Moutons

17 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées. Chacune subit une ovariectomie et la pose d'un implant d'estradiol sous anesthésie, la pose répétée de cathéters dans la veine jugulaire et jusqu'à 24 prélèvements de sang sur dix heures, répétés six fois, pour tester des analogues de kisspeptine destinés à maîtriser la reproduction des animaux d'élevage. Le porteur présente ce projet comme une piste pour supprimer les traitements hormonaux qu'il juge éthiquement contestables. Il affirme que la reproduction ne peut s'étudier que sur organisme entier et que le passage à l'animal reste incontournable.

Objectifs

Actuellement, la maîtrise de la reproduction des animaux d'élevage repose principalement sur la stimulation de l'ovulation par des hormones. Des systèmes considérés plus « naturels », tel l'effet mâle, sont aussi utilisés mais leur efficacité est moindre. Pour différentes raisons, ces deux approches ne répondent pas de façon satisfaisante aux attentes sociétales (absence de contaminant dans les produits consommés et de pollution de l'environnement) et à celles des producteurs (efficacité et rentabilité). Nous avons, dans un projet précédent, développé des analogues à partir d’un neurotransmetteur endogène, la kisspeptine (Kp) comme piste originale pour réduire voire éliminer l’utilisation d’hormones. Ce neurotransmetteur joue un rôle clé dans la stimulation de la reproduction, mais son instabilité métabolique, et par conséquent sa durée d'action trop courte, empêche son utilisation sur le terrain. Nous avons donc conçu et synthétisé des analogues avec une durée d'action plus importante que la molécule naturelle. Le présent projet vise à étudier l'effet de différentes formes de Kp humaine sur la fonction de reproduction des brebis, pour développer l'analogue le plus efficace possible.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont 1) comprendre la différence d'effet de différentes isoformes de Kp entre deux organismes, 2) mettre en place une forme de Kp optimale pour stimuler la reproduction de la brebis et 3) développer un outil permettant de maitriser la reproduction des animaux d'élevage (notamment ici, la brebis). De façon plus globale, ce projet vise à élaborer une stratégie d’élevage des animaux de rente avec une meilleur prise en compte du bien-être animal et des attentes sociétales en supprimant les traitements hormonaux et en trouvant des alternatives aux traitements actuellement mis en place et éthiquement contestables.

Procédures

- Ovariectomie et pose d’implant d’estradiol sous anesthésie générale sur 17 brebis (environ 2 heures) - Retrait d’implants d’estradiol sous anesthésie générale sur 17 brebis - Pose et dépose de cathéters dans la veine jugulaire sur animal vigile : 2 fois chez 17 brebis - Prélèvements de sang sur animaux vigiles par ponction de la veine jugulaire via un cathéter : 24 prélèvements sur 10h pour 17 brebis, répété 6 fois.

Impact sur les animaux

La kisspeptine est une molécule employée à de nombreuses reprises dans notre laboratoire dans le cadre de projets antérieurs. De plus, le peptide et ses effets sont très bien décrits chez les mammifères, et notamment chez les ovins. D'après notre expérience, suite à une injection aigüe de kisspeptine aucune nuisance ou effet indésirable n'est observé. En termes de manipulation des animaux, les chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets peuvent être observés, notamment suite à l'ovariectomie ou la pose des cathéters, des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent apparaître mais sont anticipés par l'injection d'analgésiques au moment des procédures.

Devenir

Les animaux auront été ovariectomisés, soumis à l'implantation d'un cathéter dans la jugulaire et injectées avec des isoformes de kisspeptine avec une durée de vie courte (de l'ordre de quelques minutes/heures), les animaux pourrons alors aisément être réutilisés ou replacés.

Remplacement

La reproduction est un mécanisme physiologique intégré extrêmement complexe qui ne peut être étudié que par une approche in vivo. Il en est de même pour toutes les études visant à la contrôler. Notre niveau de connaissances actuelle est largement insuffisant pour espérer mettre en place par exemple une approche de modélisation informatique afin de prédire comment le système répond à un stimulus donné ou pour une quelconque approche de substitution, comme des cultures cellulaires, capable de reproduire les phénomènes complexes d’intégration qui ont lieu au niveau de l’organisme entier. Cependant, l'activité des molécules à tester in vivo dans ce projet a déjà été caractérisée in vitro. Le passage à l'animal reste incontournable en l'état actuel de nos connaissances.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 7 animaux par traitement. Dans le souci de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés ainsi que le nombre d'injections et de prise de sang réalisées sur chaque animal, nous prévoyons de tester plusieures molécules par animal à minimum 3 jours d'intervalle. Cet intervalle de temps permettra de laisser le temps aux molécules injectées de ne plus être détectable dans le sang et de pouvoir tester la molécule suivante sans crainte d'avoir une interaction avec la molécule précédente. Chaque groupe test d'une forme de Kp (composé de 7 animaux) sera comparé avec un groupe contrôle (composé de 17 animaux répartis sur chaque série de tests) pour assurer la validité scientifique et la puissance statistique nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et seront également en groupe lors des procédures afin de minimiser au maximum le stress lié à la contention dans des cages individuelles qui sont souvent employées pour ce genre de procédures. Les méthodologies utilisées dans le cadre de ce projet ne dépasseront pas une douleur de classe modérée et nous mettrons en œuvre tout notre possible afin de garantir le bien-être de l’animal en lui apportant les soins adéquats en fonction des besoins. Dans cet optique, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement (notamment isolement) et l'apparence des brebis (notamment au niveau des plaies chirurgicales et implantation du cathéter) sera suivi avec attention et les animaux seront pesés (en prêtant attention au pourcentage de perte et qu'il ne dépasse pas le seuil critique de 20%) pendant 3 jours après l'ovariectomie. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites (soulagement de la douleur en cas de dégradation d’un critère de comportement et d’apparence, euthanasie en cas d’atteinte du seuil critique des 20% de perte de poids et/ou dégradation de plus de deux critères de comportement et d’apparence). En cas de douleur les animaux seront traités comme suit : Anti inflammatoire non stéroïdien en intramusculaire éventuellement renouvelé 48H après si signes douloureux (baisse d'appétit, prostration, décubitus prolongé). Dans le cas où ces traitements ne résulteraient pas en une amélioration significative de l’état des animaux, ou dans le cas où certains comportements témoignant une douleur seraient détectés (par exemple prostration, décubitus prolongé, anorexie...) les animaux seraient alors euthanasiés par surdosage de barbituriques intraveineux. En cas d’hémorragie post-opératoire (muqueuses pâles), l’animal serait réanesthésié et nous rechercherions le site hémorragique pour procéder à la suture vasculaire.

Choix des espèces

La brebis est un modèle largement utilisé pour l’étude de la reproduction chez les animaux d’élevage et nous pouvons nous baser sur une littérature très riche sur ce modèle. Nous avons choisi d’utiliser la race Ile de France pour les brebis parce que c’est le modèle sur lequel nous avons obtenu nos résultats précédents et parce que c’est une race d’élevage d’intérêt économique important. Adulte pour étudier un animal sexuellement développé avec un axe gonadotrope actif.

9 moutons et 9 bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur indiquant qu'ils peuvent ensuite retourner dans le troupeau expérimental. De jeunes agneaux et veaux non faunés sont inoculés avec un protozoaire puis subissent, sur quatre mois, des prélèvements répétés de contenu ruminal par sonde œsophagienne, de sang et de fèces. Il décrit un léger inconfort lié surtout à la contention et une douleur légère lors des prises de sang. Il affirme que la culture in vitro de ces protozoaires reste trop limitée, l'objectif étant d'étudier leur rôle dans la digestion et la production de méthane.

Objectifs

Ce projet propose d'utiliser des jeunes ruminants (ovin, bovin) naturellement dépourvus de protozoaires (non-faunés) qui seront ensuite inoculés par une seule espèce de protozoaire provenant de la cryobanque ERCULE (projet EU) avec l’objectif d’effectuer des études génomiques et fonctionnelles car les protozoaires du rumen ne peuvent pas être cultivés de manière axénique et en quantité suffisante in vitro.

Bénéfices attendus

A l’issue du projet, nous aurons des données génomiques et fonctionnelles pour appréhender le rôle des protozoaires dans l’écosystème digestif du ruminant qui reste mal connu. Les données alimenteront la base de données publique du projet HoloRuminant. Les informations obtenues dans ce projet serviront à évaluer le rôle des certains protozoaires dans la digestion des aliments et leur effet sur la production de méthane dans le rumen.

Procédures

Les animaux feront l'objet de 3 types de prélèvements : Contenu ruminal : Le volume prélevé sera adapté à la taille et au développement de l'animal : jusqu’à 100 ml pour un agneau de 20 kg ou 200 ml pour un veau, 6 fois au cours de toute la période de 4 mois et sera réalisé en moins de 3 minutes (entre le début de la contention et la fin du prélèvement). Sang : Les animaux seront prélevés 2-3 fois pendant la période de "mono-faunation". Les quantités prélevées sont de 10-15 ml et largement inférieures à 10% du volume sanguin total afin d’éviter tout risque d'hypovolémie, anémie ou stress physiologiques et durera moins d'une minute. Fèces : Les agneaux et les veaux seront prélevés 6 fois au cours de toute la période de 4 mois. Le volume prélevé sera d'environ 5-10 g et durera moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les techniques des prélèvements sont des pratiques couramment appliquées. Le contenu ruminal sera prélevé par sonde oesophagienne. La procédure génère un léger inconfort, surtout du à la contention de l’animal mais aucune douleur ni souffrance n’est attendue. Si nécessaire, des prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire. La prise de sang génère une douleur légère.

Devenir

Les procédures appliquées aux animaux sont peu invasives et la fréquence des prélèvements est faible. Les veaux et agneaux peuvent à l'issu de cette procédure retourner dans le troupeau expérimental.

Remplacement

A l’heure actuelle, la culture des protozoaires in vitro est très fastidieuse. La croissance in vitro est très limité et les cultures sont souvent perdus sans raison apparente après quelques jours. En plus, le nombre réduit des protozoaires que puissent être obtenues in vitro ne permet pas d’effectuer certaines études et il n’y pas asses d’information indiquant que les caractéristiques fonctionnelles des protozoaires cultivés in vitro sont similaires à celles des protozoaires dans son milieu naturel, le rumen.

Réduction

Le nombre des animaux tient compte surtout des aspects éthiques (compagnie des animaux grégaires). L’animal n’est pas l’unité expérimentale mais le moyen pour obtenir des protozoaires en quantité suffisante pour des études de séquençage du matériel génomique.

Raffinement

Tout signe de souffrance, se manifestant par de l’abattement, un refus de s’alimenter, ou un comportement anormal (considérés comme points limites) sera signalé, consigné dans le cahier d’expérimentation et pourra entrainer l’arrêt des prélèvements et la fin de l’expérimentation pour un individu donné voire l’euthanasie si nécessaire. Néanmoins, les prélèvements ne devraient pas induire de douleur car ils sont réalisés rapidement par du personnel expérimenté.

Choix des espèces

L'objectif est de comprendre les déterminants microbiens déclancheurs des diarrhées chez le jeune ruminant, un travail sur les ovins et les bovins s'avère donc, par définition en tant qu’espèce-cible et espèce-modèle, plus pertinent qu'un autre modèle pour les ruminants d’élevage. L'étude de la modulation du microbiote gastrointestinal après le sevrage nécessite d'utiliser des agneaux ou veaux qui ont eu un contact limité avec des adultes pour éviter la comtamination en protozoaire.

40 jeunes moutons mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes avec adjuvant, une dizaine de rappels au cours de leur vie productive, pour produire un sérum servant à fabriquer des réactifs de diagnostic vendus. Le porteur indique que l'adjuvant peut provoquer des inflammations locales, et précise que les animaux sont euthanasiés à la fin "afin de ne pas être reconduit dans la filière alimentaire". Il justifie le choix de l'espèce par l'absence de modèle in vitro performant et par les volumes de sérum obtenus.

Objectifs

Les anticorps polyclonaux de mouton anti-immunoglobuline de lapin et de souris sont utilisés dans la production de différents réactifs de diagnostic in vitro pour le test : - de maladies métaboliques liées aux hormones stéroïdiennes (estradiol et cortisol) ; - mesure de la concentration des hormones thyroïdiennes T4 et T3. Le dosage de ces hormones est réalisé dans le cadre d’un bilan de la fonction thyroidienne. L’anticorps de mouton est utilisé pour assurer la sensibilité et spécificité des tests en assurant la capture des anticorps spécifiques de lapin ou de souris dirigés contre chacune des molécules à doser (estradiol, cortisol, T3, T4).

Bénéfices attendus

En l'absence de modèle in-vitro performant, c'est l’espèce ovine qui a été choisie. Les résultats de développement des tests de diagnostic concernés ont montré l’efficacité de l’immunisation chez cette espèce. La qualité des anticorps ainsi obtenus s’est révélée satisfaisante (sensibilité et spécificité) permettant de garantir la fiabilité du résultat rendu par les tests : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Cette espèce donne la possibilité d’effectuer des prélèvements de sang à différentes reprises, ce qui permet de produire des quantités importantes de sérum hyper-immun et ainsi de limiter le nombre d’animaux impliqués dans le projet pour couvrir les besoins pour les 5 prochaines années de production.

Procédures

Pour un animal lors de la primo injection (1seule fois dans la vie de l’animal) : 4 injections par voie intra-dermique à 28 jours d’intervalle (3 minutes pour la totalité d’une injection). Et lors d’un rappel (une dizaine de fois dans sa vie productive) : 1 seule injection par voie intra-dermique (3 minutes pour la totalité de l’injection).

Impact sur les animaux

Par expérience, ces protocoles ne sont pas susceptibles d'occasionner douleur, souffrance ou angoisse. Les antigènes sont administrés avec adjuvant qui peut entrainer des inflammations locales au point d’injection. Ces inflammations, seront suivies quotidiennement et traitées si besoin par un protocole de traitement adapté. Toutefois, la surveillance particulière et quotidienne de ces animaux en protocole assure, en cas de signes cliniques, le déclenchement de soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire. L'observation quotidienne de la troupe permet de détecter les premiers signes d’alerte : apathie, arrêt de l’alimentation, dégradation de l’état général.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de ne pas être reconduit dans la filière alimentaire.

Remplacement

Indisponibilité de modèle in vitro performant pour la production d’anticorps contre les antigènes considérés ayant les caractéristiques nécessaires (spécificité, avidité, sensibilité) pour un dosage ELISA automatisé. Les anticorps polyclonaux obtenus sont très spécifiques de l'antigène injecté et très sensibles en raison du nombre d’épitopes différents qu'ils reconnaissent.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste en fonction des besoins de production. Le calcul du nombre d'animaux dépend du volume de produit commandé. Ce nombre d’animaux a été optimisé au fil des années d’expérience et permet d’être ajusté au plus près des besoins. Les quantités de sérum obtenues avec les moutons sont importantes, présentent des taux élevés d’anticorps ayant une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté et correspondent aux volumes souhaités.

Raffinement

Les moutons, animaux grégaires, sont stabulés en petits groupes dans des conditions conformes à la réglementation et adaptées à l'espèce. Les animaux ont accès à la nourriture via une distribution de concentrés, au foin et à l’eau à volonté. Ils sont soignés quotidiennement, avec une surveillance intensifiée assurant leur bien-être. L'observation de signes cliniques de souffrance déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire.

Choix des espèces

Le mouton est une espèce documentée et classiquement utilisée pour la production d'anticorps polyclonaux. Bien que présentant une grande hétérogénéité, les anticorps polyclonaux sont très spécifiques de l'antigène injecté et très sensibles en raison du nombre d’épitopes différents qu'ils reconnaissent. Les quantités de sérum obtenues avec les moutons sont importantes, présentent des taux élevés d’anticorps ayant une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté et correspondent aux volumes souhaités. Les animaux utilisés sont des jeunes mâles adultes afin de permettre le prélèvement de volumes sanguins (donc de sérums hyper-immuns) suffisamment importants pour la réalisation des diagnostics visés par l’étude.

6 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis rendues à l'élevage. Chacune subit une ovariectomie d'environ une heure sous anesthésie, l'ablation des ovaires les empêchant d'être gestantes tout en conservant un comportement d'oestrus. Le porteur décrit ces brebis comme des femelles "boute-en-train" destinées à stimuler les béliers pour la collecte de semence, une fois toutes les trois semaines. Il affirme qu'il n'est pas possible de collecter les béliers sans recourir à des femelles.

Objectifs

L'objectif est de réaliser une ovariectomie chez la brebis pour permettre la collecte de semence de bélier. Les brebis ovariectomisées ne présentent plus de risque de gestation non désirée et peuvent exprimer un comportement d'oestrus lorsque la collecte de semence est souhaitée.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de disposer de brebis ovariectomisées permettant la collecte de la semence de béliers, sans risques de gestation indésirable, et sans utilisation de traitements hormonaux pour synchroniser les brebis.

Procédures

Les animaux seront soumis une fois à une procédure chirurgicale : ovariectomie. La durée totale de l'intervention, anesthésie comprise, est d'environ une heure. Si des injections post opératoires s'avèrent nécessaires, les animaux seraient contentionnés à peine 2 ou 3 minutes, injection comprise.

Impact sur les animaux

Le statut ovariectomisé n'entraine pas d'effet indésirable au cours de la vie de l'animal. Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations, de la phase pré opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible, ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthésie, une irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation) peut apparaître, mais c'est rare.

Devenir

Les animaux retournent en élevage.

Remplacement

La collecte de la semence de bélier requiert l'utilisation de femelle boute en train. Il n'est pas possible chez les ovins de collecter les mâles sans une autre méthode.

Réduction

Le nombre d'animaux a été choisi pour réduire au maximum l'utilisation des femelles pour les collectes , soit une fois toutes les 3 semaines pour chaque brebis.

Raffinement

Afin de prévenir tout stress, les animaux sont gardés en groupes sociaux stables, dans des conditions d’élevage optimales avec fourrages et concentrés de qualité et des locaux calmes. La douleur est traitée préventivement avant l’acte chirurgical dès l’anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu’à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l’état normal est estimé à 3 jours postopératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. Un animal anorexique, prostré, recevra l’administration de morphinique. Sans réponse physiologique satisfaisante, il sera procédé à l’euthanasie suivi du prélèvement du site lésionnel pour analyse. Tout animal qui ne se nourrit pas pendant 4 jours ou avec perte de poids par rapport au poids initial malgré le traitement sera mis à mort. Une fiche de suivi individuel est mise en place, renseignée tous les jours. Les animaux seront surveillés quotidiennement sur 6 paramètres. Les point limites attendus sont : - Une prostration avec abattement et anorexie en cas de douleur importante : en ce cas ces animaux recevront des injections sous cutanées de morphine - Fièvre, abattement, en cas d’infection post opératoire : en ce cas, les animaux recevront des antibiotiques et des anti inflammatoires non stéroïdien en fonction de la gravité des symptomes.

Choix des espèces

La collecte de béliers est possible uniquement par l'utilisation de brebis pour stimuler le comportement reproducteur. Brebis adultes et matures sexuellement, de façon à pouvoir répondre au traitement hormonal appliqué après l'ovariectomie.