Procédures sans réveil

50 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal, profondément endormi et sous ventilation assistée pendant cinq à huit heures, subit un infarctus provoqué puis une reperfusion couplée à un traitement par ondes ultrasonores, avant le prélèvement de son cœur. L'objectif déclaré est de valider une protection du myocarde applicable ensuite à l'humain, étape que le porteur décrit comme "cruciale et préalable à toute étude clinique". Il affirme que le porc, à la physiologie cardiaque proche de l'humain, est "désormais pour des raisons éthiques le modèle recommandé".

Objectifs

L’importance de l’infarctus du myocarde et ses conséquences en termes d’insuffisance cardiaque et de mortalité cardio-vasculaire en font un problème de santé publique majeur dans les pays développés. La taille de l'infarctus est le facteur majeur du pronostic après infarctus du myocarde aigu. Les interventions visant à réduire la taille finale de la lésion ont donc un intérêt clinique majeur pour améliorer le pronostic des patients pris en charge pour infarctus du myocarde. La prise en charge actuelle de l’infarctus du myocarde vise à ré-alimenter le cœur en sang oxygéné (reperfuser) le plus rapidement possible. Cependant des études expérimentales et cliniques ont montré qu’une reperfusion brutale a trop souvent des effets secondaires sur le myocarde ischémique, induisant des lésions supplémentaires. Ces dommages survenant après reperfusion peuvent participer jusqu'à 40% de la taille finale de l’infarctus. L’objectif du projet de recherche lié à la demande d’autorisation était de valider deux nouvelles stratégies thérapeutiques de protection du myocarde, dites de sono-cardioprotection, sur un modèle d’infarctus réalisé chez le Porc, étape cruciale et préalable à toute étude clinique ultérieure. Deux modes d’applications des ultrasons comme stratégie thérapeutique non-invasive avait été envisagées : la mécano-transduction (Shock-Wave) et les ultrasons focalisés de basses intensités (LIPUS). Toutes deux ont été utilisées pour déposer de l'énergie ultra-sonore à différentes intensités dans des endroits focalisés des tissus, avec des utilisations en routine clinique dans le domaine de l'oncologie et en urologie. Trois étapes avaient été fixées pour réaliser cette étude. Les 2 premières étapes ont été accomplies dans le cadre d’une demande d’autorisation de projet précédente. Cette demande est donc destinée à couvrir la 3e et dernière étape du projet. L’évaluation de la méthode et sa validation comme précédemment combinera i) l’imagerie pour explorer le retentissement de l’infarctus du myocarde et des thérapies adjuvantes au niveau du cœur, notamment au niveau inflammatoire ii) des prélèvements sanguins et tissulaires pour des analyses histologiques, biologiques pour relier l’imagerie macroscopique et le niveau cellulaire.

Bénéfices attendus

Des études préliminaires sur des modèles cellulaires, et à thorax ouvert sur modèle porcin, ont permis de valider l’effet potentiellement protecteur des shock-wave (mécano-transduction). Toutefois, ces résultats, bien que très encourageants, sont très éloignés de la réalité clinique où les ondes de chocs doivent prouver leur efficacité en application directe sur le cœur vivant et battant. L’objectif étant une application humaine de cette technologie, seul un modèle sur gros animal, qui présente une physiologie coronaire et cardiaque très semblable à l’homme a permis d’avancer sur cette problématique. L’espèce animale choisie pour notre étude est le porc de taille réduite, dans lequel nous induisons un infarctus d’intensité similaire à celui retrouvé chez l’homme, nous effectuons la reperfusion couplée à nos deux propositions thérapeutiques innovantes, dont nous avons montré à thorax ouvert, (modèle permettant l’application des ondes de chocs directement sur le cœur) qu’elles permettent de réduire les effets délétères du traitement actuel. Si cette première étape expérimentale a été cruciale pour démontrer l’effet thérapeutique dans la configuration la plus favorable mais invasive, celui-ci doit maintenant être confirmé à thorax fermé avec la procédure non-invasive utilisée sur l’homme. Cette étape finale permettra de suivre chronologiquement la mise en place de la lésion ischémique, puis d’étudier l’efficacité de la thérapie proposée pour limiter les effets délétères de la reperfusion dans un scénario clinique qui pourra être utilisé ensuite directement sur l’Homme.

Procédures

Chaque animal, profondément endormi et placé sous ventilation assistée, sera extemporanément suivi sur le plan physiologique durant le déroulement du protocole. L’endormissement sera entretenu par une perfusion continue d’antalgiques et une anesthésie gazeuse, de sorte qu’à la moindre manifestation de signes de réveil de l’animal une augmentation de l’anesthésiant sera pratiquée et éventuellement suivie d’une augmentation de la vitesse de perfusion : l’objectif est d’éviter toute perception douloureuse à l’animal. L'expérimentation sera immédiatement arrêtée si un problème, lors de la chirurgie, survient : dissection coronaire, hémorragie, poumon atteint. Notre équipe est aussi préparée à une réanimation si une fibrillation ventriculaire arrive: massage cardiaque et défibrillation. L'expérimentation sera arrêtée après 30min de réanimation infructueuse et/ou impossibilité de stabiliser l'animal après réanimation (arythmies importantes, pression artérielle basse). A partir du moment où la chirurgie réalisée est satisfaisante, le protocole d'imagerie commence. La durée maximale de l'expérimentation est constante et évaluée de 5 à 8 heures.

Impact sur les animaux

Puisque le modèle consiste à induire une ischémie aigüe et transitoire sur le cœur de l’animal, il est attendu une anoxie du territoire en aval de l’artère occluse. Comme chez l’homme, cela entraine des anomalies de la fonction segmentaire, et des troubles rythmiques fréquents (extra-systoles (ES), tachycardie ventriculaire (TV)). Par ailleurs on note en général un œdème intra et extracellulaire comme chez l’être humain, et des complications cellulaires qui font justement l’objet de la recherche et des thérapies mises en œuvre. L’ensemble des conséquences induites par la procédure d’ischémie sont prévenues et/ou traitées par l’anesthésie/analgésie et les médicaments anti-arythmiques délivrés en fonction de la symptologie. L’infarctus étant réalisé sur animaux profondément endormis, sous anesthésie générale, la prise en charge de la douleur est prévue. La procédure par voie percutanée est celle utilisée chez l’homme, laquelle limite les conséquences hémorragiques.

Devenir

Pour permettre les prélèvements histologiques, ainsi que la mesure de l’aire à risque et de la zone de nécrose les prélèvements de cœur sous cardioprotection sont nécessaires. Immédiatement après la mort le cœur de l’animal doit ainsi être prélevé afin de permettre la découpe du cœur en tranche, digitaliser les clichés pour une analyse quantitative. Il est donc obligatoire de procéder à un protocole expérimental sans réveil, tous les animaux du protocole seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation.

Remplacement

REMPLACEMENT : Le projet vise à améliorer la thérapie de l’infarctus cardiaque pour l’homme avec des sondes ultrasonores de taille humaine et des caractéristiques physiques spécifiques. L’évaluation de la méthode et sa validation utilisera l’imagerie pour explorer le retentissement de l’infarctus du myocarde et des thérapies adjuvantes au niveau du cœur. Les sondes de thérapie, mais aussi les outils d’imagerie (IRM) utilisées doivent être les mêmes que ceux utilisés en clinique humaine, avec les mêmes contraintes physiologiques (taille, puissance des ultrasons délivrés. Nous devons aussi nous approcher le plus possible de la physiopathologie humaine le porc est désormais pour des raisons éthiques le modèle recommandé.

Réduction

REDUCTION : Le nombre porcs demandé correspond à l’effectif permettant d’évaluer et de comparer les différents groupes avec la puissance statistique nécessaire pour valider cette étude, compte tenu d'une variabilité inter-individuelle attendue et similaire à l’homme, et de la précision des mesures IRM de zone à risque, taille oedème et taille d’infarctus. Le nombre minimum pour identifier les changements dans le temps est estimé à 15, au moyen de tests statistiques prenant en compte le risque et la puissance attendue pour assurer une bonne différence entre les groupes et les points dans le temps.

Raffinement

RAFFINEMENT : Les porcs sont hébergés dans les conditions adaptées à leur espèce, logés sur copeaux, en groupes sociaux, avec jeux à leur disposition. Un suivi quotidien leur est apporté. Un vétérinaire assure le suivi sanitaire. Pour le transport vers le site d’expérimentation, l’animal déjà isolé dans un box de l’animalerie (mise à jeun de 24h obligatoire avant anesthésie), est tranquillisé avec un sédatif. A son arrivée sur le site d’expérimentation avant l’acheminement au bloc opératoire, l’animal est prémédiqué avec douceur afin de limiter au maximum son stress avant installation sur la table d’opération au bloc opératoire. Une voie veineuse périphérique est posée sur une veine marginale de l’oreille droite ou gauche, et lui seront administrés, en bolus lent, l’anesthésique et l’analgésique. Par la suite en complément une perfusion lente est mise en place pour administration continue de l’anesthésique et de l’analgésique. Chaque animal, profondément endormi et placé sous ventilation assistée, sera extemporanément suivi sur le plan physiologique (fréquence cardiaque, pressions artérielles invasives, débit cardiaque, température corporelle) durant le déroulement du protocole. L’expérimentation sera arrêtée si un problème survenant lors de la procédure ne peut pas être résolu (ex : dissection vasculaire entrainant une hémorragie de l’animal). Notre équipe est également préparée à une réanimation si une fibrillation auriculo-ventriculaire survient : massages cardiaques et défibrillations. L’expérimentation sera arrêtée après 30 minutes de réanimation infructueuse et/ou impossibilité de stabiliser l’animal après réanimation (arythmies importantes, pressions artérielles basses). Enfin pour la mise à mort, l’animal est toujours placé sous anesthésie générale avant induction d’une surcharge de barbiturique.

Choix des espèces

Le projet vise à améliorer la thérapie de l’infarctus cardiaque pour l’homme avec des sondes ultrasonores de taille humaine et des caractéristiques physiques spécifiques. L’évaluation de la méthode et sa validation utilisera l’imagerie pour explorer le retentissement de l’infarctus du myocarde et des thérapies adjuvantes au niveau du cœur. Les sondes ultrasonores de thérapie, mais aussi les outils d’imagerie (IRM) utilisée doit être les même que ceux utilisés en clinique humaine, avec les mêmes contraintes physiologiques (taille, puissance des ultrasons délivrés...). Il n'est pas possible de remplacer le porc par un rongeur, dont l’imagerie comme la thérapie nécessiterait des systèmes dédiés qui ne sont pas équipés des techniques d’imageries développées pour une application humaine. Nous devons aussi nous approcher le plus possible de la physiopathologie humaine et le porc est désormais pour des raisons éthiques le modèle recommandé. Nous utilisons des porcs adultes de taille réduite d’âge supérieur à 1 an, de sexe mâle ou femelle, ayant un poids compris entre 50 et 70 kg. L’éleveur est le spécialiste de cette souche de porcs. Nous avons des données expérimentales importantes sur ce type d’expérimentation, nous permettant de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de nouveaux protocoles sans réveil de l’animal. Les résultats obtenus sur les animaux de cet âge sont convaincants et suffisants dans nos études. Ce modèle animal est proche de l'imagerie cardiaque chez l'homme et permettra de transposer les connaissances acquises vers une imagerie clinique.

750 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil, pour former des internes à la microchirurgie sous microscope. Chaque animal, ancien reproducteur destiné à l'euthanasie, sert à s'exercer aux sutures de microvaisseaux et de nerfs pendant environ trois heures. Le porteur applique le principe "Jamais la première fois sur l'animal" après entraînement sur substituts inertes et animaux morts. L'établissement déclare avoir utilisé 831 animaux là où 3000 étaient prévus, et en demande désormais 750.

Objectifs

Les formations sur animal vivant anesthésié visent à former les internes de chirurgie à la microchirurgie sous microscope opératoire. Elles complètent l’enseignement traditionnel par le compagnonnage et permettent de mettre les internes en situation réelle et en autonomie sans impliquer la vie d’un patient humain. L’enseignement pratique est complété par des cours théoriques dans différentes disciplines nécessitant la microchirurgie. La microchirurgie est une discipline exigeante, difficile et sa mauvaise réalisation peut compromettre la récupération du patient. Les internes ne peuvent être formés directement sur le patient. Le déroulé de l’enseignement est composé de différentes étapes dont la difficulté de réalisation est progressive. L’enseignement commence par 5 sessions de 3 h soit 15 h d’enseignement sur supports inertes et sur animaux morts pour former les participants au maniement des instruments de microchirurgie et au travail sous microscope. L’enseignement sur animaux morts permet de former les participants aux différentes voies d’abords chirurgicales et aux sutures qui seront ensuite réalisées sur l’animal vivant anesthésié. Durant ces TP, le travail du participant est évalué afin de déterminer s’il est apte à travailler sur l’animal vivant. Après cette validation des gestes techniques, il y a 11 sessions de 3 h chacune (10 sessions de formation et 1 session d’examen) sur animaux vivants. Durant ces sessions, différents types de gestes techniques seront abordés et représentent les spécificités techniques de chaque spécialité. En complément de l’utilisation d’animaux vivants, 3 sessions de 3 h sont réalisées sur corps humains issus des dons du corps à la science. Ces sessions permettent de réaliser des gestes techniques qui ne sont pas réalisables sur l’animal. Les gestes chirurgicaux portent sur la chirurgie des microvaisseaux (artère & veine) et des nerfs.

Bénéfices attendus

Les objectifs pédagogiques sont de former les internes en fin d’internat (5ème et 6ème semestre) avant qu'ils soient laissés en autonomie totale au bloc opératoire. Pour placer les participants dans les conditions de chirurgie, l’installation des animaux est semblable à celle du bloc opératoire (anesthésie, analgésie, asepsie et champage, même instrumentation).

Procédures

Sur animaux vigiles, une injections sous cutanée : environs 1 minute. Les gestes chirurgicaux sont éffectués sur animaux anesthésiés et analgésié sans réveil. En moyenne cet enseignement dure 3H.

Impact sur les animaux

L’étape de réception peut provoquer des blessures de bagarre au moment de la constitution du lot. Durant la phase d’acclimatation et malgré l’enrichissement, le risque de bagarre, la perte de poids quoiqu’exceptionnelle ne peuvent être exclus. Concernant les chirurgies, ce sont des procédures sans réveil. Les animaux sont sous anesthésie générale avec analgésie, complétée par une anesthésie locale après ouverture de la peau. Durant toute la procédure chirurgicale, le maintien de la narcose et de l'analgésie sont surveillés et les doses sont adaptées afin d’exclure tout réveil ou douleur de l’animal. Sans les traitements adaptés, les incisions du plan cutané et du péritoine peuvent générées de la douleur. Lors de la chirurgie au niveau de la cavité abdominale, un refroidissement et un dessèchement des viscères sont attendus.

Devenir

Les animaux sont utilisés dans le cadre de la formation à la chirurgie des internes. Du fait de la complexité des gestes techniques, il ne serait pas éthique, ni favorable de maintenir l’animal en vie après la formation. De ce fait, tous les animaux sont mis à mort sans réveil de l’animal.

Remplacement

Le développement de substitut inerte ou organique permet de plus en plus de remplacer l’animal, et dès que cela est possible, leur utilisation est privilégiée si elle permet de répondre aux objectifs de formation. Avant d’utiliser un animal vivant, les participants sont formés sur des substituts inertes, des animaux décédés et sur les corps humains (don du corps à la science). Malgré tout, la microchirurgie est complexe, impliquant plusieurs organes, nécessitent un support vivant, avec des tissus mobiles et vascularisés. Reprenant la doctrine chirurgicale qui tend à imposer le principe «Jamais la première fois sur le patient», nous appliquons «Jamais la première fois sur l’animal».

Réduction

Sur la précédent demande d’autorisation, l’évaluation prospective des besoins portait sur 3000 animaux sur 5 ans. Le développement de la simulation ex vivo et le recours systématique aux substituts ou corps humains, nous a permis de n’utiliser réellement que 831 animaux. De plus, après le COVID et pour des contraintes sanitaires, le nombre d’étudiant par promotion a été réduit de 40% passant de 20 étudiants à 12 étudiants. Cela a permis d’améliorer les conditions d’enseignement en apportant un environnement plus calme, une meilleure disponibilité du professeur. L’utilisation d’animaux morts issus d’autres TP a permis de réduire le nombre d’animaux vivants utilisés. Pour cette nouvelle demande, cela porte sur 750 animaux sur 5 ans afin de couvrir l’ensemble des formations existantes et nouvelles (suite à la supression du numérus clausus).

Raffinement

L’animal aura 1 semaine minimum en acclimatation. Ils sont hébergés en groupe de poids harmonieux. Pour cela, chaque animal est pesé le jour de la réception et ils sont regroupés par lot de 2 à 3 individus de poids proches. Leur environnement est enrichi avec des rouleaux, bâtons à ronger, coton. L’enrichissement est diversifié à chaque change hebdomadaire. Le change est fait le jour de sortie des animaux pour le TP afin de limiter le stress des animaux restants. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un hypnotique couplé à un analgésique pour réduire toutes sensations à la douleur. L’animal sera disposé sur un système chauffant (37-39°C) pour maintenir la température corporelle. Une anesthésie cutanée et intra-abdominale sera mise en place. Pour limiter le dessèchement des viscères, une technique de voie d’abord a été développée permettant de maintenir les viscères dans la cavité abdominale. Elles sont repoussées de part et d’autre de l'incision médiale et maintenues avec des compresses humides et chaudes sous la paroi abdominale. Ce raffinement améliore le maintien de la température corporelle et limite le dessèchement des viscèresde l'animal.

Choix des espèces

Le rat adulte (animal de réforme) présente un calibre des vaisseaux sanguins (carotide, aorte abdominale, artère fémorale) très proche des micro-vaisseaux sanguins et nerfs humains. La taille des animaux d’un poids moyen 600-750 g est très adaptée à l’apprentissage de la microchirurgie. Les rats utilisés sont adultes afin de présenter une taille de vaisseaux et de nerfs appropriée. Les animaux sont des individus de réforme (anciens reproducteurs) destinés à l’euthanasie.

300 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil, au cours de chirurgies de trois à quatre heures. Chaque animal prépubère sert de support à des internes et chirurgiens pour s'entraîner à la chirurgie digestive, traumatique ou robotique, jusqu'au prélèvement multi-organe. Le porteur applique le principe "Jamais la première fois sur l'animal" après entraînement sur simulateurs et corps humains, et juge qu'il ne serait "pas éthique" de garder l'animal en vie après une telle formation. L'établissement déclare avoir utilisé 177 animaux là où 650 étaient prévus, et en demande désormais 300.

Objectifs

Les formations sur animal vivant anesthésié visent à parachever la formation des chirurgiens selon leur spécialité. En plus de l’enseignement traditionnel par le compagnonnage, elles permettent de mettre les internes en situation d’autonomie réelle sans impliquer la vie d’un patient humain. En complément à la formation de base, les participants suivent les formations spécialisées en traumatologie afin d’être aguerris à la prise en charge très particulière des victimes (arme blanche, attentat). Ces lésions impliquent systématiquement le pronostic vital des patients, avec un caractère d’urgence immédiat. Leur procédures de traitement ne peuvent être acquises directement sur les patients. Ces sessions, destinées aux chirurgiens diplômés ou en formation de chirurgie d’urgence permettent une mise en pratique globale avec un encadrement étroit par des chirurgiens séniors expérimentés. Le but est d’enseigner les techniques chirurgicales pertinentes pour la prise en charge des patients victimes de traumatismes graves et de favoriser une mise à jour des connaissances dans une spécialité en constante évolution. Pour tous les enseignements pratiques, cela comporte en premier lieu un entrainement sur corps humain issu des dons du corps à la science, puis sur porc anesthésié sans réveil. L’enseignement pratique est complété par l’étude de cas cliniques réels et apporte une réflexologie de prise en charge aux apprenants. L’apprentissage de la chirurgie robotique est un domaine en constant développement. Malgré le développement de substituts spécifiques, le recours au vivant reste indispensable. Les gestes chirurgicaux varient selon la spécialité et l’organe d’intérêt : chirurgie de réduction de l’estomac (obésité), les traitements des cancers digestifs, la chirurgie traumatique abdominale et/ou thoracique, le prélèvement multi-organe en vue de greffe. Chaque séance sur l’animal est suivi d’un compte-rendu pour améliorer les conditions de prise en charge de la douleur et de réalisation de l’anesthésie et des gestes opératoires. Les séances peuvent accueillir des infirmières de blocs opératoires (entrainement à la préparation des instruments de chirurgie et au déroulé de la chirurgie), ou des étudiants (observation de la préparation de l’animal, de la chirurgieet des techniques de mise à mort dans le respect de l’animal et réglementaire).

Bénéfices attendus

Les objectifs pédagogiques sont de former les internes, les chirurgiens diplômés à la chirurgie générale ou spécialisée avant d’être laissés en autonomie totale au bloc opératoire. Pour placer les participants dans les conditions réelles, l’installation des animaux est semblable à celle du bloc opératoire (anesthésie, analgésie, respirateur, même instrumentation). Ces formations en simulation haute fidélité placent l’apprenant dans des conditions d’exercice extrêmement proche de la réalité en clinique humaine. Ce réalisme se retrouve dans l’acquisition des gestes techniques qui sont réalisés dans les procédures chirurgicales adaptées aux différents contextes interventionnels de la clinique humaine. Le développement des chirurgies avec assistance robotique demandent un niveau d’expertise permettant au futur praticien d’exercer dans des conditions techniques plus précises permettant une augmentation des chances de succès dans chirurgies uniques et délicates.

Procédures

Injection intra-musculaire: 1 minute. Après anesthésie et analgésie, les gestes chirurgicaux exécutés durant la procédure chirurgicale sans réveil, varient selon la spécialité et l'ensemble de la chirurgie peut durer 3 à 4h en moyenne.

Impact sur les animaux

L’étape de réception peut provoquer des blessures lors du transfert de l’animal entre la cage de transport et l’enclos malgré toutes les précautions prises par le personnel. Durant la phase d’acclimatation et malgré l’enrichissement, le risque de bagarre, la perte de poids quoiqu’exceptionnelle ne peuvent être exclu. La prémédication en elle-même peut induire un stress le temps que l’anesthésie et l’analgésie agissent. Les chirurgies sont des procédures sans réveil. La procédure de chirurgie étant de 3h, et l’acte opératoire pouvant être très invasive, cela peut générer un stress et une douleur, c’est pourquoi, les animaux sont sous anesthésie générale associée à une analgésie. La narcose et l’analgésie sont monitorées par télémétrie et surveillées durant toute la procédure chirurgicale, et les doses sont adaptées afin d’exclure tout réveil ou douleur à l’animal.

Devenir

Les animaux sont utilisés dans le cadre de la formation à la chirurgie des médecins internes. Du fait de la complexité des gestes techniques et du retrait de certains organes, il ne serait pas éthique, ni favorable de maintenir l’animal en vie après la formation. De ce fait, tous les animaux sont mis à mort sans réveil de l’animal.

Remplacement

Le développement de substitut inerte ou organique permet de plus en plus de remplacer l’animal, et dès que cela est possible, leur utilisation est privilégiée si elle permet de répondre aux objectifs de formation. Avant d’utiliser un animal vivant, les participants sont formés sur des simulateurs et sur les corps humains (don du corps à la science). Si ces apprentissages répondent aux objectifs de formation, il n’y aura pas d’animaux utilisés. Malgré tout, certaines chirurgies complexes, impliquant plusieurs organes, nécessitent un support vivant avec des tissus mobiles et vascularisés. Reprenant la doctrine chirurgicale qui tend à imposer le principe «Jamais la première fois sur le patient», nous appliquons «Jamais la première fois sur l’animal». Les séances utilisant des animaux sont en nombre très limité et ne sont faites qu’après un enseignement avec validation préalable sur des simulateurs et substituts.

Réduction

Sur la précédente demande d’autorisation, l’évaluation prospective des besoins portait sur 650 animaux sur 5 ans. Le développement de la simulation ex vivo et le recours systématique aux substituts ou corps humain, nous a permis de n’utiliser réellement que 177 animaux. Chaque poste de chirurgie soit 1 animal est occupé par 2 participants (minimum) à 6 participants (maximum). En fin de TP après le décès de l’animal, des prélèvements (tissus, organes, membres) sont effectués. Ces pièces anatomiques permettent de réaliser d’autres enseignements au sein de la structure ou sont destinées à des équipes de recherche pour des tests préliminaires ou des mises en culture. Malgré la volonté de poursuivre le développement de substitut, l’augmentation du nombre de praticiens à former nous permet d’évaluer un effectif de 300 animaux sur 5 ans afin de couvrir l’ensemble des besoins de formations.

Raffinement

Durant la période d’acclimatation, les animaux sont hébergés sur de la litière. Nous leur donnons en complément des briques de litière compactées avec du pop-corn ce qui leur permet de faire de la recherche de nourriture et réduit les bagarres entre individus liées au stress du voyage et de leur arrivée. Quotidiennement, le personnel passe les voir pour donner à manger et interagir avec les individus permettant leur socialisation avec l’homme. Cette socialisation est faite par un enrichissement positif avec de la banane qui est très appréciée par le porc. Afin de détecter un mal-être, nous utilisons une grille de suivi individuel durant la période d’acclimatation. Durant la chirurgie, l’enregistrement des paramètres vitaux en continue associé à des alarmes sonores est complété par une vérification humaine toutes les 30 minutes effectuée par le personnel compétent dédié. Ce suivi permet de s’assurer du stade anesthésique et de son maintien pendant toute la durée de la procédure. Les données recueillies sont analysées et archivées pour apporter d’éventuelles améliorations. Pour lutter contre l’hypothermie (baisse de la température corporelle), les animaux sont installés sur une table chauffante à 37°C et sont perfusés avec du liquide de perfusion chaud (37°C). La présence d’un vétérinaire sur le site permet d’intervenir rapidement et à tous moments durant la période de présence de l’animal dans nos locaux.

Choix des espèces

Le porc charcutier présente une anatomie très proche de l’anatomie humaine. La taille des animaux d’un poids moyen de 30 à 35 kg est très adaptée à l’apprentissage de la chirurgie. Les animaux seront réceptionnés à 29 kg environ pour atteindre 35-37 kg (jour de chirurgie). L’utilisation d’animaux de 35 kg environ permet de bénéficier d’une taille d’organe représentative de ce que nous avons en chirurgie humaine. Ce sont des animaux prépubères (âge : 3 mois environ).

288 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ces souris, modifiées pour exprimer des récepteurs plaquettaires humains, reçoivent une injection d'anticorps puis un prélèvement de sang terminal à l'aorte, pour tester deux approches contre la thrombose artérielle. Le porteur indique que l'anesthésie peut perturber la respiration et que l'injection peut provoquer un saignement au point d'injection. Il décrit l'étape sur sang de souris comme un préalable "nécessaire" avant de passer aux essais in vivo.

Objectifs

Lorsqu'on se blesse, notre corps a un système pour arrêter les saignements, appelé hémostase. Les plaquettes sanguines jouent un rôle important dans ce processus. Lorsqu'un vaisseau sanguin est endommagé, les plaquettes se collent au vaisseau et ensemble, s'activent et forment une sorte de bouchon qui arrête le saignement. Cependant, ce processus peut également se produire de manière exagérée dans les artères malades, entraînant une thrombose artérielle qui désigne ainsi la formation d’un caillot sanguin dans les vaisseaux sanguins. Cela peut causer des problèmes graves tels qu'un accident vasculaire cérébral (un caillot au niveau du cerveau). Actuellement, il existe trois classes de médicaments utilisés en clinique pour traiter la thrombose artérielle, mais ils ont comme effet secondaire d'augmenter le risque de saignement. Dans ce projet, nous souhaitons tester deux nouvelles approches thérapeutiques pour réduire la formation de caillot. Elles consistent à cibler spécifiquement des récepteurs avec des anticorps, en utilisant des souris dans lesquelles ces récepteurs ont été remplacés par leurs équivalents humains. En utilisant ces modèles de souris spécialement conçus, nous espérons découvrir de nouvelles options de traitement pour prévenir la formation de thrombose sans augmenter le risque de saignement. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouveaux médicaments plus efficaces et plus sûrs pour les patients.

Bénéfices attendus

L'objectif est de trouver des traitements antiplaquettaires qui soient à la fois efficaces pour prévenir les caillots, mais qui aient également moins de risques de provoquer des saignements, ce qui pourrait être le cas de nos anticorps . Cela pourrait aider à améliorer le traitement des patients atteints de thrombose artérielle et à leur offrir des options thérapeutiques plus sûres et efficaces.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection (animal anesthésié) qui prend environ 1 minute. Après l’injection, il faudra attendre environs 10 minutes pour que celle-ci fasse effet et après le prélèvement de sang terminal (animal anesthésié) prend quant à lui environ 10 minutes. Ainsi, la durée totale de la procédure d’injection et de prélèvement est d’environ 20 minutes.

Impact sur les animaux

Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Une autre est le risque de saignement au site d’incision lors du prélèvement de sang. Enfin, l’injection des anticorps anti-GPIbalpha et de l’antiGPVI aux souris pourrait entrainer un saignement au site d’injection.

Devenir

Le prélèvement à l’aorte est un prélèvement terminal car la quantité de sang prélevée est très importante donc il est nécessaire après prélèvement de mettre les animaux à mort.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’anticorps spécifique sur la thrombose artérielle. C’est un processus complexes impliquant l’adhérence, l’activation et l’agrégation des plaquettes. Nous avons besoin de faire nos tests sur du sang de souris pour vérifier l’efficacité de nos approches thérapeutiques avant de pouvoir passer à des études in vivo chez la souris

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 16 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées. Nous avons ajouté des matériaux tels que des carrés de cellulose, des bâtonnets de coton et des morceaux de papier froissé pour qu'ils puissent organiser leur environnement comme ils le souhaitent. Nous avons également veillé à ce qu'ils ne se sentent pas seuls en les plaçant par groupes de 2 à 5 dans chaque cage. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées au maximum afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure). De plus, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi de limiter la souffrance et l’inconfort de l’animal. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entraîné. Les procédures sont sans réveil et l’animal sera anesthésié pendant la totalité des procédures.

Choix des espèces

L’utilisation de sang de souris pour évaluer la formation de caillot sanguin dans un contexte simplifié (in vitro) est un modèle bien maitrisé au sein du laboratoire et qui permet une évaluation précise de la formation d’un thrombus. Nous souhaitons aller vers le développement clinique d’anticorps dirigés contre nos récepteurs d’intérêts. Ainsi, la première étape consiste à étudier l’effet de nos anticorps in vitro avant de passer dans des modèles de thrombose artérielle réalisés dans la souris (in vivo). Il est donc nécessaire d’évaluer leurs efficacités sur sang de souris avant de démarrer les études in vivo. Ainsi, pour étudier nos récepteurs d’intérêt, nous utiliserons des souris spéciales modifiée génétiquement et exprimant ainsi des récepteurs humains. Ceci nous permettra de mieux comprendre les effets sur l’homme des molécules que nous souhaitons tester. Les souris seront utilisées au stade adule entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.

15 porcs vont être utilisé·es, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans des procédures menées sans réveil. Sur chaque animal, on provoque une embolie pulmonaire puis on aspire les caillots pendant six heures, non pour produire des connaissances mais pour entraîner cinq médecins à la fois à la thrombectomie. Le porteur décrit une hypoxémie profonde, un risque d'hémorragie et de perforation des artères pulmonaires, et héberge chaque porc seul un à cinq jours avant l'intervention. Il affirme qu'une formation collective sur patients est impossible en contexte d'urgence et qu'il n'existe pas d'alternative non animale pour simuler une embolie pulmonaire.

Objectifs

L'embolie pulmonaire (EP) est une affection définie par l'obstruction d'une artère pulmonaire par des caillots d’incidence annuelle estimée jusqu’à 95 pour 100 000 en Europe. Elle peut être responsable d'une défaillance cardiopulmonaire pouvant provoquer le décès du patient. Par conséquent, un traitement rapide et aigu est indiqué. Récemment, la thrombectomie mécanique percutanée artérielle pulmonaire a été proposée comme une approche alternative ou complémentaire pour soulager la défaillance cardiopulmonaire. Cette procédure permet contrairement à l'approche chirurgicale, d'aspirer les caillots au sein du vaisseau sous simple anesthésie locale et dans un temps plus rapide (entre 15 à 30 minutes), ce qui lui confère des avantages indéniables dans le domaine de l'urgence. Elle consiste en l'introduction au sein d'une veine du pli de l'aine d'un cathéter qui est guidé grâce aux rayons X par une technique de radiologie interventionnelle. Une fois en place, le cathéter permet d'être au contact des thrombus et de les aspirer. Des études récentes ont démontré une amélioration significative de la survie des patients ainsi qu’une durée de séjour plus courte. Cependant, malgré ces études, seuls quelques médecins sont formés à l'échelle nationale, de nombre trop insuffisant pour permettre une prise en charge optimale des patients dans le contexte de l'urgence. Cela limite en conséquence l'accès de ce traitement aux patients 7j/7 et 24h/24 et accentue les inégalités au sein du territoire français. Afin de palier à ce problème, nous proposons de former 75 médecins à la réalisation de cette procédure en procédant à un modèle d'embolie pulmonaire chez le porc.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent plusieurs aspects de la prise en charge de l'embolie pulmonaire. Tout d'abord, les bénéfices sont de former et certifier 75 médecins à la réalisation de cette procédure afin de s’assurer de la bonne réalisation du geste, ce qui optimisera les pratiques professionnelles. Cela rentrera aussi dans le cadre de l'accréditation des équipes. Les bénéfices sont de standardiser les prises en charge médicales dans les centres référents. Les bénéfices sont de proposer en urgence cette procédure à l'ensemble des patients atteint d'une embolie pulmonaire à risque intermédiaire élevé (5%) et à haut risque (20%) de décès. Au total, les bénéfices sont d'augmenter la survie des patients en permettant la réalisation standardisée et en urgence de la thrombectomie artérielle pulmonaire.

Procédures

Une seule procédure est prévue sur porc. Ces procédures se font sur des animaux sous anesthésie générale, sans réveil. La durée de la procédure est de 6 heures, comprenant 2 heures de mise en place et 4 heures de procédure de thrombectomie.

Impact sur les animaux

Ce protocole comporte une seule procédure sans réveil. Les effets néfastes du modèle d'embolie pulmonaire sont : - une hypoxémie profonde, comparable à celle observée chez les patients de réanimation. Le ressenti de l’hypoxémie est nul sous ces régimes de sédations. De plus, le modèle unilatéral choisi permet de ne pas engendrer de mauvaise tolérance hémodynamique. - un stress de l’animal pendant son hébergement avant manipulation : la procédure expérimentale ne nécessitant qu’un seul porc à la fois, celui-ci peut être hébergé seul pendant une période de 1 à 5 jours. - une hémorragie des voies d'abord pendant la phase de chirurgie des voies d'abord. - une perforation des artères pulmonaires pendant la phase de navigation et d'aspiration.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Le réveil en condition d'embolie pulmonaire n'est pas justifiable expérimentalement compte tenu des objectifs de la formation et de la souffrance potentiellement engendrée lors du réveil.

Remplacement

Un modèle animal doit être utilisé car il n’est pas possible de réaliser une formation collective de plusieurs médecins chez les patients compte tenu du contexte d'urgence et de gravité lié à l'embolie pulmonaire. La réalisation de la procédure nécessite l'aspiration de thrombus ce qui aspire aussi du sang. Le nombre d'aspirations réalisés par 5 médecins serait donc responsable d'une perte sanguine inacceptable pour les patients. Il n’existe pas à ce jour d’alternative non humaine, non animale pour simuler une embolie pulmonaire.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé selon le nombre de médecins à former, soit 15 nouveaux médecins par an qui assurent la permanence des soins. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous prévoyons 1 animal pour 5 médecins ce qui laisserait pour 4 heures d'anesthésie un créneau de 48 minutes par médecin. Ce temps correspond à 2 à 3 fois le temps nécessaire chez l'Homme permettant ainsi la maitrise progressive de la procédure.

Raffinement

Le protocole d’anesthésie se poursuivra avec une analgésie et sédation pour que l’animal ne ressente aucune douleur. L’animal est surveillé en continu tout au long de l’expérimentation à l’aide de points limites adaptés à cette procédure. La réalisation de la procédure nécessite des compétences en radiologie interventionnelle que l’expérimentateur et les médecins apprenants possèdent compte tenu de leurs activités de soignants.

Choix des espèces

Le porc est un modèle à la fois anatomiquement et physiologiquement proche sur le plan respiratoire et vasculaire des primates et de l’homme adulte. De plus, l'anatomie vasculaire et cardiaque de l’animal permet l’utilisation de la même technique de thrombectomie que chez l’homme. Le modèle d'embolie pulmonaire de porc est un modèle qui a fait l'objet de plusieurs études scientifiques, proposant plusieurs solutions à la fois temporaire et définitive d'occlusion des artères pulmonaires. La tolérance hémodynamique de l'animal a été caractérisé expérimentalement, mettant en évidence l'absence de retentissement sur les pressions pulmonaires lors de l'occlusion unilatérale du poumon. Ainsi, ce modèle est particulièrement adaptée à la réalisation itérative de thrombose et aspiration sans un risque élevé de perte de l'animal pendant la procédure. Porcs : stade de développement : 12 semaines (35+/- 2kg). Le stade de développement des animaux correspond à une maturation pulmonaire proche de celle de l'adulte. La taille et le poids des animaux sont compatibles avec une manutention aisée lors des expériences, et est adapté à la table opératoire de la salle de cathétérisme.

70 souris vont être utilisé·es, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, dans des procédures menées sans réveil. Un volet crânien est ouvert et des électrodes sont implantées dans le cerveau pendant trois à quatre heures sous anesthésie, avec administration d'une substance pro-inflammatoire pouvant aller jusqu'au choc septique, pour mettre au point un microcapteur mesurant une cytokine de la neuroinflammation. Le porteur présente cet outil comme un moyen futur de réduire le nombre d'animaux, les mesures actuelles étant destructrices. Il affirme que l'interaction entre système nerveux et système immunitaire ne peut pas encore être modélisée in vitro et que le recours à l'animal vivant est indispensable.

Objectifs

La neuroinflammation fait référence à un large spectre de réponses immunitaires du système nerveux central, impliquant non seulement les cellules résidentes du cerveau mais aussi des cellules immunitaires sanguines. Ces types cellulaires communiquent entre eux en libérant des cytokines, des molécules de signalisation cellulaire capable de moduler la neuroinflammation, en exerçant des actions aussi bien pro- qu’anti-inflammatoires. Une neuroinflammation excessive ou prolongée est au cœur d’un large éventail de pathologies neurologiques comme la maladie d’Alzheimer ou la sclérose en plaques, ou les agressions cérébrales aiguës comme les accident vasculaires cérébraux ou les traumatismes crâniens. Pour mieux comprendre le rôle de la neuroinflammation dans les maladies neurologiques, il est nécessaire de disposer d'outils efficaces pour monitorer la neuroinflammation in vivo. La mesure des concentrations de différentes cytokines pro- et anti-inflammatoires in vivo est une stratégie importante pour comprendre l'état neuroinflammatoire du cerveau. Les techniques actuelles pour doser les cytokines sont destructrices et impliquent la mise à mort de l’animal pour obtenir une seule mesure. Elles ne permettent pas de suivre ces concentrations dans le temps. Les techniques d'imagerie cérébrale sont mal adaptées au suivi des cytokines cérébrales car il n'existe pas de marqueurs spécifiques. Nous proposons ici de développer des microcapteurs électrochimiques qui peuvent être implantés dans le cerveau avec une perturbation limitée du tissu nerveux, qui détecteront spécifiquement les cytokines clés dans le cerveau vivant et suivront leurs concentrations dans le temps. Cette approche reposera sur le développement de polymères à empreintes moléculaires. Ils peuvent être déposés à la surface d'une électrode et lorsque la molécule ciblée se lie au polymère, des modifications électrochimiques peuvent être mesurées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider in vivo l’utilisation d’un nouvel outil de monitorage de l’IL1b chez la souris. Si nos microélectrodes sont bien sélectives et sensibles à l’IL1b in vivo, elles seront mises à disposition de la communauté scientifique pour permettre des mesures longitudinales qui se substitueront avantageusement aux mesures destructives réalisées actuellement qui ne permettent qu’une mesure ponctuelle impliquant la mise à mort de l’animal. Ainsi, ce nouvel outil devrait considérablement stimuler la rechercher sur l’IL1b et sur les mécanismes de la neuroinflammation. La capacité de mener des expériences de monitorage pouvant décrire l’intégralité d’une cinétique pendant plusieurs heures chez le même animal permettra de réduire le nombre d’animaux qui était nécessaire jusqu’à présent pour décrire le décours temporel d’un phénomène biologique.

Procédures

Réalisation d’un volet osseux crânien et implantation d’électrodes intracérébrales sous anesthésie générale et analgésie. La durée totale de l’expérimentation sous anesthésie est de 3-4 h.

Impact sur les animaux

Ce projet est entièrement réalisé sur des animaux anesthésiés sans réveil. Les nuisances sur le bien-être animal sont donc très réduites. L’administration lipopolysaccharide est pro-inflammatoire et peut conduire à une baisse de la pression artérielle, une baisse de la résistance vasculaire périphérique, compensée en partie par une augmentation du rythme cardiaque. Cet effet peut aller jusqu’au choc septique. Cependant, ces possibles effets néfastes seront toujours induits sous anesthésie et analgésie.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de chirurgie en raison du caractère invasif de la procédure

Remplacement

Les phénomènes de neuroinflammation reposent sur l’interaction entre le système nerveux central et le système immunitaire sanguin périphérique. Cette interaction ne peut pas encore être modélisée in vitro. Dans les tranches de cerveau, notamment, les capillaires sanguins sont découpés et le flux sanguin est absent. Pour cette raison, le recours à l’animal vivant est indispensable à la fois pour mettre au point des outils d’investigation in vivo comme c’est le cas ici, et pour mener des expériences scientifiques de monitorage de cytokines, qui est l’objectif de cette mise au point.

Réduction

Notre plan d’expérience est prévu avec un nombre d’animaux minimal de 10 souris (incluant deux expériences non concluantes par groupe à cause de biocapteurs cassés ou décès en cours d’anesthésie) permettant d’effectuer des comparaisons statistiques. L’approche statistique consiste à pratiquer une analyse de normalité et une analyse de variance. Pour réduire le nombre d’animaux total utilisé pour chaque procédure, nous pratiquerons une analyse de puissance dès l’obtention de six mesures concluantes indépendantes. Cette approche estimera le nombre minimal d’expériences permettant de mettre en évidence un effet statistiquement significatif, en fonction de l’effet mesuré expérimentalement. Notons que des comparaisons statistiques seront pratiquées dès l’obtention de six mesures indépendantes et si l’effet attendu est déjà significatif, les expériences seront arrêtées sans utiliser la totalité des 10 animaux par groupe.

Raffinement

Pour prévenir la douleur, un traitement analgésique est prévu avant et pendant la chirurgie. Il consistera en une injection intrapéritonéale de buprenorphine et de lidocaïne pratiquées 30 min avant l’incision de la peau. Concernant l'angoisse infligée à l'animal, elle est réduite par un hébergement par groupes de deux à trois dès l’arrivée au laboratoire et par l’insertion d’un enrichissement dans les cages d’hébergement (tunnel de plastique rouge, matériau de nidification). Tout au long du projet et dès la réception des animaux, des points limites sont appliqués afin de mettre fin aux souffrances des animaux si cela s'avère nécessaire.

Choix des espèces

La souris C57 Bl6/J est une espèce qui a été largement caractérisée en neuroscience. Cette souche de souris a servi de fond génétique à la création de la souris C57BL/6J-Il1bem2Lutzy/Mmjax déficiente pour l’IL1b. Les procédures permettant de réaliser cette mesure chez la souris ont été décrite dans la littérature et serviront de base à notre approche expérimentale. Souris adultes de 7-12 semaines pour bénéficier d'une taille maximale