Cochons

18 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Douze sont infectés par un coronavirus respiratoire porcin par voie trachéale, puis subissent des lavages broncho-alvéolaires sous anesthésie et des écouvillonnages nasaux et rectaux répétés, six autres servant de témoins. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une hyperthermie, des troubles respiratoires et une baisse d'appétit, sans signes sévères attendus. Il retient le porc comme "espèce cible" du virus et prévoit aussi de récolter des sérums pour produire des réactifs de diagnostic.

Objectifs

Le coronavirus respiratoire porcin (ou PRCV pour porcine respiratory coronavirus) a été isolé pour la première fois en Belgique dans un élevage porcin en 1984 et s’est répandu massivement au sein des élevages européens, puis dans le reste du monde. Les premières études menées sur cet Alphacoronavirus ont montré qu’il était issu du virus de la gastro-entérite transmissible (GET) suite à des modifications génétiques lui permettant d’infecter les voies respiratoires alors que le virus de la GET ciblait les voies intestinales. Le PRCV entraîne généralement des signes cliniques respiratoires modérés mais il peut entraîner une atteinte respiratoire plus complexe, notamment quand il est associé au virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin ou au virus influenza A porcin. Des investigations menées récemment dans des élevages français où les porcs présentaient un syndrome respiratoire ont permis d’isoler de nouvelles souches du PRCV. Leurs génomes présentent quelques différences avec ceux des souches isolées dans les années 80-90 et les premières études menées in vitro indiquent que certains de ces virus se multiplient efficacement dans des cellules de trachée de porc alors que d’autres n’y parviennent pas. L’étude expérimentale proposée a pour objectif de mesurer et de comparer les manifestations cliniques, les voies d’excrétion virale et les réponses immunitaires de porcs infectés soit par une souche de PRCV se multipliant en cellules de trachée (souche A), soit par une souche de PRCV ne se multipliant pas dans ces cellules (souche B). Des sérums seront également collectés en fin de procédure afin de disposer de nouveaux réactifs pour le diagnostic sérologique. Pour cela, 6 porcs seront inoculés par la souche A du PRCV, 6 porcs seront inoculés par la souche B du PRCV et 6 autres porcs recevront du milieu de culture et serviront de témoins. Dans un souci de raffinement, un soin particulier sera apporté au suivi clinique de chaque animal au quotidien. En cas d’altération importante de l’état de santé (modification sévère de la température corporelle ou perte de poids anormalement élevée par exemple), les animaux concernés seront mis à mort après anesthésie.

Bénéfices attendus

Les données collectées permettront d’actualiser le modèle expérimental d’infection par le PRCV et d’acquérir de nouvelles connaissances quant au pouvoir pathogène de souches récemment isolées en élevage, en lien avec leurs caractéristiques génétiques et leurs propriétés fonctionnelles évaluées in vitro par ailleurs. De plus ce projet permettra d’évaluer les différentes voies d’excretion du virus et de produire des réactifs biologiques nécessaires au diagnostique sérologique.

Procédures

Les animaux (n=18) recevront du virus PRCV par voie trachéale (n=12) ou du milieu de culture par voie trachéale (n=6). Les porcs inoculés par du virus seront soumis à : 1/ quatre lavages broncho-alvéolaires sous anesthésie générale de courte durée (

Impact sur les animaux

L’infection par le PRCV peut provoquer une hyperthermie transitoire, des troubles respiratoires et une baisse d’appétit dans les jours suivant l’infection. Il n’est pas attendu de signes cliniques sévères lors de cette expérimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour pouvoir récolter des prélèvements de poumons

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer/comparer les manifestations cliniques, l’excrétion virale et les réponses immunitaires de l’hôte naturel, après infection par deux souches de PRCV présentant des phénotypes différents in vitro. Ceci nécessite donc de passer par des expériences sur l’animal vivant.

Réduction

Il est nécessaire d’avoir 3 lots d’animaux au total pour répondre aux objectifs qui sont d’étudier et de comparer les manifestations cliniques, la multiplication/l’excrétion virale et les réponses immunitaires des porcs infectés par une souche de PRCV qui se multiplie in vitro sur cellules de trachée (souche A) versus une souche de PRCV qui ne se multiplie pas in vitro sur cellules de trachée (souche B): 1 lot inoculé par la souche A de PRCV, 1 lot inoculé par la souche B de PRCV et 1 lot inoculé par du milieu de culture (témoin). Les lots seront constitués chacun de 6 porcs. Cet effectif est le minimum nécessaire par groupe pour des analyses statistiques robustes compte tenu de la variabilité individuelle attendue sur les paramètres mesurés (croissance, virémie, réponses immunes, etc.).

Raffinement

Pendant tout l’essai, les animaux feront l’objet d’un examen clinique quotidien au cours d’une visite dans les animaleries et l’évolution pondérale sera suivie par des pesées individuelles quotidiennes, à partir du jour de l’inoculation jusqu’à J+4 post-inoculation, puis hebdomadaires jusqu’à la fin de la procédure expérimentale. La consommation alimentaire sera mesurée chaque semaine. Afin de diminuer la douleur pouvant être liée aux prélèvements : - les écouvillonnages répétés tous les 2 jours seront réalisés alternativement dans la narine droite puis la narine gauche afin de limiter l’irritation/lésion de la zone de prélèvement. - les prélèvements seront réalisés autant que de possible sans contention des animaux au lasso.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du Coronavirus respiratoire porcin. Les animaux seront sevrés à 4 semaines d’âge et auront 7 semaines pour s’acclimater à leur lieu d’hébergement avant le début de la procédure. Tous les animaux seront inoculés à 12 semaines d’âge. Cet âge correspond à un moment où le système immunitaire est considéré comme mature.

8 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'environ 2 h 30 sous anesthésie pour mettre en place une anse intestinale, puis est euthanasié pour prélever l'intestin, afin de tester des acides aminés encapsulés dans l'alimentation du porcelet au sevrage. Le porteur indique un risque de douleur abdominale, de déhiscence de la plaie et de péritonite. Il présente les bénéfices attendus d'abord pour la croissance des porcs et pour les éleveurs, la filière et le consommateur.

Objectifs

Le sevrage précoce et brutal des porcelets tel que réalisé dans la majorité des élevages à travers le monde est une période à risque pour la santé des porcelets. En effet, les porcelets sont sevrés généralement entre 3 et 4 semaines, un âge où leurs systèmes digestif et immunitaire sont encore immatures. Le développement de solutions nutritionnelles a depuis de nombreuses années mobilisé les acteurs de l’alimentation animale et de la recherche pour accompagner la démédicalisation du sevrage des porcelets. Parmi ces solutions nutritionnelles, celles ciblant le microbiote digestif et la production de métabolites bactériens d’intérêt peuvent limiter la dysbiose et l’inflammation digestive résultant du sevrage et pouvant générer des troubles digestifs. Les acides aminés (AA), nutriments essentiels à la croissance et à la santé des porcs, sont aussi des nutriments pour les micro-organismes présents dans le tube digestif. La fermentation de certains AA par les micro-organismes produit des métabolites exerçant des propriétés antiinflammatoires, trophiques, antioxidantes, etc. sur la muqueuse digestive. L’objectif général de ce projet est d’évaluer l’intérêt d’apporter dans l’alimentation du porc des AA libres et encapsulés pour ne pas être absorbés par l’intestin grêle et être disponibles pour produire, par fermentation, des métabolites dans les parties distales du tube digestif. Des effets positifs de ces métabolites sur la physiologie et les défenses intestinales et in fine sur la santé du porcelet au sevrage sont attendus. Les questions de recherche sont : 1-L’identification de métabolites d’intérêt et de leurs AA précurseurs exerçant des effets sur la fonction de barrière de l’épithélium intestinal in vitro et des effets antiinflammatoires et immunorégulateurs sur la muqueuse digestive in vivo (anses intestinales isolées et chez le porc). 2-La caractérisation de l’enveloppe lipidique garantissant la délivrance des AA précurseurs sur le site de fermentation (intestin distal). Les anses intestinales reprises dans le présent document concernent la première question. Les autres objectifs sont présentés au lecteur afin de lui fournir tout le contexte de l’étude.

Bénéfices attendus

Outre d’être des nutriments pour l’animal, les acides aminés (AA) sont aussi des nutriments pour le microbiote digestif. Certains de ces acides aminés vont modifier la composition du microbiote et leur fermentation par ce microbiote produit des métabolites bactériens qui peuvent exercer des effets bénéfiques sur la physiologie et les défenses intestinales. Le projet vise à identifier, pour le porc, des métabolites et les AA précurseurs d’intérêt ainsi que la réponse du tissu intestinal et du microbiote digestif en présence des AA ou des métabolites des AA, à caractériser la matrice AA/capsule lipidique qui permet la délivrance des AA précurseurs dans les parties basses de l’intestin et de réaliser un essai in vivo en conditions d’élevage contrôlées afin de montrer les effets favorables de l’apport d’AA encapsulés sur la santé et la croissance des porcelets en période de post sevrage. À court terme des connaissances scientifiques vont être générées et feront l’objet de publications. Dans un second temps il y aura : Bénéfice pour la santé des porcs et de manière plus générale pour leur bien-être (moins de trouble intestinaux) ; Bénéfice en terme de croissance pour les porcs bénéficiant des ces AAs (croissance optimisée) ; Bénéfice pour les éleveurs de porcs (des porcs plus sains qui grandissent mieux) ; Bénéfice pour le consommateur (une viande de qualité accrue encore plus sûr en terme microbiologique) et Bénéfice pour l’industriel

Procédures

Anesthésie générale et chirurgie de mise en place d’une anse intestinale : tous les animaux du projet, 1 chirurgie par animal, sur animaux anesthésiés et sous traitement analgésique, durée envison 2H30. Prise de sang : Un tube de 10 mL sur tous les anx du projet, 2 fois/porc (le jour de l’anesthésie pour la chirurgie et 48H après), sur animaux anesthésiés, 2 minutes

Impact sur les animaux

Suite à l’intervention, les animaux pourraient ressentir une douleur abdominale malgré l’analgésie. Ils sont donc susceptibles d’être apathiques, prostrés et de ne pas s’alimenter. Exceptionnellement, on pourrait avoir une déhiscence de plaie (rupture des sutures cutanées), une infection sur la ligne de suture ou une perméabilité de la suture termino-terminale de l’intestin qui engendrerait une péritonite. L’imperméabilité de la suture est vérifiée après sa réalisation.

Devenir

Le projet est de réaliser un modèle animal pour tester finalement l’AA préalablement sélectionné sur organoide intestinal, le modèle est celui des anses intestinales qui nécessite une chirurgie. Les animaux à la fin de la procédure seront tous euthanasiés pour réaliser les prélèvements d’intestins afin d’analyser l’expression de transcrits associés à la réponse immune intestinale et de déterminer la composition du microbiote intestinal et le métabolome de contenus digestifs par résonnance magnétique nucléaire et par spectrométrie de masse.

Remplacement

Les AAs ont été sélectionnés et évalués au préalable en utilisant des organoïdes porcins. Toutefois les organoïdes (uniquement constitués de cellules épithéliales) ne peuvent pas remplacer totalement les anses ligaturées qui se rapprochent beaucoup plus de la réalité (nombreux types cellulaires, apport sanguin et lymphatique…). Les anses qui peuvent être réalisées en grand nombre chez un même animal (>10 dans le jéjunum) permettent de limiter le nombre d’animaux utilisés par rapport à des approches plus conventionnelles.

Réduction

Ce modèle d’anses intestinales permet d’évaluer l’impact de l’AA sélectionné sur la muqueuse intestinale de façon précise et ciblée (espace restreint, sans transit). Nous pouvons ainsi plus facilement tester le bienfait de l’acide aminé sur la muqueuse intestinale et le microbiote porcin. Le modèle animal d’anses instestinales permettra de tester un acide aminé (2 « boudins ») versus un témoin sur 4 animaux. Le nombre d’animaux et le nombre de replicats (boudins) par animal est calculé de facon à avoir une représentativité statistique suffisante pour réaliser un test non paramétrique pour l’analyse de l’expression génique.

Raffinement

Les expérimentations seront menées à bien selon le principe des 3R. Les porcs seront hébergés par 2 afin d’éviter un isolement et pour laisser libre court à leurs interactions sociales dans une case dont la température ambiante sera contrôlée (25 ± 2 °C, adaptée à l'âge des animaux). Ils auront à disposition des chaines ou jouets suspendus pour machouiller et un ballon. Une surveillance bi-quotidienne des animaux sera mise en œuvre afin de veiller à leur bien-être. Les animaux seront sous anesthésie générale avec ventilation mécanique assistée et monitoring de paramètres physiologiques (température, saturation en oxygène, fréquence cardiaque). Un analgésique (buprénorphine) sera administré avant même le début de la chirurgie et le traitement analgésique sera continu sur la période post-opératoire. Les animaux seront manipulés dans le calme. Les deux animaux de chaque journée seront choisis comme étant des partenaires sociaux d’un même groupe. Pendant la semaine d’acclimatation au nouvel établissement, les animaux seront familiarisés à leurs soigneurs par l’administration de récompenses sucrées (type fraise tagada). Pendant le suivi post-opératoire, les visites seront plus fréquentes avec un passage en soirée.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du projet. Les animaux auront entre 28 et 40 jours d’âge. À ce stade ; les animaux péseront entre 8 et 15 kg, ce qui facilitera leur manipulation, la chirurgie et le suivi post-opératoire.

48 porcs vont être utilisés puis engraissés et abattus de façon classique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont anesthésiés à trois reprises pour un scanner de la composition corporelle et élevés en loge individuelle pendant la croissance. Le projet évalue un critère de formulation d'aliments visant à réduire le coût et l'impact environnemental de l'élevage porcin. Le porteur affirme que cette évaluation "nécessite" d'être réalisée sur l'espèce porcine et inscrit ses objectifs dans le "bien-être des animaux non-humains" et les attentes sociétales.

Objectifs

L'objectif du projet est de comparer la réponse des porcs en croissance alimentés avec des aliments se différenciant par le choix des matières premières (céréales, tourteaux) et la modulation apportée par des traitements technologiques sur leurs caractéristiques nutritionnelles et d'évaluer l'applicabilité d’un nouveau critère de formulation intégrant ces modifications nutritionnelles. Les aliments pour porcs sont préparés en mélangeant des matières premières qui apportent les nutriments nécessaires à la couverture des besoins des animaux en énergie (part la plus onéreuse de l'aliment), en acides aminés (suffisamment pour la production de viande mais sans excès pour des raison économiques et environnementales) et en minéraux (suffisamment pour la solidité osseuse mais sans excès pour des raison économiques et environnementales). Des connaissances scientifiques récentes ont été produites sur leur utilisation digestive et métabolique selon les process appliqués lors de la production des matières premières ou de l’aliment. Elles permettent de proposer un critère de formulation synthétique intégrant ces effets, qu’il est nécessaire d’évaluer en conditions pratiques. Cela contribuera aux efforts déployés par la filière pour améliorer l'efficacité d'utilisation des ressources par les porcs à la fois pour réduire la part de l’alimentation dans le coût de production et pour répondre aux attentes sociétales pour un moindre impact environnemental et un meilleur bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Une bonne connaissance des valeurs nutritionnelles des aliments pour animaux est essentielle pour optimiser l’efficacité alimentaire et ainsi réduire les coûts de production associés à l’alimentation, économiser les ressources, réduire l'impact sur l'environnement par une réduction des apports de nutriments en excès. La formulation des aliments repose encore le plus souvent sur des valeurs nutritionnelles déterminées à partir de matières premières présentées sous forme de farine. Or des traitements technologiques peuvent être appliqués aux aliments (par exemple lors de la granulation) ou sur directement sur les matières premières (par exemple lors de l'extrusion ou l'expansion) qui sont susceptibles de modifier leur utilisation par les animaux. Une fois les modifications induites caractérisées (étape en amont de ce projet), les connaissances scientifiques acquises seront intégrées dans un critère synthétique permettant d'intégrer lors de la formulation les effets des traitements technologiques appliqués lors de la fabrication de l'aliment ou la préparation des matières premières sur la valeur nutritionnelle de la formule. Les résultats du projet contribueront à la transposition de ce critère de façon opérationnelle dans les services de formulation des usines d'aliment ou directement chez les éleveurs qui fabriquent leur aliment à la ferme.

Procédures

Aucun prélèvement n'est réalisé sur les animaux. Les porcs sont anesthésiés par un protocole classique d'anesthésie vétérinaire : injection (aiguille 40 x 1.2 mm) intramusculaire de xylazine (Rompun® à 10 ml/100 kg) et de kétamine (Imalgène® à 20 ml/100 kg pour les porcs de poids supérieur à 35 kg et 25 ml/100 kg pour ceux de poids inférieur à 35kg). L'acquisition d'images scanner prend environ 10 mn. L'anesthésie doit donc durer suffisamment longtemps pour permettre un transport de l'animal endormi jusqu'au scanner, la prise de mesure et le transport retour à la case de réveil, soit une vingtaine de minutes.

Impact sur les animaux

Les phases les plus critiques pour les animaux correspondent à l'élevage en loge individuelle pendant la phase de croissance et à l'anesthésie et la contention mises en oeuvre pendant les trois mesures de la composition corporelle individuelle. L’élevage en loges individuelles permet d’attribuer à chaque animal une aire de vie qui comprend une zone d’alimentation, d’abreuvement, de repos et de déjection. Elle ne leur permet pas de se mélanger avec leurs congénères mais leur permet de se voir au travers des cloisons ajourées, de se sentir, de s'entendre, et aux porcs de deux cases voisines de se toucher. Les procédures d’anesthésie et le suivi constant des animaux au réveil permettent de limiter au maximum le stress autour de la mesure de la composition corporelle par tomographie. L'anesthésie permet d'obtenir des animaux endormis et détendus pour des images de bonne qualité. La contention des animaux endormis pendant le déplacement aller-retour entre la loge et le scanner ainsi que pendant la prise d’image est réalisée avec un matelas à dépression identique à celui utilisé par les pompiers pour le transport de personnes. Les porcs sont ajeûnés avant l’anesthésie afin d'éviter les remontées gastriques dans l'œsophage et la trachée et éviter d'obstruer les voies respiratoires jusqu’au réveil, et sont surveillés après l’anesthésie jusqu’à reprise de la consommation normale d’aliment et d’eau.

Devenir

Les animaux sont tous gardés en vie à la fin des procédures. Ils seront engraissés en groupe pendant 1 mois après la période expérimentale et leur abattage interviendra de façon classique pour ces animaux de rente, à la fin de la période d'engraissement.

Remplacement

L'évaluation de l'applicabilité d'un nouveau critère de formulation pour améliorer l'efficience alimentaire des porcs selon la technologie appliquée lors de la préparation des matières premières et la fabrication des aliments pour porcins nécessite d’être réalisée sur l’espèce porcine et sur animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux mis en essai (12 par lot) est limité au strict nécessaire pour être en mesure de mettre en relation précisément l'ingestion de nutriments et les dépôts tissulaires associés pendant l'engraissement. Cet effectif permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour mettre en évidence un écart de 2 points de pourcentage de teneur en gras et en muscle dans l'animal. L'élevage en loge individuelle permet de limiter le nombre d'animaux à anesthésier pour le même nombre d'unités expérimentales (12/lot) et une mise en relation plus précise entre les nutriments ingérés et les tissus déposés que si ces mesures étaient réalisées sur des porcs élevés en case (donc plus d'animaux) sans possibilité de quantifier leur ingestion alimentaire individuelle (moins de précision). Les données seront soumises à une analyse statistique qui intègre le lot et la répétition en effets principaux, et le porc en unité expérimentale.

Raffinement

Contrairement aux mesures faites après l'abattage, la tomographie est une technique non invasive qui permet de caractériser la composition corporelle en réduisant le nombre d'animaux, chacun étant suivi à 3 stades de croissance. Les aliments sont formulés pour couvrir les besoins nutritionnels des porcs. Ils sont distribués à volonté et les porcs disposent d'une distribution d'eau également à volonté. La température ambiante est régulée par un système de ventilation qui permet de maintenir les animaux dans leur zone de confort thermique.

Choix des espèces

L'évaluation de l'applicabilité d'un nouveau critère de formulation pour améliorer l'efficience alimentaire des porcs selon la technologie appliquées lors de la préparation des matières premières et la fabrication des aliments pour porcins nécessite d’être réalisée sur l’espèce porcine. Les porcs seront suivis depuis leur entrée en engraissement vers 68-70 jours d'âge jusqu'à environ 150 jours d'âge (vers 115 kg de poids vif). La comparaison de la croissance des animaux se fera pendant cette période.

17 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par deux coronavirus porcins pour étudier la recombinaison virale, avec écouvillonnages fécaux quotidiens pendant dix jours, puis tués pour prélever les tissus. Le porteur indique que l'infection peut provoquer des hyperthermies, une baisse d'appétit et des diarrhées légères. Il affirme que les modèles cellulaires miment rarement la complexité de l'animal et qualifie l'expérimentation animale d'"essentielle" pour reproduire l'environnement naturel de la recombinaison.

Objectifs

L'objectif du projet est d'améliorer la compréhension des mécanismes de recombinaison chez les coronavirus, suite à l'émergence du SARS-CoV-2, en utilisant comme modèle deux coronavirus porcins, montrant depuis 2009 des événements de recombinaison naturelle. La recombinaison génétique virale, formation de virus chimériques à partir de souches parentales, contribue significativement à la variation génétique des virus ARN et joue, avec les mutations, un rôle important dans l'aptitude de ces derniers à évoluer et s'adapter à un nouvel environnement.

Bénéfices attendus

Les connaissances générées dans le cadre de ce projet permettront d'évaluer si nous arrivons à reproduire des événements de recombinaison entre les deux souches de coronavirus porcins et plus précisément d'estimer la fréquence associée de ces évènements et la caractérisation des génomes recombinants identifiés.

Procédures

Prélèvement de fèces par écouvillon les J1, J2, J3 jusqu’à J10 - 1 fois par jour - quelques minutes d'intervention par prélévements.

Impact sur les animaux

L'infection chez des porcelets de plus de 3 semaines par les souches étudiées est moyennement virulente. Elle devrait induire quelques hyperthermies et une diminution temporaire d'appétit. Des épisodes de diarrhées légères sont possibles.

Devenir

Les porcs seront mis à mort à la fin de l'étude afin de prélever les tissus.

Remplacement

Les approches d’infection de virus en modèle alternatif in vitro type lignées cellulaires sont sujettes à critique car ces cultures miment rarement la complexité cellulaire et la totalité des interactions présentent dans l’animal. L'expérimentation animale est ainsi essentielle dans l'optique de mimer l'environnement naturel avec tous les facteurs prédisposant à la recombinaison.

Réduction

Le nombre d’animaux impliqué dans chaque groupe constitue un minimum nécessaire pour des analyses statistiques robustes (test ANOVA et de Student). En effet, nous ne pouvons prévoir l’efficacité de recombinaison entre le GETv et le DEPv, ainsi un nombre plus élevé de porcelets co-infectés (8 porcelets) est nécessaire en comparaison aux animaux témoins et mono-infectés GETv ou DEPv (3 porcelets par groupe) qui montrent une très faible variabilité.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes stables avec enrichissement du milieu. Le bien-être animal sera pris en compte avec la constitution suite au sevrage de groupes d’élevage avec un nombre stable (autant que possible) tout au long d’un essai, eau et nourriture à volonté, la surface par animal, la mise à disposition d’objets manipulables, la présence de lampes chauffantes et d’une plaque de couchage si l’âge des animaux le justifie, la surveillance des animaux afin de déceler la survenue de points limites et d’y remédier. Après chaque inoculation en particulier, et tout au long du séjour de ces animaux dans nos animaleries, les porcs seront observés quotidiennement.

Choix des espèces

Seuls les porcs sont sensibles à l’infection par les virus de la GET et de la DEP. Il est donc indispensable d’avoir recours à cette espèce animale pour cette étude. Porcelets à partir de 8 kg de poids vif (en post-sevrage plus âgés que 3 semaines pour diminuer les symptômes tout en favorisant l’infection).

24 porcs adultes vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans des protocoles de prélèvement d'organes. Chaque animal reçoit un cathéter jugulaire, quatre plaies par excision chirurgicale ou par brûlure thermique, des biopsies répétées et cinq prélèvements sanguins, pour tester un pansement destiné aux grands brûlés humains. Le porteur affirme que la peau du porc est "le meilleur modèle" de la cicatrisation humaine et présente l'étude comme le dernier passage avant l'essai chez l'homme. Sur le remplacement, il indique que ces tests de tolérance et d'efficacité doivent réglementairement passer par un modèle animal après les étapes in vitro et ex vivo.

Objectifs

Les brûlures constituent un important problème de santé publique, avec près de 11 millions de personnes dans le monde subissant annuellement des brûlures suffisamment graves pour nécessiter des soins médicaux. Le besoin de la prise en charge des brûlures est de restaurer le plus rapidement possible et complètement la fonction de la barrière cutanée, évitant ainsi la survenue de cicatrices, d’infections et de diminuer la douleur. Il n'existe actuellement aucun traitement des brûlures qui soit en mesure de relever ce défi majeur. Ce problème de santé publique est particulièrement important chez les enfants, qui représentent près de 50 % des brûlés, et pour lesquels le chirurgien décide le plus souvent d'effectuer une autogreffe de peau. L’objectif de ce projet est de montrer la tolérance et l’efficacité du pansement sur la durée et la qualité de la cicatrisation chez un modèle porcin. En effet, les nombreuses similarités entre l’homme et le porc au niveau dermatologique font que le porc est un excellent modèle animal pour la cicatrisation. Dans une revue bibliographique, sur 25 thérapies de plaies, 78 % de concordances ont été établies entre les études sur modèles porcin et l’homme. Cette étude est le premier élément avant de pouvoir passer à une étude chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les attendus sur cette étude doivent nous permettent : - De démontrer la sécurité du pansement (absence de nécrose, d’irritation, d’allergies), - De démontrer la protection contre la contamination (absence de surinfection), - De démontrer la protection contre les facteurs physiques extérieurs (maintien en place avec le pansement secondaire, intégrité du pansement), - D’évaluer l’efficacité de l’absorption (absence d’exsudat non absorbés) - D’évaluer la protection du pansement (absence de contamination du pansement) - De mesurer l’impact sur la vitesse de cicatrisation (accélération de la cicatrisation d’un point de vue macroscopique et histologique), - D’évaluer la qualité de la cicatrice (accélération de la cicatrisation d’un point de vue macroscopique), - D’analyser des marqueurs histologiques de proliférations, de migration et de différenciation tissulaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales de type pose de cathéter en veine jugulaire (n = 24), induction de plaie par excision chirurgicale (4 plaies par animal, n= 12) ou par brûlure thermique (4 plaies par animal, n= 12). Au cours des 14 jours de suivi prévus, des biopsies seront réalisées (4 fois par plaie) ainsi que des prélèvements de sang via un cathéter (5 fois par animal).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus seraient ceux liés à la douleur due aux plaies par excision chirurgicale ou par brûlure thermique. La douleur sera prise en charge, comme en médecine humaine, la seule restriction médicamenteuse portant sur l’utilisation d’AINS qui peuvent interférer sur la cicatrisation. Après l’intervention chirurgicale, l’apparition de signes d’infection sera particulièrement surveillée : chaleur, rougeur au niveau des plaies chirurgicales, fièvre. Les animaux seront en hébergement collectif jusqu'aux chirurgies, dans des conditions d'élevages classiques. L'hébergement individuel sera utilisé uniquement durant la phase expérimentale pour protéger les pansements et plaies chirurgicales et en faisant en sorte de maximiser les contacts entre les animaux. Les cages seront disposées dans la salle pour que les animaux se voient et puissent avoir des contacts groin-groin. Un autre risque identifié est celui lié à l'anesthésie générale (anesthésie gazeuse avec un mélange d'oxygène / isoflurane) mais que le protocole de monitoring des animaux permet d'appréhender (spo2, rythme cardiaque). Le dernier risque relevé est celui lié au prélèvement sanguin (5 ml par prélèvement à raison de 5 prélèvements par animal). Ces volumes et fréquences sont inférieurs aux recommandations en vigueur et sont réalisés via un cathéter posés en veine jugulaire.

Devenir

Les biopsies ou prises de sang seront faites sur animaux vivants. A l'issu de la phase expérimentale, les animaux seront destinés à être réutilisés notamment dans des protocoles de prélèvements d'organes et de tissus dans un objectif de développement de modèle in vitro.

Remplacement

Les études de biocompatibilité, de tolérance et d’efficacité sur un tissu aussi complexe que la peau doivent réglementairement être réalisées sur des modèles animaux avant tout essai clinique chez l’homme. Ce nouveau pansement a été testé in vitro et ex vivo avant d’envisager le modèle animal.

Réduction

Les protocoles d’excisions (chirurgicale et thermique) ont été validés par une pré-étude méthodologique pour obtenir une méthode fiable et répétable et ainsi limiter le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Les excisions chirurgicales ou brûlures thermiques seront faites sur des animaux anesthésiés. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à cicatrisation totale des plaies (la grille de score pour l'évaluation de la douleur, de la détresse et de l'inconfort du mini-porc sera remplie pour chaque animal) et des traitements antalgiques par voie générale leur seront administrés.

Choix des espèces

Anatomiquement et physiologiquement la peau de porc est très similaire à celle de l’homme. Sur une revue de 180 articles sur la cicatrisation montre le haut taux de concordance entre les études sur le modèle humain et porcin faisant du modèle porcin le meilleur modèle pour la cicatrisation humaine. Les animaux sont adultes. La croissance d’un animal jeune pourrait interférer, améliorer la cicatrisation et donc biaiser le mécanisme

24 porcs adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Douze subissent une perfusion isolée du rein de six heures pour tester un vecteur de thérapie génique, avec cathétérisme, prélèvements sanguins répétés et mise à mort au bout de deux semaines, les douze autres, jugés non éligibles, étant cédés à un autre établissement pour une formation chirurgicale sans réveil. Le porteur indique des douleurs possibles aux points de cathétérisme, gérées par antalgiques. Il affirme qu'un "organisme entier" au système vasculaire intact est requis et qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité du rein.

Objectifs

Les maladies rénales rares se répartissent en trois groupes principaux : • les anomalies congénitales du développement rénal, • les maladies rénales monogénétiques identifiées, • les syndromes néphrotiques. Ces maladies ont en commun un phénotype variable selon l’âge, pouvant progresser jusqu'au stade final qui est incurable et exige un traitement soit de substitution avec la dialyse, soit une transplantation rénale. Les maladies rénales monogénétiques, comme les tubulopathies, maladies kystiques, tubulo-interstitielles ou glomérulaires, peuvent toucher n’importe quelle structure du néphron et nécessitent une prise en charge spécifique précoce. A ce jour il n’existe aucun traitement curatif. L’objectif final de ce projet est de traiter ces maladies rénales chez l’homme, et plus particulièrement celles d’origine génétique. L’approche par thérapie génique qui a pour but de suppléer le gène défectueux dans les maladies monogéniques, c’est à dire liée au dysfonctionnement d’un seul gène, est très prometteuse. Elle doit pouvoir permettre l’administration en toute sécurité de vecteurs thérapeutiques (« moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles) dans le rein, et d’en cibler l’action au rein en limitant l'exposition à d'autres organes. Les vecteurs de thérapie génique de choix aujourd’hui sont les vecteurs de type AAV (virus adéno-associé), car ils permettent un transfert de gène efficace dans beaucoup de tissus. Une Perfusion LocoRégionale (PLR) du rein, dans laquelle le rein est isolé de la circulation générale de façon transitoire tout en étant oxygéné, pourrait assurer un ciblage spécifique de ce tissu d’intérêt.

Bénéfices attendus

Les maladies rénales ciblées, ont en commun une présentation phénotypique variable selon l’âge, un risque d’évolution vers l’insuffisance rénale, d’une hypertension artérielle, et des répercussions possibles sur la croissance chez l’enfant. Toutes ces maladies rares nécessitent donc une prise en charge adaptée et précoce, gage d’une évolution ralentie ainsi qu’un suivi prolongé et pour un grand nombre d’entre elles tout au long de la vie adulte. Par rapport aux thérapies classiques, la thérapie génique permet de cibler directement le gène défectueux responsable des maladies rénales géniques. L’identification d’un vecteur de thérapie génique avec un fort tropisme pour le rein, couplée à la technique de PRL optimisée en terme de durée de perfusion et de quantité de vecteur injectée pourra permettre une transduction maximale du vecteur au niveau du rein, avec donc une correction du gène défectueux, et sans avoir à subir les effets secondaires liés à une transduction du vecteur dans les autres organes.

Procédures

Le projet se déroulera selon les étapes suivantes (cf annexe 1) : 1- CT-Scan Chacune des 4 Phases du projet devra être constituée de 3 porcs (2 minimum). 6 porcs seront soumis au CT-Scan, afin de vérifier la compatibilité avec une PLR. L’examen sera réalisé sous anesthésie générale avec monitoring et sera d’une durée d’environ 2h. Cette étape sera répétée pour chacune des Phases du projet, pour un total maximum de 24 porcs. 2- PLR du rein Cette intervention concerne les animaux éligibles à une PLR du rein suite au résultat du CT-Scan. La PLR sera réalisée en établissant une perfusion localisée et isolée du système vasculaire rénal. La mise en place de la PLR se fera par une méthode peu invasive : cathétérisme de la veine jugulaire et de l’artère fémorale pour accéder respectivement à la veine rénale et à l’artère rénale. Cette mise en place se fait en percutanée sous angiographie. La PLR sera réalisé sous anesthésie générale et analgésie adaptée ainsi qu’un monitoring constant. Le vecteur testé sera injecté au niveau du système PLR à une dose donnée et pendant le temps déterminé L’intervention est estimée à 6h. Cette étape sera répétée pour chacune des Phases du projet, pour un total maximum de 12 porcs (3 animaux maximum /Phase, 4 Phases maximum) 3- Prélèvements Sanguins Des prélèvements sanguins seront réalisés pendant la PLR à D0 sous anesthésie générale, sur sang périphérique et au niveau de la PLR (détermination de l’infectiosité et dissémination du vecteur) : - sang périphérique à D0 avant le début de la PLR (baseline) pour toutes les analyses citées ci-après. - au niveau du système de la PLR à D0 puis +5min, +10min , +15min , +20min, +25min , +30min , +45min, +60min, +75min, +90min, +105min et +120min après le démarrage de la PLR Des prélèvements sanguins seront réalisés au niveau de la veine jugulaire sous anesthésie générale à D3, D5, D10+/-1, D14+/-2 pour sérologie anti-AAV, dosages des paramètres biochimiques, numération sanguine et hémostase, marqueurs rénaux, évaluation immunologiques et biodistribution. Tous les animaux inclus dans chacune des Phases du projet : 12 porcs max (3 animaux max/Phase, 4 Phases max.). 4- Mise à mort Suite à un suivi de 14±2 jours, les animaux inclus seront euthanasiés sous anesthésie générale et analgésie, pour prélèvements post-mortem. Avant l'euthanasie, des prélèvements sanguins ante-mortem sont effectués. Tous les animaux inclus dans chacune des Phases du projet : 12 porcs max (3 animaux max / Phase, 4 Phases)

Impact sur les animaux

La mise en place de la PLR se fera par méthode peu invasive. L’accès veineux du système vasculaire rénal sera réalisé à partir du cathétérisme de la veine jugulaire ou fémorale et l’accès artériel à partir de l’artère fémorale. La PLR sera réalisée dans un premier temps sur l’un des 2 reins, isolé de la circulation générale par une approche hémodynamique basée sur l’oxygénation d’une membrane extra-corporelle (ExtraCorporeal Membrane Oxygenation, ou ECMO). Lors d’une précédente étude identique menée sur le cœur, « Etude de tolérance, toxicité et biodistribution d’un vecteur thérapeutique à 2 semaines après perfusion locorégionale (PLR) du coeur battant chez le porc domestique », APAFIS#26250-2020062915381908, quelques animaux ont montré de douleurs post-LRP au niveau des points de cathétérisme avec difficulté de mobilité durant 3 jours maximum. Des traitements antalgiques et antibiotiques supplémentaires ont été mis en place et ont permis de résoudre ces effets indésirables. Lors du présent projet, les mêmes observations peuvent être attendues et anticipées, et le traitement suivant sera mis en place en fin de PLR du rein : un traitement antibiotique sera réalisé par injection IV de 20 mg/kg de Céfazoline (Rilexine®, Cefovet®). En fin de procédure de PLR, une antibiothérapie sera mise en place, 1g d’ampicilline/ulbactam (Unacim®) et 0.4mg/kg de meloxicam (Metacam®)) par voie IV. Pour anticiper toute douleur, 0.2mg/kg de Morphine sera administré en intramusculaire. Si besoin, avec accord du vétérinaire de l’UE, un traitement analgésique (ex : Buprénorphine ou Perfalgan si douleur) pourra être mis en place dans les jours suivant la procédure.

Devenir

Au cours de ce projet, les animaux subiront différents actes expérimentaux du début à la fin de la procédure dans laquelle ils seront inclus. Avant chaque Phase du projet, une imagerie CT-Scan sera réalisée sur un maximum de 6 porcs (nombre maximal compte tenu des statistiques de compatibilité avec une PLR afin d’obtenir 3 animaux (2 minimum) /Phase) afin de déterminer les animaux éligibles à une PLR de rein. Un total maximum de 24 porcs sera donc soumis à une imagerie (6 porcs/Phase, 4 Phases maximum). Sur ces 24 animaux, 12 maximum seront retenus pour la réalisation de la PLR du rein, et seront suivis durant 14±2 jours durant lesquels différents prélèvements sanguins seront effectués, avant euthanasie pour prélèvements post-mortem afin de déterminer la tolérance, la toxicité et la biodistribution du vecteur testé. Les 12 autres animaux non éligibles seront réutilisés par un autre établissement utilisateur pour des formations de procédures chirurgicales, procédure sans réveil.

Remplacement

Différents modèles cellulaires in vitro comme des lignées de cellules épithéliales rénales, ou plus récemment d’organoïdes rénaux différenciés à partir notamment de cellules souches pluripotentes induites sont disponibles et permettent l’étude des maladies rénales. Il est cependant très difficile d’obtenir dans ces modèles une structure vascularisée. L’expérimentation animale proposée vise à établir la PLR du rein, un organisme intact avec un système vasculaire est requis pour sa mise en oeuvre. En effet, compte tenu de la complexité du rein, tant structurelle (vascularisation, structure cortico-médullaire) que fonctionnelle (contrôle de la pression rénale), les paramètres issus de processus complexes qui doivent être contrôlés lors de la PLR ne peuvent pas être simulés par des modèles in vitro. D’autre part, l’étude de la transduction du rein par les AAVs en comparaison avec la transduction d’autres organes non-ciblés (biodistribution) permettant d’évaluer l’efficacité et la sécurité du futur produit thérapeutique ne peut être réalisée que sur un organisme entier, et donc sur animal vivant.

Réduction

Un total maximum de 24 porcs sera nécessaire, afin d’obtenir 3 animaux (2 minimum) éligibles à la procédure PLR pour chacune des 4 Phases. Ce nombre requis s’explique par le fait que l’un des critères d’inclusion est que la structure vasculaire rénale de chaque animal inclus ne doit pas présenter d’anomalies. Cette structure vasculaire rénale sera analysée par imagerie médicale, CT-scan Computed Tomography Scan, ou tomodensitométrie). Selon les données préliminaires du Sponsor, seul 1 animal sur 2 présentera une structure vasculaire rénale adaptée à le PLR et pourra donc être finalement inclus pour l’approche PLR du rein. D’autre part, les reins sont des organes très vascularisés et une quantité importante de sang y afflue. Aussi, toute intervention chirurgicale, même peu invasive, reste délicate et entraine un risque accru pour l’animal. Il en résulte la possibilité d’une interruption prématurée de l’expérience en cas par exemple d’une hémorragie ou encore une altérations des structures cellulaires en cas de pression et d’oxygénation non contrôlées. Le nombre d’animaux inclus dans chaque phase (3 porc) a été défini en tenant compte de ces 2 points de façon à obtenir le nombre minimal requis d’animaux ayant été soumis à la procédure PLR complète, à savoir 2 porcs + 1 animal « backup ». L’enchainement des 4 Phases est lié à des « GO/NO GO », cf. Annexe 1, c’est à dire avec un enchaînement dépendant des résultats obtenus à une dose d’AAV donnée et un temps de perfusion donné. Un « GO » sera donné lorsque une transduction maximale et spécifique du rein sera obtenue à une dose donnée. La Phase suivante consistera alors à réduire le temps de perfusion, afin de vérifier si une efficacité similaire est obtenue avec un protocole PLR plus réduit. Au contraire, en cas de « NO GO » (transduction insuffisante et/ou non spécifique du rein), la phase suivante consistera à tester une dose de vecteur plus haute. Un tel enchaînement permet de minimiser le nombre total d’animaux inclus. Et dès lors que l’objectif de transduction maximale du rein sera atteint durant une des Phases, le projet sera stoppé, minimisant là aussi le nombre total d’animaux inclus. Des analyses statistiques de type non paramétriques seront utilisés pour comparer les données obtenues entre les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

- De bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur : Deux à 3 porcs par hébergement permettant des interactions sociales entre les animaux. L’hébergement est organisé sur 2 box attenants dont un seul avec copeaux de façon à garantir une propreté maximale. Un enrichissement du milieu et mise à disposition d’objets (Box équipés de planche anti-démangeaisons, balles, Kong dental…). Interactions sociales, en dehors des gestes inhérents au protocole, avec des soignants par le biais d'échanges quotidiens avec un technicien animalier. - Intervention de personnels formés spécifiquement à l’espèce - Suivi observationnel et clinique régulier des animaux - Toutes les interventions seront réalisées sur animal anesthésié. Les procédures d’anesthésie légère (prélèvements sanguins) ou profonde (chirurgie), sont détaillées dans les procédures expérimentales. - Un traitement peri-opératoire avec analgésiques sera mis en place pour limiter la douleur. - Un suivi post-chirurgie par un vétérinaire et technicien animalier sera réalisé - Une grille de scoring de la douleur sera mise en place afin de détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates.

Choix des espèces

En raison de la configuration expérimentale avec une membrane extracorporelle (ECMO), seul le modèle grand animal peut être utilisé pour les expériences prévues. Puisqu'un rein suffisamment grand est important pour réaliser l'expérience de perfusion avec son propre circuit de perfusion extracorporelle, les petits modèles animaux ne sont en effet pas compatibles avec cette étude. Le porc est un modèle animal répandu dans la recherche médicale de par certaines caractéristiques physiologiques, anatomiques et génétiques proches de celles de l’être humain. C’est notamment le cas de ses fonctions cardiaques, pulmonaires et rénales. Le choix du porc est donc optimal pour le développement d'une méthode de PLR, qui est transférable à l'homme du fait de son anatomie, de sa taille et de la possibilité d’utiliser un matériel identique à celui utilisé chez l’homme et donc permettant de favoriser rapidement son utilisation thérapeutique potentielle chez le patient. Le porc domestique à l’âge adulte a été choisi pour cette étude en raison de son poids et des similitudes avec le rein humain. En effet un poids de 80-90kg lors de la procédure PLR est nécessaire pour se rapprocher d’une future évaluation chez l’humain adulte. Les animaux seront donc injectés à l’âge adulte, puis seront suivis durant 14±2 jours post-injection maximum.