Procédures sans réveil

Deux chirurgies crâniennes de quarante minutes par animal, puis des séances d'enregistrement cérébral de cinq heures sous anesthésie profonde : 2 377 souris vont être utilisées, toutes tuées pour le prélèvement de leur cerveau. Pour 1 015 d'entre elles, les procédures sont menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil, les 1 362 autres subissant un niveau de souffrance modéré. Entre les opérations, elles passent vingt à quarante jours de tests, consommation de nicotine en cage individuelle, exploration, locomotion, anxiété et interactions sociales, pour cartographier les circuits cérébraux de la dépendance au tabac. Le porteur écarte le rat et le singe au motif que les outils génétiques y sont trop peu nombreux, et retient la souris parce qu'elle vit en groupe, ce qui permet d'étudier chez elle l'effet de la nicotine sur les rapports sociaux.

Objectifs

Le tabagisme est la première cause de mortalité évitable au monde (OMS). L'usage de la nicotine peut entraîner une dépendance par le biais de processus complexes qui sont régulés à la fois par ses effets récompensants et par ses effets aversifs. L’effet primaire de la nicotine sur le système nerveux central est d’activer les récepteurs de la nicotine, modifiant ainsi l’activité électrique des neurones. Ces récepteurs sont normalement activés par une molécule fabriquée par le cerveau : l’acétylcholine. Identifier et comprendre le rôle des différents récepteurs nicotiniques et des voies neuronales dans la transmission des effets récompensants et aversifs de la nicotine est crucial à la compréhension des mécanismes de la dépendance au tabac et au développement de nouvelles thérapies. Nous nous focaliserons sur deux voies distinctes. Premièrement, la voie de la résompense, qui fabrique de la dopamine et est impliquée dans les phénomènes de renforcement aux drogues et de motivation, mais aussi dans les effets anxiogènes de la nicotine. Nous étudierons cette voie dans le contexte du lien entre addiction à la nicotine et interactions sociales. Deuxièmement, nous étudierons une voie qui joue un rôle clé dans l’aversion à la nicotine et également un rôle de frein sur les proprétés récompensantes de la drogue. Le lien fonctionnel entre ces deux voies reste à élucider, et c’est l’objectif de ce projet.

Bénéfices attendus

La dépendance à la nicotine demeure un problème majeur de santé publique dans le monde entier, et les traitements pour les fumeurs qui veulent arrêter de fumer ne restent que marginalement efficaces. L'usage de la nicotine peut entraîner une dépendance par le biais de processus complexes qui sont régulés à la fois par ses effets récompensants et par ses effets aversifs. En fait, les humains comme les animaux de laboratoire régulent leur consommation de nicotine lorsqu’ils s’auto-administrent de la nicotine, en jouant sur cette balance renforcement/aversion. Identifier et comprendre le rôle spécifique de certains types de récepteurs nicotiniques et de certaines voies neuronales dans la transmission des effets récompensants et aversifs de la nicotine est crucial à la compréhension des mécanismes de la dépendance au tabac et au développement de nouvelles thérapies.

Procédures

1) Chirurgies réalisées sous anesthésie générale (durée 40 min), deux fois par animal maximum, avec 1 semaine de récupération entre deux chirurgies. 2) Prélèvement du cerveau : procédure réalisée sous anesthésie profonde (durée 10 minutes) une seule fois par animal. 3) Biopsie de la queue pour génotypage, réalisée une seule fois par animal. Durée 30 secondes. 4) Enregistrements des signaux électriques du cerveau in vivo (durée 5h) : procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie profonde, une seule fois par animal. 5) Tests comportementaux (consommation de nicotine, exploration, locomotion, tests d'anxiété, et interactions sociales), dont la réalisation s’étend de 20 à 40 jours, avec 1 jour de repos minimum entre deux tests. 6) Injections intraveineuse de composés : procédure réalisée sous anesthésie profonde, une fois par animal (durée 5 h).

Impact sur les animaux

Douleurs post opératoire minorées par l’emploi d’antalgiques, s’accompagnant d’une perte de poids durant environ 48 h. Des signes d'infection autour de la zone de chirurgie peuvent apparaître. Pour le test de consommation de nicotine, les animaux sont isolés, ce qui peut les stresser. Douleur légère de courte durée pour les animaux génotypés qui subissent une biopsie de la queue.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés, afin de récupérer les cerveaux pour analyses histologiques et moléculaires, ou bien pour vérifier les sites d’injection.

Remplacement

La mise en place de l’addiction à la nicotine est un phénomène complexe qui fait intervenir plusieurs régions du cerveau et qui entraine des remaniements cérébraux à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition, le maintien et la rechute de ce trouble psychiatrique nécessite de travailler chez l’animal. En effet, les cultures de cellules ne permettent pas de reproduire la complexité des circuits neuronaux qui régissent ces différentes étapes de l’addiction. Ces circuits neuronaux doivent être étudiés soit sur organe prélevé (expériences d’électrophysiologie patch clamp) soit sur animal intact pour préserver les circuits (électrophysiologie in vivo, photométrie fibrée, optogénétique…). Par ailleurs ces expériences de physiologie sont mises au regard des comportements addictifs observés chez les animaux, comportements qui ne peuvent aujourd’hui être modélisés in silico. Par ailleurs, nous étudions l’impact de la nicotine sur les interactions sociales entre souris, et les circuits impliqués, ce qui ne peut être réalisé que chez un animal avec ses congénères.

Réduction

Le nombre d'animaux, pour ce projet, est déterminé sur la base d'une littérature vaste et robuste dans des domaines similaires mais aussi sur notre expertise personnelle en physiologie et analyses comportementales. Afin de minimiser l'utilisation de souris, nous nous imposerons un cahier des charges strict. Pour ce faire, les procédures ont été pensées pour qu'une même souris puisse passer dans un nombre maximum d'expériences (notamment les tests comportementaux) afin de réduire l'utilisation de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. Nous utiliserons dans la mesure du possible tant les souris mâles que femelles, afin d’utiliser toutes les souris issues d’une même portée. Les groupes d’animaux testés seront définis de manière à réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire pour obtenir des résultats robustes, dans les différentes conditions.

Raffinement

Le bien-être des souris est conditionné par la mise en place de protocoles visant à réduire les éventuelles souffrances animales (administration d'analgésique lors de chirurgies ou après agression entre congénères, utilisation d'anesthésique local au niveau des oreilles pour les injections stéréotaxiques). Un tapis chauffant est utilisé lors des chirurgies pour maintenir la température coroporelle constante. L’anxiété des animaux est réduite par un maintien en groupe et par une manipulation régulière. Les jours suivant l’opération chirurgicale, les animaux sont surveillés quotidiennement afin de détecter d'éventuelles infections post-chirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. Les signes de douleur contrôlés sont : apparence générale, alimentation, consommation d'eau, irritation au site de la chirurgie, vocalisation, tremblements, léthargie, agressivité etc.... En cas de signes de douleur (isolement, immobilité, perte de poids de plus de 10%, blessures contaminées, hyper-réactivité quand on le prend, posture, poils hérissés) persistant au-delà de 12h après la chirurgie, nous procéderons à une nouvelle injection d’antalgique et potentiellement à une application locale de pomade antibiotique sur une potentielle plaie infectée. Si les points limite persistent, une grille d’évaluation sera utilisée pour déterminer si l’animal doit continuer à être traité avec des analgésiques, ou euthanasié. Dans le cas où les animaux doivent être isolés (en cas de blessure ou pour enregistrement de consommation de boisson), un abri en carton ainsi que du tissu papier seront déposés dans les cages de manière à enrichir l’environnement des animaux et leur permettre de fabriquer un nid.

Choix des espèces

D’un point de vue anatomique et fonctionnel, les systèmes dopaminergiques et cholinergiques sont bien conservés chez l'ensemble des mammifères et en particulier chez les rongeurs. Plus particulièrement, les afférences cholinergiques sont organisées de manières similaires que chez l'homme. Ce n’est pas le cas chez les invertébrés, les poissons ou les oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulation des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles animaux. L’organisation anatomique des modèles d’invertébrés et poissons est trop différente pour qu'ils puissent être utilisés pour comprendre la modulation cholinergique et dopaminergique. Finalement la souris étant un mammifère social qui vit en groupe, c’est un modèle pratique pour pouvoir étudier le comportement social en groupe chez les animaux sociaux. Des modèles d’autres mammifères sociaux (rat, singe) ne se justifient pas car les outils génétiques nécessaires pour disséquer les mécanismes sous-jacents sont peu nombreux chez ces espèces. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (> 8 semaines) car leur cerveau est complètement développé et les circuits de la récompense sont arrivés à maturité.

Huit cents secondes d'irradiation, puis une greffe de moelle osseuse injectée derrière l'œil : 425 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 150 sous anesthésie sans réveil et 275 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines sont désignées comme donneuses et tuées pour qu'on prélève leurs tibias et leurs fémurs. Les receveuses subissent trois prélèvements sanguins derrière l'œil, deux échocardiographies et des injections d'un produit qui simule une insuffisance cardiaque aiguë, dont le porteur écrit qu'il peut "générer une douleur ou une gêne". Le choix de la souris tient, selon lui, à sa petite taille, à son hébergement aisé et aux similitudes de la défaillance cardiaque avec celle de l'être humain.

Objectifs

Les infections sévères, notamment sepsis, sont un problème majeur de santé publique qui touche près de 50 millions de personnes chaque année dans le monde. Le sepsis est défini comme une infection grave caractérisée par une forte diminution de la pression artérielle et une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Lors d’un sepsis, le système immunitaire est complètement déréglé, et conduit les patients à un état d’immunodépression, c’est-à-dire à une incapacité du corps à combattre une infection. Notre projet s’intéresse à une enzyme qui joue initialement un rôle de régulation de la pression artérielle et potentiellement un rôle immunitaire. Il a été démontré précédemment qu’une augmentation de notre enzyme d’intérêt dans le sang de patients atteint de sepsis coïncidait avec une plus forte mortalité. Il s’agit donc d’un biomarqueur de mauvais pronostique. Des études précédentes ont montré que notre enzyme d’intérêt est également un facteur induisant des modifications délétères du système cardiaque et potentiellement un modulateur immunitaire. Notre étude a 3 objectifs : 1- Déterminer si la suppression du gène codant pour l’enzyme induit une modification de l’immunité et plus précisément si ceci induit un changement des différentes populations de cellules immunitaires dans la moelle osseuse et le sang, 2- Déterminer les taux de l’enzyme dans les différentes cellules provenant de la moelle osseuse dans des conditions physiologique et pathologique, 3- Vérifier si les cellules issues de la moelle osseuse sont une source de libération de l’enzyme dans la circulation lors de situations de dysfonction d’organe.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de comprendre le lien qui existe entre les cellules dérivées de la moelle osseuse et l'enzyme. Ce projet apportera des connaissances dans le domaine et surtout pourra bénéficier aux patients qui souffrent de dysfonctions cardiaques aigues qui auront un traitement plus adapté si une association claire entre l'enzyme et activation immunitaire est connue.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions : Pour l’objectif 1, les animaux vont subir une seule fois une anesthésie générale (30s) puis un prélèvement sanguin (5min après l'endormissement) sera réalisé sur ces souris. Pour l'objectif 2, les souris vigiles recevront une injection d'un médicament ou d’une solution saline, 2x par jours, pendant 2 jours, (1min). Une injection sous anesthésie générale d’un anticorps (30s) puis un prélèvement sanguin (30s) sera réalisé. Pour l'objectif 3, les souris "receveuses" seront irradiées (1x pendant 800s). Les souris « donneuses » seront prélevées au niveau des tibias et fémurs après leur mise à mort. L’injection de la moelle osseuse aux souris « receveuses » se fera sous anesthésie générale. Post-greffe, un prélèvement sanguin sous anesthésie générale supplémenté par un collyre analgésiant (5min x3) et des échocardiographies (10min x2) pour suivre leur fonction cardiaque. A deux mois, même intervention que pour l’objectif 2.

Impact sur les animaux

Pour l’objectif 1, les souris vont subir une anesthésie générale via une injection intra-péritonéale, ce qui pourra induire un stress sur les animaux. Pour l’objectif 2, les animaux subiront des injections sous cutanée en vigile sur une durée de deux jours, pouvant induire un stress chez l’animal. De plus, l'injection du médicament mimera une insuffisance cardiaque aigue ce qui pourrait générer une douleur ou une gêne chez l’animal. Pour l’objectif 3, les animaux seront sujets à différentes injections : intra-péritonéales pour les anesthésies, sous-cutanée pour l’injection d’’un médicament et intra-orbitaire pour la greffe de cellules de moelle osseuse. Ces injections pourront induire un stress et une gêne chez l’animal. Des prélèvements sanguins en rétro-orbitaire seront réalisés sous anesthésie et en appliquant préalablement un collyre analgésiant. Les prélèvements en rétro-orbitaire pourrait générer un stress et une douleur chez l’animal. Enfin, le protocole ISO mimera une insuffisance cardiaque aigue, ce qui pourrait possiblement générer une douleur ou une gêne chez l’animal.

Devenir

Mise à mort des animaux suite au prélèvement rétro-orbitaire pour permettre la récupération des organes (coeur, poumon, foie, rate, rein gauche et rein droit) ainsi que de la moelle osseuse.

Remplacement

Notre objectif est de déterminer le lien entre notre enzyme d'intérêt et les cellules immunitaires dans un contexte de dysfonction cardiaque aigue comme celle qui survient chez les patients souffrant de choc. Les modèles in vitro et organoïdes ne peuvent mimer les phénomènes pathophysiologiques systémiques, c'est-à-dire les mécanismes modifiant les fonctions organiques mis en jeu dans la maladie.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ce nombre par groupe a été déterminé par calcul statistique pour mettre en évidence une différence significative entre les groupes afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisé. Nous optimiserons nos expérimentations en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal. Notre critère de jugement principal est la diminution de la taille du ventricule gauche pendant la contraction du cœur appelé la fraction de raccourcissement du ventricule gauche (paramètre indiquant une dysfonction de la contraction cardiaque).

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions standard d’environnement (22°C, 50% hygrométrie). Les cages sont enrichies de maisons, bâtons à ronger, coton de nidification pour leur permettre d’exprimer tout leur comportement social. Des points limites adaptés et une surveillance quotidienne des animaux permettent de prévenir toute forme de souffrance des animaux. Les protocoles expérimentaux se feront sous anesthésie générale afin d’éviter le plus possible une quelconque douleur chez l’animal. Un collyre analgésique sera utilisé avant chaque injection et chaque prélèvement rétro-orbitaire. Un antibiotique est également utilisé afin de minimiser les risques d'infection post-irradiation. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel de l’animalerie. L’optimisation du protocole inclura une seule anesthésie pour l’évaluation de la fonction cardiaque par échocardiographie et le prélèvement sanguin. Des points critiques et scorés permettant d’objectiver la douleur ou la gêne de l’animal ainsi que les dispositions à suivre en fonction du score obtenu ont été préalablement définis.

Choix des espèces

Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherche. Outre sa petite taille et son hébergement aisé le modèle de dysfonction cardiaque aigue comporte de nombreuses similitudes avec la dysfonction cardiaque chez l’Homme. Des souris mâles de 12 à 20 semaines seront utilisés pour l’objectif 1 et 2 du projet. Et des souris mâles et femelle de 8 à 12 semaines seront utilisés pour l’objectif 3 du projet. L'utilisation des souris jeunes adultes permet d'obtenir des résultats plus fiables et pertinents grâce à leur maturité physiologique, leur homogénéité et leur robustesse.

Plus de 200 souris juvéniles sont anesthésiées et opérées pour qu'on leur prélève le cerveau, sans jamais se réveiller. 246 souris au total vont être utilisées : 210 dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil, et 36 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces dernières, âgées de quatorze à trente-quatre jours, passent vigiles cinq tests destinés à mesurer leur douleur, leur anxiété et leur peur. Le porteur annonce ces cinq tests sans en nommer aucun, et écrit que les réactions d'évitement ou de peur "sont l'objet de l'étude".

Objectifs

Le cerveau du nouveau-né est très vulnérable aux événements indésirables qui peuvent entraver le développement du cerveau et entraîner des troubles du neurodéveloppement (TND), avec des conséquences à long terme à l'âge adulte telles que la schizophrénie, les troubles obsessionnels compulsifs, les troubles anxieux généraux ou les troubles du spectre autistique. Ces TND ont une caractéristique commune, à savoir une anomalie structurelle ou fonctionnelle de l'amygdale. L'amygdale, et plus précisément l'amygdale centrale, est une structure cérébrale impliquée dans le traitement des réponses émotionnelles telles que la peur, l'anxiété et de la dimension affective de la douleur, processus qui sont altérés dans de nombreux TND. L'apparition des troubles du neurodéveloppement a souvent été liée à une neuroinflammation précoce, conséquence directe ou indirecte d’une lésion cérébrale. Par conséquent, la réduction d’une neuroinflammation néonatale ou de ses conséquences au niveau de l'amygdale est un moyen prometteur de réduire ou de prévenir les maladies neurodégénératives. Toutefois, dans les modèles animaux murins le neurodéveloppement postnatal de l’amygdale a été peu étudié, notamment aucune étude longitudinale de l’activité neuronale et du fonctionnement des réseaux astrocytaires dans la période juvénile n’a été réalisée. Ces données en condition physiologiques sont indispensables pour comprendre les altérations induites par une neuroinflammation postnatale indicatrice d’un trouble du neurodéveloppement.

Bénéfices attendus

Les études cliniques démontrent que l’amygdale et ces perturbations sont des marqueurs dans de multiples Troubles du NeuroDeveloppement. Il est donc important de comprendre comment au cours de développement postnatal une atteinte cérébrale néonatale altère à long-terme le fonctionnement de cette structure. En préclinique, il a été démontré qu’une neuroinflammation néonatale a des conséquences au niveau de l’amygdale sans que celles-ci ne soient pleinement caractérisées. Il est donc essentiel, pour comprendre les dysfonctionnements induits par ces atteintes cérébrales néonatales et leur conséquences à long-terme, de comprendre la mise en place structurelle et fonctionnelle des réseaux amygdaliens au cours de cette phase critique du développement postnatal.

Procédures

La majorité des animaux (>80%) seront anesthésiés et subiront une chirurgie d’une durée maximale de 15 minutes pour prélever l'encéphale. Moins de 20% des animaux seront soumis vigile à cinq tests comportementaux évaluant la nociception, l’anxiété et la peur, d’une durée maximale de 10 minutes. Les tests sont espacés d'au moins 24h.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir du stress ou de l’anxiété légère, des douleurs légères, des réactions d’évitement ou de peur qui sont l’objet de l’étude.

Devenir

Les animaux seront soit mis à mort pour prélèvement ou en fin de protocole.

Remplacement

Pour la partie ex-vivo, notre étude porte sur l’analyse de l’activité complexe de réseaux neuronaux et astrocytaire, ainsi que sur leurs interactions, qui ne peuvent être pour le moment reproduits in vitro ou in silico. Concernant la partie de l’étude faisant appel à des tests comportementaux, nous ne pouvons pas avoir recours à des méthodes alternatives pour réaliser un tel projet. Il est nécessaire d’évaluer les différents paramètres comportementaux sur l’animal vigile. En effet la plupart des tests comportementaux réalisés dans le cadre d'un criblage comportemental impliquent une réponse motrice et intégrée de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à l’étude est mathématiquement déterminé afin d’obtenir des résultats faibles et robustes. L'utilisation d'un nombre d'animaux plus faible pourrait induire un biais et ainsi affaiblir les conclusions. Chaque cohorte comportera un ratio 50/50 mâle et femelle afin d’évaluer les potentielles différences liées au genre. L’utilisation d’une technique permettant d’enregistrer l’activité sur l’ensemble de la structure d’intérêt et sur les structures avoisinantes fournira des résultats qui pourront être exploités dans des études ultérieures pour lesquelles ils permettront de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Pour répondre aux besoins comportementaux des animaux, ils seront hébergés en cages collectives avec de l'enrichissement. Cet enrichissement comportera de la frisure et du coton pour qu'elles se fassent des nids de toute splendeur. Des bâtons à ronger seront aussi mis à disposition dans les cages d'hébergement. Enfin, les souris étant des animaux sociaux, elles seront hébergées par cage de 2 à 5. Afin de soustraire les animaux à la souffrance, nous avons mis en place des points limites et les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. De même les modèles précliniques permettant l’étude des troubles du neurodéveloppement sont majoritairement effectuer sur la souris. Notre étude porte sur le développement postnatal de l’amygdale et des comportements associés. Toutefois, la bibliographie montre peu d’étude avec des tests comportementaux adaptés à la période néonatale et juvénile. De plus certains comportements ont été montré émergeant à partir du jour postnatal 14, nous débuterons donc cette étude durant la période juvénile (entre le jour postnatal 14 et 34). Nous aurons aussi un point de comparaison avec un stade de développement adulte à partir du jour postnatal 56.

Toutes tuées à l'issue pour prélever des tissus, 72 souris triple mutantes vont être utilisées, la moitié opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil, l'autre dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un cathéter dans la veine de la queue ou de la cuisse et un second dans l'abdomen, puis passe une heure trente d'IRM sous anesthésie, une ou deux fois à quinze jours d'intervalle. Le porteur affirme que les doses d'agent de contraste et d'activateur "n'ont aucun effet délétère" sur ces souris, et ne retient comme risque que la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie. Il justifie la mise à mort par le fait que la remise en liberté d'animaux génétiquement modifiés et "dégénérés" serait inconcevable, alors que le projet reste une étude pilote destinée à vérifier qu'une réponse cérébrale est mesurable.

Objectifs

Il s'agit ici d'une étude pilote dont les objectifs sont d'étudier la biologie d'une classe particulière de neurones somato-sensoriels non myélinisés capables de transduire des stimulations mécaniques à bas seuil, détectées au niveau de la peau poilue. Typiquement, chez l'homme, ces neurones interviennent dans la détection et la transduction du toucher social ou affectif. De manière intéressante, des études récentes, y compris certaines réalisées au sein de notre équipe, suggèrent que ces neurones sont aussi capables de moduler la douleur post-lésionnelle ainsi que la réponse immunitaire cutanée. Cependant, ces conclusions ont toutes été formulées de manière indirecte et à l'heure actuelle, aucune étude n'apporte la démonstration directe de leur fonction in vivo, à l'état basal et dans la modulation de la douleur post-lésionnelle. C'est précisément le but de notre projet. Il repose sur l'utilisation d'une série de lignées de souris génétiquement modifiées de manière à générer des souris triple mutantes permettant d'activer, inhiber ou bien éliminer séléctivement ces neurones in vivo, et ce, de manière inductible. Le but de cette étude pilote est de vérifier qu’il est possible de suivre par IRM la réponse cérébrale induite par l'activation de ces neurones. Les résultats de cette étude préliminaire conditionneront la mise en œuvre d’un projet s’appuyant sur des méthodes d’IRM fonctionnelle pour l’étude des réseaux cérébraux de la nociception impliquant ces neurones.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de cette étude pilote sont la prise en charge de la douleur qui est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important et souligne que les mécanismes moléculaires et cellulaires intervenant dans la mise en place et le maintien des douleurs chroniques restent peu compris. Dans ce projet, nous allons nous intéresser à une classe particulière de neurones somatosensoriels, qui semblent avoir des propriétés de modulation de la douleur post-lésionnelle. Par conséquent, nous allons augmenter nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle induite par des lésions tissulaires. De plus, notre projet est conçu de sorte à permettre la découverte de nouvelle pistes thérapeutiques, qui pourraient avoir une application chez les patients humains. A noter que les neurones étudiés ont été également décrits chez l'homme.

Procédures

Un cathéter sera implanté sous anesthésie dans la veine caudale ou fémorale pour l'injection d'un agent de contraste IRM. Un autre cathéter sera implanté en IP pour l'injection d'un activateur de ces neurones. Une session d'imagerie (d'une durée de 1h30) sera ensuite réalisée de façon non invasive sur chaque souris (sous anesthésie) avant et après injections.

Impact sur les animaux

Les animaux seront examinés soit une seule fois par IRM, soit 2 fois à au moins 15 jours d'intervalle, l'IRM étant une procédure non invasive. Nos données préliminaires nous permettent d’affirmer que les doses d'agent de contraste et d'activateur utilisées ici n’ont aucun effet délétère sur nos souris triples mutantes. L’examen IRM sera conduit sous anesthésie gazeuse. La seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque l’isoflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie, ce qui permet le réveil rapide des animaux.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue de la procédure pour prélever post-mortem différents tissus. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées et sur des souris dégénérées, leur mise en liberté est inconcevable.

Remplacement

Ce projet a pour but d'étudier la biologie d'une classe particulière de fibres somatosensorielles. Il sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. Le recours à l’animal est incontournable car la détection de variations hémodynamiques cérébrales résultant d’une stimulation pharmacologique ne peut être réalisée que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico car elles ne sont pas adaptées au suivi de cette étude. En effet, les organs-on-chips ou les organoïdes ne permettent pas de reconstituer les connexions neuronales complexes impliquant différentes structures du système nerveux et ne reflètent donc pas la physiologie et le fonctionnement du cerveau dans son entièreté. Quant aux modèles informatiques pour la transduction d'un stimulus sensitif de la peau vers le cerveau, leur design nécessiterait des données in vivo, que nous n'avons pas mais que cette étude serait susceptible de fournir.

Réduction

L’utilisation d’une technique d’imagerie non invasive permettra de réduire le nombre d’animaux, grâce au suivi longitudinal de chaque individu. De plus, nous étudirons si l’activation cérébrale est reproductible en imageant les souris une 2ème fois, dans le but de répéter la procédure plusieurs fois dans des études futures et ainsi réduire le nombre total d'animaux utilisés. En l’absence de données préliminaires permettant de connaître la taille d’effet attendu (l’objectif de ce projet exploratoire étant justement d’apporter des informations sur la réponse cérébrale) nous avons estimé la taille des groupes nécessaires à l'obtention de données fiables sur la base de notre expérience en IRM préclinique. Les données seront analysées avec des outils statistiques appropriés.

Raffinement

Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress et l’angoisse. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec monitoring physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge en plastique, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels. Suite à la procédure d'imagerie, les animaux seront suivis régulièrement et l'évaluation de la douleur sera monitorée par une grille de score fournie en annexe : recours à l'utilisation d'analgésiques pour réduire la douleur et euthanasie de l'animal en cas d'atteinte des points limites.

Choix des espèces

Chez la souris, la population des neurones somato-sensoriels ciblée dans ce projet est similaire à celle décrite chez l'homme sous le nom de C-Tactile. Cette étude pilote sera réalisée sur des souris âgées de 8 à 12 semaines car nous travaillons sur la physiologie d’animaux adultes.

1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 60 d'entre elles étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Dans leurs deux premières semaines de vie, les souriceaux reçoivent des injections intramusculaires de composés pro-inflammatoires sous anesthésie, séparés de leur mère, puis passent des enregistrements de vocalisations ultrasoniques, de l'actimétrie et un test de nidification. À trois mois, chaque animal est isolé pendant trois semaines avant le test d'interaction sociale, pour stimuler ses comportements sociaux. Le porteur présente ces tests comme "non invasifs" tout en décrivant par ailleurs le stress lié à la séparation maternelle, à l'hébergement individuel et aux prélèvements sanguins.

Objectifs

Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions différentes particules auxquelles l’organisme est exposé dans les premières semaines de vie. La toxicité de ces composés bio-persistants et fortement pro-inflammatoires a été montrée dans différentes études, notamment en lien avec un effet sur le neurodéveloppement. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autres par différents tests de comportements, à différents âges, chez un modèle souris pour lequel i) un gène de l’autophagie a été invalidé ; ii) une exposition précoce aux particules est réalisée. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes cellulaires et la mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs : enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte de séparation maternelle (5 minutes), enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte d’interaction sociale (8 minutes à trois stades : jeune, adolescent, adulte), actimétrie à 2 et 3 mois (2 heures d’enregistrement), test de nidification (suivi sur 24 heures). Les souris sont isolées pendant 3 semaines en amont de la session de test d’interaction sociale à l’âge de 3 mois, afin de stimuler les comportements d’interactions. Les injections intra-musculaires de composés pro-inflammatoires (durée du geste d’environ 10 secondes) sont réalisées sous anesthésie (5 minutes d’anesthésie) et ne sont pas de nature à impacter de manière durable le bien-être des animaux. Ils sont ensuite soumis à une chirurgie sans réveil de quelques minutes réalisée sous anesthésie et analgésie, se finissant par l’euthanasie de l’animal. Deux prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés à deux âges différents, le second prélèvement sera suivi d’une euthanasie.

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables de stress sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, l’anesthésie gazeuse, les prélèvements sanguins (douleur légère liée à la piqûre de la veine et risque possible d’hémorragie), la mise en place d’une période d'hébergement individuel pour les animaux, les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques avant la chirurgie sans réveil, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. Pour l’anesthésie une détresse respiratoire et l’hypothermie des animaux est possible.

Devenir

Le projet décrit est réalisé sur des souris. L’ensemble des 1380 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt.

Remplacement

L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie combiné à une perturbation inflammatoire précoce, sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.

Réduction

Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 1380 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et ou la réalisation de séries de coupes pour les cerveaux prélevés, ce qui nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Les paramètres environnementaux comprennent une humidité de 50 pour cent plus ou moins 20 pour cent, une température constante entre 20 et 24 degrés Celsius. L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification ainsi que d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue, à l’aide d’une grille de suivi. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés. Les injections intramusculaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Le stress induit par la séparation est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation. Les travaux antérieurs menés au laboratoire ou par d’autres équipes indiquent que l’injection intramusculaire des molécules pro-inflammatoires d’intérêt n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les portées seront particulièrement observées après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation impactant potentiellement l’élagage synaptique et la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (test à 9 jours de vie), jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie). Les injections seront réalisées pendant les deux premières semaines de vie de l’animal, de manière à modéliser une situation d’exposition réaliste chez l’enfant pendant sa 1ère année de vie.