nos cohortes.
Raffinement
Cette étude impliquera l’utilisation d’une lignée de souris génétiquement modifiées, déficientes pour le récepteur d’un neurotransmetteur cérébral dont le phénotype n’est pas dommageable. Elle impliquera également l’isolement des souris. Cependant, tous les animaux de cette étude seront placés dans un milieu enrichi (frisottis de papier, bâtonnets de coton et abri en carton) avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum, sous surveillance régulière et en portoir ventilé. Notre étude comporte des procédures avec actes chirurgicaux et imagerie qui ne débuteront que sept jours après réception des animaux afin de diminuer le stress lié au changement d’environnement. Tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront suivis quotidiennement après l’opération. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Nous avons déterminé différents points limites spécifiques à nos procédures basées sur une observation de l’animal (difficulté respiratoire, rythme cardiaque altérée, manque d’activité) et une pesée quotidienne des animaux (importante perte de poids).
Choix des espèces
Les nanocorps à tester reconnaissent des cibles murines. Afin que leur passage à travers les différentes voies possibles d’entrée soit évalué, le choix de l’espèce Mus musculus et du phénotype sauvage des animaux est indispensable. Les souris déficientes en récepteur du glutamate serviront à évaluer le rôle crucial que jouerait ce récepteur dans le transport des nanocorps qui en sont spécifiques. Les souris seront traitées à partir de 7 semaines d’âge correspondant à l’âge adulte où le développement cérébral est achevé. Les souris seront livrées au minimum à l’âge de 6 semaines et seront hébergées pendant une semaine avant le début de l’étude pour permettre une acclimatation.