Mammifères "de rente"

Entretenir une souche de parasite conservée au laboratoire depuis 1982 : 20 veaux nouveau-nés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Âgés de deux jours au maximum, ils reçoivent par la bouche une dose de cryptosporidies, puis développent la maladie attendue, diarrhée, déshydratation, perte d'appétit et, rarement, la mort. Chaque veau est attaché et hébergé seul pour faciliter la récolte de ses selles, avec pour tout enrichissement la présence de deux poules de réforme. Le porteur indique qu'il n'existe pas d'autre méthode pour obtenir assez de parasites infectants, et qu'un veau tous les quatre mois suffit à produire la quantité utile à ses études.

Objectifs

Les cryptosporidies (Cryptosporidium) sont des parasites protozoaires qui se multiplient uniquement dans l’intestin et sont rejetés dans le milieu extérieur avec les selles. Elles sont responsables de la cryptosporidiose, une maladie conduisant à des diarrhées sévères chez les ruminants ou les enfants de moins de 5 ans. Nous étudions plus particulièrement les réponses immunitaires qui se développent dans l’intestin en réponse à l’infection dans le but de mettre au point des stratégies immunitaires pour réduire l’incidence des infections. Par ailleurs, nous réalisons des infections expérimentales in vitro et in vivo pour tester l’efficacité de certains traitements pour tenter d’enrayer la maladie. Nous avons besoin pour tous nos projets de recherches et toutes nos expérimentations in vivo et in vitro d’une quantité importante de cryptosporidies. Comme il n’existe pas de système in vitro pour les multiplier nous devons les propager chez l’animal sensible : le veau nouveau-né. D’autres mammifères pourraient nous fournir des parasites mais en trop faible quantité. Par ailleurs, la souche de Cryptosporidium parvum (C. parvum) ne peut être congelée et nécessite d’être conservée à 4°C, mais au-delà de 2 mois, il est observé une diminution progressive de la capacité du parasite à infecter les cellules in vitro. Nos études exigent des parasites fraîchement multipliés aussi 4 multiplications/an maximum sur veau sont nécessaires pour conserver la souche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de multiplier la souche Cryptosporidium parvum pour la conserver (souche de laboratoire isolée et conservée depuis 1982 par cette méthode de multiplication in vivo).

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à une administration orale du parasite, sous contention. Chaque animal recevra une administration unique. Cette intervention durera une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles seront soumis à une administration orale du parasite, sous contention. Il est attendu que les animaux soient atteints par la maladie. Les symptômes sont la déshydratation, la diarrhée, perte d’appétit et dans de très rares cas la mort. L’hébergement individuel et l’attache du veau sont nécessaires pour le projet. Cela réduit la liberté de mouvement de l’animal (nécessaire pour que les selles soient plus facilement récoltées). L’attache, l’isolement et la contention peuvent engendrer du stress.

Devenir

Le veau sera mis à mort à l’issue de la procédure. Des prélèvements d'intestins peuvent être réalisés afin de constituer une banque.

Remplacement

Pour obtenir suffisamment de parasites infectants, il n’y a à l’heure actuelle pas d’autres méthodes n’utilisant pas d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a minima pour pouvoir conserver la souche au-delà de 2 mois.

Raffinement

Afin de limiter les effets de l'infection, les animaux recevront préventivement un réhydratant par voie orale. L'hébergement sera enrichi par la présence de 2 poules de réforme, les animaux recevront au moins 2 visites quotidiennes. En fonction de l’état de l’animal, les visites seront plus nombreuses. Une grille de score clinique est mise en place pour le suivi de l’animal. Un anti-spamodique est utilisé en cas de douleurs ou de spasmes.

Choix des espèces

Le veau nouveau-né est une espèce très sensible à Cryptosporidium. Un seul veau (par souche) tous les 4 mois produit la quantité de parasites nécessaires à nos études. Des veaux nouveau-nés de 2 jours maximum sont utilisés. Au-delà de cet âge, ils sont moins sensibles à l’infection et multiplient moins bien le parasite.

Quarante brebis sont saillies, vingt-cinq gestantes reçoivent huit injections intramusculaires de testostérone sur dix-huit semaines, puis leurs quarante agneaux subissent quatorze prises de sang au cou de la naissance à six mois. À la puberté, seize femelles nées de mères androgénisées passent une anesthésie générale et une IRM, la pose d'un cathéter jugulaire, puis 64 prélèvements de sang et six injections. 80 moutons vont ainsi être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour tester un anticorps contre l'hormone anti-müllérienne comme traitement possible du syndrome des ovaires polykystiques chez la femme, le porteur affirmant que cet anticorps ne peut être testé que sur un "organisme entier". Dix-neuf retournent à l'élevage, les autres sont tués après l'agnelage ou après la puberté pour prélever leurs tissus reproducteurs.

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la cause la plus fréquente d'infertilité féminine (8 à 13 % des femmes en âge de procréer dans le monde). Les critères du diagnostic du SOPK sont basés sur au moins deux des trois caractéristiques suivantes : 1/ irrégularité ou absence des règles, 2/ un taux élevé d’hormones masculines dans le sang, et 3/ ovaires renfermant de nombreux kystes folliculaires de 2 à 6 mm. La plupart des patientes atteintes de SOPK présentent également des taux d'hormone AMH (anti-müllérienne) et LH (hormone lutéinisante) élevés. De plus, ce trouble est généralement associé à une résistance à l'insuline, de l’obésité, des taux de cholestérol élevés et une hypertension artérielle. Il est important de noter que la plupart des caractéristiques du SOPK sont transmises aux filles des femmes atteintes de ce syndrome, puisque 60 à 70 % de leurs filles développent ce syndrome. Malgré le nombre de femmes touchées par ce trouble, les causes du SOPK restent incomprises. Parmi les facteurs impliqués dans le SOPK, les androgènes, et l'AMH ont été reconnus comme jouant un rôle central. L'hypothèse actuelle est que l’excès d'androgènes ou d'hormones sexuelles masculines durant la grossesse pourrait entraîner des modifications au niveau de l’activité ovarienne et la sécrétion de certaines, ce qui entraînerait le développement du SOPK à l'âge adulte. Notre projet qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) a pour objectif de tester si un anticorps dirigé contre l’AMH peut supprimer les défauts d'ovulation observés dans un modèle de brebis ayant reçu un excès d'androgènes mimant le SOPK chez la femme. En effet, la brebis est une espèce proche de la femme en terme de développement ovarien. Nous étudierons également chez la mère et chez ses descendants mâles les conséquences d’un taux élevé d’hormones masculines au niveau des tissus périphériques et reproducteurs.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de constituer un corpus de données visant à évaluer si un anticorps anti-AMH est un bon candidat pour des essais ultérieurs chez l'humain, en l'occurence chez la femme développant un syndrome des ovaires polykystiques. Elle permettra aussi de mieux comprendre les effets moléculaires de la testostérone chez la femme et les conséquences chez la descendance mâle.

Procédures

Pour les 40 brebis adultes : 1 prise de sang (PS) intra-veineuse (IV) (jugulaire) sera réalisé à 18 jours après la saillie. Pour les 25 brebis gestantes sélectionnées : 8 Injections intra musculaire (IM) sur 18 semaines. 4 PS IV (jugulaire) pendant la gestation. Pour tous les descendants mâles (n=20) : 14 Prises de sang par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Pour tous les descendants femelles (n=20) : 14 PS par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Autour de la puberté, 6 PS par IV (jugulaire) sur 3 semaines. 1 anesthésie générale pour 1 passage à l’IRM à la puberté. Pose de cathéter à la puberté sous anesthésie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Pour les femelles pubères issues des mères androgénisées (n=16) : 18 Prises de sang sur 9 semaines. 4 injections intra veineuse (jugulaire). 1 anesthesie genérale pour un passage à l’IRM après l’injection de l’anticorps. 1 pose de cathéter après le passage à l’IRM sous anesthesie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Dans l'EU1 seront effectuées toutes les expérimentations sauf l'anesthésie générale et le passage à l'IRM qui seront réalisés dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les differentes injections peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose des cathéters jugulaires peut entraîner des douleurs au point d'injection. Pour les animaux traités, il existe un risque d’apparition de kystes et d’anomalies de la vessie (observés par IRM). Il peut arriver mais trés rarement des signes extérieurs associés à une douleur comme une dérivation urinaire entre les cuisses qui peut entrainer des brûlures. Les nuisances en lien avec l’anesthésie de l’IRM sont une irritation des voies respiratoires lors de l’intubation et l’extubation, un possible hématome lors l’intraveineuse et un potentiel stress lors des manipulations.

Devenir

Pour la procédure 1: sur les 40 brebis saillies, 25 seront utilisées, les 15 brebis non selectionnées retourneront à l'élevage. Les 25 brebis sont nécessaires afin d'obtenir suffisamment de descendants femelles pour tester l'effet de l'injection d'anticorps . Une fois l'agnelage effectué, les 20 brebis androgénisées et les 5 témoins seront euthanisées afin de récupérer les tissus périphériques et reproducteurs pour une analyse moléculaire. Pour la procédure 2: sur les 40 descendants, 4 descendants femelles issues des mères témoin pourront retourner sur l'élevage. Ainsi, seront euthanasiés 12 descendants mâles issus des mères androgénisées et 4 descendants mâles issus des mères témoin mais aussi 16 descendants femelles injectés soit avec l'anticorps (n=8) ou avec une solution témoin (n=8) afin de pouvoir mener une étude moléculaire sur les tissus périphériques et reproducteurs.

Remplacement

Nous ne pouvons tester les anticorps que sur un organisme entier. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. D'autre part, il a été démontré dans la littérature que la brebis androgénisée est un bon modèle syndrome d'ovaires polykystiques chez la femme.

Réduction

Nous allons utiliser 25 brebis gestantes, 20 (16+4) agneaux mâles et 20 (16+4) agneaux femelles jusqu’à la puberté. Ce nombre a été estimé en utilisant un test de comparaison de deux moyennes (nombre de follicules antraux) dans chaque groupe. Avec des lots de 8 descendants femelles issues de mères androgénisées cela donne une puissance tout à fait satisfaisante. Afin d’avoir 16 brebis issues de mères androgènisées, il faut partir d’au moins 20 brebis au départ. Afin de vérifier que le traitement de testostérone fonctionne, nous suivrons également 5 brebis qui seront non traitées, et leurs descendants.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. Pour limiter les tress lié à la manipulation, Ils seront visités tous les jours avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Nous récompenserons les animaux après chaque session de prises de sang en distribuant du concentré à l’auge. Lors de la pose des cathéters, le comportement et l'apparence des brebis (notamment au niveau de l’implantation du cathéter) sera suivi avec attention. Les animaux seront maintenus en cage individuelle le temps des prélèvements, mais auront tout de même un contact visuel et olfactif avec leurs congénéères. Avant toute injection intramusculaire ou intraveineuse, une application de gel antalgique sera réalisée. Les deux veines jugulaires seront utilisées en alternance pour limiter le risque d’hématome. Les animaux seront mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie pour le passage à l’IRM, afin de limiter tout risque de régurgitation. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Le transport des animaux de l'EU1 vers l'EU2 avant l'opération et leur retour de l'EU2 vers l'EU1 sera réalisé par un technicien formé et expérimenté dans une bétaillère agréée pour le transport d'animaux vivants. Le trajet est très court (moins de 5 minutes) et la bétaillère sera abondamment remplie de paille.

Choix des espèces

Afin de pouvoir mimer le SOPK chez la femme nous souhaitons utiliser des brebis gestantes pour plusieurs raisons : 1. contrairement aux rongeurs, la brebis présente l'avantage d'avoir un développement ovarien similaire à la femme. 2. De plus, ce modèle a déjà été validé dans nos unités. - 40 brebis saillies seront utilisées pour la détection de 25 brebis gestantes qui rentreront dans la procédure. Cet effectif doit permettre d'assurer la production de descendants assez conséquente pour poursuivre nos travaux. - 20 descendants mâles seront étudiés de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 20 descendants femelles seront étudiées de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 16 femelles pubertes sur les 20 entreront dans la 2ème phase de l’expérimentation (de J168 jusqu’à J235).

Une dissection de la sous-muqueuse de l'œsophage provoque une sténose, donc une gêne à avaler et un risque de vomissements, auxquels s'ajoutent la perforation et la péritonite liées à la pose d'une prothèse. 40 cochons vont être utilisés dans ces procédures classées à un niveau de souffrance modéré, chacun subissant de deux à cinq interventions sous anesthésie générale, de vingt minutes à deux heures, suivies chaque fois de 24 heures à jeun. Le porteur écarte l'idée de pratiquer deux procédures sur le même animal, au motif que la sévérité serait alors "trop importante" pour maintenir un niveau de bien-être suffisant. Tous sont tués en fin de protocole pour examiner à l'œil nu les zones traitées.

Objectifs

La cicatrisation après une résection endoscopique peut aboutir à la formation d’une sténose dans environ 15% des cas et jusqu’à 90% lorsque la dissection fait plus des ¾ de la circonférence le risque de sténose est de 90%. Pour prévenir cette sténose, l’application de corticoïdes locaux afin de diminuer le processus inflammatoire est utilisée et diminue le risque de sténose entre 12-30% en cas de dissection de plus de 75%. Des dilatations endoscopiques peuvent également être effectuées avec néanmoins un risque de sténose dans les suites de la dissection estimé à 59% des cas. En cas de sténose des dilatations itératives sont nécessaires (jusqu’à 30 séances) et non dénuées de risque (perforation). La mise en place systématique d’un stent dans la sous muqueuse pour créer une nouvelle lumière digestive est une technique encore non évaluée mais qui pourrait permettre d’éviter une sténose en créant un nouveau chenal. Enfin, ce processus sténosant pourrait être détourné pour traiter des fistules ou encore fermer des orifices naturels pour modifier l’anatomie notamment à des fins bariatriques. Nous souhaitons donc évaluer plusieurs nouvelles procédures utilisant ce processus de cicatrisation excessive entrainant une sténose après dissection circonférentielle de la sous-muqueuse sur des modèles animaux. Nous proposons ainsi 3 procédures : 1) En créant une sténose par dissection sous muqueuse endoscopique puis en traitant ces sténoses en évaluant si la sous-muqueuse profonde de l'œsophage pourrait être utilisée comme tunnel pour placer un stent sous-muqueux afin de créer une nouvelle lumière œsophagienne qui permettrait le passage de l’endoscope. 2) Pour fermer le pylore en même temps que l'anastomose guidée simulant ainsi un by-pass gastrique 3) Pour fermer les fistules recto-vésicales Ce projet permettra également une évaluation à court terme de l’efficacité des techniques sus-cité par la possibilité d’une reprise alimentaire des porcs après la réalisation du tunnel oesophagien et de la gastroentéroanastomose , et par l’absence de récidive de fistule qui se manifesterait par la présence d’une fécalurie au décours de l’intervention numéro 3.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter des preuves sur l’efficacité d’un traitement endoscopique pour : 1) La prévention des sténoses œsophagiennes post dissection sous muqueuse. En effet, actuellement les dissections cicronférentielles de l’œsophage entrainent de nombreuses complications et sont un frein à cette technique endoscopique en faveur d’une chirurgie plus morbide. La preuve d’une prévention de la sténose par pose d’une prothèse oesophagienne systématique sur modèle animal permettra de proposer une étude de faisabilité chez l’homme. 2) La réalisation de By-pass par voie endoscopique. En cas de succès de la technique sur modèle animal, une étude pilote chez l’homme pourra être proposé au patient souffrant d’obésité morbide et ne pouvant subir une intervention chirurgicale lourde du fait de leur trop nombreuses co-morbidités. 3) La fermeture des fistules par technique endoscopique combinée (dissection et clip). Nous avons déjà apporté quelques cas humain de l’efficacité de la technique, néanmoins des données plus robuste sont nécessaire. Une validation préalable sur animal est nécessaire avant de pouvoir diffuser la technique sur le sujet humain

Procédures

Procédure 1 : les animaux auront de 3 à 5 interventions, sous anesthésie générale, dont procédure chirurgicale de dissection sous muqueuse (durée : 1-2h) , avec pour la moitié une pose de prothèse lors de cette intervention. La pose de prothèse peut également être faite en cas d’apparition d’une sténose avec nouvelle anesthésie générale pour les animaux n’ayant pas eu de prothèse initiale. Les autres interventions sont des évaluations endoscopiques (durée : 30-45min). La dernière anesthésie générale est celle pour l’euthanasie(durée : 30-45min). Procédure 2 : les animaux qui suivent cette procédure auront 1 intervention sous anesthésie générale par voie endoscopique (durée : 1-2h) et une réévaluation endoscopie avant mise à mort (durée 30-45min). Procédure 3 : Les animaux subiront 4 interventions sous anesthésie générale : 1 création de fistule (durée 45min-1h30), 1 intervention pour le retrait de la prothèse (45min-1h), un procédure de dissection sous-muqueuse (durée 1-2h) et une réévaluation endoscopique avant mise à mort (durée 30-45min)

Impact sur les animaux

Les animaux devront rester à jeun les 24 heures qui suivent les différentes interventions. Procédure 1 : Du fait de la dissection sous muqueuse de l’œsophage, les animaux vont développer une sténose œsophagienne qui va entrainer une dysphagie avec un risque de diminution de la prise alimentaire voir de vomissement en cas de sténose complète (occlusion haute). Les complications inhérentes au geste sont dominées par la perforation œsophagienne per endoscopique, et la migration de la prothèse œsophagienne pouvant entrainer une perforation et une péritonite. Ils pourront avoir une alimentation liquide après 24 heures de jeune, en l’absence de vomissement après 24 heures d’alimentation liquide, une alimentation moulinée pourra être proposée progressivement sur 48 heures. Procédure 2 : Les nuisances peuvent être la perforation, la migration de la prothèse d’apposition pouvant entrainer une perforation et une péritonite. Après les 24 heures de jeun, une reprise alimentaire progressive sera entreprise, avec à J1 une alimentation liquide, puis à J2 une alimentation mixée et à J3 une alimentation normale. Procédure 3 : Les complications de cette technique sont : la perforation, la migration de la prothèse d’apposition pouvant entrainer une perforation et une péritonite. Il existe également un risque d’infection urinaire. Après les 24 heures de jeun, une alimentation normale pourra être reprise.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure à des fins d’analyse macroscopique des zones traitées

Remplacement

l’utilisation de l’animal est indispensable car aucun modèle n’est en mesure de reproduire les difficultés techniques retrouvées in vivo (mouvements de l’intestin, de l’anse jéjunale par rapport à l’estomac, mouvements respiratoires) dont la maîtrise est primordiale dans la réussite de ces techniques. Par ailleurs, le processus sténotique/fibrosant ne peut être évalué sur simulateur virtuels /mécanique ou modèle ex vivo puisque ce phénomène nécessite l’activation d’un processus cellulaire inflammatoire non reproductible en laboratoire à l’heure actuelle.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à 5 par groupe pour chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux. Chaque procédure pourra être répétée au besoin une fois. Dans l'objectif de réduire le nombre d'animaux, la possibilité d'effectuer plusieurs procédures différentes sur le même animal a été étudiée. Cependant, le fait de pratiquer 2 procédures ou plus sur le même animal serait selon nous d'un niveau de sévérité trop important pour maintenir un niveau de bien-être suffisant de l'animal.

Raffinement

Les animaux seront récupérés a minima 5 jours avant l’intervention et logés dans une animalerie adaptée avec enrichissement du milieu permettant une prise en charge adéquate avec les règles du bien-être animal. La procédure est réalisée sous anesthésie générale ; des règles d’euthanasie strictes en cas de signe de souffrance identifiée pendant la procédure ont été stipulées. Une surveillance particulière sera effectuée sur les animaux en post-opératoire avec le suivi notamment de l’alimentation pour être en mesure de détecter au plus tôt la présence de sténose œsophagienne (surveillance toutes les 6-8 heures sur la période à risque). Le risque d’infection urinaire était présent dans les procédures de fistules, ce point sera particulièrement suivi, et un traitement antibiotique sera mise en place de manière préventive.

Choix des espèces

Les simulateurs virtuels et mécaniques ont démontré leur efficacité pour réduire l’utilisation du modèle animal pour l’apprentissage de l’écho-endoscopie diagnostique et de la ponction sous écho-endoscopie. Les modèles ex-vivo ont démontré eux leur utilité pour l’apprentissage du drainage des collections pancréatiques en suturant sur les faces postérieures et antérieures de l’estomac des morceaux d’intestin de porc remplies de gel d’échographie. A l’heure actuelle, aucun modèle n’existe permettant de remplacer le modèle animal vivant anesthésié. Effectivement, aucun modèle ex-vivo combinant l’estomac et l’intestin grêle jusqu’à l’angle de TREITZ n’est disponible et de plus la difficulté technique est basée sur une combinaison des mouvements péristaltiques de l’intestin grêle, une mobilité de l’anse jéjunale par rapport à l’estomac et les mouvements digestifs liés aux mouvements respiratoires. Ces difficultés techniques ne peuvent à l’heure actuelle être appréhendées uniquement sur un modèle animal vivant anesthésié. Par ailleurs le processus sténotique/fibrosant ne peut être évalué sur simulateur virtuels /mécanique ou modèle ex vivo puisque ce phénomène nécessite l’activation d’un processus cellulaire inflammatoire non reproductible en laboratoire à l’heure actuelle.

Douze ponctions ovariennes par animal, sous anesthésie épidurale et sur bête vigile, avec pose et retrait répétés d'un dispositif vaginal et cinq injections de superovulation à douze heures d'intervalle avant chaque collecte : 12 génisses Prim'Holstein subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et sont gardées en vie à l'issue. L'ensemble sert à produire 400 embryons pour mettre au point la détection des anomalies chromosomiques dès le stade préimplantatoire, afin d'éviter les transferts sans issue et de réformer les animaux porteurs. Le porteur mentionne des hématomes possibles au point d'injection et un stress ponctuel lié aux contentions. Il classe la procédure en gravité modérée du fait de la répétition d'actes légers et, écrit-il, en l'absence de données objectives sur le sujet.

Objectifs

Depuis 2009, la sélection génomique s’est développée dans la filière bovine avec près de 300 000 analyses annuelles du génome réparties désormais dans une quinzaine de races, dont 80% pour une gestion du renouvellement en élevage. La lecture du génome peut également être effectuée plus précocement, dès le stade embryonnaire préimplantatoire après analyse de l’ADN préamplifié issu d’une biopsie de quelques cellules d‘un embryon (utilisation dans le cadre des schémas de sélection). Ces données génomiques sont principalement utilisées aujourd’hui pour prédire les performances futures de chaque individu mais ne sont pas valorisées pour détecter des problèmes d‘aneuploïdie (nombre anormal de chromosomes) qui peuvent survenir à chaque génération. Ces anomalies chromosomiques entrainent souvent l’arrêt du développement voire des problèmes d’infertilité ou de stérilité sur l’individu né. Le projet présenté vise à développer des approches méthodologiques permettant valoriser les données de génotypage pour détecter les anomalies chromosomiques (monosomie, trisomie) le plus précocement possible chez l’embryon et chez le veau afin de les prévenir et les gérer. Le projet justifiant cette demande d’autorisation porte uniquement sur la détection des anomalies chromosomiques chez les embryons, les approches chez les veaux nécessitant uniquement l’exploitation de données de génotypages déjà disponibles dans les bases de données nationales.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de développer et valider des méthodologies de détection des problèmes de ploïdie (monosomie, trisomie) dès le stade embryonnaire préimplantatoire chez les bovins. Ces indicateurs permettront à la fois d’éviter de transférer les embryons aneuploïdes (probabilité de gestation et naissance quasi-nulle alors même que l’aspect morphologique semble bon) mais également de mieux diagnostiquer des problèmes de fertilité chez des animaux aneuploïdes et ainsi les réformer pour éviter la dissémination de ces tares génétiques.

Procédures

La production des embryons nécessitera la répétition, pour chaque génisse du projet, de 12 collectes d'ovocytes (1 collecte d'ovocytes tous les 15 jours par animal) réparties en deux séries entrecoupées d’une période de repos de plusieurs semaines. Au début de chacune des deux séries de collecte d'ovocytes, un traitement de synchronisation des chaleurs sera effectué comprenant la pose et le retrait d'un dispositif vaginal ainsi qu'une injection intramusculaire (chaque intervention durant moins d'une minute à chaque fois). Chacune des collectes d'ovocytes nécessite une succession d'interventions sur les animaux : ponction ovarienne (15 minutes) et pose d'un dispositif vaginal (moins d'une minute) suivi 2 jours plus tard d'un traitement de superovulation (5 injections intramusculaires à 12 heures d'intervalle; chaque injection durant moins d'une minute à chaque fois) et enfin ponction ovarienne multiple sous contrôle échographique (30 minutes) avec changement de dispositif vaginal (moins d'une minute). Les ponctions ovariennes seront systèmatiquement effectuées sur animaux vigiles anesthésiés.

Impact sur les animaux

Du fait des injections intramusculaires liées aux traitements de superovulation, un hématome peut apparaitre au niveau du site d’injection. Afin de limiter ces risques, les injections seront réalisés alternativement de chaque côté de l'encolure. De plus, les différentes interventions et contentions prévues dans le projet peuvent engendrer un stress ponctuel chez les animaux. Néanmoins, du fait de la répétition d'actes induisant des nuisances légères et en l'absence de données objectives sur le sujet, la procédure expérimentale est considérée en degré de sévérité modérée dans ce projet.

Devenir

Toutes les génisses seront gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.

Remplacement

Avant de passer à l’utilisation de l’animal, les méthodes de détection de l’aneuploïdie ont d’abord été développées et validées sur embryons produits in vitro à partir d’ovaires prélevés post-mortem en abattoir. Néanmoins, compte-tenu des différences de qualité ovocytaire avec le modèle de prélèvement sur animaux vigiles et de la volonté d’étudier l’impact de la répétition des sessions de production sur le taux d’aneuploïdies des embryons, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo. De plus, la production d’embryons in vitro après ponction folliculaire sur animaux vigiles représente le protocole principalement utilisé par les professionnels de la filière. Le développement méthodologique effectué doit donc nécessairement être validé en conditions de production réelles avant d’être mis en œuvre en routine.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé en fonction du nombre d’embryons à produire pour étudier le taux d’aneuploïdie (nombre anormal de chromosomes) des embryons selon les facteurs étudiés (protocole de production des embryons, taureau utilisé pour la fécondation, rang de collecte des ovocytes) et en tenant compte des impératifs pratiques imposés par le protocole de production (nombre de femelles traitées par jour et intervalle de temps entre les sessions). Ainsi, l’utilisation de 12 génisses permet de limiter le nombre d’intervention sur chaque animal avec 12 ponctions ovocytaires par individu permettant la production de 400 embryons sur l'ensemble du projet. Ces effectifs sont à priori nécessaires pour mettre en évidence, s'ils existent, les effets du taureau (présumés faibles), du protocole de production d’embryons (présumés importants) et du rang d’OPU (inconnus; aucune donnée bibliographique n'étant disponible sur le sujet) avec les exigences statistiques fixées (risque de 5% de conclure que l'effet existe alors qu'il n'existe pas; risque de 20% de conclure que l'effet n'existe pas alors qu'il existe).

Raffinement

L’étude est mise en place sur 12 génisses qui seront hébergées dans une stabulation libre avec aire paillée intégrale. Les génisses donneuses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales, enrichissement de milieux avec différents objets,...). Afin de limiter les risques d’hématomes, au niveau du site d’injection IM du traitement de superovulation, nous alternerons le lieu et le coté des injections. De plus, une anesthésie épidurale sera réalisée préalablement aux ponctions ovocytaires. Enfin, dans un objectif de renforcement positif, une récompense alimentaire (concentrés) sera donnée aux femelles après chaque passage dans la cage de contention, lors de la phase d’acclimatation ainsi que pour les collectes d'ovocytes.

Choix des espèces

Compte tenu de l’objectif même de l’étude, aucune autre espèce animale ne peut être choisie. La race Prim’Holstein choisie est la 1ère race laitière française en effectif, et est particulièrement concernée par les biotechnologies de l’embryon sur le terrain. Afin de produire les embryons du projet, il est nécessaire d'utiliser des génisses, toutes pubères et âgées de 14 à 18 mois. Le modèle génisse est représentatif de la population de donneuses d’embryons en France et à l’étranger. De plus, il a l’avantage, par rapport à un modèle vache, de ne pas présenter de biais expérimentaux liés à l’historique des femelles (conditions de mise bas, interactions avec la production laitière….).

40 brebis sont saillies, 25 gestantes entrent dans le protocole et les 15 autres retournent à l'élevage, où pourront aussi retourner plus tard 4 agnelles nées de mères témoins. 80 moutons, brebis et agneaux, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les 25 brebis gestantes, dont 20 androgénisées et 5 témoins, reçoivent 8 injections intramusculaires en 18 semaines, et leurs 40 agneaux subissent chacun 14 prises de sang de la naissance à 24 semaines. Autour de la puberté, les agnelles passent une IRM sous anesthésie générale, puis la pose d'un cathéter jugulaire suivie de séries de 36, 12 et 16 prélèvements, et les 16 nées de mères androgénisées recommencent après des injections d'anticorps anti-AMH ou de solution témoin. Les 25 mères sont tuées après l'agnelage, ainsi que 16 agneaux et ces 16 agnelles, pour analyser leurs tissus. Le texte ne dit rien du sort des 4 autres agneaux mâles, nés de mères androgénisées.

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la cause la plus fréquente d'infertilité féminine (8 à 13 % des femmes en âge de procréer dans le monde). Les critères du diagnostic du SOPK sont basés sur au moins deux des trois caractéristiques suivantes : 1/ irrégularité ou absence des règles, 2/ un taux élevé d’hormones masculines dans le sang, et 3/ ovaires renfermant de nombreux kystes folliculaires de 2 à 6 mm. La plupart des patientes atteintes de SOPK présentent également des taux d'hormone AMH (anti-müllérienne) et LH (hormone lutéinisante) élevés. De plus, ce trouble est généralement associé à une résistance à l'insuline, de l’obésité, des taux de cholestérol élevés et une hypertension artérielle. Il est important de noter que la plupart des caractéristiques du SOPK sont transmises aux filles des femmes atteintes de ce syndrome, puisque 60 à 70 % de leurs filles développent ce syndrome. Malgré le nombre de femmes touchées par ce trouble, les causes du SOPK restent incomprises. Parmi les facteurs impliqués dans le SOPK, les androgènes, et l'AMH ont été reconnus comme jouant un rôle central. L'hypothèse actuelle est que l’excès d'androgènes ou d'hormones sexuelles masculines durant la grossesse pourrait entraîner des modifications au niveau de l’activité ovarienne et la sécrétion de certaines, ce qui entraînerait le développement du SOPK à l'âge adulte. Notre projet qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) a pour objectif de tester si un anticorps dirigé contre l’AMH peut supprimer les défauts d'ovulation observés dans un modèle de brebis ayant reçu un excès d'androgènes mimant le SOPK chez la femme. En effet, la brebis est une espèce proche de la femme en terme de développement ovarien. Nous étudierons également chez la mère et chez ses descendants mâles les conséquences d’un taux élevé d’hormones masculines au niveau des tissus périphériques et reproducteurs.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de constituer un corpus de données visant à évaluer si un anticorps anti-AMH est un bon candidat pour des essais ultérieurs chez l'humain, en l'occurence chez la femme développant un syndrome des ovaires polykystiques. Elle permettra aussi de mieux comprendre les effets moléculaires de la testostérone chez la femme et les conséquences chez la descendance mâle.

Procédures

Pour les 40 brebis adultes : 1 prise de sang (PS) intra-veineuse (IV) (jugulaire) sera réalisé à 18 jours après la saillie. Pour les 25 brebis gestantes sélectionnées : 8 Injections intra musculaire (IM) sur 18 semaines. 4 PS IV (jugulaire) pendant la gestation. Pour tous les descendants mâles (n=20) : 14 Prises de sang par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Pour tous les descendants femelles (n=20) : 14 PS par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Autour de la puberté, 6 PS par IV (jugulaire) sur 3 semaines. 1 anesthésie générale pour 1 passage à l’IRM à la puberté. Pose de cathéter à la puberté sous anesthésie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Pour les femelles pubères issues des mères androgénisées (n=16) : 18 Prises de sang sur 9 semaines. 4 injections intra veineuse (jugulaire). 1 anesthesie genérale pour un passage à l’IRM après l’injection de l’anticorps. 1 pose de cathéter après le passage à l’IRM sous anesthesie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Dans l'EU1 seront effectuées toutes les expérimentations sauf l'anesthésie générale et le passage à l'IRM qui seront réalisés dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les differentes injections peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose des cathéters jugulaires peut entraîner des douleurs au point d'injection. Pour les animaux traités, il existe un risque d’apparition de kystes et d’anomalies de la vessie (observés par IRM). Il peut arriver mais trés rarement des signes extérieurs associés à une douleur comme une dérivation urinaire entre les cuisses qui peut entrainer des brûlures. Les nuisances en lien avec l’anesthésie de l’IRM sont une irritation des voies respiratoires lors de l’intubation et l’extubation, un possible hématome lors l’intraveineuse et un potentiel stress lors des manipulations.

Devenir

Pour la procédure 1: sur les 40 brebis saillies, 25 seront utilisées, les 15 brebis non selectionnées retourneront à l'élevage. Les 25 brebis sont nécessaires afin d'obtenir suffisamment de descendants femelles pour tester l'effet de l'injection d'anticorps . Une fois l'agnelage effectué, les 20 brebis androgénisées et les 5 témoins seront euthanisées afin de récupérer les tissus périphériques et reproducteurs pour une analyse moléculaire. Pour la procédure 2: sur les 40 descendants, 4 descendants femelles issues des mères témoin pourront retourner sur l'élevage. Ainsi, seront euthanasiés 12 descendants mâles issus des mères androgénisées et 4 descendants mâles issus des mères témoin mais aussi 16 descendants femelles injectés soit avec l'anticorps (n=8) ou avec une solution témoin (n=8) afin de pouvoir mener une étude moléculaire sur les tissus périphériques et reproducteurs.

Remplacement

Nous ne pouvons tester les anticorps que sur un organisme entier. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. D'autre part, il a été démontré dans la littérature que la brebis androgénisée est un bon modèle syndrome d'ovaires polykystiques chez la femme.

Réduction

Nous allons utiliser 25 brebis gestantes, 20 (16+4) agneaux mâles et 20 (16+4) agneaux femelles jusqu’à la puberté. Ce nombre a été estimé en utilisant un test de comparaison de deux moyennes (nombre de follicules antraux) dans chaque groupe. Avec des lots de 8 descendants femelles issues de mères androgénisées cela donne une puissance tout à fait satisfaisante. Afin d’avoir 16 brebis issues de mères androgènisées, il faut partir d’au moins 20 brebis au départ. Afin de vérifier que le traitement de testostérone fonctionne, nous suivrons également 5 brebis qui seront non traitées, et leurs descendants.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. Pour limiter les tress lié à la manipulation, Ils seront visités tous les jours avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Nous récompenserons les animaux après chaque session de prises de sang en distribuant du concentré à l’auge. Lors de la pose des cathéters, le comportement et l'apparence des brebis (notamment au niveau de l’implantation du cathéter) sera suivi avec attention. Les animaux seront maintenus en cage individuelle le temps des prélèvements, mais auront tout de même un contact visuel et olfactif avec leurs congénéères. Avant toute injection intramusculaire ou intraveineuse, une application de gel antalgique sera réalisée. Les deux veines jugulaires seront utilisées en alternance pour limiter le risque d’hématome. Les animaux seront mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie pour le passage à l’IRM, afin de limiter tout risque de régurgitation. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Le transport des animaux de l'EU1 vers l'EU2 avant l'opération et leur retour de l'EU2 vers l'EU1 sera réalisé par un technicien formé et expérimenté dans une bétaillère agréée pour le transport d'animaux vivants. Le trajet est très court (moins de 5 minutes) et la bétaillère sera abondamment remplie de paille.

Choix des espèces

Afin de pouvoir mimer le SOPK chez la femme nous souhaitons utiliser des brebis gestantes pour plusieurs raisons : 1. contrairement aux rongeurs, la brebis présente l'avantage d'avoir un développement ovarien similaire à la femme. 2. De plus, ce modèle a déjà été validé dans nos unités. - 40 brebis saillies seront utilisées pour la détection de 25 brebis gestantes qui rentreront dans la procédure. Cet effectif doit permettre d'assurer la production de descendants assez conséquente pour poursuivre nos travaux. - 20 descendants mâles seront étudiés de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 20 descendants femelles seront étudiées de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 16 femelles pubertes sur les 20 entreront dans la 2ème phase de l’expérimentation (de J168 jusqu’à J235).

20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, l'anosmie leur étant provoquée au cours du projet. Dix d'entre elles subissent une chirurgie de deux heures pour la pose d'une électrode dans les bulbes olfactifs, un test de stimulation de trente minutes sur animal vigile et une IRM fonctionnelle d'une heure sous anesthésie. Les dix autres passent vingt séances d'entraînement à associer une odeur à une récompense, puis trois interventions chirurgicales, et portent une muselière rotative sur laquelle est fixée la partie externe de l'implant. Le porteur décrit des essais menés en laboratoire, un capteur de gaz exposé à un flux d'air odorant et une stimulation électrique enregistrée dans un verre d'eau, puis conclut que le recours aux animaux est "irremplaçable" pour évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4) .10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2). • 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.