Procédures sans réveil

946 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose du foie est induite par chirurgie, puis les animaux reçoivent des injections de vecteurs de thérapie génique et des séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie, avant prélèvement terminal du foie entier. Le porteur affirme que le ciblage d'un organe par un vecteur injecté dans la circulation n'est pas modélisable in vitro. Les applications thérapeutiques chez l'humain restent annoncées comme précliniques et lointaines.

Objectifs

Les maladies du foie, de causes très variées (excès de gras, alcool, virus, médicaments, atteinte biliaire, génétique etc), sont un enjeu majeur de santé publique. Elles mènent à la cirrhose qui est la 14ème cause de mort dans le monde et au cancer du foie, 3ème cause mondiale de décès par cancer. Quelle que soit l’origine de la maladie, un tissu cicatriciel excessif responsable de la maladie est fabriqué par des cellules appelées « myofibroblastes ». En même temps, les cellules assurant les principales fonctions du foie appelées « hépatocytes » meurent. De nombreux traitement ont été proposés mais jusqu’à présent aucun ne s’est montré satisfaisant par manque d’efficacité de ciblage sécurisé d’un type cellulaire présent dans le foie et l’apparition d’effets secondaires indésirables (ex : l’élimination de cellules saines en même temps que les cellules pathogéniques). Ce projet vise à développer et tester l’efficacité préclinique d’un vecteur de thérapie génique permettant l’élimination spécifique des myofibroblastes rendant le foie malade quelle que soit l’origine de la maladie, et d’un vecteur de thérapie génique protégeant les hépatocytes de la mort au cours des maladies chroniques du foie.

Bénéfices attendus

Il n’existe aucun traitement curatif des maladies chroniques du foie. Ce projet comprend des études précliniques de validation de vecteurs de thérapie génique ciblée pour les maladies chroniques du foie chez les animaux en vue d’application clinique thérapeutique chez l’humain.

Procédures

Des souris auront une intervention chirurgicale unique et terminale, sous anesthésie générale et sous analgésique (10 min). Des souris subiront une opération chirurgicale d’environ 15min sous anesthésie générale et sous analgésique. 15 jours après ces souris auront une intervention chirurgicale terminale, sous anesthésie générale et sous analgésique (10 min). Des souris recevront une injection (5min). Une partie d’entre elles recevront une deuxième injection 1 à 3 semaines après (5 min). 1 fois par semaine, pendant 2 mois maximum, ces souris seront soumises, en même temps, à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie. Des souris seront opérées chirurgicalement (environ 15min) sous anesthésie et sous analgésique. Ces souris recevront deux injections à 1 semaine d’intervalle en 5min. 1 fois par semaine pendant 2 semaines, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie. Des souris seront nourries avec un régime particulier pendant 16 semaines maximum et recevront deux injections à 1 à 3 semaines d’intervalle (5min/acte). 1 fois par semaine pendant 8 semaines maximum, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie générale. Des souris seront injectées 2 à 3 fois par semaine pendant 12 semaines (5min). 1 fois par semaine pendant 6 semaines, sous anesthésie, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin.

Impact sur les animaux

Pour induire la fibrose du foie, un des modèles expérimentaux est chirurgical (15 minutes par intervention). Une perte de poids post-opératoire, des infections ou des ruptures de sutures pourraient survenir. Plusieurs actes seront pratiqués sous anesthésie (10 minutes environ par intervention) pouvant induire des nuisances comme le risque d’arrêt cardio-respiratoire, l’hypothermie et la perte de repère transitoire au moment du réveil. Des nuisances peuvent également être induites par les prélèvements sanguins et les injections comme un stress émotionnel de courte durée (5min maximum par acte) liés à la contention et la douleur de l’introduction de l’aiguille ou des saignements et irritations. Les régimes alimentaires ou le produit injectable utilisés pour induire une fibrose hépatique aux animaux entrainent une perte de poids pendant les 3 premières semaines qui se stabilise ensuite. Un des modèles de fibrose nécessite l’utilisation de souris transgéniques développant spontanément une fibrose hépatique qui reste asymptomatique jusqu’à l’âge de 12 mois. Dans ce projet ces souris seront maintenues jusqu’à l’âge de 4 mois maximum.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux de toutes les procédures est nécessaire pour pouvoir isoler les cellules du foie, évaluer la maladie du foie et pour valider le ciblage cellule spécifique des vecteurs de thérapie génique. Le prélèvement du foie entier ne permet pas la survie des animaux.

Remplacement

Les maladies du foie reposent sur de multiples interactions dans l’organisme entier entre les processus de régénération, d'inflammation, de vascularisation et de cicatrisation impliquant le support des autres organes du corps et n’est pas modélisable in vitro. Le ciblage spécifique d'un organe par rapport à un autre via l’injection d’un vecteur génique dans la circulation sanguine et l’étude de sa répartition corporelle n’est pas modélisable in vitro. De même, le ciblage spécifique d’un sous type cellulaire du foie par rapport aux autres cellules du foie nécessite d’étudier l’organe en entier. Aucun modèle 3D in vitro du foie ne reproduit actuellement la réelle complexité cellulaire du foie ni sa structure. Enfin, Il n’existe pas de lignées cellulaires proche de la physiologie réelle du foie. Pour étudier les signatures cellulaires saines ou malades dans l’organe entier, nous serons donc contraints d’utiliser des cellules primaires dont la survie est limitée en culture et qui ne peuvent être obtenues qu’à partir du foie des souris. Ainsi, pour développer cliniquement une thérapie génique ciblée, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire

Réduction

A cause des variabilités entre animaux et des risques d’échec des procédures, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Le nombre d’animaux utilisés pour le projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre notre objectif scientifique. Le nombre d’animaux a été évalué à 948 maximum. Les tests in vitro seront réalisés sur des cellules primaires mais qui ne peuvent être maintenues à long terme après isolement. Pour les types cellulaires qui le permettent, une amplification sera réalisée en culture. Afin de réduire le nombre d’animaux, un seul modèle de fibrose sera utilisé pour réaliser les expériences in vitro. Autant que faire se peut, nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Le nombre de candidats vecteurs sera réduit progressivement de 10 vecteurs à 1 au cours des procédures réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Grâce aux prélèvements sanguins et au suivi du transgène fluorescent qui nous permettent d’observer dans le temps la pathologie et l’expression de notre vecteur au cours des expérimentations, 1 seul temps d’euthanasie est nécessaire. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats scientifiques dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les animaux seront anesthésiés pour chacune des procédures et un analgésique sera administré en per et/ou post opératoire pour éviter toute souffrance liée à l’intervention chirurgicale. Au cours des chirurgies, les souris seront placées sur une plaque chauffante pendant et après l’opération, jusqu’au réveil total, et leurs yeux seront protégés au cours de l’anesthésie. Au cours des expériences impliquant le produit médicamenteux induisant la fibrose, aucun analgésique ne sera administré en même temps aux souris afin d’éviter toute surdose et une insuffisance hépatique. Dans le cas des injections répétées, plusieurs sites d’injection seront alternés au cours des procédures pour éviter une irritation locale et diminuer le risque d’ascite. Des points limites ont été définis suivant une grille d'évaluation établie sur l’apparence physique, le poids et le comportement animal, adaptés à chaque procédure. Si l’animal atteint un point limite il sera soulagé par l’administration d’un analgésique et si les symptômes persistent où sont trop sévères, l'animal sera euthanasié. Les prélèvements sanguins et l’imagerie médicale réalisés au cours des procédures permettent également de surveiller précisément toutes déclarations de symptômes. Les souris seront prises en charge par du personnel qualifié et entrainé aux procédures, et examinées quotidiennement. Les animaux seront hébergés 7 jours avant le début des procédures jusqu’à l’euthanasie en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles dans un environnement enrichi favorisant les comportements exploratoires et réduisant ainsi le stress. Les animaux seront hébergés dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Au cours des 7 jours d’hébergement avant procédure, les souris s’adapteront à leur nouvel environnement et un contact sera mis en place afin de les habituer aux manipulations et ainsi réduire leur stress au cours des procédures. Les personnes non formées agiront en tant qu’observateurs et toujours accompagnés par un membre formé.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris, dans la littérature est la plus référencée pour les modèles de maladies hépatiques notamment pour leur grande reproductibilité et leur capacité à développer une pathologie très proche de l’homme. De plus la souris possède une vésicule biliaire tandis que le rat n’en possède pas. Or la vésicule biliaire possède un rôle dans la régénération du foie et son absence au cours des modèles biliaires pourrait biaiser les résultats. La fibrose hépatique est un processus insidieux et indolore pouvant mettre plusieurs années à se déclarer chez l’humain adulte. Chez la souris elle est également asymptomatique et peut prendre jusqu’à 3 mois pour s’installer en fonction des modèles. Dans ce projet, les souris utilisées seront donc de jeune adulte de 8 à 10 semaines afin de participer à des procédures pouvant durer plusieurs mois sans être affectées par un vieillissement avancé.

40 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie ou impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une bronchoscopie et une exploration des voies biliaires de deux heures pour y appliquer un plasma froid, susceptible de provoquer lésions et brûlures superficielles des muqueuses. Le projet teste la faisabilité et la sécurité d'un dispositif médical endoscopique antitumoral avant un éventuel usage clinique. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico et retient le porc pour son système aérodigestif proche de celui de l'humain.

Objectifs

Tester un dispositif pour traiter localement par voie endoscopique des tumeurs des bronches et des voies biliaires, 2 tumeurs difficiles à traiter en raison de leur localisation, grâce à une technique utilisant le plasma froid atmosphérique, qui est un gaz ionisé utilisé comme agent antitumoral. L’équipe a une grande expertise dans ce domaine puisqu’elle a déjà mené plusieurs travaux dans ce domaine. Nous souhaitons passer maintenant à l’évaluation en temps réel de notre dispositif.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont que le plasma soit délivré en toute sécurité (absence de lésions électriques et de brûlures) dans les voies biliaires et dans les bronches sans induire d'effets délétères sur les tissus sains. Ce projet a pour but de valider la faisabilité et la sécurité d’un dispositif endoscopique à plasma qui est la promesse d'une nouvelle alternative aux approches conventionnelles comme la chirurgie ou la chimiothérapie pour le traitement des cancers des voies biliaires et du poumon chez l’Homme.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à une endoscopie, dans les poumons (bronchoscopie) et les voies biliaires (duodénoscopie) afin d’appliquer le plasma froid atmosphérique dans ces cavités. Pour cela, les animaux seront anesthésiés, et une endoscopie des poumons et des voies biliaires sera réalisée par des experts cliniciens. Ces interventions seront réalisées au nombre de 40, pour une durée de 2 heures (installation dans la salle d'examen, administration de la sédation, réalisation de l'examen, réveil).

Impact sur les animaux

perforation digestive ou pulmonaire

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=40) seront mis à mort à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, le remplacement n’est pas possible car il vise à tester un dispositif médical qui est un endoscope au sein d’un organisme vivant complexe. Il n’y a pas de modèles in vitro ou in silico. Le porc possède l’avantage d’avoir un système aérodigestif (poumon, foie et canaux biliaires) proches de celui de l'homme en termes de taille et de caractéristiques physiologiques et anatomiques. En outre, il existe de nombreuses similitudes morphologiques entre les poumons porcins et humains, tous deux étant fortement lobulés, avec des lobules pulmonaires bien définis et délimités par des cloisons interlobulaires. Le recours à l'expérimentation animale chez le cochon constitue un prérequis avant la réalisation d’essais cliniques chez l’Homme. Dans les procédures 1 et 2 un même porc servira pour tester les 2 dispositifs médicaux (bronchoscope et duodénoscope).

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux en testant sur un même animal l’endoscope à plasma dans les voies biliaires puis dans les bronches. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de porc. Un nombre de 10 porcs par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 40 porcs sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi). Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Le vétérinaire réfèrent du Laboratoire effectue une surveillance hebdomadaire ainsi qu’à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (alimentation, perte de poids, dyspnée, douleur) Les animaux auront un traitement antalgique adapté. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, cachexie, prostration, fièvre) ou de dyspnée persistante pendant plus de 24h, les animaux seront mis à mort. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi). Les animaux sont mis en boxe commun dès que les conditions optimums nous le permettent.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des porcs car le foie et les canaux biliaires des porcs sont proches de ceux du corps humain en termes de taille et de caractéristiques physiologiques et anatomiques. Le tube digestif (œsophage, estomac) est également similaire, ce qui permet l’utilisation du même matériel que chez l’homme (utilisation d’un duodénoscope). De plus, des similitudes morphologiques existent entre les poumons porcins et humains, tous deux étant fortement lobulés, avec des lobules pulmonaires bien définis et délimités par des septums interlobulaires, et car ces animaux constituent des modèles validés par les cliniciens pour la manipulation d’endoscopes. Description du ou des modèle(s) : Nous utiliserons des porcs commerciaux mâles ou femelles d’environ 45-55 kg, fournis par un éleveur agrée. Les porcs opérés seront âgés de 6 à 8 semaines pesant environ 45 kgs à ce stade.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la plupart sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à modéré. Elles servent à entraîner du personnel à cinq techniques d'injection et quatre techniques de prélèvement sanguin, trois gestes étant pratiqués sur animal vigile, dont le gavage et l'injection dans la veine de la queue. Le porteur indique que ces souris sont issues de l'élevage et écartées faute du génotype voulu, et qu'elles sont mises à mort après chaque geste pour éviter tout mal-être lié aux gestes imparfaits des apprenants. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible car la maîtrise ne s'acquiert qu'en pratiquant sur l'animal vivant.

Objectifs

Une bonne maitrise des gestes techniques est une nécessité pour garantir le bien-être des animaux et la qualité des expériences. Ce projet a pour objectif la formation interne des personnes de l’établissement qui dispose du diplôme nécessaire à la réalisation des procédures sur les animaux vivants. Il permettra la formation du personnel à différentes techniques d’injection et de prélèvement de sang chez la souris ainsi que la validation de ces gestes. Les animaux impliqués dans ce projet sont des animaux issus de notre élevage dont l’utilisation dans une procédure expérimentale n’est pas possible (par exemple : l’animal n’a pas le génotype souhaité). Aucun animal ne sera produit spécialement pour ce projet.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est la maitrise des gestes techniques permettant de s’assurer du bien-être animal et de la qualité des expériences réalisées ultérieurement.

Procédures

Les différents animaux seront soumis à 5 techniques d’injections et 4 techniques de prélèvement de sang différentes. Parmi les injections, l’injection sous-cutanée, rétro-orbitale et intrapéritonéale durent 2 minutes, l’injection dans les veines de la queue dure 10 min et le gavage 5 min. Parmi les prélèvements de sang, le prélèvement à la queue, en submendibulaire et en rétro-orbital durent 5 min, le prélèvement à l’aorte dure 15 min. Ces procédures seront réalisées sur animal anesthésié sauf 3 d’entre elles qui nécessitent que l’animal reste vigile.

Impact sur les animaux

Il est possible d’observer un saignement au niveau du point d’injection ou du site de prélèvement de sang. Pour l’administration par voie orale, il est possible d’observer la présence de sang dans la bouche et des difficultés respiratoires suite à une fausse route. 3 des gestes doivent être réalisés sur souris vigiles, un stress peut être ressenti par les animaux, surtout du fait que les apprenants n’ont jamais réalisés ces gestes.

Devenir

Les souris sont mises à mort à l’issue de chaque procédure afin d’éviter tout mal-être dû aux gestes encore imparfaits des apprenants.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer l’utilisation de l’animal pour cet apprentissage car la manipulation des êtres vivants demande de la maîtrise qui ne peut s’acquérir qu’en pratiquant avec l’animal vivant.

Réduction

Ce projet vise à former les apprenants aux gestes de base pratiqués régulièrement au sein de notre unité de recherche. Avant la formation, les besoins spécifiques de chaque apprenant sont analysés et il ne sera formé que pour les gestes qui lui seront nécessaires. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés pour l’apprentissage, le geste est d’abord expliqué à l’aide d’un schéma puis montré sur un animal par le formateur expérimenté. Seulement suite à ces étapes, l’apprenant pourra démarrer l’apprentissage des gestes par la pratique. Pour la partie pratique, nous n’utiliserons que des animaux de réforme nés dans notre animalerie qui ne peuvent pas être utilisés dans d’autres projets et destinés à être mis à mort, par exemple parce qu’ils sont nés avec un génotype non souhaité. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé pour garantir la maitrise du geste par les apprenants. Ce nombre peut être réduit si la maitrise du geste est acquise avant d’avoir utilisé tous les animaux prévus. Si plusieurs gestes doivent être acquis, l’apprentissage peut se faire sur le même animal selon les procédures expérimentales décrites ci-après, dans la mesure où les conditions d’anesthésie sont maintenues.

Raffinement

Avant d’expérimenter sur des animaux vivants, le geste est expliqué par le formateur, puis l’apprenant observe une personne experte dans la réalisation de ces gestes. Ensuite, les gestes seront réalisés avec des animaux anesthésiés, sauf lors de l’apprentissage de l’anesthésie par injection intrapéritonéale, de l’injection dans la veine de la queue ou du gavage, 3 gestes qui nécessitent que l’animal soit vigile. De plus, une analgésie locale est appliquée lorsqu’une incision est nécessaire. Des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi de limiter la souffrance et l’inconfort de l’animal.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est l’apprentissage de techniques d’injection et de prélèvement de sang chez des souris afin de les appliquer dans nos différents projets de recherche comprenant de l’expérimentation animale sur souris. Il est donc nécessaire que les apprenants se forment sur des souris. Des souris de plus de 7 semaines seront utilisées lors de ce projet. C’est à partir de cet âge que les animaux sont le plus souvent utilisés dans les projets autorisés de notre établissement, donc cela est favorable à un bon apprentissage.

930 souris et rats vont être utilisés pour une formation réglementaire à la chirurgie, la plupart tués sous anesthésie sans réveil, certains réveillés puis suivis quatre heures avec une douleur postopératoire possible. Chaque animal sert à une intervention abdominale ou thoracique réalisée par un stagiaire après démonstration, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnels. Le porteur indique que les stagiaires s'exercent d'abord sur des supports inertes, cuisses de poulet et rats en plastique, et affirme qu'aucun modèle inerte ne reproduit les signes d'anesthésie profonde et de réveil. Il justifie l'ensemble par le caractère obligatoire de la formation et le "besoin" d'acquérir les bases chirurgicales.

Objectifs

Le projet consiste à réaliser des travaux pratiques sur Rongeurs (rats et souris) au cours des sessions du « module spécialisé en procédures chirurgicales » de la formation spécifique en expérimentation animale, destiné aux concepteurs de projets intégrant des interventions chirurgicales et aux personnels réalisant ces procédures chirurgicales. Cette formation réglementaire est obligatoire pour être autorisé à pratiquer des actes chirurgicaux sur l’animal. L’objectif est d’enseigner aux stagiaires les bases en chirurgie : rappels d’anesthésie, monitoring, gestion de la douleur pré-/per-/post-opératoire, sutures, cicatrisation, asepsie et d’acquérir des bases pour la réalisation de gestes chirurgicaux. Les stagiaires s’entrainent sur des supports inanimés (cuisses de poulets pour les sutures, rat MD-PVC pour les microsutures) avant de passer sur l’animal anesthésié. Plusieurs types d’interventions chirurgicales sont réalisées afin d’avoir une approche pluridisciplinaire (chirurgie abdominale, thoracique). Chaque stagiaire dispose d’un animal pour réaliser chaque intervention après démonstration de la technique par vidéo puis mise en œuvre par un intervenant compétent. Il y a donc une progression dans la compréhension de la technique avant sa mise en œuvre par le stagiaire. Chaque intervenant supervise au maximum 5 stagiaires afin d’assurer un encadrement de qualité. Pour réaliser ces travaux pratiques 15 souris et 16 rats maximum sont utilisés à chaque session soit sur 5 ans et pour 6 sessions de formation par an un total maximal de 480 rats et 450 souris.

Bénéfices attendus

Les formations réglementaires en chirurgie sur l’animal sont obligatoires et ont pour objectif de former les personnels impliqués dans ces procédures afin de minimiser les contraintes imposées aux animaux. Il leur est nécessaire d’acquérir les bases en chirurgie afin de garantir la mise en oeuvre de bonnes pratiques vétérinaires, tant éthiques que techniques. A l’issue de la formation, les stagiaires connaissent les points-clés indispensables à cette mise en œuvre éthique et responsable des protocoles de chirurgie.

Procédures

les animaux sont soumis à des procédures chirurgicales effectuées sous analgésie et anesthésie (1 procédure par animal). Chaque procédure chirurgicale est d’abord montrée par un intervenant qualifié et elle dure de l’ordre de 30 à 45 minutes. Lorsque les procédures sont mises en œuvre par les stagiaires, elles durent entre 1h et 1h30.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés pour la formation subissent une chirurgie qui peut avoir des effets indésirables : mauvaise mise en place de l’analgésie/anesthésie, détresse respiratoire, chute de température centrale. Les souris peuvent subir une lègère douleur au point de piqure lors de l’adminsitration de l’anesthésique par voie intrapéritonéale. La plupart des souris ne sont pas réveillées après le geste chirurgical. Celles dont le réveil est suivi pendant 4 heures peuvent ressentir une douleur post-opératoire. L’anesthésie des rats est induite par de l’isoflurane : ils peuvent subir un stress au moment de les placer dans la cage d’induction. Ils ne sont pas réveillés.

Devenir

Ces procédures sont mises en oeuvre dans le cadre d'un stage de formation aux bonnes pratiques chirurgicales. Les animaux sont euthanasiés à l'issue de la mise en oeuvre du geste technique(1 procédure par animal). Chaque procédure chirurgicale est d’abord montrée par un intervenant qualifié et elle dure de l’ordre de 30 à 45 minutes. Lorsque les procédures sont mises en œuvre par les stagiaires, elles durent entre 1h et 1h30.

Remplacement

Il s’agit de former aux bons gestes chirurgicaux. Les stagiaires commencent par pratiquer sur des supports inertes (cuisses de poulet, rats plastiques) puis ils mettent en œuvre 2 gestes chirurgicaux (procédures 1 et 2) après démonstration et sous supervision des enseignants. Il n’existe actuellement pas de modèle inerte permettant l’observation des signes d’anesthésie profonde et de réveil et un abord le plus précis et le moins invasif possible d’un organe. Quand cela est possible pour un bon apprentissage des gestes, les modèles plastiques sont utilisés. C’est le cas d’une des procédures qui est réalisée uniquement en démonstration par les enseignants : 1 seul animal est concerné par groupe de TP et par séance, les stagiaires reproduisant les gestes sur des modèles de vaisseaux en silicone.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste : 1 animal par démonstration de procédure et 1 animal par stagiaire pour les 2 premiers gestes (pas d’animal pour les stagiaires pour le 3e geste), auxquels on ajoute 2 rats et 4 souris supplémentaires par stage pour tenir compte des aléas chirurgicaux. Il y a 10 stagiaires par session, 6 sessions par an et la demande est faite pour 5 ans. Au total pour 5 ans, 930 Rongeurs : 450 souris et 480 rats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des locaux conformes à la réglementation. Il s’agit d’animaux surnuméraires issus du pôle élevage de l’animalerie, ou ils sont exceptionnellement achetés chez un éleveur agréé lorsqu’il est nécessaire de compléter les lots. Ils sont habitués aux locaux de stabulation et à la manipulation pendant une semaine minimum avant les expérimentations. Les cages sont enrichies en nid végétal pour les souris et en buchettes à ronger pour les rats. Lors des chirurgies, une analgésie pré-opératoire est mise en place et, pour les rats, une sédation est d’abord induite avant d’installer l’anesthésie. En cas de besoin, une demi-dose du mélange anesthésique est administrée et/ou un relais est fait par de l’anesthésique local. Tout au long de l'hébergement et des procédures, la surveillance quotidienne permet de vérifier l'état de santé des animaux et des points limites précoces et adaptés sont mis en place.

Choix des espèces

Pour apprendre à gérer le stress inhérent à toute chirurgie, il est nécessaire en plus de l’apprentissage des gestes techniques sur des supports inertes de se placer dans les conditions réelles et donc de manipuler l’animal. La formation est essentiellement axée sur les Rongeurs (rat et souris) qui représentent plus de 80 % des animaux utilisés dans le cadre des procédures expérimentales. La formation est effectuée sur des animaux adultes car ils sont de gabarit adapté d'un point de vue pédagogique

410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures menées pour partie sous anesthésie sans réveil et pour partie à un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de toxine diphtérique provoquant une chute des plaquettes et des saignements, puis certaines subissent une incision du foie déclenchant une hémorragie massive sous anesthésie profonde, pour mesurer le pouvoir hémostatique de concentrés de plaquettes. Le porteur décrit un modèle de choc hémorragique destiné à évaluer différentes préparations de plaquettes transfusées. Il affirme que l'efficacité de ces concentrés ne peut être évaluée qu'"in vivo" et non uniquement in vitro.

Objectifs

La survenue d’un choc hémorragique provoquée par la perte massive et brutale de sang est une urgence vitale qui doit être prise en charge dans les plus brefs délais. La transfusion sanguine reste encore à ce jour le traitement principal dans la prise en charge d’un patient en choc hémorragique lié à une chirurgie ou à un traumatisme. Les caractéristiques intrinsèques des concentrés plaquettaires, telles que leur durée de conservation ou leurs préparations, sont autant de facteurs qui inflencent le rendement et l’efficacité de la transfusion. Nous proposons d’étudier les capacités hémostatiques (c'est à dire leur capacité à arrêter une hémorragie), des concentrés plaquettaires dans un modèle de choc hémorragique. Différents types de concentrés plaquettaires seront administrés et leur pouvoir hémostatique seront évalués.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de mesurer l’éfficacité des différentes préparations de concentrés de plaquettes sanguines dans la prévention du choc hémorragique mortel. A ce jour chez l'homme, le temps entre le don de plaquettes par un donneur et la transfusion à un malade est au maximum de 7 jours. De plus elles ne peuvent pas être conservées à 4°C ce qui limiterait la prolifération bactérienne mais sont conservées à température ambiante. Ce délai très court et les conditions restreintes de conservation impactent la mise en œuvre de la transfusion qui doit être réalisée des la survenue du choc.

Procédures

Des animaux vigiles subiront des injections en i.p. quotidiennement pendant 4 jours (durée de l'injection inf à 1 minute) Aucun prélèvement ne sera fait sur animal vigile. Des prélèvements sanguins de faible quantité seront faits à la queue (durée du prélèvement inf à une minute), Certains animaux seront profondément anesthésiées avant un prélèvement sanguin qui est unique car terminal (durée du prélèvement inférieur à 3 minutes). Les animaux seront profondément anesthésiés et seront transfusés avant de subir une incision calibrée au niveau du foie entrainant un saignement massif (durée de l'intervention : 20 minutes)

Impact sur les animaux

Les injections répétées de toxine diphtérique entraînent une thrombopénie profonde qui peut être associée à des saignements.

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort à la fin de chaque procédure : la procédure décrivant le prélèvement sanguin pour préparer les plaquettes à transfuser est une procédure sans réveil (car prélèvement sanguin unique et terminal), la procédure décrivant le modèle hémorragique est faite également sur souris anesthésiée profondément et mise à mort à la fin de la procédure car la souris a subi un choc hémorragique.

Remplacement

L’hémorragie met en jeu le vaisseau, les conditions hémodynamiques de la circulation sanguine et le sang. Ces conditions multifactorielles nécessitent l’évaluation de l’éfficacité des concentrés plaquettaires in vivo et ne peuvent pas être évaluées uniquement in vitro même si certains tests sur les fonctions plaquettaires peuvent être évalués in vitro au préalble afin de minimiser le nombre d'animaux.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris nécessaires au développement du modèle de choc hémorragique les conditions de la lésion hépatique seront établies sur des souris décédées. Les plaquettes transfusées sont fluorescentes afin de mettre à profit ces expériences pour la déterminer des mécanismes cellulaires mis en jeux dans l’arrêt du saignement. Pour les procédures le nombre d’animaux nécessaires par condition est établi à 10. Enfin, les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques adaptés permettant d’évaluer le pouvoir de coagulation de concentrés de plaquette sanguines sur un modèle de choc hémorragique chez le souris.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie profonde sans réveil. Un soin particulier sera apporté afin de diminuer la douleur et le stress de tous les animaux utilisés dans ce projet : - Hébergement dans des cages munies de particules de bois et enrichie avec 3 carrés de cellulose + 3 bâtons de coton + de la frisure afin de permettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux - Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Les points limites ont été établis afin de pouvoir soustraire l'animal à toute souffrance.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car nous avons une bonne connaissance de la biologie des plaquettes de cet animal. Sa petite taille permet la transfusion d’une quantité modérée de plaquettes. De plus la disponibilité de nombreux modèles génétiquement modifiés permettra d’étendre ce projet vers la compréhension des mécanismes hémostatiques de la transfusion plaquettaire. La quantité de plaquettes sanguine des souris augmentent avec l’âge. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte entre 7 et 20 semaines, période où la numération plaquettaire est stable.