Moutons

50 moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une création d'infarctus par occlusion des artères coronaires, des séances d'imagerie, une ablation cardiaque par électroporation et des prises de sang répétées, avant l'euthanasie pour prélever le cœur. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de tachycardie ventriculaire, une procédure plus efficace et une meilleure qualité de vie, restent au conditionnel. Le porteur affirme que le remplacement "n'est actuellement pas possible" et présente un jumeau numérique en développement comme un remplacement futur.

Objectifs

La tachycardie ventriculaire est un trouble du rythme cardiaque complexe grave qui peut entraîner une mort subite. Dans la grande majorité des cas (>70%), les tachycardies ventriculaires surviennent dans un contexte d’infarctus du myocarde ancien. Le remodelage du tissu cardiaque suite à un infarctus permet la création d’hétérogénéités qui favorisent les tachycardies ventriculaires. L’ablation par cathéter de ces zones hétérogènes du cœur, est une thérapie qui peut significativement réduire les nombres de tachycardies ventriculaires des patients, en améliorant leur qualité de vie. Une nouvelle forme d’ablation, utilisant un champ électrique pulsé de haute amplitude appelée ablation par électroporation ou Pulsed Field Ablation (PFA), est une nouvelle technique de traitement pour obtenir une thérapie plus efficace, notamment si elle est combinée avec des techniques d’imagerie qui permettent d’avoir un modèle, trois dimensions du cœur du patients (jumeau numérique) pendant l’opération. Dans ce projet, nous souhaitons investiguer les effets et les propriétés de cette technique d’ablation dans un modèle animal ovin pathologique, avec l’assistance de jumeaux numériques. Les objectifs scientifiques sont les suivants : mieux caractériser les lésions de la technique innovante d’ablation PFA dans le tissu hétérogène du cœur en utilisant de techniques d’imagerie non invasive ; développer un modèle mathématique pour optimiser et personnaliser l'administration de la thérapie ; et l'inclure dans un logiciel de traitement d’images pour les procédures cliniques existantes, ce qui fournira un nouveau outil à la thérapie des patients.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’optimiser une technique d’ablation innovante (PFA) et de révéler des aspects importants de l'effet de cette technique sur les tissus d’intérêt du cœur (sur le modèle pathologique post infarctus développé). Il permettra un meilleur dosage de l’énergie d'électroporation et d’adapter le protocole en fonction de l’anatomie individuelle du cœur et de l’origine de la tachycardie ventriculaire. Le projet ouvrira également de nouvelles perspectives dans le domaine du traitement des images cardiaques en trois dimensions (jumeau numérique) grâce à cette première application pour la tachycardie ventriculaire. Cette technologie pourrait permettre de l’étendre à d’autres formes de maladies cardiaques. Autant de thèmes encore largement ignorés mais capitaux pour éviter les récidives et les interventions ultérieures sur les patients atteints de tachycardie ventriculaire. Les patients bénéficieront non seulement d’une procédure plus efficace et plus sûre, mais aussi d'une meilleure prise en charge pendant et après la procédure, avec une meilleure qualité de vie après le traitement. Ce travail permettra à cette technique d’ablation PFA de devenir progressivement le traitement de choix pour l’ablation des tachycardies ventriculaires.

Procédures

Les animaux utilisés subiront des interventions de création d’infarctus, d’imagerie et d’ablation par electroporation sous anesthésie générale et avec l’administration d’une thérapie anti-algique appropriée. La procédure de création d’infarctus (150 minutes) se déroule, sous guidance des rayons X, par occlusion progressive, sous surveillance, de deux ou trois branches des artères coronaires. Une prise de sang avant (animal sous anesthésie générale, 30 secondes) et 24 après l’infarctus (animal vigile, 30 secondes) de 5 ml nous permettra de mesure l’état inflammatoire (cytokine) et de dégâts subis par le tissu cardiaque (troponine). Apres 4-6 semaines de récupération, les séquences d’imagerie sont de type non-invasif, soit par IRM cardiaque et/ou une échocardiographie par sonde thoracique/transoeasophagienne et/ou par scanner cardiaque (environ 180 minutes). L’ablation par cathéter (90 minutess) est effectuée sous anesthésie et administration d’héparine pour prévenir la formation de caillots. Des systèmes de traitement d’image et de cartographie de contact nous permettent de cibler les zones potentiellement favorisantes des tachycardies ventriculaires. Une prise de sang avant (animal sous anesthésie générale, 30 secondes) et 24 après l’ablation (animal vigile, 30 secondes) de 5 ml nous permettra de mesure l’état inflammatoire (cytokine) et des dégâts subis par le tissu cardiaque (troponine). Apres 4-6 semaines de récupération, une imagerie (environ 180 minutes) et une cartographie de contact diagnostique (90 minutes) de suivi sont prévus pour évaluer les effets du protocole d’ablation par electroporation. Une prise de sang avant l’euthanasie (animal sous anesthésie générale, 30 secondes) de 5 ml nous permettra de mesure l’état final du contexte inflammatoire et du remodelage cardiaque.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes phases du projet notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie), ces effets disparaissent rapidement car les moyens nécessaires pour faciliter le réveil des animaux (lampe chauffante, molécules de réanimation par exemple si besoin) sont mis en place. Les examens d’imagerie (échocardiographie, IRM et cartographie de contact) sont effectués sous anesthésie générale et thérapie antalgique. La création de l’infarctus aura lieu durant la perfusion continue d’anti-arythmiques et de bétabloquant, dont le débit sera ajusté en fonction des signes cliniques observés sur le monitoring. Pendant l’ablation, notamment avec la PFA, on pourrait observer une paralysie temporaire du nerf phrénique ou du diaphragme, mais ces conditions n’empêchent pas la ventilation mécanique. En phase d’étude diagnostique pendant la cartographie de contact, des déclenchements de tachycardie ventriculaire et potentiellement débordants en fibrillations, seront traitées immédiatement par un défibrillateur toujours présent en salle. Des saignements mineurs peuvent avoir lieu aux sites d’introduction des cathéters pour la cartographie.

Devenir

Afin de prélever le cœur et effectuer des études ex vivo d’histologie et de microscanner, qui nous permettront de mieux comprendre la structure des cicatrices induites par l’infarctus et l’ablation, l'ensemble des animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Pour répondre aux questions d’ordre clinique, pour développer et optimiser la prise en charge des patients, des modèles animaux de pathologies humaines sont nécessaires. Le remplacement des animaux n’est actuellement pas possible. En effet, l'étude des mécanismes physiologiques complexes dans leur globalité nécessite d’avoir recours à un modèle animal et il n'existe pas à ce jour de modèle de modélisation numérique ou in vitro. Au cours des dernières années, un travail est en cours sur une technologie de traitement des images préopératoires permettant de construire un jumeau numérique du cœur sain et malade. En utilisant cet outil en clinique, nous évitons aujourd’hui d’utiliser des animaux pour l’optimisation des protocoles d’ablation. Ce projet permettra à terme d’obtenir un modèle numérique remplaçant l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Notre stratégie pour réduire le nombre d'animaux utilisés repose sur la création, dans notre modèle, de plusieurs cicatrices, ce qui nous permettra d’obtenir des sites d’ablation. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer la taille des lésions entre les groupes et pour définir la vulnérabilité à la tachycardie ventriculaire avant et après la thérapie. Cela nous donnera une idée de la variabilité individuelle liée à la structure du tissu et au remodelage du tissu cardiaque. Nous allons également minimiser les temps des différents examens, pour que nous puissions utiliser les mêmes animaux pour différentes techniques d’imagerie non invasive l'une après l'autre, notamment l’IRM ou l'échographie. Dans le meilleur des cas, cela nous permettra de diminuer jusqu’à 50% le nombre d’animaux nécessaires. En phase de création du modèle nous allons utiliser certains animaux comme leurs propres contrôles. Cette dernière stratégie nous permettra de ne pas inclure d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Au cours du projet, les animaux reçoivent un protocole analgésique approprié, ils sont sous anesthésie générale avec une ventilation mécanique et les constantes vitales sont suivies en permanence lors des opérations. Tout le nécessaire est mis en place pour leur prise en charge : opération réalisée par du personnel formé, anti-arythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire, défibrillateur disponible... Pendant la phase de suivi, l'animal est hébergé dans des locaux adaptés et les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce sont mise en place (groupe social notamment). Les animaux sont suivis quotidiennement par le personnel, qui peut intervenir rapidement. Le vétérinaire et le responsable du projet adapteront les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l'état de santé au point d'atteindre l'un des points limites sans qu'aucune action ne puisse permettre un retour à l'état basal alors le protocole sera interrompu.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme (mouton, porc, chèvre, chien), le mouton a été retenu car ce modèle est une référence pour la communauté scientifique dans l’étude des pathologiques cardiaques, de plus le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ce modèle. Le mouton atteint la fin de son développement entre 1 et 2 ans, à ce stade de développement, l’organe d’intérêt de l’étude, à savoir le cœur aura donc une taille et une maturité nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

75 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie un stimulateur cardiaque et un dispositif de télémétrie, puis subissent une stimulation rapide destinée à installer une fibrillation auriculaire persistante, avec IRM, échographies, scanners et biopsies rénales, hépatiques et cardiaques sous anesthésie. Seuls 15 pour cent des animaux stimulés développant le trouble recherché, le porteur prévoit d'inclure jusqu'à 65 brebis pour en obtenir dix exploitables. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité du cœur et que le remplacement est impossible "au stade actuel de la recherche".

Objectifs

La fibrillation auriculaire est l’arythmie la plus répandue, elle atteint 1-3% de la population globale. Sans traitement, la fibrillation auriculaire multiplie le risque de subir un AVC (accident vasculaire cérébral) ou de souffrir d'insuffisance cardiaque. L’objectif de ce projet est d’étudier la fibrillation auriculaire afin de mieux la prévenir et mieux la traiter. Il a été observé que la fibrillation auriculaire modifie spécifiquement le métabolisme cardiaque. Nous avons observé dans des études préliminaires que le tissu cardiaque atteint par la fibrillation subit des effets délétères dû à l’accumulation de certains métabolites, parmi lesquels le succinate. Ce dernier a l’effet de changer la dynamique cardiaque et de favoriser des arythmies. À ce jour, nous ne disposons pas de données sur l'équilibre métabolique effectif du cœur et sur les changements temporels de la signature métabolique. L’objectif de ce projet est d’obtenir des informations sur les facteurs du métabolisme cardiaque qui favorisent l'installation de la fibrillation et sur la façon dont le tissu cardiaque réagit à un remodelage précoce ou chronique dû à l'arythmie. Ces informations pourront être directement testées chez les patients afin d'identifier de nouvelles approches thérapeutiques qui ciblent le métabolisme cardiaque.

Bénéfices attendus

La littérature actuelle et nos travaux les plus récents montrent comment la fibrillation auriculaire produit un changement dans les métabolites tissulaires et circulants. Les connaissances manquantes que ce projet fournira nous permettront de définir quel équilibre métabolique systémique et cardiaque favorise ou s'oppose au développement de la maladie, quels organes et systèmes sont affectés aux stades précoces et avancés, notamment du point de vue métabolique et quels biomarqueurs circulants, dans le plasma ou dans l'urine, sont pertinents pour identifier la pathologie. Ces trois objectifs seront directement applicables en médecine préventive de la fibrillation auriculaire. Les changements métaboliques observés seront utilisés pour définir les risques de l'apparition et de la stabilisation de la fibrillation auriculaire. Ainsi, la caractérisation approfondie de la maladie servira de base à la recherche de la signature métabolique et de biomarqueurs significatifs pour une meilleure prise en charge de la fibrillation auriculaire chez les patients.

Procédures

Les animaux subiront l’implantation, sous anesthésie générale et angiographie, d’un dispositif de monitorage ECG (télémétrie) et d’un stimulateur cardiaque, ce qui nous permet d’appliquer un protocole de stimulation atriale rapide conduisant à une fibrillation auriculaire persistante. Avant l’implantation et pendant le suivi (mais pas plus de trois fois) les animaux subiront, sous anesthésie générale : des protocoles d’imagerie par IRM, échocardiographie et scanner, un protocole de cartographie de contact sous angiographie, des prélèvements de sang, d'urine, et de tissu atriale, rénale et hépatique (par biopsie).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes phases du projet notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie), ces effets disparaissent rapidement car les moyens nécessaires pour faciliter le réveil des animaux (lampe chauffante par exemple) sont mis en place. Les examens d’imagerie (échocardiographie, IRM, scanner et électrophysiologique) sont indolores pour les animaux. Des effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des équipements électroniques localisés en sous-musculaire dans la zone du cou pour induire et enregistrer la progression de la fibrillation auriculaire mais ils sont maîtrisés et correspondent à des phases de cicatrisation prolongées. Le modèle de brebis en fibrillation est très bien maîtrisé au laboratoire depuis de nombreuses années et aucune brebis n’est décédée des suites d’une infection ou d’un problème lié à la cicatrisation. L’induction de la maladie chez la brebis peut provoquer une fréquence ventriculaire cardiaque irrégulière mais à noter que l’installation de la fibrillation est asymptomatique chez la brebis. Ainsi les brebis saines et en fibrillation sont indiscernables au niveau du comportement et de l’aspect physique.

Devenir

A la fin de la procédure, l'ensemble des animaux seront euthanasiés pour pouvoir poursuivre les investigations ex-vivo et répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Au stade actuel de la recherche biomédicale, il n'y a aucune possibilité de remplacer l'utilisation d'animaux vivants pour ce type d'étude cardiaque. Il n'existe aucun modèle in vitro de fibrillation auriculaire et nous ne pouvons pas reproduire la complexité des structures cardiaques, leurs propriétés électromécaniques et l'interaction entre les organes qui soutiennent les changements biologiques que nous voulons étudier. Ce projet est unique car ses résultats seront directement transposables aux patients. Une étude parallèle sur l'homme sera menée pour faire correspondre les résultats obtenus sur plusieurs organes dans le modèle animal avec les données métaboliques que nous pouvons obtenir à partir des métabolites circulants des patients atteints de fibrillation auriculaire qui subissent une restauration du rythme sinusal par ablation par cathéter.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux et pour obtenir un plus grand bénéfice de leur utilisation, lorsque cela est possible, nous ferons en sorte que chaque brebis soit son propre contrôle. Nous avons calculé la quantité minimale d'animaux par groupe en tenant compte de la variabilité biologique observée et en considérant le nombre de répétitions nécessaires pour la robustesse statistique et la significativité des résultats. Pour obtenir 10 animaux résistants, nous devrons inclure 65 animaux dans le groupe de stimulation auriculaire rapide, car seuls 15 pourcent des animaux stimulés développent ce phénotype. Par conséquent, nous prévoyons au maximum 55 animaux dans le groupe de fibrillation auriculaire. Néanmoins, ce nombre sera réduit si nous obtenons en cours du projet un nombre de 10 animaux par groupe.

Raffinement

La télémétrie pour surveiller la température, l’activité et le rythme cardiaque des brebis 24h/24 est une mesure de raffinement. En effet, cette approche permet de réagir très rapidement pour la réalisation de soins. Par exemple, lors du réveil de l’animal nous pouvons agir si nous observons que le retour de la température corporelle est trop lent. Cette surveillance renforcée permet de mieux gérer les traitements antibiotiques et/ou analgésiques suite à une augmentation de température significative sans modification du comportement ce qui est souvent le cas chez la brebis. Ainsi, cette méthode permet de récolter des données sans induire de stress supplémentaire et nous communiquons également les données à l’équipe de l’animalerie dans le but de rassurer d’une part mais également d’accroître la réactivité en cas de problèmes suite à la réalisation d’une chirurgie par exemple. Nous entrainerons les animaux à rentrer dans le box d’isolement pour l’allumage, de 5 à 7 jours après la chirurgie, du boitier de stimulation et pesage de la brebis, mais également lors des visites régulières à l’animalerie ou dans l’annexe de l’animalerie. L’utilisation d’une récompense alimentaire sous forme de granulés fonctionne très bien chez la brebis. Cet entrainement sera réalisé par les animaliers qui s’occupent quotidiennement des animaux pour optimiser le processus d’apprentissage. Il est important de noter que la présence des animaliers lors des procédures est indispensable pour limiter le stress des brebis mais également pour faciliter la réalisation des différentes étapes du projet. Le personnel s’occupant des animaux possèdent les compétences nécessaires et ont une très bonne expérience de cette espèce. L’entrainement des brebis permettra de réduire l’angoisse/stress lors des phases d’injections. Les brebis entraînées ont un rythme cardiaque moins élevé lors de l’arrivée dans le box d’isolement que des brebis qui découvrent cet exercice pour la première fois. L’animal est placé en d’hébergement initial avec les méthodes de raffinement adéquat à son espèce : groupe social-pierre à sel-foin-paille, ils sont suivis quotidiennement par le personnel. Si une étape du protocole affecte l’état de santé au point d’atteindre un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu.

Choix des espèces

Le cœur de la brebis a une anatomie, une électrophysiologie et une géométrie proche de celles du cœur humain. Ainsi, les méthodes cliniques d’imagerie et d’électrophysiologie peuvent être directement appliquées dans cette espèce. Le modèle de fibrillation auriculaire persistante utilisé dans cette étude a été mis au point sur le mouton. Le modèle est donc bien décrit et caractérisé dans cette espèce et est une référence dans la communauté scientifique. Nous utilisons ce modèle depuis plusieurs années et nous maîtrisons la réalisation des étapes nécessaires à sa mise en place avec un taux de succès proche de 100 pour 100. Les brebis utilisées seront adultes car les dimensions du cœur permettent l’utilisation des outils cliniques notamment les cathéters. Etant donné que la fibrillation auriculaire est une pathologie majoritairement représentée chez les personnes âgées des brebis âgées de 8 minimums seront incluses.

10 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie cardiaque à cœur ouvert d'environ cinq heures pour l'implantation d'une valve en textile, puis est tuée au plus tard six mois après afin de récupérer l'implant. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie, d'infection, de pneumothorax voire de mort liés à la thoracotomie et à l'anesthésie. Il affirme que le modèle ovin est "le seul" reconnu pour l'étude des prothèses de valves cardiaques et qu'aucune méthode in vitro ne le remplace.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans le cadre de l'optimisation des implantations de valves cardiaques par chirurgie miniinvasive. Ce type de chirurgie, qui est moins lourde et plus confortable pour le patient, concerne en effet plus de 50% des remplacements valvulaires aujourd'hui. Cependant les valves biologiques utilisées aujourd'hui dans le cadre de cette procédure subissent des contraintes spécifiques qui tendent à dégrader les feuillets de la valve. Ces dégradations qui ne sont pas forcément apparentes au moment de l'implantation, peuvent mettre en péril la durée de vie de l'implant. Le phénomène est particulièrement critique chez les patients jeunes pour lesquels le matériau doit être durable. Le projet a pour objectif d'étudier le potentiel du matériau textile (polyester) comme candidat au remplacement du matériau biologique pour fabriquer des valves synthétiques plus durables pour la procédure transcathéter. La souplesse du textile favoriserait en particulier le pliage de la valve au moment de l’implantation. Des essais in vivo préliminaires réalisés sur le modèle animal de la brebis à partir de 2016 avait mis en évidence que la valve textile reste fonctionnelle à 6 mois, avec cependant une tendance à la rigidification du matériau. Il s'agit maintenant de tester une nouvelle structure textile plus à même de rester souple sur le long terme dans le but d'optimiser la durée de vie de l’implant.

Bénéfices attendus

Les essais in vivo devraient permettre de valider l'hypothese avancée: un textile monofilamentaire hydrophile en surface permet de limiter à la fois la calcification et le développement de la fibrose sur la valve obtenue à partir de ce textile en position mitrale.

Procédures

Les animaux subissent une intervention chirurgicale en chirurgie ouverte dans le cadre d'un remplacement valvulaire. La procedure se deroule sur une matinee (en incluant la mise en place). 10 animaux sont inclus dans l'etude. La durée prévue de l'intervention est de 5h de l’induction au réveil complet de l’animal.

Impact sur les animaux

Pas d'effet indésirable relatif à la biocompatibilité du matériau identifié. Le polyester utilisé est largement biocompatible. Les effets indésirables sont ceux liés à la chirurgie (infection de la plaie, diminution de la fréquence cardiaque/arrêt cardiaque) ainsi que ceux liés à l’anesthésie (allergie à un des médicaments, difficulté au réveil et à l’extubation). Certains effets peuvent être liés aux complications inhérentes à la thoracotomie: fistule bronchopleurale, hémorragie, infection, pneumothorax, douleur voire mort de l'animal. La durée prévue de l'intervention est de 5h de l’induction au réveil complet de l’animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à 6 mois au plus tard. Ils ne peuvent pas être réutilisés ni replacés ni adoptés car la valve implantée doit être récupérée pour analyse.

Remplacement

Les resultats attendus ne peuvent pas etre obtenus autrement que par la voie de l'implantation animale (ni in silico ni in vitro). En effet les mecanismes lies a la calcification et a l'encapsulation d'un implant par de la fibrose sont complexes et multifactoriels donc difficiles a reproduire in vitro.

Réduction

Dans une approche préliminaire, seulement 2 animaux (brebis) seront considerees. Il s'agit d'un nombre minimal qui permet de reproduire 2 fois la meme configuration tout en limitant les essais. En fonction des résultats obtenus, ce nombre pourra ensuite être augmenté juqsu'à 10 maximum poru confirmer la tendance. Malgre le faible nombre global d'animaux utilisés, il sera quand même possible de tirer des conclusions etant donne que des resultats ont deja ete obtenus avec d'autres textiles par le passe. Il sera de fait possible de comparer les comportements obtenus dans le cadre du present projet avec les resultats precedents.

Raffinement

Le Laboratoire où ont lieu les implantations animales est largement reconnu comme un laboratoire où tout est mis en œuvre afin que les contraintes subies par les animaux soient minimales et que leur bien-être soit préservé au mieux. Les animaux sont évalués quotidiennement ou 2 fois par jour et recevront un traitement approprié. S’ils ressentent des signes de souffrance, ils recevront un analgésique par voie intra-musculaire. La souffrance est prise en charge par l’utilisation de points limites précis et adaptés , un arbre décisionnel, et des critères d’arrêt des souffrances

Choix des espèces

Le modele ovin est le seul modele considere au niveau international comme significatif pour l'etude de protheses de valves cardiaques. En comparaison avec le modele porcin, pourtant tres utilise dans le cadre des chirurgies vaculaire et cardiaque, il apparait que ce dernier ne permet que difficilement de pratiquer l'arret cardiaque et la circulation extra corporelle avec reveil qui est necessaire dans le cadre de ce projet. Brebis de 30kg. Il s'agit de prendre un animal en croissance afin de favoriser l'effet calcification.

100 moutons vont être utilisés, brebis gestantes et agneaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et une partie des brebis réutilisée dans d'autres projets. Chaque brebis subit trois laparotomies sous anesthésie générale, tandis qu'une malformation de la moelle épinière est créée chirurgicalement chez son fœtus à mi-gestation, puis réparée, avant une naissance par césarienne et six mois de vie suivis de la mise à mort. Le porteur indique un taux de fausse couche d'environ 40 %, imposant d'opérer 50 fœtus pour obtenir 30 agneaux vivants. L'objectif est de tester une thérapie cellulaire avant un éventuel passage chez le fœtus humain, les bénéfices annoncés restant au conditionnel.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer le bénéfice de l’utilisation de la thérapie cellulaire comme traitement adjuvant de la chirurgie in utero (pendant la grossesse) des myéloméningocèles (MMC) dans le modèle ovin, avant les essais chez le fœtus humain. La MMC est une malformation congénitale ayant des conséquences neurologiques sévères. Les lésions cérébrales associées peuvent entraîner une déficience intellectuelle en général modérée. Les personnes atteintes peuvent présenter un handicap moteur (déficit moteur et angle anormal des jambes, raideur) nécessitant une assistance orthopédique, des anomalies de la colonne vertébrale, de l’incontinence urinaire et/ou anale nécessitant des auto-sondages, un traitement par laxatifs et des lavements rectaux. Il est démontré que la chirurgie des MMC in utero apporte un bénéfice pour les enfants, comparée à une chirurgie réalisée après la naissance, en améliorant leurs fonctions motrices (capacité à marcher) et les potentielles complications cérébrales liées à cette malformation. Cependant ce bénéfice reste moindre puisque 71% des enfants restent dans l’incapacité de marcher sans orthèses à l’âge scolaire et 62% d’entre eux sont contraints à réaliser des sondages urinaires quotidiens. Depuis 2 ans la thérapie cellulaire est expérimentée comme traitement adjuvant de la chirurgie in utero à ciel ouvert des myéloméningocèles chez le fœtus ovin. Les derniers résultats sont extrêmement prometteurs avec une nette amélioration des capacités de déambulation à la naissance chez les agneaux. Il existe deux techniques de chirurgie in utero des MMC chez le fœtus humain : la chirurgie “à ciel ouvert”(c’est-à-dire avec ouverture de l'utérus) et une chirurgie moins invasive dite foetoscopie impliquant la réalisation de mini-incisions pour le passage des instruments, ce qui permet de limiter le risque d’accouchement prématuré et qui permet un accouchement par les voies naturelles. À ce jour, les expérimentations de la thérapie cellulaire n’ont eu lieu que lors de chirurgies à ciel ouvert. Il est maintenant nécessaire d’expérimenter l’utilisation de ces cellules en utilisant la fœtoscopie, avec l’utilisation d’une solution liquide de cellules plutôt qu’un patch pour pouvoir l’introduire par ces mini-incisions.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de démontrer une amélioration du pronostic des agneaux ayant eu une greffe de cellules au cours de la chirurgie in utero par fœtoscopie, sans induction de tumeurs: - bénéfices cliniques à court et moyen terme (6 mois de vie) : amélioration du score de motricité des agneaux, score SLR (Sheep Locomotor Rating) - bénéfices histologiques : augmentation de la densité neuronale au niveau de la moelle épinière et diminution de la fibrose entre la moelle et le tissu cutané pour les agneaux ayant reçus les cellules souches - absence de tumeur 8 mois après la greffe des cellules (53 jours de vie prénatale + 6 mois de vie postnatale)

Procédures

Chaque brebis sera soumise aux procédures chirurgicales suivantes, toutes réalisées sous anesthésie générale : 1/ temps n°1 au 75e jour de gestation : laparotomie et ouverture de l’utérus sous anesthésie générale Durée : environ 30 minutes 2/ temps n°2 au 90e jour de gestation : laparotomie et mise en place de trois trocarts intra-utérins pour fœtoscopie sous anesthésie générale (passage de trois tubes au travers de la paroi utérine pour passe une caméra et des instruments) Durée : environ 90 minutes 3/ temps n°3 au 143e jour de gestation : laparotomie et ouverture de l’utérus sous anesthésie générale Durée : environ 15 minutes Chaque agneau (n= 50) sera soumis aux procédures chirurgicales suivantes, toutes réalisées sous anesthésie générale : 1/ création chirurgicale de la myéloméningocèle au 75e jour de gestation sous anesthésie générale : Durée : environ 20 minutes 2/ réparation chirurgicale de la myéloméningocèle à 90 jours de gestation Durée : environ 30 minutes 3/ Naissance par césarienne à 143 jours de gestation Après la naissance, les agneaux sont maintenus en vie pendant 6 mois. Aucun prélèvement n’est prévu pendant ces 6 mois. 4/ Mise à mort à 6 mois de vie Chaque agneau sera mis à mort après 6 mois de vie pour dissection anatomique et analyse histologique afin de rechercher une amélioration de la réparation de la moelle épinière ainsi que l’absence de tumeurs chez les agneaux ayant bénéficié de la thérapie cellulaire lors de la chirurgie in utero de leur myéloméningocèle.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes Pour les brebis : - mobilité réduite de J70 de gestation à J143 de gestation (temps pendant lequel elles sont hébergées en vue des chirurgies) : effet indésirable diminué par la possibilité de sortir les animaux des cages afin de favoriser une déambulation plus libre - douleurs post opératoires : effet indésirable prévenu par une surveillance très rapprochée et un protocole précis de prise en charge de la douleur. Pour les agneaux au cours de la vie prénatale : - Douleurs per opératoires : effet indésirable prévenu par un protocole d'anesthésie/analgésie passant la barrière placentaire (similaire à ce qui est réalisé chez le fœtus humain) Pour les agneaux au cours de la vie postnatale : - mobilité réduite : effet indésirable diminué par la possibilité de sortir les animaux des cages afin de favoriser une déambulation plus libre - potentiels troubles locomoteurs secondaires à la création de la malformation : il est possible que les agneaux présentent des troubles de la déambulation à l’instar des symptômes observés chez les enfants présentant une MMC. - potentiels troubles sphinctériens secondaires à la création de la malformation : il est possible que les agneaux présentent une incontinence urinaire à l’instar des symptômes parfois observés chez les enfants présentant une MMC.

Devenir

Les brebis gestantes seront maintenues en vie après la chirurgie de création et après la chirurgie de réparation. Elles seront mises à mort au cours de la césarienne, après clampage du cordon ombilical. Les brebis ne peuvent être réhabilitées car elles auront eu trois laparotomies. En revanche, 40% de l’effectif des brebis seront réutilisées dans d’autres projets de recherche au cours de procédures sans réveil, à l’issue des césariennes. Les agneaux seront maintenus en vie jusqu’à l’âge de 6 mois, après avoir été opérés in utero à deux reprises et être nés par césarienne. Leur maintien en vie permettra de rechercher un effet pérenne de la thérapie cellulaire ainsi que de l’absence de formation tumorale 8 mois après la greffe des cellules. La mise à mort à 6 mois permettra une analyse histologique pour comprendre le potentiel bénéfice clinique observé (amélioration des capacités de déambulation) en examinant la moelle épinière et les muscles des pattes postérieures. Cette analyse histologique permettra également de s’assurer de l’absence de développement de tumeur avec certitude.

Remplacement

Les expérimentations in vitro préliminaires aux expérimentations in vivo ont permis de s’assurer en amont de la vitalité des cellules greffées, de leurs fonctions neuroprotectrices ainsi que de déterminer le nombre de cellules à greffer. Ce projet de recherche a pour objectif l’expérimentation d’une thérapie à visée humaine. Bien qu’une activité paracrine ayant un effet neuroprotecteur ait été démontré in vitro, l’expérimentation de cette thérapie chez des modèles chirurgicaux animaux est indispensable pour pouvoir étudier la réelle efficacité de ces cellules in vivo et l’absence d’effets secondaires néfastes.

Réduction

Des expérimentations in vitro menées en amont ont permis de potentialiser les expérimentations in vivo, notamment en déterminant le nombre de cellules à inclure dans les patchs. Des brebis présentant une gestation singleton (un seul agneau) seront dans le mesure du possible sélectionner afin de limiter le nombre d’agneaux jumeaux. Des résultats préliminaires nous ont permis de calculer le nombre minimal d’animaux à inclure pour permettre une analyse statistique et de tirer des conclusions pertinentes. Le critère de jugement principal sera le score de motricité validé chez le modèle ovin. Les autres paramètres statistiques étudiés seront : la présence de mouvements de la queue, la miction spontanée, l’amyotrophie des pattes postérieures, l’aire de la moelle épinière, la densité neuronale, l’épaisseur de la fibrose. Les variables quantitatives seront comparées en utilisant un test de Mann-Whitney et les variables qualitatives en utilisant un test du Chi2. Le taux de fausses couches après réalisation de deux chirurgies in utero est élevé, atteignant environ 40 %. Il est donc nécessaire d’opérer 50 agneaux pour obtenir 30 agneaux vivants à la naissance (15 dans chaque groupe). Il est malheureusement difficile d’imaginer une réhabilitation des brebis car elles auront subi trois laparotomies. Cependant, il est prévu de réutiliser les brebis sur des procédures de recherche sans réveil.

Raffinement

Les animaux sont pris en charge dans des locaux adaptés pour l’accueil des brebis et des agneaux avec la possibilité de sortir les animaux. Le personnel est qualifié et diplômé et a une grande expertise en expérimentation animale. Un habitat adapté et enrichi sera mis en place, en limitant l’isolement des brebis à 5 jours après chaque chirurgie et en leur permettant de voir et d’entendre les autres brebis pendant cette période. Chaque intervention sera réalisée sous anesthésie générale maternelle avec une analgésie fœtale complémentaire si nécessaire. Un traitement antalgique sera administré de manière systématique durant les 5 jours qui suivent chaque chirurgie. La surveillance des agneaux sera réalisée toutes les trois heures pendant les 48 premières heures de vie, puis au minimum trois fois par jour au-delà. Plusieurs fonctions seront évaluées (locomotion continence anale et uriniare, capacité à se nourrir) et seront la base des points limites, avec des scores. En fonction des scores obtenus, une réponse graduée sera effectuée avec mise en place de traitement de physiothérapie, laxatifs, aide à la miction et biberonnage. En cas de non réponse aux traitements mis en place ou en cas de score trop sévère, les décisions d’arrêt seont prises de façon conjointe entre vétérinaires expérimentés.

Choix des espèces

Le modèle ovin de MMC représente le modèle animal le plus proche de la malformation observée dans l’espèce humaine. Ce modèle permet de retrouver les anomalies cérébrales présentes dans l’espèce humaine en cas de MMC (malformation de Chiari de type 2). Il a été validé par de nombreuses équipes dont la nôtre. En plus de mimer la pathologie humaine, le modèle ovin présente de nombreux avantages pour la réalisation de notre projet. Premièrement, ces animaux sont porteurs de grossesses gémellaires ou singletons ce qui facilite le parallèle avec l’espèce humaine. Deuxièmement, la taille de l’animal permet aisément de réaliser une chirurgie sur les fœtus. Enfin, le temps de gestation (145 jours) permet l’organisation de deux chirurgies successives tout en étant suffisamment court pour limiter la durée de l’étude dans des délais tolérables. Il s’agit de brebis sexuellement matures. La création chirurgicale de la MMC aura lieu au 75e jour de gestation (soit à la moitié de la gestation) : cet âge gestationnel est celui validé par les nombreux auteurs ayant travaillé sur ce sujet. Le terme de 75 jours a été choisi car il paraissait difficile d’intervenir chirurgicalement sur les fœtus plus précocement du fait de leur fragilité. La réparation de la MMC aura lieu 90e jour de gestation (0,6 gestation): ce délai a été choisi entre les deux interventions car il est est nécessaire à la survenue de la malformation deChiari. Un délai plus court ne permettrait pas de conclure au succès de la technique chirurgicale en cas de correction de la hernie cérébelleuse. La naissance des agneaux est prévue à 143 jours afin de n’induire aucune prématurité qui pourrait mettre en péril la survie des agneaux et nuire à l’obtention des critères de jugements, notamment cliniques.

36 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, on leur injecte des nanocapsules dans les disques intervertébraux, avec suivi par IRM pendant six mois, puis mise à mort pour analyse des disques. Le porteur indique une douleur modérée transitoire après l'injection et précise recourir à des animaux réformés destinés à l'abattoir. L'objectif est d'évaluer un traitement des lombalgies avant d'éventuelles études chez l'humain.

Objectifs

Les douleurs lombaires chroniques fréquemment rencontrées chez l’Homme concernent des sujets de tous âges. Le coût de leur prise en charge représente 240 milliards d’euros par an pour la totalité de l’UE. Toutefois, le tribu payé par l’individu malade reste le plus important : les lombalgies sont une cause majeure d’incapacité et de morbidité dans le monde. Le contributeur majeur de ces douleurs lombaires est la dégénérescence des disques intervertébraux (40%), appelée lombalgie discogénique. Le disque intervertébral (DIV) joue un rôle essentiel d’amortisseur dans la biomécanique de la colonne vertébrale. Il subit un processus dégénératif progressif inévitable au cours du temps (vieillissement), qui, lors de dégénérescence discale, est accéléré. Les DIV concernés sont alors plus rapidement altérés, avec pour conséquence une modification de la biomécanique vertébrale et une lombalgie discogénique. Aujourd’hui, aucune option thérapeutique disponible ne permet de ralentir l’évolution de cette maladie. Les traitement préconisés sont symptomatiques : physiothérapie, médicaments antidouleurs ou même chirurgie pour les patients les plus atteints. Les traitements chirurgicaux reposent sur l’exérèse totale du DIV incriminé : les procédures restent très invasives et s’accompagnent le plus souvent d’une convalescence longue et de risques de complications. A plus long terme, une instabilité vertébrale et une aggravation de l’atteinte des DIV adjacents sont souvent observées, aboutissant à des rechutes. L’amélioration des connaissances autour de la physiopathologie discale à l’origine des douleurs lombaires offre aujourd’hui de nouvelles opportunités de traitement. Il s’agit en particulier des approches de médecine régénératrice qui ont pour objectif de restaurer le tissu discal en modifiant la machinerie cellulaire à l’aide de miARN (petites molécules d’acide ribonucléique). C’est dans ce contexte que ce projet a pour objectif de démontrer l’innocuité et l’efficacité d’une injection intradiscale de nanocapsules lipidiques (LNC) renfermant des miARN chez des individus ovins (modèle animal spontané de dégénérescence discale), avant de pouvoir envisager des études cliniques chez l’Homme. L’efficacité thérapeutique sera évaluée contre placebo pour trois concentrations croissantes de miARN, pour un volume d’injection et une concentration en LNC constants : 36 animaux seront répartis en 4 groupes de 9 individus.

Bénéfices attendus

La dégénérescence discale (vieillissement prématuré des disques intervertébraux jouant le rôle d’amortisseurs entre les vertèbres) est responsable de 40% des lombalgies. Actuellement, il n’existe pas de solution thérapeutique permettant de stopper l’évolution de cette maladie ni de restaurer un disque intervertébral (DIV) fonctionnel. Les patients les plus atteints, pour lesquels la physiothérapie et l’administration d’antalgiques ne sont pas suffisantes, peuvent bénéficier d’une intervention chirurgicale au cours de laquelle le DIV incriminé est retiré. Les conséquences d’une telle chirurgie sur la biomécanique de la colonne vertébrale ne sont pas négligeables et les DIV adjacents sont alors d’autant plus sollicités, avec une aggravation de leur atteinte. Le projet que nous menons aspire à développer une nouvelle alternative thérapeutique qui pourrait être proposée aux patients atteints de lombalgie discogénique à des stades précoces, afin de restaurer un fonctionnement cellulaire permettant la synthèse de fibres de collagène et le maintien de l’hydratation du DIV, paramètres indispensables pour qu’il joue son rôle biomécanique. Il ne s’agirait plus de traiter les dégâts causés par la maladie (douleurs, hernie discale) mais de stopper son évolution voire de restaurer un DIV complètement fonctionnel. A court terme, cette expérimentation doit permettre d’évaluer l’innocuité de la procédure mini-invasive décrite (injection intradiscale sous contrôle radioscopique de nanocapsules lipidiques renfermant des molécules de miARN). A moyen terme, elle doit permettre d’évaluer l’efficacité d’une telle injection dans des DIV atteints de dégénérescence discale, et de choisir la dose de miRNA optimale véhiculée par les nanocapsules lipidiques. Et enfin, à long terme, elle doit permettre d’envisager plus rapidement la mise en place d’études cliniques chez l’Homme, l’obtention de résultats encourageants chez un modèle animal spontané représentant un tremplin non négligeable.

Procédures

Chacune des 36 brebis sera manipulée 4 fois pour des soins réalisés systématiquement sous anesthésie générale ou des examens/prélèvements post-mortem : - le premier jour (durée de l’anesthésie = 2h) : radiographies et IRM du rachis lombaire, injection intradiscale des nanocapsules lipidiques dans 3 disques intervertébraux (DIV) lombaires sélectionnés par randomisation. Les animaux sont répartis en 4 groupes de 9 animaux : un groupe placebo (nanocapsules lipidiques vides) et 3 groupes avec des nanocapsules lipidiques renfermant des miARN à trois concentrations différentes. - M1 et M3 (durée de l’anesthésie = 1h) : radiographies et IRM du rachis lombaire - M6 : euthanasie des animaux, radiographies et IRM du rachis lombaire (les DIV étant des tissus non vascularisés, leur aspect à l’IRM reste inchangé pendant plusieurs heures après la survenue de la mort), prélèvement de la totalité des DIV du rachis lombaire (nombre variant entre 6 et 7 selon les brebis) Par ailleurs, les animaux seront soumis à un examen clinique quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation, sur leur site d’hébergement (pas de déplacement prévu pour les animaux). L’examen clinique se fait dans un premier temps à distance (temps mis à profit pour que les animaux s’habituent à la présence humaine) puis de manière rapprochée et individuelle (quelques minutes par animal, sans douleur).

Impact sur les animaux

La procédure décrite ici ne fait appel à aucun geste particulièrement douloureux. L’injection intradiscale par voie transannulaire (injection au sein du noyau pulpeux, élément central du DIV, à travers l’anneau fibreux, élément périphérique du DIV) se fait de manière percutanée (procédure mini-invasive correspondant à un geste de radiologie interventionnelle) et sous anesthésie générale. Une douleur modérée transitoire peut être ressentie par les animaux dans les jours qui suivent l’injection. Le risque infectieux lié à l’injection intradiscale est très faible.

Devenir

L’euthanasie des brebis aura lieu au 6ème mois après le début de la procédure, c’est à dire à l’issue des 6 mois de suivi par imagerie médicale et à la fin de la procédure expérimentale. Cette euthanasie est indispensable afin de pouvoir réaliser les analyses histologiques et immunohistochimiques prévues sur l’ensemble des DIV des brebis concernées par l’expérimentation (216 à 252 DIV au total). Ces analyses permettront d’identifier les modifications résultant des injections intradiscales du nouveau médicament évalué par ce projet, tant au niveau cellulaire que moléculaire (informations non disponibles par imagerie médicale).

Remplacement

Ce projet correspondant à une étude préclinique d’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un nouveau médicament in vivo, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de l’animal. Toutefois, nous avons choisi de faire appel à des animaux de production réformés destinés à l’abattoir (élevage laitier) plutôt qu’à des animaux élevés spécifiquement pour l’expérimentation animale. Toutes les étapes de développement des nanocapsules lipidiques renfermant des miARN ont été réalisées in vitro, sans utilisation de l’animal.

Réduction

A l’IRM, le degré d’atteinte d’un DIV atteint de dégénérescence discale est évalué par la détermination du score de Pfirrmann (valeur allant de I à V). Nous souhaitons pouvoir mettre en évidence, entre chacun des 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes avec une concentration croissante en miRNA), une différence de 1 point dans la valeur moyenne du score de Pfirrmann. Pour cela, après analyse statistique, chaque groupe doit être composé de 27 DIV. En injectant des nanocapsules lipidiques dans 3 DIV lombaires d’un même animal (sélection des DIV recevant une injection de nanocapsules lipidiques par randomisation), nous réduisons le nombre total d’individus utilisés : 9 animaux par groupe, soit 36 animaux au total (108 DIV recevant une injection intradiscale, analyse histologique de 216 à 252 DIV au total). De plus, la méthode de suivi choisie (par imagerie médicale et ne faisant appel qu’à une euthanasie terminale) limite également le nombre d’animaux utilisés (par comparaison avec des procédures où des animaux seraient euthanasiés à chaque temps de suivi). Tests statistiques : Nous avons prévu de comparer des moyennes entre chacun des 4 groupes.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont stabulés en groupe dans des conditions similaires à leur hébergement en élevage. Ils ont accès librement au foin et à l’eau (ad libitum). L’alimentation est complétée par des granulés spécifiques (Terrena, France) et par des pierres à lécher (apport en minéraux). Les animaux bénéficient d’un suivi individuel quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation : examen clinique et évaluation de la douleur/inconfort selon une grille adaptée à l’espèce ovine : intégration dans le troupeau, comportement à l’approche de l’opérateur, appétit et rumination, vigilance, posture (debout, couchée), port de tête à l’arrêt et en déplacement, aspect et posture au niveau du dos et des membres postérieurs, confort global (addition sur une grille de 1 à 10). Prévention de la douleur : De façon générale, la gestion de la douleur per- et post-opératoire suit les règles de l’analgésie multimodale associant l’administration de molécules antalgiques et le recours à l’anesthésie locorégionale. Un examen clinique sera fait quotidiennement par un vétérinaire pour déceler toute complication post-injection.

Choix des espèces

L’espèce ovine est un modèle spontané de dégénérescence discale. Les similitudes avec l’Homme concernent la physiopathologie de cette maladie, les anomalies détectées à l’IRM au niveau des disques intervertébraux (DIV) atteints et l’évolution clinique. Ainsi, la brebis est un modèle classiquement utilisé en médecine régénératrice du DIV. Par ailleurs, la taille des animaux facilite la réalisation des injections (taille relativement proche de celle de l’Homme) et leur hébergement en stabulation est aisé (contrairement aux porcs par exemple). Chez l’Homme comme chez la brebis, la sévérité de l’atteinte des disques intervertébraux lors de dégénérescence discale n’est pas corrélée à l’âge des individus. Nous avons choisi de travailler avec des animaux adultes âgés de 3 à 7 ans (animaux réformés destinés à l’abattoir du fait de problème de production de lait) afin de nous assurer que des lésions de dégénérescence discale seront identifiées à l’IRM chez chacune des 36 brebis de l’étude, sans que d’autres affections liées à l’âge n’interfèrent avec leur santé.

40 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré. Trente-trois subissent une autogreffe de l'utérus puis une seconde opération sans réveil quatre jours plus tard, les sept autres servant de témoins avec la même chirurgie. Le porteur décrit les risques de cette chirurgie longue, hypothermie, douleurs et hémorragie interne, et un hébergement seul de quatre jours en post-opératoire. Le projet cherche des marqueurs sanguins de rejet du greffon utérin, le porteur qualifiant le modèle ovin de "meilleur modèle animal" et le recours à l'animal d'"indispensable".

Objectifs

Deux études préliminaires ont permis de démontrer la faisabilité, puis la maitrise de la greffe utérine chez la brebis. La mise en évidence de marqueurs sanguins reflétant un défaut de fonctionnalité de l’utérus, et en particulier un état inflammatoire important, permettrait de modifier les modalités de surveillance et de mettre en place une stratégie préventive et thérapeutique pendant la chirurgie et en post opératoire afin d’optimiser la réussite de la transplantation. A ce jour, la surveillance repose sur les biopsies répétées du col de l’utérus sources d’inconfort, d’hémorragie et d’infections. L’identification de marqueurs sanguins permettrait de remplacer cette méthode invasive. De plus, cette approche pourrait permettre de mettre en évidence des marqueurs ayant un intérêt similaire dans des situations de greffe d’autres organes. Nous nous proposons de comparer l'impact de deux solutés de préservation d’organe sur la survie du greffon à court terme dans un modèle d'auto-transplantation chez la brebis. Cet objectif sera évalué au travers de 4 paramètres: 1) Évaluation de l'expression de marqueurs de l'inflammation et d’absence de circulation sanguine dans la muqueuse de l’utérus à J4 de la transplantation, par l'analyse de l'expression de 90 gènes connus impliqués dans l'inflammation, 2) Comparaison de l'expression des protéines exprimées dans la muqueuse utérine à J4 de la transplantation entre les deux solutés testés 3) Par une approche immunologiques utilisant des anticorps, analyse de la localisation de protéines dans la muqueuse utérine du groupe contrôle et des deux groupes expérimentaux, 4) Évaluation de la corrélation entre les paramètres précédents, l'analyse histologique et l'état clinique du greffon en fonction du soluté de préservation d'organe utilisé.

Bénéfices attendus

Le succès des premières greffes utérines chez l'l’humain suggère une demande potentiellement croissante pour une telle intervention. On estime globalement que 4000 à 5000 femmes en France pourraient être candidates à une greffe utérine dans l'avenir. L'équipe de recherche collabore dans ce travail avec l'équipe de l'hôpital travaillant sur un essai pilote évaluant la faisabilité, l'efficacité et la sécurité de la greffe utérine à partir de donneurs vivants apparentés pour 10 patientes avec une malformation congénitale caractérisée par l’absence d’utérus et d’une partie du vagin (syndrome de Rokistanski). La première greffe utérine en France a été réalisée en Mars 2019 et a abouti à une naissance vivante par césarienne en février 2021. En transplantation utérine humaine, le diagnostic de rejet du greffon est réalisé sur des analyses de tissus à partir de prélèvements répétés du col de l’utérus qui contribuent à générer des microtraumatismes tissulaires. Identifier des marqueurs non invasifs indiquant la bonne circulation du sang et l’absence d’inflammation pendant et après transplantation de l'utérus permettrait de limiter les interventions traumatisantes et de mettre en place une stratégie thérapeutique pour assurer la réussite de la transplantation.

Procédures

33 brebis subiront une procédure chirurgicale d'autogreffe et seront réopérées sans réveil 4 jours plus tard. 7 brebis témoins subiront une procédure chirurgiale similaire mais sans greffe pour servir de témoins et seront réopérées sans réveil 4 jours plus tard.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont liés à une chirurgie longue : risques d'hypothermie, douleurs, difficultés à se lever et se déplacer, diminution du transit digestif et de l'appétit. Les effets indésirables comprennent aussi les risques inhérents à toute chirurgie abdominale : risque d’infection, risque de plaie digestive, risque de plaie vasculaire ou de rupture des sutures vasculaires avec hémorragie interne. En postopératoire, les brebis sont hébergées seules dans un box dédié et sous surveillance humaine. Cet hébergement, de 4 jours, est nécessaire pour le suivi d’ingestion alimentaire et le suivi de la reprise du transit digestif. Mais aussi pour éviter l’arrachage du cathéter et une blessure au niveau de la suture par une congénère.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par injection de pentobarbital en IV sous anesthésie générale. L’utérus sera prélevé afin d'évaluer l'expression de marqueurs de l'inflammation et corréler ceux-ci aux analyses histologiques du greffon en fonction du soluté de préservation d'organe utilisé.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer de manière non invasive des marqueurs inflammatoires et de mauvaise circulation sanguine lors d'une greffe utérine. L'utilisation d'un modèle animal est indispensable car il n'existe aucun modèle alternatif permettant de reproduire les réactions complexes d'inflammation suite à une greffe d’organe entier.

Réduction

Les chirurgies de greffe utérine sont réalisées en autotransplantation, ce qui évite de recourir à un animal donneur. Le nombre d'animaux nécessaire est donc divisé par deux.

Raffinement

Pour limiter le risque d’hypothermie, les brebis seront installées sur un tapis chauffant pendant toute la chirurgie. La température corporelle, la fréquence cardiaque et la saturation pulsée en oxygène (SpO2) de la brebis seront également monitorées durant la chirurgie. Un cathéter sera posé pour administrer en continu une solution physiologique pour maintenir une bonne hydratation de l’animal. Cette voie, permettra également l’injection régulière d’analgésiques pendant l’opération. Ce cathéter sera conservé pendant les 4 jours post opératoire pour éviter de piquer l'animal plusieurs fois lors de prélèvements sanguins ou de l'administration d'analgésiques. En début de post opératoire, la température corporelle de la brebis sera contrôlée et maintenue grâce à des lampes chauffantes. Durant les 4 jours de post opératoire, les brebis seront sous surveillance permanente. La gestion de la douleur sera suivie par scoring des mimiques faciales basé sur des critères décrits dans la littérature. Si le score de la douleur est supérieur à cinq, cela justifie la mise en place d’une analgésie adaptée Le suivi des constantes physiologiques sera réalisé plusieurs fois par jour (température corporelle, fréquences cardiaque et respiratoire, glycémie),. Une analyse sanguine quotidienne (hématologie, biochimie et gaz du sang) permettra d’adapter les traitements. Le confort des cages de post opératoire sera renforcé par l’ajout de tapis, qui permettent de maintenir l’animal dans un environnement sain et facilitent les premières levées de l’animal et ses déplacements. Après la première phase de post opératoire, deux cages seront jumelées afin de permettre à l’animal d’avoir plus d’espace d’exercice. De plus, des enrichissements lui seront proposés (brosse, ballon, râtelier à foin, ambiance musicale). Afin de favoriser la reprise de l’appétit de l’animal, une alimentation variée lui sera proposée régulièrement (eau, foin, granulés, herbe, salade) en fonction de ses goûts et sera contrôlée par des pesées systématiques des quantités distribuées et consommées. Si le niveau d'inconfort/de douleurs ainsi que l'altération de l'état général de l'animal est constaté malgré les traitements analgésiques, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

L'avantage de la brebis dans la recherche sur la transplantation, comparativement aux autres espèces qui ont été testées, est que le bassin est plus large et que l'anatomie de la vascularisation ressemble aux vaisseaux pelviens humains. Le modèle ovin a été défini dans la littérature internationale comme le meilleur modèle animal pour la recherche sur la greffe utérine. Utilisation d'adultes à maturité sexuelle, ayant mis bas deux fois. Ce modèle permet d'avoir un utérus qui a deja fait preuve de sa fonctionnalité et des vaisseaux de calibre optimal, car une brebis ayant eu plus de deux gestations ) pourrait présenter des veines de trop gros calibres (varices).