Moutons

21 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Chaque brebis subit des chirurgies des fémurs et des humérus pour l'injection de substituts osseux, puis des scanners sous anesthésie et des transports entre deux établissements. Elles peuvent retourner dans leur élevage entre les interventions mais sont tuées à la fin pour prélever et analyser les os. Le porteur justifie l'espèce par sa pertinence et sa recommandation dans une norme ISO, et présente les dommages comme justifiés au regard de bénéfices futurs pour les patients.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer la dégradation de produits de substitution osseuse, plusieurs semaines après leur injection. La dégradation au niveau des condyles fémoraux et des grandes tubérosités humérales sera réalisée in-vivo par imagerie médicale (scanner CT). Les scanners seront réalisés par l’établissement utilisateur (nommé ci-après EU2 et demandeuse du projet à soumettre) et le reste du protocole dans l’autre établissement utilisateur (nommé ci-après EU1). Ces études, réalisées sur des brebis, ont pour but d’évaluer les effets sur les tissus de différents substituts osseux en comparaison à un produit de référence déjà présent sur le marché. Ce modèle in vivo est standardisé pour les injections intra-osseuses et représentatif des modalités d’administration du futur produit chez le sujet traité. Les analyses par imagerie CT permettrons de visualiser le comblement des défauts osseux et ainsi estimer la dégradation des produits testés.

Bénéfices attendus

Les défauts osseux peuvent être causés par une lésion osseuse traumatique ou suite à un curetage chirurgical dans le cas de kystes ou de tumeurs bénignes. Des substituts osseux synthétiques et résorbables sont utilisés pour combler ces vides et ainsi aider à la croissance du nouveau tissus osseux. Ce modèle animal permet de mimer ce qui est observé chez l’Homme et ainsi tester de nouveaux produits. Ainsi, les dommages potentiellement infligés à un nombre restreint d’animaux lors de ces études sont justifiés au regard des futurs bénéfices éventuels dont pourront profiter les patients présentant des défauts osseux.

Procédures

Tous les animaux subiront des chirurgies des fémurs et humérus en vue d’une administration locale de produits de substitution osseux sous anesthésie générale réalisée par un chirurgien vétérinaire compétent. Plusieurs semaines après l’intervention, les animaux seront amenés à passer un scanner des régions opérées (sous anesthésie).

Impact sur les animaux

EU1 : En raison du caractère invasif de la procédure chirurgicale et afin d'éviter d'éventuelles infections intra-osseuses, des anti-inflammatoires et des antibiotiques prophylactiques seront administrés juste avant chirurgie. Une surveillance poussée des zones opérées et l’utilisation d’analgésiques est donc prévue pendant la durée nécessaire au rétablissement des animaux. EU2 : Concernant les acquisitions CT, il s’agit d’une technique non invasive avec anesthésie appropriée des animaux. De ce fait, les seuls effets indésirables potentiels seront liés à l’anesthésie. De plus, les transports entre l’EU1 et l’EU2 sont susceptibles de causer un stress aux animaux. Ces nuisances sont considérées comme légères.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la phase expérimentale afin de prélever les sites fémoraux et huméraux injectés et analyser les tissus post-mortem via des analyses d’histopathologies.

Remplacement

L'utilisation de modèles orthopédiques de petits ruminants, tels que les moutons, n'a cessé de croître au cours des 40 dernières années en raison de sa pertinence par rapport aux conditions osseuses et articulaires humaines. La procédure expérimentale décrite dans le présent projet ne dispose pas d’essais in-vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent remplacer les résultats obtenus dans ces études.

Réduction

L'utilisation de fémurs et d'humérus de mouton permet d'injecter jusqu'à huit éléments par animal (3 sites injectés par fémur et 1 site par humérus), ce qui permet d'augmenter le nombre de sites par élément, sans augmenter le nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe tout au long du projet (période d’acclimatation inclue) par l’EU1 et auront la possibilité, sur accord vétérinaire, de retourner dans leur élevage après la période post-opératoire. La réalisation des actes techniques complexes sera faites sous anesthésie fixe (chirurgie, scanner CT) par un personnel habilité, compétent et expérimenté. De plus, une surveillance accrue et quotidienne sera réalisée jusqu’au rétablissement complet des animaux (avec observation clinique de l’état général, observation de la boiterie, de la rigidité, de la douleur lors de la palpation ou de la mobilisation de l'articulation, de la rougeur et du gonflement des sites implantés) et l’utilisation d’analgésique, d’antibiotique et d’anti inflammatoire en traitement pré et post-opératoire est prévu afin de prévenir et réduire la douleur post-chirurgicale.

Choix des espèces

Le mouton est un modèle animal identifié pour l'évaluation des matériaux et est recommandé dans la norme ISO 10993 pour les injections intra-osseuses. Le modèle d'injection fémoral et huméral chez le mouton est hautement standardisé de par ses similitudes avec l'homme dans le poids, la taille, la structure des os et des articulations. Il est également associé à de faibles taux de complication. De plus, il s'agit d'un animal couramment employé en expérimentation animale, permettant ainsi d'une part de gérer plus facilement son bien-être au cours de l'étude et d'autre part de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). Les animaux sélectionnés pour ce projet seront âgés de 2 à 4 ans au moment de la procédure d’injection afin que leur croissance osseuse soit terminée. Ce stade de développement est nécessaire dans le cadre d’un test sur des substituts osseux destinés à une population adulte.

30 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Leur cycle est synchronisé par éponge vaginale et injections hormonales, puis elles sont inséminées et tuées huit jours après pour prélever leur utérus et récupérer les embryons, afin d'étudier trois mutations récessives qui réduisent la fertilité des élevages ovins laitiers. Le porteur présente les bénéfices d'abord comme "technico-économiques", limitant les pertes liées à la baisse de fertilité, puis évoque la santé des animaux. Il affirme qu'aucune alternative n'existe et que l'espèce ovine est étudiée pour elle-même.

Objectifs

La ségrégation de mutations récessives de l'ADN dans les populations d’élevages en sélection peut conduire à des anomalies génétiques lorsqu’elles se retrouvent à l’état homozygote (2 copies mutées) chez un individu. Ces anomalies peuvent être bégnines, affectant la couleur du pelage, la taille, ou l’absence de cornes par exemple, d’autres sont délétères. Ces mutations délétères peuvent affecter la survie de l’embryon au cours du développement précoce et/ou induire des avortements au cours de la gestation, impactant négativement les résultats de fertilité. Elles peuvent également donner lieu à de la mortalité des jeunes animaux (en périnatal ou avant le sevrage). Elles peuvent encore créer des altérations morphologiques handicapantes, ou de multiples syndromes affectant la santé et le bien-être. Il y a donc un enjeu socio-économique pour les filières d'élevage dans la découverte et le contrôle de la diffusion de ces mutations dans les populations en sélection de façon à limiter la procréation d’animaux homozygotes et ainsi limiter l'impact négatif sur la santé et le bien-être. Une étude préliminaire de génétique chez des ovins laitiers a permis de mettre en évidence trois de ces mutations nommées « m1 à m3 » qui affectent trois gènes importants pour le métabolisme et la multiplication cellulaire. Les données populationnelles chez ces moutons indiquent une fertilité réduite (baisse de réussite à l’insémination animale) lorsque deux animaux porteurs supposés de ces mutations sont accouplés, laissant penser à une action délétère de ces mutations sur le développement embryonnaire précoce. L’objectif de ce projet expérimental est d’étudier l’effet des mutations « m1 », « m2 » et « m3 » à l’état homozygote (m/m) chez le mouton pour expliquer le défaut de fertilité dans l’accouplement d’animaux hétérozygote m/+. Ainsi, la réalisation d’accouplements orientés entre individus porteurs hétérozygotes (m/+) pour ces mutations est une étape essentielle pour produire des embryons homozygotes m/m et établir si la période du développement embryonnaire précoce est affectée. Avec un déterminisme supposé récessif (les deux copies du même gène doivent être mutées pour observer un effet), il y a une chance sur quatre qu’un tel accouplement génère un embryon homozygote (m/m) atteint d’une anomalie.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de pouvoir objectiver le/les phénotype(s) affecté(s) par des mutations récessives supposées délétères découvertes chez les ovins laitiers. Les bénéfices attendus sont multiples. D’un point de vue scientifique et cognitif, la réalisation de ce projet permettra d’apporter à court terme des connaissances de biologie fondamentale sur le rôle et le fonctionnement des gènes touchés par les mutations « m1 », « m2 » et « m3 » dans le développement des embryons de mammifères. D’un point de vue appliqué, ce projet bénéficie du soutien de l’interprofession en génétique pour l’élevage ovin. Par une gestion adaptée des reproducteurs porteurs de ces mutations, les bénéfices attendus à moyen terme sont d’ordre technico-économique d’une part pour limiter les pertes économiques dues à la baisse de fertilité engendrée (entretien de brebis vides, coûts vétérinaires pour avortements, manque à gagner pour la production laitière et la vente d’agneaux) et d’autre part pour améliorer la santé et le bien-être des animaux (baisse de la mortinatalité et de l’apparition d’anomalies génétiques handicapantes directement imputables à ces mutations).

Procédures

Pour réaliser les inséminations animales chez la brebis en vue de la production d’embryons après une stimulation ovarienne, nous devons préalablement synchroniser le cycle reproductif de chaque brebis par l’introduction intravaginale (J0) d’une éponge imprégnée d’une hormone progestagène (une pose d'éponge dure 2min) que l'on retire 14 jours plus tard (J14, le retrait prend quelques secondes). La stimulation ovarienne est réalisée par l’injection intramusculaire d'hormones gonadotropes en 6 doses décroissantes, avec 12h d’intervalle entre chaque injection et sur 3 jours (entre J12 et J14, chaque injection dure quelques secondes). Puis, l'insémination par dépôt intra-vaginal de la semence est réalisée 55h après retrait de l’éponge (J16, l'insémination dure 2 minutes). Huit jours après l’IA (J24), les brebis ainsi inséminées seront euthanasiées pour le prélèvement post-mortem des utérus et la collecte et l'analyse des embryons présents dans les cornes utérines (l'injection létale dure quelques secondes).

Impact sur les animaux

Cette procédure (sans euthanasie) est classiquement utilisée pour produire des embryons en centre d’élevage agrée des entreprises de sélection ovine et n’induit pas d’effets indésirables récurrents connus. Néanmoins, la procédure nécessitera plusieurs contentions des brebis (pose de l’éponge, intravaginale, injections intramusculaires, insémination) qui peuvent générer du stress durant les quelques minutes (5 min maximum) que durent les contentions.

Devenir

La procédure expérimentale pour produire des embryons est de classe légère. Cependant, le projet scientifique dans lequel s'inscrit cette procédure expérimentale nécessite la récupération des embryons produits pour analyse génétique. Pour cela, les 30 brebis seront euthanasiées 8 jours après la dernière intervention de la procédure (insémination animale) pour la collecte post-mortem des utérus contenant les embryons.

Remplacement

La réalisation et le suivi d’accouplements orientés pour produire des embryons ovins du génotype désiré ne peuvent se faire que par l’utilisation d’animaux vivants. Aucune alternative existe.

Réduction

Nous souhaitons obtenir une vingtaine d’embryons homozygotes mutés pour chaque mutation. Le projet utilisera 30 brebis (10 brebis par mutation, 3 mutations étudiées) identifiées comme porteuses d’une de ces mutations récessives délétères pour obtenir le nombre d’embryon souhaité. Cette estimation prend en compte l’efficacité du traitement de superovulation (12 ovulations/brebis en moyenne), le taux de fécondation après insémination (80%) et le taux de récupération des embryons (85%). Ainsi, la réalisation d’accouplements à risque de 30 brebis permettra d’obtenir environ 240 embryons (=30*12*0,8*0,85). Parmi ces 240 embryons, un quart devrait être homozygote, soit une soixantaine. De ce fait, ce projet permettra d’obtenir environ 20 embryons homozygotes par mutation étudiée permettant l'observation d'une altération du développement embryonnaire précoce par comparaison aux 20 autres embryons non porteurs de la mutation (observation d'un écart de 5 embryons au stade blastocyste entre les deux groupes, avec une puissance de 88%). Sans l’utilisation de biotechnologies de la reproduction (stimulation ovarienne, insémination animale), le nombre de brebis nécessaire serait de 210 pour obtenir 240 embryons (1,5 ovulation/brebis en moyenne, 90% de fertilité en monte naturelle, 85% de récupération des embryons) avec la gestion d’au moins 5 béliers en 2 lots de lutte.

Raffinement

Les poses d’éponges intra-vaginales, injections intramusculaires et inséminations seront réalisées par du personnel animalier expérimenté et formé pour ce type de gestes. Grâce au suivi journalier, toute suspicion d’impact négatif sur la santé et le bien-être des animaux sera pris en compte par un traitement médicamenteux vétérinaire adaptée. Ce projet sera réalisé en condition d’élevage des ovins offrant une litière paillée, un accès à l'eau et à la nourriture sans restriction, et respectant le comportement grégaire de cette espèce.

Choix des espèces

Les mutations identifiées ne sont présentes que chez les ovins. Les conséquences technico-économiques des pertes embryonnaires affectant la fertilité ne concernent que l'espèce ovine. L'espèce ovine est donc étudiée pour elle-même. Pour réaliser les accouplements nécessaires, les brebis seront adultes et cyclées, aptes à la reproduction (2 à 7 ans).

60 agneaux vont être utilisés dans des procédures classées légères, puis renvoyés dans le cheptel pour être engraissés et abattus pour la consommation. Ils sont infestés par voie orale par deux vers parasites, Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis, puis subissent prélèvements rectaux, prises de sang à la jugulaire et pesées répétées, l'objectif étant de tester l'autopesée pour repérer les animaux parasités. Le porteur indique que l'infestation peut provoquer anémie et perte de poids et prévoit de sortir de l'essai les agneaux dont l'hématocrite chute. Il affirme qu'on ne peut pas remplacer le mouton pour reproduire le cycle parasitaire.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel de l’auto-pesée pour détecter les animaux parasités par les strongles gastro-intestinaux (SGI) qui présenteraient des trajectoires de gains de poids quotidien déficitaires par rapport à des individus témoins non infestés.

Bénéfices attendus

Les nématodes parasites du tube digestif, dont les strongles gastro-intestinaux (SGI), sont une contrainte majeure pour l’élevage des ovins et caprins en système pâturant en raison des pertes de production et de la mortalité qu’ils occasionnent. Plus précisément, ils peuvent entrainer une réduction significative de l’ingéré se traduisant par des pertes de gain de poids moyen quotidien (GMQ). Leur contrôle repose actuellement sur l’emploi systématique de molécules à activité anthelminthique (AH). Toutefois, l’utilisation intensive de ces molécules pendant des décennies a conduit à l’émergence de résistances voire de multirésistance (résistance à plusieurs familles d’AH en même temps) chez certaines populations de parasites. De plus, l’écotoxicité d’une classe particulière d’AH, les lactones macrocycliques, est maintenant bien documentée et acceptée de tous, laboratoires producteurs compris. Dès lors, il nous faut repenser complètement notre approche du contrôle de ces parasites. Une lutte intégrée combinant une utilisation rationnelle et prudente des AH avec des méthodes non chimiques (conduite du pâturage, sélection génétique d’animaux résistants, alicaments…) est actuellement proposée pour permettre un contrôle durable des SGI et une moindre diffusion de la résistance aux AH. L’utilisation rationnelle des AH consiste à n’appliquer un traitement AH qu’aux seuls animaux qui en ont vraiment besoin (traitement ciblé sélectif). En effet, dans un troupeau ovin, le parasitisme par les SGI est réparti de façon très hétérogène entre les individus : certains hébergent peu voire très peu de parasites et n’en souffrent pas ou très peu quand d’autres en hébergent beaucoup. Afin de freiner la diffusion de la résistance aux AH dans les élevages, il faut donc pouvoir identifier les individus qui nécessitent un traitement. Un outil permettant de contrôler régulièrement le poids et l’embonpoint des animaux serait alors d’une grande utilité pour développer une stratégie de traitement ciblé sélectif.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 actes expérimentaux : (Infestation expérimentale per os, prélèvement rectal pour analyse coprologique et prélèvement sanguin par ponction à la veine jugulaire es pesées). Les agneaux sont pesés deux fois par semaine, à heure fixe. Une cage d'autopesée sera également installée dans le lot afin de collecter des données de pesée plus régulières des agneaux (jusqu'à plusieurs fois par jour). - Coprologie : Des prélèvements individuels sont réalisés sur tous les animaux de l’essai à la mise en lots (J0) puis à J21, J28 et J35 pour vérifier la bonne installation des vers puis suivre l’évolution des excrétions. La méthode utilisée pour les coprologies individuelles est la méthode de flottation au chlorure de sodium en lame de McMaster avec une sensibilité de 15 oeufs par gramme de matières fécales. - Hématocrite et indice FAMACHA : Des prises de sang individuelles sur tubes EDTA seront réalisées sur tous les animaux de l’essai, animaux infestés et animaux témoins non infestés, à la mise en lots (J0), puis à J14, J21, J28 et J35. Les prises de sang sont accompagnées d’une notation FAMACHA (intensité de la coloration des muqueuses oculaires, indicateur de l’anémie). Si la valeur d’hématocrite s’avère inférieure à 20% ou si l’examen de la coloration des muqueuses (FAMACHA) conclu à une anémie sévère, l’animal est traité et sorti de l’essai. Toutefois, ce cas de figure est peu probable car la dose utilisée est à la fois suffisante pour diminuer l’ingéré mais insuffisante pour mettre en danger la vie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus dus à l’infestation des agneaux par Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis sont : - L’anémie qui peut apparaitre autour du 21eme jour suite à l’infestation, une fois que les nématodes seront adultes et infectants. - La perte d’appétit qui peut engendrer une perte de poids des animaux à partir du 21eme jour après infestation. Le rationnement des agneaux à 800g de concentrés par jour peut accentuer les effets de la perte de poids des agneaux. En cas de signes de maladie (fièvre > 40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé, anorexie, perte de poids > à 15%…), ou d’impact sur l’état général des animaux (prostration, cachexie, alopécie…), une intervention vétérinaire aura lieu et un traitement adapté (antidouleurs, antiinflammatoires, antibiotiques) sera mis en place (l’animal sortira du protocole si nécessaire). Les nématodes intestinaux utilisés dans ce protocole seront inoculés à une dose suffisamment importante pour obtenir les réponses souhaitées mais suffisamment faible pour ne pas engendrer de signes cliniques. Les animaux seront observés quotidiennement afin d'évaluer toute altération de l'état général (anorexie, prostration). Tout animal présentant une altération générale fera l'objet d'un examen clinique (température, hématocrite, coproscopie). Tout animal ayant un hématocrite inférieur à 15% ou excrétant plus de 50 000 oeufs/g de fèces sera vermifugé et sorti du protocole.

Devenir

Les agneaux retournent dans le cheptel à la fin de la procédure. Ils seront par la suite engraissés pour la consommation.

Remplacement

On ne peut pas remplacer l’hôte (le mouton) pour la réalisation du cycle parasitaire et l’étude de l'impact de l’infestation sur le gain de poids des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus dans l’expérimentation a été limité au maximum pour avoir un effectif garantissant l’interprétation des données.

Raffinement

Les agneaux sont hébergés sur une litière paillée et en lots de manière à pouvoir exprimer leurs comportements sociaux. Petit à petit, ils vont s’habituer à être manipulés et les prélèvements seront réalisés par du personnel expérimenté.

Choix des espèces

L’espèce ovine est l’espèce cible (application potentielle en élevage). Il n'existe pas d'autre espèce modèle ni de système alternatif à cette étude car ce caractère résulte de phénomènes biologiques, physiologiques, génétiques complexes.

40 brebis vont être utilisées dans des procédures classées légères, sans être tuées à l'issue. Chacune subit des prélèvements de sang à la jugulaire, jusqu'à 400 à 450 millilitres une fois toutes les trois semaines, pendant deux ans et demi, pour tester in vitro l'hémocompatibilité d'une pompe cardiaque. Le porteur indique que les brebis seront réhabilitées, replacées ou adoptées par une association en fin de projet si leur bilan sanitaire le permet. Il affirme avoir choisi l'ovin pour sa "docilité", l'accès facile aux veines et une coagulation proche de celle de l'humain.

Objectifs

Le projet a pour objectif d'utiliser du sang frais prélevé chez des brebis, afin d’évaluer et d’améliorer les interactions entre le tissu sanguin et la pompe cardiaque dévelopée par notre partenaire. Cette dernière est un dispositif médical appelé “assistance circulatoire gauche”, ou “LVAD”, destiné aux personnes souffrant d’insuffisance cardiaque grave. Il s’agit d’une pompe mécanique implantée chirurgicalement dans le corps et destinée à pallier un cœur défaillant. Le LVAD développé a pour ambition de recréer fidèlement les phases de remplissage et d’éjection du cœur natif sans pour autant exposer le sang aux dommages causés par les pompes actuellement commercialisées. Afin d’évaluer cet aspect sur des prototypes avancés de LVAD en cours de développement, puis dans le cadre de leur évaluation pré-clinique, il est nécessaire d’utiliser du sang frais prélevé dans des conditions permettant de préserver toutes ses caractéristiques biologiques.

Bénéfices attendus

Il est essentiel de caractériser les interactions des pompes LVAD avec le sang afin d’évaluer et de prévenir les risques d’hémolyse (destruction des globules rouges), de formation de thrombus dans la pompe (caillot), ou de dégradation de protéines sanguines essentielles. Les essais d’hémocompatibilité in vitro permettent de caractériser ces aspects dans des conditions contrôlées. Cependant, la qualité et la fraicheur du sang utilisé sont essentielles dans la réalisation de ces tests. Il est donc nécessaire de prélever le sang par ponction veineuse afin de minimiser les risques d’activation et de contamination extérieure. La norme en vigueur recommande l’utilisation de sang bovin, porcin, ou ovin pour la réalisation de tests d’hémocompatibilité sur des pompes cardiaques car le tissu sanguin de ces animaux est très similaire à celui des humains. De plus l’utilisation des gros animaux permet d’obtenir de grandes quantités de sang (quelques centaines de ml) sans préjudice pour l’animal. Dans ce projet des ovins ont été choisis pour leur docilité, l’accès facile aux veines jugulaires et des mécanismes de l’arrêt de l’écoulement du sang comparables à ceux observés chez l’humain.

Procédures

Un prélèvement sanguin par ponction veineuse au niveau de la veine jugulaire de moins de 10% du volume total (environ 400-450 mL) jusqu’à un maximum d’une fois toutes les 3 semaines pendant 2 ans et demi, pourvu qu’aucun point limite n’ait été atteint.

Impact sur les animaux

Les brebis pourront ressentir un peu de fatigue à la suite du prélèvement sanguin, comme tout un chacun à la suite d'un don de sang. Alimentation et abreuvement seront disponibles à volonté pour tous les animaux prélevées. Dans le cadre de ce projet le prélèvement de sang se limitera à 10% du volume sanguin total, et 3 semaines minimum de repos seront respectées entre chaque prélèvement. L'état des muqueuses des animaux ainsi que leurs numérations de formules sanguines seront controlées régulièrement afin de dépister toute survenue éventuelle d'anémie

Devenir

Toutes les brebis seront réhabilitées/replacées ou adoptées (par une association de protection animale qui gère la réhabilitation des animaux de laboratoire), dans la mesure où leur bilan sanitaire nous y autorisera, en fin de procédure.

Remplacement

L'étude des interactions biologiques entre le LVAD CorWave et le sang est réalisé in vitro mais nécessite d’avoir recours à du sang frais prélevé chez des animaux vivants. Bien que la pompe CorWave soit développée en amont à partir de simulations numériques et de tests hydrauliques in vitro de pointe, ces derniers ne permettent pas dans l'état actuel des connaissances d’évaluer les interactions biologiques complexes avec le sang.

Réduction

Les dispositifs LVAD sont conçus pour pomper 5L de sang dans un organisme humain. Le nombre d'animaux impliqués dans le projet sera réduit au minimum grâce à l'utilisation de systèmes de test in vitro des dispositifs LVAD exploitant de faibles quantités de sang. Les tests in vitro de ces dispositifs réduisent les volumes de sang nécessaires à quelques centaines de millilitres par dispositif testé, réduisant ainsi la fréquence et le volume des prélèvements sanguins à effectuer. Un volume de 2 L permet ainsi de comparer 4 designs de pompe différents en une semaine.

Raffinement

L’étude de l’hémocompatibilité du LVAD in vitro à partir de sang prélevé par ponction veineuse permet de réduire le recours à des études d’implantation in vivo de classe « sévère » ou « sans réveil ». L’utilisation d’ovins se limite ainsi dans ce projet à une procédure expérimentale de classe « légère » qui ne devrait pas avoir d’incidence sur l’état général des animaux. Aucune souffrance ou stress significatif n’est attendu dans ce projet. Des ovins ont été choisis pour leur docilité, l’accès facile aux veines jugulaires et une hémostase comparable à celle de l’Homme. Les animaux seront hébergés en troupeau et placés au maximum en situation d'éco-paturage en extérieur. Ils ne seront isolés que le temps du prélèvement sanguin.

Choix des espèces

L’utilisation des gros animaux permet d’obtenir de grandes quantités de sang (quelques centaines de mL) sans prejudice pour l’animal. Les normes en vigueur recommandent donc l’utilisation de sang bovin, porcin, ou ovin. Des brebis adultes seront utilisées afin de pouvoir prélever le volume de sang nécessaire sans affecter la santé de animaux.

14 brebis vont être utilisées, opérées sous anesthésie et mises à mort avant tout réveil, dans des procédures pourtant classées de souffrance légère. Sous une anesthésie de trois heures, chaque animal subit une incision derrière l'oreille et un fraisage de l'os pour accéder à l'oreille interne, dont le prélèvement de liquide entraîne une surdité définitive des deux oreilles. Le porteur indique mettre à mort les brebis par surdosage d'anesthésique parce que cette surdité et d'éventuels vertiges compromettraient leur vie quotidienne. L'objectif est de vérifier qu'une technique de diffusion de médicaments vers l'oreille interne n'est pas toxique.

Objectifs

Les objectifs de notre travail sont doubles : - Vérifier l'absence d'ototoxicité de la sonoporation sur l'oreille interne. - Evaluer la concentration en stéroïdes au niveau des liquides de l'oreille interne suite à la sonoporation et l'administration locale trans-tympanique.

Bénéfices attendus

Si l'absence de toxicité de la sonoporation est démontrée ainsi que la possibilité d'augmenter la concentration de corticoïdes au sein de la périlymphe, cela permettrait de proposer un nouveau mode de diffusion de molécules thérapeutiques à l'oreille interne. Cette méthode permettrait d'atteindre des concentrations plus élevées que l'administration des mêmes molécules par voie systémique. Actuellement, les molécules les plus utilisées par cette voie sont les corticoïdes et la gentamicine à but thérapeutique, ainsi que le gadolinium pour l'imagerie de l'oreille interne. Cette voie de diffusion de molécules à l'oreille interne pourrait avoir un rôle thérapeutique à jouer, notamment pour agir dans la régénération de nouvelles cellules ciliées fonctionnelles, qui vieillissent et meurent, suite à l'âge et l'exposition au bruit. L'autre intérêt de pouvoir faire parvenir des molécules telles que des corticoïdes à l’oreille interne serait d’obtenir une réduction de la fibrose suite à une implantation cochléaire.

Procédures

L'ensemble des prélèvements auront lieu lors de l'anesthésie générale ainsi que la procédure chirurgicale et la sonoporation. Il sera prélevé un tube de sang et de périlymphe. La durée totale de l'anesthésie générale est de 3H, au cours de cette anesthésie générales, les 3 procédures seront effectuées.

Impact sur les animaux

Les brebis incluses subiront une anesthésie générale durant laquelle aura lieu l'ensemble de l'expérimentation. Lors de cette anesthésie générale, il sera effectué une incision rétro-auriculaire puis un fraisage de l'os mastoïdien pour accéder à l'oreille interne. Une fois l'oreille interne repérée, le prélèvement de périlymphe sera réalisé pour l'ensemble des groupes. Ce prélèvement entraine une surdité irréversible. Les animaux seront atteints d'une surdité bilatérale compte tenu du protocole. De plus, ils peuvent être atteints de vertiges incoercibles en cas de réveils suite à l'anesthésie générale et de paralysie faciale périphérique en fonction de la position du nerf facial par rapport à la fenêtre ronde, cela pourrait avec des repercussions sur les possibilités d'alimentation des animaux. D'où la mise à mort par surdosage d'anesthésiques lors de l'anesthésie générale, suite aux 3 procédures décrites.

Devenir

Les 3 procédures auront lieu lors de la même anesthésie générale. Suite au prélèvement de périlymphe de la procédure 3, les brebis présenteront une surdité définitive bilatérale, irréversible du fait du prélèvement de liquide de l'oreille interne aura été prélevé. Elles pourraient aussi en cas de réveils présentés des vertiges empêchant une mobilité normale. Cette perte de la fonction auditive et de l'équilibre pourraient avoir un retentissement majeur dans la vie quotidienne des brebis, ainsi il sera effectué une euthanasie par surdosage médicamenteux suite à la procédure 3.

Remplacement

Une étude pré-clinique chez l'animal est nécessaire afin de s'assurer de l'absence d'ototoxicité de la sonoporation et pour comparer le liquide de l'oreille interne (périlymphe). Cette étude permettra de définir si un tel concept est réalisable et permet d’obtenir une diffusion des molécules thérapeutiques à l’oreille interne (corticoïdes) supérieure à la diffusion par injection locale. Le modèle animal ne peut être substitué par un modèle in-vitro ou in silico

Réduction

Sur la base d'une analyse statistique et bibliographique, notre étude nécessite l’inclusion de 12 animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux, chaque brebis sera son propre témoin sur le statut normo-entendant/sonoporation pour l'étude de l'ototoxicité et sur le statut injection locale/sonoporation pour vérifier l’existence d’une meilleure diffusion par la sonoporation comparée aux injections locales transtympaniques. Un test de Wilcoxon en rangs signés sera utilisé pour comparer les valeurs quantitatives des paramètres étudiés (seuils auditifs, concentration de corticoïde). Des analyses uni- et multivariées seront effectuées sur les profils métabolomiques de la périlymphe. En métabolomique, il n’existe pas de recommandation sur le nombre minimum de sujets. Cependant, nos précédentes études effectuées à ont montré que le nombre de 6 sujets avait permis de faire ressortir des groupes statistiquement différents en utilisant les analyses statistiques multi et univariées en métabolomique qui comportent notamment le Partial Least Squares (PLS) qui est une méthode supervisée utilisant des techniques de régression multivariée pour extraire, par combinaison linéaire de variables originales (X), l’information qui peut prédire l’appartenance à une classe (Y). Notre expérience, sur le prélèvement de périlymphe, nous a permis de le réaliser systématiquement sur une oreille normale jamais opérée. La principale contrainte est le faible volume prélevé qui ne dépasse jamais quelques microlitres. Ainsi, nous estimons que 6 brebis par groupe serait raisonnable pour ne pas augmenter les animaux, tout en ayant des résultats si nos hypothèses se vérifient.

Raffinement

Le monitoring des constantes sera effectué lors de l'anesthésie générale afin de détecter une douleur per-opératoire nécessitant une adaptation de l'analgésie et/ou de la profondeur de l'anesthésie. Une augmentation de la fréquence cardiaque, de la tension artérielle ou une hyperventilation avec augmentation de pression des voies aériennes feront partie des paramètres monitorés. Des signes cliniques tels que un larmoiement, une grimace, ou une tentative de mouvement feront partie des points limites surveillés et s' ils apparaissaient des mesures thérapeutiques seraient alors initiées. Le stress sera minimisé avant la chirurgie avec un hébergement en groupe, les cases seront paillées et la nourriture sera la même que dans l’élevage. Une injection de buprénorphine sera effectuée avant la chirurgie pour prendre éviter les douleurs per-opératoires ainsi qu'une anesthésie locale. Ces injections pourront être renouvelées si le monitorage des constantes suggère une douleur de l'animal en per-opératoire. Les 3 procédures auront lieu lors de la même anesthésie générale et une table chauffante sera utilisée pour éviter l'hypothermie. Il sera considéré comme point limite tous signes clinique et hémodynamique en faveur d'un choc hemorragique nécessitant l'arrêt des souffrances par euthanasie.

Choix des espèces

Ce modèle a l'avantage d'avoir une anatomie de l'oreille interne (Trinh et al, 2021) et un spectre auditif comparable à l'homme. Des études ont montré la comparabilité anatomique entre l'oreille interne de la brebis et celle de l'homme, avec une cochlée réalisant 2 tours 1/2 de spire et des proportions morphologiques équivalentes à celles de l'homme (Seibel et al. 2006). Les animaux seront âgés de plus d'un an car à partir de cet âge ils ont atteint la maturité du cortex auditif. Afin de constituer un groupe homogène, les brebis seront âgées de 2 à 3 ans.

40 brebis vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes rendues ensuite à la production. Le porteur soumet des brebis venant de mettre bas à deux jours de paille de faible valeur nutritive, puis leur prélève du sang huit fois en dix-neuf jours, pour étudier leur adaptation à un manque alimentaire lié au changement climatique. Il indique qu'une perte de poids et une mobilisation des réserves corporelles sont possibles, sans danger annoncé. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible car l'étude porte sur une race ovine précise.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme européen. Des expérimentations similaires sont en train de se dérouler dans d'autres installations expérimentales, avec d'autres races ovines et une autre espèce, les caprins, dans les pays membres du consortium (Egypte, Espagne et Tunisie). L’objectif global est d’étudier les réponses des petits ruminants face aux effets du changement climatique, plus particulièrement les effets des challenges nutritionnels en faisant varier quantité et qualité de l’offre alimentaire. L'objectif du projet est d'évaluer, d'une part, les capacités adaptatives des brebis de race Romane face à un challenge nutritionnel sévère après la mise bas. D'autre part d'étudier, pour le caractère efficacité alimentaire, les effets de la lignée génétique (une lignée de brebis efficaces et une lignée de brebis inefficaces) sur la réponse au challenge nutritionnel et de décrypter les mécanismes de l'organisme qui sont reponsables de cette réponse. Ainsi une meilleure compréhension de la réponse des animaux aux stress alimentaires nous permettra de proposer aux éleveurs des pratiques de conduites ciblées pour des catégories ou types d’animaux spécifiques et de maintenir la performance productive des brebis dans des situations extrêmes par exemple imposées par le changement climatique où l’offre de ressources est variable ou limitée et/ou la qualité (valeur nutritionnelle des fourrages) est dégradée.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'étudier comment des brebis de race Romane qui appartiennent à une lignées génétique divergente, pour le caractère efficacité alimentaire, font face à un challenge nutritionnel pendant la période critique de la mise-bas. Il permettra également de déterminer la variabilité individuelle des brebis.

Procédures

Prélevements sanguins pour dosage des métabolites et hormones métaboliques. La prise de sang se fera au niveau des jugulaires en alternant gauche/droite. Cela 8 fois durant les 19 jours de mesures.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas d'effets indésirables attendus avec le déroulement de ce projet. Néanmoins, un minimum d’effet est prévu concernant l’impact instantanée sur le bilan énergétique des brebis soumises à un challenge nutritionnel pendant deux jours avec de la paille de faible valeur nutritionnelle. Donc des effets « cascade » à court terme sur le métabolisme, avec une perte éventuelle de poids vifs et d'état corporel (mobilisation des réserves corporelles) seront envisageable, sans représenter un danger pour les brebis.

Devenir

Tous les animaux retourneront en production dans leur environnement naturel.

Remplacement

Il s'agit d'un projet qui cherche à développer de la connaissance fondamentale pour l'espèce ovine, plus particulièrement, pour la race Romane (ancien INRA401) et les deux lignées divergentes développées pour l'éfficacité alimentaire. Donc, pas de remplacement possible avec d'autres animaux ou méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre d'animaux prévus a été calculé avec la formule statistique : n=(2SD/p)² avec N = nombre d’animaux, SD=écart type, P=la précision souhaitée pour l’analyse. Au final, nous avons 10 brebis par lignée, par parité, il s'agit du minimum d'observations possibles pour arriver à une puissance statistique minimale pour les interprétations à prévoir dans ce projet.

Raffinement

Les animaux sont en groupe sur aire paillée. Pendant toute la durée de l'expérimentation, le personnel qualifié observera quotidiennement les brebis et leurs agneaux lors des 2 distributions de l'alimentation ainsi que lors de son passage dans la matinée et l'après-midi. Les brebis seront dressées au fonctionnement des portillons électroniques pendant quelques jours au milieu de la gestation, pour éviter la phase critique de la fin de gestation. Le milieu sera enrichi, pour les brebis, par des objets (chaine ou disque) accrochés qui seront alternés au cours de la semaine . Lors du paillage la paille sera mise en tas et ce sont les brebis qui l'étaleront. Pour les agneaux une table, de petite taille dont les pieds ont été ajustés à leur hauteur, sera mise à disposition. Le matériel de contention pour les prélèvements est adapté aux ovins et les animaux y sont habitués.

Choix des espèces

Il s'agit d'un projet destiné à la filière des petits ruminants, notamment les ovins. Les brebis seront utilisées après la mise bas et au début de la lactation. A ce stade physiologique la brebis démarre sa lactation qui permettra d'assurer la croissance des agneaux. En élevage selon les périodes d'agnelage des déficits nutritionnels (quantité et/ou qualité) peuvent avoir lieu pendant cette période. L'objectif est d'évaluer les capacités adaptatives des petits brebis.

72 brebis laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réintégrées à la production laitière. Le porteur décrit quatre séries de prélèvements sur deux mois, associant une prise de sang à la jugulaire et un prélèvement de jus de rumen par sonde gastro-œsophagienne. Il indique que la répétition de ces prélèvements peut générer un stress, atténué par une habituation à la cage de contention. Sur le remplacement, il affirme qu'étudier le statut énergétique d'un ruminant en début de lactation rend le recours à l'animal inévitable.

Objectifs

L’objectif du projet est de proposer aux éleveurs de brebis laitières des outils de précisions pour améliorer la gestion des moments d’élevage clés du troupeau, et ainsi améliorer la santé des brebis et des agneaux, mieux valoriser l’alimentation et avoir un lait de meilleure qualité pour le consommateur. L’approche innovante est de s’intéresser au début de lactation, moment critique jusque-là peu étudié, et d’identifier grâce à des indicateurs non invasifs, les animaux en situation nutritionnelle difficile. En effet, durant le premier mois après la mise-bas, les brebis laitières sont à la fois allaitantes et traites, puis elles passent en traite exclusive : c’est dans cette période que certaines d’entre elles se retrouvent en déficit énergétique, lorsque leurs besoins énergétiques ne peuvent pas être totalement couverts par les apports alimentaires. Le spectre en Moyen Infra-Rouge (MIR) du lait est un phénotype simple et peu couteux à obtenir : nous proposons de le valoriser durant la phase d’allaitement-traite pour identifier les animaux en déficit énergétique afin que l’éleveur puisse moduler l’alimentation de ceux-ci. Nous nous appuierons sur des brebis divergentes pour le comptage des cellules somatiques (CCS) dans le lait, car il a été montré que ces 2 groupes se différenciaient en termes de bilan énergétiques en début de lactation, et afin de définir le moment le plus propice à la détection des animaux en déficit énergétiques, les analyses du lait via le MIR seront effectuées de façon longitudinale durant les 2 premiers mois de lactation des brebis. Enfin, d’autres biomarqueurs seront recherchés dans le lait, le plasma et le rumen (métabolome) et une étude du microbiote ruminal des brebis sera réalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir, en situation d’élevage classique et sur un nombre conséquent d’animaux, des profils d’évolution individuel de l’état énergétique des brebis laitières durant la phase clés d’allaitement-traite. L’utilisation synchrone de dosages de références et de mesures non invasives va permettre l’identification de prédicteurs de l’état énergétique dégradé de certaines brebis, utilisables en élevage classique. De plus, le programme de recherche dont fait partie ce projet fait intervenir un second site expérimental où les phénotypages simplifiés seront aussi effectués de façon longitudinale durant cette période d’allaitement-traite ; il est aussi adossé à un programme européen où 8 fermes privées réaliseront un « suivi » type pour valider la faisabilité de cette détection en ferme classique.

Procédures

Les brebis seront soumises à 2 types de prélèvement : - Une prise de sang à la veine jugulaire, - Un prélèvement de jus de rumen par sonde gastro-oesophagienne ; Cela 4 fois durant les 2 mois de l’essai, au maximum à une semaine d’intervalle.

Impact sur les animaux

La répétition à 1 semaine d’intervalle du prélèvement de jus de rumen et de sang pourrait générer un stress sur les brebis : des actions de renforcement positif seront mis en place pour palier à ce possible effet indésirable, notamment en habituant les brebis à la cage de contention. Celle-ci, ainsi que la compétence du personnel réalisant depuis de nombreuses années ce type de prélèvements, assurera un prélèvement efficace, sans lésion et sur un laps de temps très court.

Devenir

Poursuite de la vie productive classique de la brebis laitière en lactation

Remplacement

Il s’agit ici d’étudier le statut énergétique d’un animal. Celui-ci est la résultante de l’alimentation et du fonctionnement global de l’organisme. Le recourt à l’animal ne peut être éviter.

Réduction

Nous avons calculé le nombre optimal d’animaux à utiliser avec une formule statistique : n = (2SD/p)² où n est le nombre d'animaux, SD l'écart-type et p la précision souhaitée pour notre analyse.

Raffinement

Tous les animaux seront hébergés sur une aire paillée en groupe, de manière à exprimer leurs comportements sociaux. Afin de stimuler les brebis, au cours d'une semaine des objets d'enrichissement seront suspendus dans les parcs et alternés (disques, chaines). Au quotidien, lors du paillage, la paille seront mise en tas et ce sont les brebis qui l'étaleront. Afin de limiter le stress de contention, les prélèvements seront réalisés par du personnel qualifié à l’aide de matériel de contention adapté aux ovins et à laquelle les animaux sont habitués. Les prélèvements de lait se feront lors du contrôle laitier, sans manipulation supplémentaire de la brebis. Les prélèvements de sang et de contenu ruminal se feront successivement lors de la même contention, afin de réduire au maximum le temps de contention de chaque animal. Les animaux font l’objet d’une surveillance toute particulière au moment des prélèvements et après ceux-ci. Au moindre problème l’animal est retiré du projet et soigné.

Choix des espèces

Le déficit énergétique que l’on vise à monitorer apparait spécifiquement chez les ruminants, quand la capacité digestive post-mise bas n’est pas suffisante pour ingérer l’énergie permettant de faire face aux besoins de la femelle en début de lactation. Il est donc indispensable de réaliser ce travail sur un ruminant. Par ailleurs, chez les bovins et les caprins laitiers, le petit est très rapidement séparé de sa mère : cette concomitance de l’allaitement du petit et du passage à la traite pour extraire le surplus de lait, n’existe que chez la brebis laitière. Notre étude porte sur le déficit énergétique en début de lactation, donc nos animaux seront à ce stade.