Procédures sans réveil

Une partie des souris utilisées porte des modifications qui les font développer spontanément des tumeurs : mélanomes chez 25 à 60 % d'entre elles à partir de deux mois, tumeurs de l'ensemble des glandes mammaires après une latence moyenne de 92 jours. 4 372 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour la quasi-totalité, 54 étant tuées sans réveil. Elles reçoivent quatre à six injections sous anesthésie, trois à six injections intrapéritonéales vigiles, des prélèvements de sang à la queue ou en rétro-mandibulaire, et une irradiation de 2 grays ou une injection de busulfan, avec nécrose, ulcération et saignements des tumeurs annoncés. L'élevage croise des femelles sauvages avec des mâles qui ne développent leurs tumeurs mammaires qu'après leur période de reproduction, ce que le porteur compte au titre du raffinement.

Objectifs

L’immunothérapie connaît un grand essor depuis ces dernières années et est de plus en plus utilisée pour traiter différents cancers. Cette thérapie consiste à réactiver le système immunitaire du patient afin qu’il puisse lui-même reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Malgré de nombreux succès cliniques, l’efficacité des immunothérapies est encore limitée à un sous-ensemble de patients répondeurs. Une des principales limites réside dans l’infiltration de la tumeur par les cellules immunitaires. En effet, un faible effet thérapeutique corrèle avec une tumeur dite « froide », c’est-à-dire peu infiltrée et pauvre en cellules immunitaires. Il est donc crucial de comprendre les mécanismes permettant l’infiltration des cellules immunitaires au sein de ces tumeurs et de développer des stratégies pour manipuler ce processus afin de contourner la résistance thérapeutique aux points de contrôle immunitaire (ICB). Ce projet a pour but de développer de nouvelles thérapies capables de remodeler le microenvironnement tumoral afin de rendre répondante une tumeur qui ne l’est pas initialement. Utiliser ces nouvelles thérapies en combinaison avec les immunothérapies déjà existantes pourrait ainsi permettre de surmonter la résistance primaire observée chez de nombreux patients. Ce projet nécessite la modélisation du contexte immunitaire dans des modèles vivants. Au fur et à mesure de l’avancement du projet, des modèles pré-cliniques (tumeurs endogènes et souris humanisées) seront utilisés afin d’imiter au mieux les effets présents chez l’Homme. Ainsi les modèles précliniques permettent de sélectionner les stratégies immuno-thérapeutiques les plus efficaces à tester dans le cadre d'essais cliniques et par conséquent réduire les risques associés aux essais cliniques infructueux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif fondamental d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents à l'infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs solides. En parallèle, il cherche à développer des thérapies innovantes capables de réguler et de maîtriser ce processus complexe. En réalisant cette double démarche, nous espérons ouvrir de nouvelles perspectives dans le domaine de la lutte contre les tumeurs solides, en exploitant ces connaissances pour élaborer des approches thérapeutiques plus efficaces et ciblées. Ces traitements seront conçus pour surmonter la résistance initiale souvent observée vis-à-vis des immunothérapies. Ils agiront en transformant une tumeur qui, au départ, ne répondait pas favorablement envers ces traitements en une tumeur réceptive, permettant ainsi une meilleure efficacité des immunothérapies. Cette approche novatrice vise à contourner les obstacles initiaux et à ouvrir la voie à des réponses positives là où elles étaient auparavant limitées, potentiellement révolutionnant ainsi le traitement des tumeurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à ces types d’interventions : - 4 à 6 injections en intraveineuse/sous-cutanée/intra-tumoral, sur animaux anesthésiés. Cet acte ne dure que quelques secondes. - 3 à 6 injections en intra-péritonéal, sur animaux vigiles. Cet acte ne dure que quelques secondes. - 1 à 3 prélèvements sanguins au niveau de leur queue, sur animaux vigiles. Cet acte dure quelques minutes. - 1 à 3 prélèvements sanguins en rétro-mandibulaire, sur animaux anesthésiés. Cet acte dure quelques minutes. - 1 prélèvement sanguin en rétro-orbital ou rétro-mandibulaire, sur animaux anesthésiés. Cet acte dure quelques minutes et est sans réveil. - 1 injection intra-péritonéale de buprénorphine. Cet acte dure quelques secondes. - 1 à 3 injections intra-péritonéales d’un anesthésique. Cet acte dure quelques secondes. - 1 anesthésie locale par injection sous cutanée d'une solution d’anesthésique. Cet acte dure quelques secondes. - 1 irradiation (générateur X, dose 2 Gy) ou 1 injection de busulfan dilué en solution saline. Cet acte dure quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont particulièrement liés à la croissance tumorale. En effet, l’ensemble des traitements utilisés sur les animaux ont été déjà publiés dans la littérature comme étant bien tolérés par les animaux dans les lignées de souris que nous utilisons. Ainsi, hormis les nuisances sporadiques parfois observées sur les animaux saints, l’initiation des possibles nuisances se fera à partir du début des expériences et pourra donc être promptement suivie. Certaines souris sont viables et fertiles, mais 25 % à 60 % ou plus développeront spontanément des mélanomes avec un début à l'âge de 2 à 12 mois. L'application topique d’une molécule entraîne le développement de lésions cutanées pigmentées en 21 à 28 jours, qui évoluent en mélanomes. D’autres souris développant des tumeurs mammaires spontanément, les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et poursuivre les éventuels signes de souffrance ou de stress. Les souris femelles d’un certain génotype développent des tumeurs au niveau de toutes les glandes mammaires (m1 à m10) avec un temps de latence moyen de 92 jours. Les tumeurs apparaissent progressivement à partir de 15 semaines jusqu’à un point limite vers 25 semaines. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales en sous-cutanées (cancer du sein, mélanome) sont : nécrose, uclération et saignements de la tumeur, gène à la locomotion et baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie, perte de poids. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales du cancer du poumon sont : perte de poids, difficultés respiratoires, baisse de la tonicité dans les derniers stades de la maladie. Les nuisances liées aux injections des thérapies et aux prélèvements sont égales à la douleur causée par l’insertion d’une aiguille. Cet inconfort est léger et passager. Les traitements utilisés n’induisent pas de réaction adverse chez la souris. Une autre lignée (phénotype dommageable) sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection, dans une cage individuelle sur portoir ventilé, la litière sera autoclavée, l’eau et les aliments irradiés, le matériel en contact avec les animaux sera au préalable autoclavé ou décontaminé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car la plupart d’entre eux seront porteurs de tumeurs. De plus les animaux “contrôles”, non porteurs de tumeur, devront être mis à mort car nous nous intéressons aux cellules présentent dans les organes et nous devons absolument mettre les animaux à mort pour récupérer ces organes.

Remplacement

Dès qu’il est possible de remplacer un modèle murin par une approche in vitro, comme la culture cellulaire ou la création d'organoïdes en 3D, nous opterons pour cette solution, comme nous l'avons déjà fait par le passé. Les diverses thérapies cellulaires seront systématiquement soumises à une validation in vitro avant toute autre étape. Cependant, il est important de noter que ni les modélisations mathématiques ni les systèmes in vitro ne permettent actuellement d'étudier de manière exhaustive l'infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs ainsi que les réponses immunitaires anti-tumorales qu'elles déclenchent. Par conséquent, le modèle murin demeure un élément incontournable de ce projet, puisqu'il est le seul à permettre l'étude approfondie de l'infiltration immunitaire au sein des tumeurs et des réponses anti-tumorales qu'elle engendre. L'utilisation de souris s'avère essentielle pour tester de nouvelles thérapies anti-cancéreuses qui réactivent le système immunitaire, ouvrant ainsi la voie à des avancées significatives dans le domaine de la lutte contre le cancer.

Réduction

Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animaux. Les expériences de croissance de tumeurs seront effectuées avec 7 animaux en accord avec les calculs de puissance statistiques. Les résultats seront analysés par tests statistiques non paramétriques ou l’analyse de la variance . En outre, nous utiliserons des animaux mâles et femelles pour réduire le nombre d’animaux respirant non impliqués dans des expérimentations dans les lignées de souris génétiquement modifiées.

Raffinement

Une lignée de souris étudiée développe des tumeurs mammaires très progressivement sur 5 mois. La stratégie d’élevage participe au raffinement du projet, elle repose sur le croisement de femelles sauvages avec des mâles hétérozygotes qui développent tardivement des tumeurs mammaires (donc sans phénotype dommageable pendant la période d’utilisation comme reproducteurs. Les expérimentations avec une lignée de souris seront réalisées avant que les tumeurs se développent spontanément (à partir de 2 à 12 mois). Dans ce cadre nous utiliserons les souris mâles et femelles pour l'expérimentation. Les animaux seront régulièrement surveillés, et en cas d'apparition inattendue de tumeurs, ils serviront à standardiser

Choix des espèces

La souris se révèle être le modèle privilégié pour les expérimentations dans le domaine de l'onco-immunologie et de la thérapeutique du cancer. Ceci est principalement dû à la connaissance approfondie du génome murin, ce qui permet de tirer parti de nombreux outils soigneusement caractérisés. Parmi ceux-ci figurent les souris génétiquement modifiées pour exprimer des protéines spécifiques d'intérêt, ainsi qu'une variété étendue de modèles de tumeurs transplantées. La souris présente des avantages pratiques significatifs. Elle est aisément manipulable, dispose d'une courte période de gestation et peut donner naissance à plusieurs individus par portée, ce qui crée des conditions d'élevage optimales pour les expériences. Grâce à sa grande similitude génétique avec l'Homme, il est envisageable de transférer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Cette corrélation renforce la pertinence des découvertes réalisées avec les souris, ouvrant la voie à des avancées cliniques prometteuses dans la lutte contre le cancer. Les animaux seront mis en expérimentation entre 8 et 14 semaines après leur naissance, car c’est l’âge à partir duquel ils auront atteint le stade « adulte » et que leur système immunitaire sera pleinement développé.

Prélever du sang et du liquide céphalo-rachidien pour valider des appareils de mesure et fournir des produits sanguins à d'autres laboratoires : la finalité déclarée relève de la mise au point de méthodes d'analyse pour des études réglementaires. 500 souris, 500 rats, 200 chiens, 100 lapins, 200 ouistitis et tamarins et 200 macaques à longue queue vont être utilisés, 1 360 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 340 sous anesthésie sans réveil. Les ponctions de liquide céphalo-rachidien se font sous anesthésie profonde, avec un risque de hernie par hypertension intracrânienne ou de destruction de la moelle que le porteur qualifie de négligeable chez des animaux en bonne santé. 1 320 animaux repartiront vers d'autres projets, 10 chiens et 10 lapins seront adoptés et 20 macaques rendus à l'élevage, le projet servant aussi à faire pratiquer des prélèvements d'organes à des collaborateurs en formation.

Objectifs

Ce projet a deux objectifs principaux : 1- Prélever des échantillons biologiques afin de valider au sein de notre établissement l’utilisation d’appareils de mesure plus performant, et de développer et d’optimiser des méthodes d’analyses de biomarqueurs d’intérêts majeurs. En effet, afin de garantir la qualité des résultats et la validité des études, un objectif synergique des exigences 3Rs, le développement et la validation de méthodes d’analyses des échantillons biologiques sont nécessaires pour la bonne réalisation des études de sécurité et d’efficacité pré-clinique de médicaments régies par les BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoires). A terme, dans le cadre de ces exigences 3Rs, des appareils et des méthodes d’analyses plus performantes permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour un objectif scientifique donné et de raffiner les procédures expérimentales (par exemple, en réduisant les volumes sanguins prélevés, ou en déterminant des points limites plus précoces). 2- Fournir à la communauté scientifiques des produits biologiques (comme des produits sanguins) pour des études in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet assure le développement et la validation de méthodes d’analyses ou d’identifications de biomarqueurs analytiques d’intérêt majeur dans les études pré-cliniques et indispensables à l’élaboration de tout nouveau médicaments actuellement. Il permet la mise en application dans le cadre d’études réglementaires régies par les BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoires) d’appareils ou de méthodes d’analyses biochimiques, hématologiques, histologiques ou encore immunologiques plus fiables et plus précises. Il permet d’assurer un suivi plus spécifique des effets d’un produits en cours d’essai chez l’animal, ce qui apporte au moins deux bénéfices majeurs : 1) détecter plus rapidement les effets délètères pour la santé des animaux modèles (et donc anticiper des lésions sévères avant que l’impact sur le bien être devienne significatif) et 2) augmenter notre capacité à détecter de potentiels effets toxiques en amont des phases de test cliniques chez l’humain. De plus, il permet de développer des méthodes réduisant les volumes prélevés nécessaires lors des analyses de biomarqueurs, ainsi que les fréquences de prélèvement chez l’animal. Enfin, en particulier dans le cadre des prélèvements d’organes, il permet d’assurer une formation sous tutorat de collaborateurs ayant acquis les bases théoriques des gestes techniques mais nécessitant de pratiquer ces gestes et ce sans utiliser d’animaux à dans ce seul but. Ainsi, ce projet permet l’optimisation continue de la qualité des données expérimentales des études précliniques et les respects des exigences 3Rs de réduction (liées à la qualité des études) et de réduction et de raffinement (réduction de la fréquences et des volumes d’échantillons biologiques nécessaires).

Procédures

Les animaux sont soumis à des prélèvements sanguins vigiles ou anesthésiés ainsi qu'à des prélèvements de liquides céphalo-rachidien sous anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins (majoritaires au cours de ce projet) ne constituent pas de risque sévère pour la santé des animaux, d’autant plus car ils sont effectués dans le cadre des lignes directrices EFPIA / ECVAM (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations / European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development. Le prélèvement de LCR, lorsqu’il est effectué par un personnel qualifié sur un animal en bonne santé ne présente que peu de risques de complications sévères. Les complications les plus susceptibles d’avoir lieu sont celles lié à l’anesthésie (prévenu en utilisant un protocole d’anesthésie mis en place par un vétérinaire), et le risque d’une hernie en cas d’hypertension intracrânienne (risque négligeable lorsque le geste est pratiqué sur des animaux en bonne santé). Les complications plus rares peuvent apparaitre (une destruction accidentelle de la moelle ou du rachis cervical rostral lors de ponction par voie haute et une infection du système nerveux central par introduction de germes lors de l’acte) mais ne sont pas attendus en raison de la réalisation du geste par un personnel compétent.

Devenir

Les animaux seront soit utilisés dans d'autres projets autorisés par le MERS, soit adoptés lorsque cela est possible (sur avis vétérinaire).

Remplacement

Lorsque cela est possible, le développement et la validation d’appareils ou de méthodes analytiques sont faits en utilisant des substitues au sang. Ces substitues peuvent être des solutions de contrôles chimiques reconstitués (surtout dans le cadre de dosages biochimiques), ou encore des contrôles humains délivrés par le fournisseurs des appareils. Ces échantillons reconstitués permettent de remplacement les échantillons de sang frais prélevés chez l’animal.

Réduction

Dans le cadre des études pré-cliniques, des prélèvements sanguins sont nécessaires avant que ne commencent l’étude, c’est-à-dire avant l’administration du produit testé. Lorsque les volumes de sang prélevés le permettent, le sang (et ses dérivés : plasma, sérum) non utilisé dans le cadre de l’étude est récupéré pour ce projet, réduisant ainsi le nombre d’animaux naïfs nécessaire. De plus, l’utilisation d’échantillons chimiques reconstitués (voir 3.3.6.1 Remplacement) en lieu et place de sang frais permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Lors des prélèvements d’organes, les animaux utilisés seront le plus souvent des animaux ré-utiliser d’autres procédures (après validation par un vétérinaire), afin de ne pas sacrifier un animal uniquement pour récupérer ces organes.

Raffinement

Le prélèvement sanguin est une procédure peu invasive et peu douloureuse d’autant plus lorsqu’elle est effectuée par du personnel expérimenté selon les lignes directrices EFPIA / ECVAM (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations / European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development.. De plus, un prélèvement sous sédation peut être effectué, afin de limiter le stress induit par la contention manuelle ou des lésions vasculaires lorsqu’un animal est agité. Dans le cas de prélèvements sanguins répétés, une crème anti-hématome ou analgésie peut être utilisée. Dans la cadre des prélèvements de LCR, une anesthésie générale (avec une analgésie adaptée mise en place par un vétérinaire) est nécessaire et un suivi post-prélèvement est mis en place : évaluation de son état de santé, surveillance de l’animal jusqu’à son réveil complet, mis à disposition de dispositifs chauffants (tapis, lampe) lors de la phase de réveil, administration d’une analgésie adéquate si nécessaire. En cas de doute sur l’état de santé de l’animal prélevé, un examen clinique évaluant spécifiquement les fonctions neurologiques de l’animal est mis en place à son réveil par un vétérinaire afin de prendre en compte le plus tôt possible l’apparition de complications impactant le bien-être et de mettre en place une stratégie adaptée. Pour ces procédures, un suivi vétérinaire dans la cadre de la Structure en charge du Bien-Etre animal est effectué sur les animaux utilisés, afin de s’assurer de lors bon état de santé. Si animal voit son état de santé se dégrader, indépendamment ou non des procédures, il est immédiatement exclu des procédures de prélèvements et un traitement adéquat est mis en place sous la responsabilité d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Les études de sécurité et d’efficacité pré-clinique sont des études réglementaires (régies par les lignes directrices ICH M3(R2) et ICH S3A) in vivo qui nécessitent l’utilisation d’au moins deux espèces différentes (rongeur et non rongeur). Les études visant en particulier le système immunitaire sont réalisées chez le primate non humain pour sa proximité avec l’homme et donc la fiabilité des résultats obtenus. Ce projet est destiné à développer et optimiser des appareils et méthodes d’analyses utilisés dans le cadre de ces études pré-cliniques. Ainsi, les espèces choisies dans le projet sont les animaux utilisés dans le cadre de ses études et choisis comme étant le modèle le plus pertinent pour évaluer la toxicité de la candidat médicament testé. Les animaux utilisés seront les mêmes que les animaux ensuite utilisés en études. Pour les rongeurs et lapins, à partir de 6 semaines. Pour les chiens, à partir de 6 mois. Pour les macaques, à partir de 2 ans et pour les marmousets à partir d’un an.

714 souris vont être utilisées, dont 414 anesthésiées puis tuées sans réveil pour prélever une partie de leur système nerveux central, les autres passant 75 minutes par jour, deux jours de suite, dans une enceinte hermétique de mesure respiratoire. Juvéniles puis adultes, elles reçoivent deux solutions par le nez sous anesthésie, à 48 heures d'intervalle, alors que le porteur reconnaît chez ces mutantes du syndrome d'Ondine une sensibilité accrue à l'anesthésie et un risque accru de défaillance respiratoire. Une biopsie de la queue leur est prélevée pour génotypage. Les bénéfices sont renvoyés à l'identification de "nouvelles pistes thérapeutiques" pour les personnes atteintes, l'objectif immédiat restant de mesurer l'effet de la leptine sur la commande respiratoire.

Objectifs

Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration, ils surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré). Cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. Elle est produite par les neurones du cerveau qui composent la commande centrale respiratoire. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie, ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide respiratoire dès qu’elles s’endorment. Le bon fonctionnement des cellules de la commande centrale respiratoire, sensibles aux variations de CO2, dépend de l’expression d’un gène codant pour une protéine spécifique. Si le gène est muté, la protéine a une mauvaise structure et devient non fonctionnelle. Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC, le syndrome d’Ondine et leurs souris contrôles (sauvages). Une approche utilisée chez des souris nouveau-nées permettra d’étudier la commande centrale respiratoire et de déterminer la concentration de leptine, un stimulant respiratoire, la plus efficace, capable d’augmenter l’activité du réseau neuronal respiratoire qui compose la commande. Chez des mêmes souris juvéniles puis adultes, l’approche utilisée est non invasive. Elle permettra de déterminer l’effet bénéfique de la leptine, à la concentration la plus efficace sur la ventilation et la réponse respiratoire au CO2. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment la leptine impacte la respiration. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC.

Bénéfices attendus

Les souris mutantes modèles de la maladie que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie. A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie. Cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. L’utilisation de la leptine, connu comme stimulant de la respiration pourrait : 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cellules et les molécules cibles de la leptine au niveau de la commande respiratoire localisée dans le cerveau et 2/déterminer si ces cellules et molécules cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment la leptine impacte la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.

Procédures

Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité du modèle animal à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. Les souris mutantes et contrôles nouveau-nées sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées par une méthode réglementaire afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. D’autres souris juvéniles puis adultes seront anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant (pendant 10 minutes maximum) puis recevront l'administration par voie nasale deux solutions (faible volume par narine ; en 10 minutes par souris). 48 heures séparent les deux administrations. D’autres souris juvéniles puis adultes recevront par nébulisation les deux solutions. 48h sépareront les deux administrations. La mesure des variables respiratoires chez les souris juvéniles et adultes sera réalisée de façon non invasive pendant 75 min (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu. Une biopsie caudale (au niveau de la queue, inférieure à 2 mm) est réalisée chez les souris nouveau-nées/juvéniles pour génotypage.

Impact sur les animaux

Le prélèvement caudal réalisé une unique fois chez l’animal pour la détermination de son génotype apparaît comme une source de douleur et de stress. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale des deux solutions peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements post-mortem et analyses nécessaires.

Remplacement

L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur des souris vivantes. L’étude de l’influence des systèmes leptinergiques sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par la leptine ne peut être réalisée que sur des souris vigiles, non contraintes et non anesthésiées.

Réduction

Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles (714 animaux au total) dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux mutants et sauvages (contrôles). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et permet de mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes. L'isolement est évité au maximum. Le milieu des animaux est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Cependant il est possible que certains animaux se retrouvent isolés pour des contraintes zootechniques (agression entre congénères, etc...). Dans ce cas, la structure chargée du bien-être animal sera toujours sollicitée pour trouver la solution la plus adaptée et la moins contraignante pour les animaux (enrichissement supplémentaire si l’isolement est validé, possibilité de rassemblement, etc.). L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des administrations intranasales sous anesthésie. De ce fait, lors de ces administrations sous anesthésie, une surveillance accrue en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris. En cas de défaillance cardiorespiratoire, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée si nécessaire. Les points limites sont les suivants : -tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire -modification du comportement caractéristique d’une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et ou terne, prostration, dos voûté) -anomalies pouvant entraîner une douleur intense ou une souffrance, par exemple un amaigrissement de l’animal par constat visuel, plaies et ulcères, tumeurs, fractures… Les points limites définis ci-dessus sont assortis d’une surveillance adaptée des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la respiration par la commande centrale respiratoire. Le modèle animal de la pathologie sur laquelle nous travaillons, n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour un gène, présent sur des neurones impliqués dans la sensibilité au dioxyde de carbone (hypercapnie). Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues que par un travail sur les souris mutantes et leur contrôle, des souris sauvages ; étude de l’influence de la leptine sur la commande centrale respiratoire ex vivo ; étude de la ventilation chez l’animal juvénile et adulte vigil et de l’influence de la leptine appliquée par administration intranasale et par nébulisation.

Abordées chirurgicalement sous anesthésie générale pour recevoir de la bléomycine directement dans la trachée, 228 souris vont être utilisées, 20 tuées avant tout réveil et 208 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à J14 pour analyse des poumons, après cinq séances d'imagerie par tomographie de trente minutes. La fibrose ainsi provoquée sert à tester si une protéine, CD146, peut devenir une cible thérapeutique dans la sclérodermie systémique. Le porteur décrit une douleur et une perte de poids possibles après la chirurgie, et annonce vouloir mettre au point une instillation non chirurgicale pour "limiter la morbimortalité des souris", reconnaissant ainsi que la technique employée aujourd'hui en tue une partie.

Objectifs

La sclérodermie systémique (ScS) est une pathologie auto-immune caractérisée par une mauvaise fonction des petits vaisseaux sanguins responsables d’une inflammation cutanée et fréquemment pulmonaire. L’atteinte pulmonaire, appelée fibrose, est responsable d'une toux et essoufflement handicapant des patients pouvant aboutir au décès. Cette atteinte représente la principale cause de décès et son mécanisme reste mal connu. CD146 une protéine impliquée dans la formation des vaisseaux été récemment identifiée comme une nouvelle piste thérapeutique dans la ScS. Nous avons montré dans l’atteinte cutanée chez l’humain et dans un modèle de sclérodermie cutanée induite par la bléomycine (agent profibrosant), que CD146 était impliqué. Ces résultats nous conduisent aujourd’hui à poser l’hypothèse du rôle de CD146 dans la fibrose pulmonaire sclérodermique et d’en étudier le mécanisme. Pour cela nous comparerons le développement d’une fibrose pulmonaire induite par la bléomycine entre des souris saines et des souris pour lesquelles le gêne CD146 a été inactivé. Nous étudierons les mécanismes impliqués et évaluerons l’efficacité d’un traitement par CD146 afin de prévenir ou diminuer la fibrose pulmonaire. Ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la fibrose pulmonaire de la ScS et de proposer CD146 comme nouvelle piste thérapeutique pour le traitement des patients.

Bénéfices attendus

L‘évaluation du rôle de la protéine CD146, une protéine impliquée dans la formation des vaisseaux, dans notre modèle murin de fibrose pulmonaire permettra d’approfondir les connaissances dans le domaine de la fibrose pulmonaire de la sclérodermie systémique. La mise en évidence d’une telle voie physiopathologique et d’un tel marqueur permettra d’obtenir un outil d’évaluation et pronostic simple pour les patients atteints de sclérodermie avec fibrose pulmonaire mais surtout de développer des thérapeutiques ciblées sur CD146 dans cette population à haut risque de mortalité.

Procédures

Les animaux seront soumis à une instillation intratrachéale, qui dure 10 minutes, de bléomycine (un agent profibrosant) ou sérum physiologique sous anesthésie générale par voie chirurgicale. Nous tenterons également de mettre au point un modèle par instillation par voie non chirurgicale afin de limiter la morbimortalité des souris. Les animaux auront une imagerie, qui dure 30 minutes,par tomographie par emission de positons à J-1 , J0, J3, J7 et J14 sous anesthésie générale. A J14, les animaux seront euthanasiés après anesthésie générale pour analyse des poumons

Impact sur les animaux

Du fait de l’instillation intratrachéale d'un agent profibrosant, une douleur et une perte de poids pourront suivre la chirurgie. Une surveillance particulière sera réalisée. Le protocole sera arrêté si l'animal présente des difficultés à respirer, s'il est prostré ou si la perte de poids de l'animal est supérieure ou égale à 20%. Grille d'évaluation de la douleur permettant de reconnaître la douleur, de la quantifier et d’agir. Au moyen de cette grille, nous déterminerons un score régulièrement (3 fois/semaine). Ainsi, selon le score obtenu, l'analgésie peut- etre effectuée (score 4 à 9). Si le score est élevé (10 à 20) : l’arrêt de l’expérimentation par mise à mort de l’animal sera immédiate.Grille d'évaluation de la douleur permettant de reconnaître la douleur, de la quantifier et d’agir.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyse histologique des tissus.

Remplacement

Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux. Malgré les stratégies de remplacement mises en place dans le projet, ces dernières ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique. Par ailleurs, les animaux génétiquement modifiés (souris transgéniques et knockouts) représentent un atout majeur pour l’obtention de résultats les plus pertinents relatifs à la compréhension des maladies humaines. Ainsi, l’expérimentation animale utilisant des souris sauvages et génétiquement modifiées est indispensable à l’étude intégrée des phénomènes physio-pathologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d’animaux en fonction des données disponibles dans littérature. L’objectif sera d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence une différence entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre tout en réduisant le nombre d’animaux au minimum nécessaire. Un dernier lot d’animaux sera nécessaire afin d’optimiser la procédure et limiter la souffrance. Le protocole initial et tel qu’il est décrit dans la littérature consiste en une instillation intra-trachéale par voie chirurgicale. Au cours de l’étude nous nous efforcerons de mettre en place une technique non chirurgicale par intubation en passant par les voies naturelles. Cela limitera la mortalité mais aussi la morbidité liée à la douleur tout en garantissant une technique d’induction aussi efficace. Afin de limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal, tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions reliées à l'étude, des stratégies ont été mises en place. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale les données obtenues sur chaque animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Des stratégies d’optimisation sont mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse.

Raffinement

L'induction trachéale s'effectue sous anesthésie des souris à la kétamine/xylazine par voie intra-péritonéale, avec injection de buprénorphine 30 minutes avant l'incision et d'une anesthésie locale de la souris par injection sous-cutanée de lidocaïne 5%. Du fait de l’instillation intratrachéale de bléomycine, une douleur et une perte de poids pourront suivre la chirurgie. Une surveillance particulière quotidienne sera réalisée. Le protocole sera arrêté si l'animal présente des difficultés à respirer, s'il est prostré ou si la perte de poids de l'animal est supérieure ou égale à 20%. Au moyen de la grille d'évaluation de la douleur, nous déterminerons un score régulièrement (3 fois/semaine). Grille d'évaluation de la douleur permettant de reconnaître la douleur, de la quantifier et d’agir. Ainsi, selon le score obtenu, l'analgésie peut- etre effectuée (score 4 à 9) par administration de buprénorphine .Nous nous efforcerons de mettre au point une technique non invasive par instillation à travers une sonde d’intubation oro-trachéale. Ainsi aucune douleur et gêne ne pourra être attribuée à l’induction, limitant ainsi la douleur et les décès pour la procédure.

Choix des espèces

Les souris utilisées seront des souris mâles et femelles C57bl/6. Nous utiliserons ces souris car c’est l’espèce de souris la plus utilisée dans la littérature pour le modèle murin de fibrose pulmonaire induit par bléomycine. En effet les thérapeutiques disponibles actuellement ont été évaluées sur un modèle murin de fibrose pulmonaire. L’utilisation de cette espèce nous garantit donc des résultats analysables et extrapolables aux données déjà disponibles dans la littérature. Les souris seront à un stade adulte, elles auront ainsi entre 8 et 12 semaines lors de l’induction, cet âge est celui utilisé dans la littérature pour l’induction de fibrose pulmonaire.

222 souris gestantes sont immobilisées sous une lumière vive, trois fois par jour, trente minutes par séance, six jours de suite. 4 002 souris vont être utilisées, 2 304 dans des procédures menées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 1 698 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec prélèvement de fœtus à E15 et E18,5 puis mise à mort des souriceaux à plusieurs âges. La plupart des souris de la première génération sont tuées pour prélever les organes, les géniteurs non stressés étant proposés à d'autres équipes puis tués si personne ne les reprend, le tout pour mesurer l'effet du stress maternel sur les neurones du toucher affectif. 1 008 souris passent des tests d'anxiété, d'état dépressif et de sensibilité mécanique qualifiés de non invasifs, sans qu'aucun soit nommé, celui de l'état dépressif durant trois heures.

Objectifs

Le toucher est un sens qui comprend non seulement la perception tactile de son environnement, mais également une composante émotionnelle et motivationnelle appelée toucher affectif. Cette composante est notamment très importante pour le développement social des individus. Dans la peau, cette composante émotionnelle de l'information tactile est dépendante de l'activation d'une population de neurones sensitifs spécialisée appelée les fibres C mécanoréceptrices à bas seuil d'activation ou C-LTMRs. Chez l'homme une altération de ce toucher affectif peut aboutir à des comportement d'isolement social (trouble du spectre autistique) associés à des états anxieux et/ou dépressifs. Il a été montré chez la souris que l'activation spécifiques des C-LTMRs est suffisante pour engendrer une augmentation des interactions sociales. Le développement des C-LTMRs intervient chez la souris entre le jour embryonnaire E13, où les précurseurs neuronaux commencent à se différencier, pour se poursuivre jusqu'à plusieurs jours après la naissance. La période prénatale est une période critique durant laquelle tous les systèmes physiologiques, y compris le système nerveux, développent leurs fonctions spécifiques et apprennent à s'adapter aux éventuels stimuli déclencheurs. Nous avons récemment mis en évidence chez la souris qu’un stress prénatal (c'est à dire subit par la mère durant la gestation) entraine à la fois une hypersensibilité mécanique, mais aussi une modification transcriptomique profonde dans les neurones sensitifs, notamment de gènes spécifiques des C-LTMRs. Nous émettons donc l'hypothèse que le stress prénatal pourrait induire une perturbation du développement des cLTMRs chez la descendance, et donc perturber le sens du toucher et donc le développement des interactions sociales chez les souris nées de mères stressées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de possiblement mettre en évidence l'effet du stress prénatal sur la susceptibilité des individus à développer des troubles du comportement anxieux/dépressif, ainsi que des troubles du comportement social. Il explorera également pour la première fois les mécanismes biologiques sous-jacents, en se concentrant sur le développement des neurones sensoriels périphériques, notamment les c-LTMRs. Il apportera donc des informations cruciales sur les effets du stress subit par la mère durant sa grossesse sur le développement des organes sensoriels de l'enfant, et sur le remodelage des comportements qui pourraient en découler.

Procédures

Procédure 1 : Modèle de stress prénatal Les souris seront mises en stress de contention sous une lumière vive, 3 fois par jour, 30 minutes par session, sur 6 jours consécutifs (222 animaux) . Procédure 2, 5 et 6 : Les animaux subiront des tests comportementaux (1008 animaux) non invasifs visant à évaluer l'état d'anxiété (durée des tests, 10 minutes et 30 minutes), l'état dépressif (durée du test, 3h) , et la sensibilité mécanique (stimulation de 1s maximum). Procédure 5 : les nouveaux nés seront injectés sous anesthésie par le froid et par voie intrapéritonéale (durée de l'injection, 3 secondes maximum) . A l’âge adulte ils seront injectés par voie intrapéritonéale (576 animaux). Procédure 6 : Les souris seront injectées en intra-péritonéal (durée de l'injection, 2 secondes maximum) avant chaque session de stress, voire trois fois par jour, sur 6 jours consécutifs (36 animaux)

Impact sur les animaux

Dans le projet proposé, les souris subiront des tests pas ou peu invasifs. Bien que nous n’ayons pas observé de nuisance qui perturberaient le comportement soit de la mère stressée, soit de la descendance dans les expériences que nous avons déjà fait en accord avec le protocole éthique précédent utilisant ce modèle, les souris seront accompagnées et suivies et observées régulièrement (au moins une fois par jour), pour détecter la présence de comportements anormaux (prostration, isolement, absence de nettoyage). L'injection de l'inhibiteur de corticosterone sera également contrôlée (fréquence, dose, etc.) d’autant que la corticostérone joue un rôle clé durant la gestation. Nous utiliserons des doses déjà validées dans la littérature et suivront attentivement l'état des souris et souriceaux.

Devenir

La plupart des animaux de la 1ère génération (F1) sera euthanasiée à l'issu des procédures, pour récupérer les organes d'intérêt. Les souris mâles, et femelles non stressées ayant servi de géniteurs seront proposés à la communauté, et euthanasié si non utilisés.

Remplacement

Ce projet vise à identifier les mécanismes biologiques induits par l'exposition au stress durant la gestation. Il n'existe à ce jour aucun modèle cellulaire qui peut remplacer l'usage d'animaux pour investiguer cette thématique. La substitution par l'humain n'est pas évidente, étant donné d’une part que le niveau de stress est relatif à chaque personne (ce qui sera source de variabilité pour notre étude), et l'accès à des neurones sensoriels de foetus ou de mamans durant la gestation n'est pas possible. Le modèle murin est donc un élément clé et incontournable pour étudier l'effet du stress prénatal sur le développement des neurones sensoriels et sur les comportements associés.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans le modèle de stress prénatal (protocoles éthiques obtenus précédemment) et la présence de data préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 12 mères par groupe, par génotype, réparties entre contrôle et stress. Ce nombre pourra éventuellement varier à la hausse ou à la baisse (+/- 3 animaux par groupe) en fonction des résultats expérimentaux obtenus avec chaque génotype analysé pour chacun des modèles étudiés. Ces femelles seront accouplées avec 8 mâles aux génotypes correspondants, pour un rapport 2 mâles / 3 femelles . Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées, . L’utilisation de vecteur viraux pour permettre l’expression de gènes d’intérêt dans les souris permettra également d’éviter le recours à des lignées de souris transgéniques supplémentaires.

Raffinement

Jusqu'à présent, le taux de mortalité lors des expériences proposées n'atteint pas les 0.1%. Lors de la mise en place des procédures expérimentales, l’état clinique des animaux sera monitoré tous les jours. Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, les souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Lors du suivi quotidien des souris, nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels qu’un comportement anormal (mouvement stéréotypés, isolement du groupe), la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Nous examinerons également la présence de problèmes visibles (plaies cutanées étendues, dents longues, prolapsus anal). Si nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien un comportement apathique, des plaies trop importantes ou la présence de dents longues ou de prolapsus, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines, surtout l'inflammation de la peau (taux de similarité important). En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués transgéniques, qui dans notre cas, permettront l'étude du rôle des C-LTMRS et l'effet du stress sur ces cellules. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sont déjà disponibles dans le laboratoire. L'utilisation de méthodes alternatives (ex. avoir recours à des biopsies humaines, etc. sera d'un grand intérêt mais cependant limite le projet, étant donné que les niveaux de stress sont relatifs à la personne en question, ce qui apportera une variabilité dans nos analyses. Trois stades/périodes de développement seront d'intêret durant notre projet: Jour embryonnaire (E) 13 à E18 : Cette période de gestation sera la période durant laquelle les sessions de stress seront conduites. Cette période correspond également à la période de développement des neurones Jour embryonnaire E15, E18,5: Les souris gestantes seront euthanasiées et les foetus prélevés, euthanasiés et analysés pour nos études, pour évaluer l’impact du stress sur la différenciation neuronale in utero. Jour post-natal P0, P5, P21 et P56 : Les souriceaux ou souris adultes de premieère génération seront euthanasiées à ces différents temps pour étudier l’impact du stress sur la maturation des neurones cLTMRs innervant la peau qui se déroule durant cette periode (P0 à P21) puis à l’age de jeune adulte (P56) .