Mammifères "de rente"

20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune anesthésiée trois fois en quatre ou cinq jours pour des séances d'IRM de deux heures à deux heures trente. Elles reçoivent aussi, sous anesthésie générale, une injection de manganèse dans la cavité abdominale, un métal neurotoxique à forte dose selon le porteur, et trois injections dans la veine jugulaire pour déclencher les anesthésies. Le porteur prévoit jusqu'à 20 brebis plutôt que 12 "pour pallier les pertes éventuelles liées aux longues anesthésies successives". Toutes sont tuées sous anesthésie après les acquisitions, le porteur expliquant qu'elles ne peuvent être réutilisées faute de savoir combien de temps le manganèse reste dans leur corps. Le projet se limite à caler la fenêtre d'imagerie avant de futures études sur les circuits cérébraux des interactions sociales et sexuelles chez les moutons, et ses mises au point "bénéficieront à des appels à projet ultérieurs", écrit-il.

Objectifs

L’objectif est de mettre en place la technique d’Imagerie par Résonnane Magnétique du manganèse in vivo à l'échelle du cerveau entier chez l’ovin. Les propriétés paramagnétiques du manganèse (Mn2+) permettent son utilisation comme agent de contraste pour l'IRM (MEMRI : IRM du ManganEse). C’est un composé qui pénètre et s'accumule dans les neurones actifs, donc sa concentration intracellulaire est le reflet direct de l'activité neuronale. Cette technique permet de visualiser les changements du cerveau en réponse à des stimulis. La dynamique du Mn2+ (biodisponibilité, pharmacocinétique) dépend de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin. Une première expérience pilote a été réalisée sur 5 animaux ; cette expérience nous a permis de déterminer la dose minimale de Mn2+ à utiliser. Nous avons également observé les zones de diffusion du Mn2+ 24h post administration. Il est nécessaire de compléter et d’affiner ces résultats, notamment en analysant des points de cinétique qui manquent à notre analyse : les temps 48, 72 et 96 heures post-administration de manganèse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir la fenêtre temporelle optimale pour l’acquisition du meilleur contraste en IRM MEMRI. Après injection, la concentration du manganèse augmente graduellement dans les tissus du cerveau, puis sa détection atteint un plateau, persiste pendant plusieurs heures et ensuite décroit. C’est la fenêtre correspondant au plateau qu’il s’agit de déterminer chez l’ovin. Une fois cette fenêtre temporelle définie, nous pourrons réaliser les expériences d’IRM fonctionnelle. Les mises au point des conditions de dose et temps dans cette expérimentation préliminaire bénéficieront à des appels à projet ultérieurs. Ce projet est une étape clé dans la mise en œuvre des études d’IRM fonctionnelle chez les ovins en utilisant une approche MEMRI par réhaussement de manganèse.

Procédures

Entre 12 animaux et 20 animaux subiront les gestes techniques, 20 est un nombre maximal prévu pour pallier les pertes éventuelles liées aux longues anesthésies successives. Les animaux subiront 3 anesthésies sur une durée de 4 jours pour 6 à 10 animaux maximum, et 5 jours pour 6 à 10 animaux maximum, pour passage à l'IRM. La 1ère anesthésie durera 2h30, les 2 autres 2h. Ils recevront également une injection intra-péritonéale sous anesthésie générale. Ils subiront 3 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies (durée totale contention comprise d'une minute).

Impact sur les animaux

Bien qu’il soit un élément nécessaire au bon fonctionnement de l’organisme, le manganèse est cependant neurotoxique à forte dose. Chez l’homme, il provoque maux de tête, insomnies, pertes de mémoire, instabilité émotionnelle, dystonie, tremblements, troubles du langage et des troubles de la marche. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse.

Devenir

A la suite des acquisitions, tous les animaux seront mis à mort toujours sous anesthésie générale. En effet, ils ne pourront pas être réutilisés car nous ne savons pas combien de temps le manganèse reste dans l'organisme des animaux.

Remplacement

Cette étude d‘imagerie cérébrale permettant de déterminer la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste IRM ne peut être réalisée qu’in vivo. Il est en effet impossible d’étudier ou de reproduire ces expériences in vitro et encore moins in silico. Ce projet est un prérequis pour développer l’approche d’imagerie MEMRI qui permettra, ultérieurement, de mettre en place des projets longitudinaux, avec des nombres restreints d’animaux expérimentaux.

Réduction

Ce projet, qui concerne 12 animaux expérimentaux (20 animaux maximum) est nécessaire car il complétera et affinera les résultats obtenus lors d’une précédente expérience. L’évolution temporelle de la concentration de Mn2+ dans le cerveau d’ovins a été déterminée 24h, 72h et 120h après son administration. Les points 48h et 96h n’ont pas été étudiés et sont indispensables pour déterminer la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste. Nous avons planifié l’expérience de manière à acquérir des images IRM à deux temps post-administration de Mn2+ pour chaque animal, ce qui réduit considérablement le nombre d’animaux. Nous pensons qu’avec 4 temps d’analyse post-administration de Mn2+ et 6 animaux (10 animaux maximum) par temps (6 animaux imagés aux temps 24h et 72h et 6 animaux imagés aux temps 48h et 96h post-administration de Mn2+), la disponibilité du manganèse dans le cerveau des ovins au cours du temps pourra être modélisée par un ingénieur expert en pharmacologie. La taille de nos effectifs (6 individus par traitement expérimental) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances (tests paramétriques ou non paramétriques).

Raffinement

Pour limiter les stress liés à la manipulation des brebis, les 12 brebis (20 maximum) seront regroupées pour rester ensemble toute la durée de l’expérience et former ainsi un groupe social stable. Deux semaines avant les expériences, les manipulateurs iront quotidiennement approcher les brebis, les toucher et évoluer parmi elles pour établir un contact et lors de chaque visite, nous leur donnerons à chacune une poignée de granulés comme renforcement positif, ce qui participera à leur habituation. Nous n’avons pas observé d’effet néfaste de l’administration intra péritonéale de manganèse à la dose utilisée lors de l’expérience pilote, néanmoins, les brebis feront cette fois aussi, l’objet d’une surveillance accrue dans la période qui suivra l’administration de Mn2+, et ce jusqu’à l’anesthésie pour l’imagerie suivante. Au cours de cette période, l’apparition de tremblements, les difficultés de déplacement, la prise alimentaire seront particulièrement surveillés. Nous serons attentifs à la survenue de signes de mal être (position des oreilles, port de la tête, prostration). Dans le cas où de tels signes apparaitraient, un traitement analgésique sera administré. Nous avons opté pour une administration sous endoscopie du manganèse qui permet de nous assurer de la qualité de l’injection en intrapéritonéale ainsi que de la progressivité de l’injection : sous anesthésie générale, nous pouvons adopter une vitesse d’injection réduite susceptible de limiter l’apparition d’effets indésirables. Les animaux expérimentaux seront maintenus dans des conditions adaptées aux herbivores, litière de paille et foin ad libitum. Ils seront manipulés dans le calme par des agents expérimentés. Les animaux arriveront sur la plateforme 3 jours avant le début de l’expérimentation, pour s’habituer à l’environnement. Avant l’anesthésie, et pour réduire la météorisation et assurer quand même leur confort, ils auront accès à du foin de bonne qualité en quantité limité avec abreuvement adlibitum. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé.

Choix des espèces

L’espèce ovine sera utilisée dans ce protocole car cette approche d’imagerie MEMRI sera utilisée pour étudier les circuits cérébraux impliqués dans les interactions sociales et sexuelles dans cette espèce. Un lot homogène de brebis de 18 mois sera utilisé, car nous souhaitons que cette approche soit validée dans les conditions où les animaux ont terminé leur développement. Dans un premier temps, cette approche sera développée chez les brebis car ce sont elles qui sont présentes majoritairement en élevage. Elle sera ensuite transférable (dose de MnCl2+ et temps de diffusion de manganèse jusqu’à la phase plateau) chez les béliers. Un essai avec quelques individus sera réalisé plus tard pour la validation chez les mâles. Aucune différence dans la distribution cérébrale du manganèse dans le cerveau entre les mâles et les femelles n’est cependant attendue.

Enfermées seules pendant 72 heures dans une enceinte close qui mesure le méthane qu'elles émettent, avec traite manuelle deux fois par jour, 160 chèvres en lactation vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un séjour pouvant provoquer vocalisations, baisse d'ingestion, perte de poids transitoire et agitation, et reconnaît que l'hébergement individuel est un facteur stressant. Il écrit pourtant que la procédure "n'implique aucune mesure invasive sur les animaux". Les chèvres retournent ensuite à l'élevage, où leur efficience alimentaire et leur résilience continuent d'être mesurées, les données servant à nourrir des modèles mathématiques de réduction du méthane.

Objectifs

Chez les ruminants, La dégradation des aliments se produit principalement dans le rumen (estomac) grâce à l'action d'une communauté microbienne complexe. Ce microbiote est responsable de la fermentation des aliments dont les produits principaux sont les acides gras volatils, le gaz carbonique et le méthane. La réduction des émissions de méthane des ruminants est un défi majeur pour le secteur de l'élevage. La conception de stratégies optimales de réduction de méthane nécessite la prise en compte des éléments de productivité et de résilience animale. En effet, une stratégie de réduction des émissions ne doit peut pas défavoriser la santé et la production (e.g. production du lait des chèvres laitières dans notre cas). Dans ce contexte, ce projet associe la modélisation mathématique et l’expérimentation animale pour contribuer à une meilleure compréhension des interactions entre caractères clés. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la dynamique de production de méthane de chèvres dont les caractéristiques et les capacités de résilience et d’efficience alimentaire sont connues. Les données résultantes seront utilisées pour le développement de modèles mathématiques. Par efficience alimentaire, on entend le rapport entre les produits animaux et les ressources mobilisées. Ce ratio résulte de la capacité des animaux à transformer les ressources alimentaires en produits (lait, viande). Par résilience, nous entendons la capacité à court terme de l'animal à faire face aux perturbations environnementales. Notre hypothèse est que des animaux présentant des différences en termes de leur efficacité ou robustesse pourraient présenter des différences dans leur dynamique de production de méthane. Nous espérons que ce travail produira des connaissances permettant la conception de stratégies de réduction de la production du méthane tout en conservant résilience animale et des productions optimales. Ce projet s’appuie sur des projets en cours et futurs de notre équipe autour de l’efficience alimentaire et la résilience.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des liens entre émissions de méthane par des ruminants et caractères d’intérêt clés, comme leur production de lait et leur santé ou bien-être Cette approche globale est centrale pour la conception des stratégies durables pour la réduction d’émission de méthane dans l’atmosphère. Le projet fournira, de plus, des données clés (cinétiques d’ingestion couplées aux cinétiques de production de méthane) pour les travaux de modélisation portés par notre équipe. Ces modèles prédictifs s’intègrent dans une démarche d’élevage de précision en produisant des outils d’aide à la décision pour le suivi de l’élevage et la formulation de stratégies alimentaires durables. En plus, les modèles mathématiques résultants sont des outils qui pourraient aider à réduire le besoin d'expérimentations animales pour prédire les réponses des animaux aux changements alimentaires, ce qui répond aux principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner).

Procédures

Pour toute la durée de la procédure, les animaux serons soumis à un hébergement individuel pendant 72 heures dans des enceintes fermées permettant la mesure de la production de méthane. Pendant le séjour dans les enceintes, les animaux serons soumis à une traite manuelle 2 fois par jour, pour un totale de 6 traites d’une durée d’environ 3 minutes chacune.

Impact sur les animaux

Les séjours (3 jours) dans les enceintes peuvent entraîner un stress en raison de l’hébergement individuel des animaux. Le séjour dans les enceintes peut conduire certains animaux à vocaliser et à diminuer leur ingestion, ceci conduisant à une perte de poids transitoire. Le séjour pourrait avoir un impact sur l’activité de l’animal (excrétions excessives, agitation ou immobilisation).

Devenir

La procédure de mesure de méthane n’implique aucune mesure invasive sur les animaux. Les chèvres retournent dans l’élevage à la fin.

Remplacement

Les modèles mathématiques résultants de ce projet seront des outils permettant d’étudier des alternatives durables pour la réduction de méthane. La construction des modèles doit impérativement reposer sur des données expérimentales obtenues in vivo, en prenant en compte la spécificité de l’animal (i.e. son comportement alimentaire et son niveau de production). Des systèmes in vitro existent pour étudier la production de méthane. Néanmoins, les conclusions basées sur ces études in vitro sont limitées car ce type de système ne tient pas compte des facteurs physiologiques importants de l’hôte, comme par exemple l’absorption des acides gras volatils à niveau du rumen. Pour ce projet, l’expérimentation animale est donc essentielle et irremplaçable. Le but est que, dans l’avenir, les modèles résultants du projet constituent une alternative à l’expérimentation animale dans certains cas spécifiques.

Réduction

La procédure impliquera l’utilisation de chèvres dont le comportement alimentaire, l’efficience alimentaire ou la résilience auront déjà été caractérisées dans des expérimentations précédentes ou à venir. L’objectif est de déterminer la production de méthane chez des animaux avec des profils d’efficience et résilience variés pour permettre d’évaluer notre hypothèse. Pour éviter des conditions environnementales d'inconfort (température, humidité), nous avons décidé de n'utiliser le dispositif qu'au printemps et à l'automne. Pour chaque saison, nous caractériserons la production de méthane d'animaux avec deux niveaux différents de résilience ou efficience alimentaire. L’expérimentation en 2 saisons nous permettra évaluer 2 stades de lactation. Nous utiliserons 4 animaux par traitement (16 animaux par saison, par an) afin de tenir compte de la possibilité que certains animaux ne réussiront pas la phase d'habituation et sortiront de l’expérimentation sans passer par la phase de mesure de production de méthane. Les animaux à utiliser seront sélectionnées en connexion avec des protocoles précédents permettant la caractérisation de leur résilience ou de leur efficience alimentaire. La procédure a une durée de 5 ans pour permettre élargir le phénotypage d’un nombre important des animaux dans notre installation expérimentale. Ces animaux auront une caractérisation en termes de leur résilience/efficience dans des expériences à venir dans le cadre de projets de recherche de l’équipe. La consolidation d’une base des données important intégrant des données de production de méthane, résilience et efficience alimentaire sera un atout pour le développement de modèles mathématiques de notre équipe.

Raffinement

L’hébergement individuel est un facteur stressant pour les animaux. Pour réduire les nuisances sur le bien-être animal, une phase d’habituation sera mise en place pour minimiser le stress dans les enceintes. Dans cette phase d’habituation, les animaux seront exposés à l’hébergement individuel de manière graduelle. Les enceintes sont équipées d’un matelas qui laisse passer l’urine pour améliorer le confort de l’animal. Des brosses et des petites chaines seront installées comme enrichissement. La présence de parois transparentes (qui permettent la visibilité avec leurs congénères et de la présence humaine) et la présence d’une veilleuse pour la nuit pendant les phases d’habituation et de mesures réduiront le stress. Les animaux seront observés régulièrement pendant toute la durée du protocole d’habituation et pendant les mesures. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Une caméra vidéo enregistrera en continu les comportements des 4 chèvres durant la période de mesures pour surveiller et détecter un éventuel changement de comportement. Les vidéos seront sauvegardées et visionnées systématiquement le lendemain matin par les animaliers. Si un animal présente des comportements anormaux durant la nuit, il sera sorti du dispositif. Une étape en amont des essais sera effectuée pour sélectionner des animaux qui, potentiellement, auront moins de stress. Cette sélection sera faite sur l’observation des comportements. L’observation de la production de lait et de la mamelle sera aussi prise en compte pour choisir des animaux ave une bonne conformation des trayons pour faciliter la traite manuelle.

Choix des espèces

Ce projet s’intègre dans le programme de recherche de l’équipe. Il utilisera l’animal modèle de l’unité : la chèvre laitière. Nous allons utiliser des chèvres en lactation dans des conditions similaires à l’élevage conventionnel de chèvres laitières .pour avoir des résultats représentatifs du contexte de production des élevages commerciaux. Nos travaux de modélisation suivent une approche mécanistique générique qui peut être appliquée aux autres espèces de ruminants y compris les bovins.

Jusqu'à trois chirurgies crâniennes sous anesthésie générale par animal, plus vingt séances d'entraînement à associer une odeur à une récompense : 20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs bulbes olfactifs. Une électrode leur est implantée dans le bulbe olfactif, la stimulation est ensuite testée sur animal vigile pendant trente minutes, puis une IRM fonctionnelle est réalisée sous anesthésie. Une muselière rotative portant la partie externe de l'implant leur est fixée. Le porteur affirme que le recours aux brebis est "irremplaçable" pour évaluer la tolérance du dispositif et justifie le choix des ovins par des dimensions de bulbe olfactif proches de celles de l'humain et par un crâne encore assez fin entre 12 et 18 mois, ce qui rend les chirurgies plus rapides.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4) .10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2). • 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.

Écartés du circuit commercial parce que l'anesthésique employé n'a pas d'autorisation de mise sur le marché chez le porc, les 27 animaux de ce projet doivent être soit confiés à une association par l'intermédiaire du GRAAL, soit tués par injection létale et éliminés par l'équarrissage. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, quatre biocapteurs à microaiguilles suturés à la peau du dos ou derrière les oreilles, portés de 24 heures à 7 jours en hébergement individuel, un isolement que le porteur reconnaît stressant pour une espèce grégaire. Chaque porc est anesthésié deux fois, dont une jusqu'à quatre heures avec cathéter, prélèvements sanguins répétés et injections provoquant une hyperkaliémie qui expose à un arrêt cardiaque, et peut être réutilisé pour quatre itérations espacées de dix jours. Le dispositif est destiné au suivi des maladies rénales chroniques, mais le porteur indique qu'aucune analyse statistique n'est prévue et que l'effectif correspond à une estimation haute du nombre d'itérations nécessaires pour que le capteur fonctionne.

Objectifs

Les affections rénales chroniques sont des maladies évolutives se traduisant par une importante dégradation de sa qualité de vie. En effet, en phase terminale le patient a besoin de dialyses régulières voire d'une transplantation d’organe. Le suivi des patients comprend des prises de sang régulières pour surveiller l’évolution de la maladie et des prises de sang rapprochées durant les phases de décompensation. Les délais dans la réalisation des analyses puis dans la réception des résultats peuvent conduire à des retards dans l’ajustement de traitement voire à des hospitalisations en urgence. L’analyse en temps réel des concentrations des biomarqueurs permettrait un suivi plus simple, moins contraignant, et une réponse plus rapide aux évolutions des symptômes, avec une prise en charge plus adaptée. Le dispositif testé dans ce projet est un biocapteur portable à placer sur la peau et mesurant en continu 2 biomarqueurs couramment utilisés par les néphrologues : le potassium et le glucose. Ce patch contient un réseau de microaiguilles (

Bénéfices attendus

Les résultats du projet pourraient présenter plusieurs bénéfices sur le long terme, sur le plan médical et sur le plan scientifique. Le projet pourrait etre bénéfique aux patients car il s’inscrit dans le cadre du développement d’un instrument destiné à l’amélioration du suivi des affections rénales chroniques. Un meilleur suivi de ces maladies permettra d’améliorer les conditions de vie des patients en les maintenant plus longtemps à des stades précoces de la maladie auxquels sont associés des symptômes et/ou des contraintes médicales mineures. Cela sera permis par un suivi facilité, un traitement plus adapté et ajusté plus rapidement. Additionnellement, le dispositif permet de remplacer les prises de sang comme moyen de suivi de l’évolution de l’état des reins. Ceci présente 3 avantages : - Une diminution des contraintes de déplacement pour le patient, et donc un suivi quotidien simplifié - Une augmentation du nombre de points de mesure permises par le capteur ce qui offre une image plus précise de l’évolution de ces concentrations au cours du temps aidant ainsi les médecins - Les informations étant directement transmises au médecin et au patient, il est possible de réagir plus rapidement pour adapter le traitement médical et/ou le comportement du patient (alimentation notamment) si besoin. Au-delà des bénéfices induits directement par l’utilisation de ce capteur à l’avenir, les résultats de cette étude, ainsi que des prochaines permettront d’ouvrir la voie au développement d’autres capteurs du même type adaptés au diagnostic, au suivi et/ou au traitement d’autres pathologies. D’un point de vue scientifique, un des objectifs de cette étude est de démontrer l’existence d’un lien utilisable pour la mesure en continu entre la kaliémie sanguine et la concentration de potassium dans le fluide interstitiel, où est effectuée la mesure. En effet, si des liens sur des mesures ponctuelles ont déjà été observés, aucun lien de ce type n’a été démontré à ce jour pour des mesures dynamiques et une preuve dans ce sens ouvrirai de nouvelles perspectives dans le domaine de la mesure en continu de la kaliémie dans le fluide interstitiel.

Procédures

Les animaux d'études seront anésthésiés à deux reprises: - Une anéthésie de courte durée (une vigntaine de minutes) pour la pose des biocapteurs (4 capteurs par animal positionnés sur le dos ou derrière les oreilles, suturés à la peau), - Une anésthésie de longue durée (jusqu'à 4h) pour les tests de mesures. Au cours de cette deuxième anésthésie, les animaux seront cathéterisés afin de faciliter l'administration des solutés et les prélèvements sanguins. Une fois les biocapteurs mis en place, les animaux seront hébergés en individuel pour une durée allant de 24h à 7 jours. Cet isolement peut être source de stress chez cette espèce grégaire.

Impact sur les animaux

1 - Le port du capteur peut potentiellement provoquer des effets secondaires chez l’animal, que ce soit dû à une réaction aux aiguilles insérées dans la peau ou bien à l’adhésif utilisé. 2 - Effets secondaires dûs à l’anesthésie (hypotension, hypoxie, réaction anaphylactique). 3 - Effets secondaires liés à l’injection de solution de biomarqueurs : Une hyperkaliémie crée un risque de complication cardiaque pouvant aller jusqu’à l’arrêt cardiaque. 4 - Effets secondaires liés aux prélèvements sanguins

Devenir

Les animaux ayant participés à la procédure expérimentale ne pourront pas retourner dans le circuit commercial car l'anésthésique utilisé n'a pas d'AMM chez le porc. Il y a donc deux issues possibles pour les animaux: 1) Rehabilitation des porcs en passant par Le GRAAL. Ces derniers seront placés dans des Associations ou Refuges avec un contrat spécifiant que l'animal ne pourra en aucun cas entrer dans la chaîne alimentaire. 2) Les animaux seront euthanasiés par injection lethale d'anesthésique jusqu'à l'arrêt cardiaque. Les carcasses seront éliminées par la filière de l'équarrissage.

Remplacement

Des études bibliographiques et des tests de biocompatibilité (notamment de cytotoxicité en culture cellulaire et d’extraction) seront menés en parallèle de cette étude, toutefois ces résultats sont limités et ne remplacent pas une observation in-vivo. De même, des résultats préliminaires ont été obtenus concernant la performance analytique du capteur en conduisant des tests in-vitro. Toutefois, ce résultat ne peut pas etre directement extrapolé pour l’utilisation du capteur in-vivo car l'environnement de mesure de la peau est radicalement différent de celui des tests in-vitro. Ces derniers incluent l’utilisation de solutions prélevées, de peaux d’animal mort ou de peaux artificielles, toutefois, cela n'est pas suffisant. Il est aussi difficile de simuler informatiquement un environnement aussi complexe. En effet l’impédance des tissus, les concentrations des molécules, la répartition des molécules cibles dans l'environnement et la dynamique de ces paramètres ont une influence importante et ne peuvent etre testés qu’in-vivo. Additionnellement, cela permet de tester l’effet de la réaction immunitaire sur l’évolution de la qualité de la mesure dans le temps et notamment une diminution du signal dû à une colonisation de la surface des électrodes de mesure par des cellules immunitaires ou d'autres effets de bio-encrassement.

Réduction

27 animaux maximum seront nécessaires. Cette étape est itérative, chaque itération permet d'optimiser le capteur et l'algorithme de mesure en fonction des résultats de la précédente jusqu'à atteindre un résultat satisfaisant. Le nombre d’itérations, et donc d’animaux nécessaires, dépendra des résultats obtenus durant l’étude. Le nombre d’animaux indiqué correspond donc à une estimation haute du nombre d’itérations qui seront nécessaires pour que le capteur fonctionne correctement et pour valider le résultat. Dans un cas idéal, 1 animal serait suffisant pour optimiser le capteur et 3 pour valider le design et l'algorithme. Chaque animal pourra etre réutilisé pour un maximum de 4 itérations, chacune espacée d’au moins 10 jours. Aucune étude statistique n'est prévue sur cette étude. A ce stade, la performance analytique est établie de manière individuelle pour chaque capteur.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en case individuelle afin d'éviter que les animaux ne s'arrachent les dispositifs entre eux. Néamoins, les animaux pourront maintenir les contacts physiques (groin à groin), olfactifs, visuels et auditifs avec leurs congénères à travers les barrières. Dans chaque case, des objets à manipuler (jouets à mâcher, balles, cordes ou chaînes) seront mis à disposition. De la compote de pomme ou morceaux de fruits seront également mis à disposition. Les enrichissements seront renouvelés chaque semaine. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de vérifier leur état général, la prise alimentaire, la prise de boisson et l’émission de fèces. L’absence de réaction au dispositif sera également contrôlée. Des points-limites adaptés ont été définis afin de limiter et de prendre en charge précocement toute souffrance. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie afin de limiter le stress pour ces protocoles invasifs comprenant notamment la pose d’un cathéter pour une durée de 4 heures, des prélèvements sanguins réguliers ainsi que des injections pouvant provoquer des états d’hyperglycémie et d’hyperkaliémie. Durant les procédures invasives, le niveau des biomarqueurs sanguins seront suivis en temps réel donc le contrôle des paramètres vitaux pourra etre réalisé dès l’apparition des premiers signes alarmants. Les procédures invasives seront espacées d’au moins 10 jours afin de permettre le repos et le rétablissement de l’animal entre deux phases.

Choix des espèces

Pour cette étude, le choix de l’espèce animale s’est porté sur le porc pour plusieurs raisons : - La structure de la peau des porcs est similaire à celle de la peau humaine, elle fournit un environnement adapté pour tester les capacités des capteurs - L’épaisseur de la peau des porcs est similaire à celle de la peau humaine à certains emplacements du corps (oreilles,cou...) - La concentration des analytes cibles dans le sang des porcs est similaire à celle que l’on trouve chez l'homme. Les porcs utilisés seront des porcs juvéniles d’environ 30 kg. A ce stade de développement, les animaux sont facilement manipulables.

Entraînées quatre à huit semaines à associer une odeur à une récompense, rendues anosmiques, puis opérées deux heures sous anesthésie générale pour implanter une électrode dans le bulbe olfactif, 20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit un test de stimulation du bulbe sur animal vigile et une IRM fonctionnelle sous anesthésie, l'autre moitié deux chirurgies supplémentaires d'une heure, chaque animal servant de témoin à lui-même avant et après induction de l'anosmie et portant une muselière rotative qui supporte la partie externe de l'implant. Le porteur attend des saignements de nez, des fuites de liquide céphalo-rachidien, des infections, et de la frustration en cas d'échec au test, les brebis circulant en bétaillère entre quatre établissements utilisateurs. Toutes sont tuées pour prélever leurs deux bulbes olfactifs et des biopsies d'épithélium olfactif.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4) .10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2). • 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.

Tués à l'issue d'une sixième intervention menée sans réveil, pour prélever la trachée greffée et de la muqueuse nasale, 20 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit six chirurgies sous anesthésie générale sur 56 jours, dont une de quatre à cinq heures, avec un prélèvement de 50 mL de sang à chaque anesthésie. Le porteur attend des douleurs cervicales de cinq à six jours, des troubles de la déglutition, un risque d'infection du site opératoire et, pour les animaux porteurs d'un stent, des difficultés respiratoires si le dispositif se déplace. Il décrit le remplacement trachéal chez l'humain comme une impasse thérapeutique et conclut que le recours à l'expérimentation animale est "indispensable" avant tout essai clinique.

Objectifs

En chirurgie des voies aériennes pédiatriques, les maladies nécessitant d’enlever une grande partie de la trachée sont des impasses thérapeutiques. En effet, une résection étendue nécessite un remplacement trachéal dont la technique chirurgicale n’est pas maitrisée à ce jour. De nombreuses techniques de remplacement ont été publiées chez l’adulte et l’enfant, avec des suites opératoires compliquées. Le remplacement trachéal reste exceptionnel. Néanmoins, la problématique clinique demeure. Notre équipe a fait le choix d’un projet de recherche de remplacement trachéal avec un procédé de décellularisation. L’objectif du projet est l’évaluation in vivo de ce remplacement de trachée par une étude comparative de la survie sans événement respiratoire et de l’aspect endoscopique après remplacement trachéal avec et sans stent trachéal.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’y a pas d’étude comparative de l’évolution clinique et endoscopique d’un modèle vivant de gros animal après un remplacement trachéal. Cette étude comparative permettra d’analyser d’une part les événements cliniques et endoscopiques survenant dans les suites à court et moyen termes, avec ou sans stent trachéal, et d’autre part les processus cellulaires, tissulaires et systémiques sous-jacents. Les différences attendues, dans le groupe avec stent par rapport au groupe sans stent, sont une diminution des événements respiratoires obstructifs par fragilisation de la trachée et diminution du calibre de la trachée. Les bénéfices à long terme seront la preuve de concept de la fiabilité du remplacement trachéal par décellularisation et la possibilité d’une étude du remplacement trachéal chez l’homme. De plus, des résultats positifs permettront également d’envisager la technique pour des indications différentes

Procédures

20 porcs auront six interventions chirurgicales sous anesthésie générale. La première intervention dure 60 minutes. La deuxième dure 240 à 300 minutes. Les troisième, quatrième, cinquième interventions durent 30 minutes. La sixième intervention dure 90 minutes et est sans réveil. Un prélèvement sanguin de 50 mL sera réalisé lors de chaque anesthésie générale. Les interventions auront lieu sur une période de 56 jours.

Impact sur les animaux

La première intervention peut être génératrice de stress et de douleur modérée dont la durée prévisible est de 3 à 4 jours. L’infection du site opératoire est une complication potentielle. Le prélèvement du muscle peut entrainer des douleurs modérées à la mobilisation de la tête. Il n’y pas de trouble de déglutition attendu. La perte de poids, sauf cause infectieuse, n’est pas attendue. La deuxième intervention peut être source de difficulté à respirer soit aiguë, soit progressive dans le temps. Il n’y a pas de risque hémorragique attendu. Des douleurs modérées sont attendues au site opératoire cervico-trachéal, d’une durée prévisible de 5-6 jours. Le prélèvement musculaire peut entraîner des douleurs modérées à la mobilisation de la tête. Le geste trachéal peut générer des troubles modérés de la déglutition. Les difficultés majeures d’alimentation ne sont pas attendues. Des douleurs cervicales légères à modérées sont attendues après les interventions 3, 4, et 5, d’une durée prévisible d’un à deux jours. Pour les animaux qui seront porteurs de stent trachéal, une mobilisation du stent peut également être cause de difficulté à respirer.

Devenir

Les 20 animaux seront mis à mort à l’issue de la sixième intervention pour prélèvement du complexe trachée native-matrice trachéale implantée, et pour prélèvement de muqueuse nasale.

Remplacement

Le remplacement n’est pas possible car l’étude porte sur le remplacement trachéal circonférentiel au sein d’un organisme vivant complexe (avec une anatomie proche de celle de l’homme). Il n’y a ni modèle in vitro ni modèle in silico. Par ailleurs, cette étude n’a pas été rapportée par une autre équipe à ce jour. Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour ce projet avant la réalisation d’essais cliniques chez l’homme.

Réduction

Nous avons déjà débuté les études chirurgicales d’implantation sterno-céphalique sur des porcs vivants. Ces chirurgies nous ont permis d’affiner et de perfectionner les techniques chirurgicales au préalable, et d’étudier la sécurité de cette intervention. Le nombre total d’animaux a été calculé́ en respectant les critères pour une analyse statistique non paramétrique par échantillons appariés. Les extrémités du remplacement seront conservées pour études histologiques, immunologiques et biomécaniques. Les prélèvements non utilisés seront cryopréservés ou fixés pour une possibilité d’étude rétrospective sans recourir à de nouvelles expérimentations animales. Enfin lors de la mise à mort, sur le principe de la mutualisation des prélèvements, d’autres tissus du porc pourront également être mis à disposition de nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, de manière globale, en expérimentation animale.

Raffinement

La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi). Le vétérinaire référent du Laboratoire passera une fois par semaine et à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (dyspnée, alimentation, perte de poids, douleur). Les animaux auront un traitement antalgique adapté. Afin d’éviter une surinfection de la zone de greffe, une antibioprophylaxie systématique sera administrée. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, prostration, fièvre) ou de difficulté aiguë à respiratoire sans traitement possible, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Parmi les différents modèles animaux envisageables (rongeurs, lapins, chèvre, mouton, porc), le porc a une trachée dont les caractéristiques anatomiques et biomécaniques se rapprochent le plus de celle de l’homme. De plus, des modèles de porcs sont déjà utilisés dans d’autres études de remplacement trachéal. Enfin, l’immunologie du cochon est bien connue. Cette connaissance établie facilitera notre analyse de la réaction inflammatoire potentielle sur le site de greffe. Animaux matures sexuellement pour limiter la croissance des tissus, plus intense chez les animaux en croissance (juvéniles). L'âge est relativement secondaire en revanche nous visons des animaux dont le poids est stabilisé entre 45 et 60 kg. Cette stabilité (relative) du poids est habituellement atteinte entre 12 et 18 mois.

Un rein prélevé par chirurgie ouverte, transporté par drone, puis regreffé au même animal avant l'ablation du rein restant: 9 porcs subissent cette séquence au cours d'une procédure unique de sept jours, d'un niveau de souffrance modéré, et sont tués au septième jour pour analyse histologique du greffon. Chaque animal est à la fois son propre donneur et son propre receveur, avec une heure de chirurgie pour le prélèvement, trois heures pour la transplantation, un cathéter central, des prises de sang quotidiennes et un hébergement individuel jusqu'à reprise de la diurèse. Le projet porte sur le mode de transport, le drone étant présenté comme une solution prioritaire pour ramener la durée d'ischémie sous dix heures, avec un intérêt économique et sécuritaire déclaré. Le porteur écrit que trois porcs par groupe ne permettent aucune analyse statistique, tout en jugeant cet effectif suffisant pour fonder la sécurité du dispositif avant son autorisation en clinique humaine.

Objectifs

Le plan ministériel (ministère de la santé) pour le prélèvement et la greffe d’organes et de tissus 2022-2026 en coordination avec l’Agence de BioMédecine a pour objectif de diminuer la durée moyenne de transport des organes. Le but est d’atteindre pour les transplants rénaux une durée d’ischémie au cours du transport < 10 heures. L’utilisation de systèmes d’avions pilotés à distance (drones aériens) fait partie des solutions prioritaires car il permet de diminuer significativement la durée de transport des transplants. Il présente aussi un intérêt sécuritaire en diminuant le nombre d’intervenants et travailleurs nocturnes et également un intérêt économique. Le transport de transplants rénaux par drones représente néanmoins un challenge et fait apparaitre de nouvelles problématiques non explorées (Condition non pressurisée et non thermo-régulée, avec exposition des transplants à des température décroissantes et à des vibrations). L’objectif de ce projet est d’évaluer l’utilisation d’un nouveau mode de transport par drones des transplants rénaux. Notre projet vise à réaliser une première en utilisation d’un drone développé pour le transport d’organe avant autorisation en clinique humaine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont d’apporter des données de sécurité de l’utilisation des drones dans le transport des transplants rénaux. Les évaluations biopsiques visent à évaluer l’absence de lésion histologique. La surveillance clinique vise à assurer la reprise de fonction des transplants après transport. Ces données de sécurité permettront la mise en place des premiers protocoles de transport des transplants rénaux en clinique humaine.

Procédures

Ce projet prévoit l’utilisation de 9 porcs sur une procédure unique expérimentale de 7 jours reproduisant un processus complet de transplantation rénale avec prélèvement, transport du transplant, transplantation et suivi. - Sous anesthésie générale, un prélèvement rénal gauche sera réalisée par chirurgie ouverte. (1 heure) - Après transport des transplants rénaux selon 3 distances de références avec une phase de décollage, de vol et d’atterrissage Sous anesthésie générale, transplantation rénale puis néphrectomie droite seront réalisées par la même cicatrice de chirurgie. (3 heures) . - Un suivi des animaux sera réalisé pendant 7 jours avec une surveillance clinique, de la diurèse et par prises de sang quotidiennes sur cathéter central. - Mise à mort des sujets sous procédure d’anesthésie

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux pourraient inclure : • Anesthésie profonde et prolongée des animaux • Effets secondaires systémiques liés à l'anesthésie générale et ou aux médicaments administrés pendant les procédures chirurgicales et pour la gestion de la douleur post-opératoire. • Douleur en lien avec la chirurgie abdominale. • Risques de complications chirurgicales telles que l'infection des plaies ou les saignements. • Hébergement individuel des animaux pour surveiller la diurèse jusqu’à reprise franche de la diurèse.

Devenir

Au 7ème jour, les porcs seront euthanasiés sous procédure complète d’anesthésie générale, pour prélèvement et analyse histologique du greffon explanté.

Remplacement

L'étude de la fonction d’un organe dans sa complexité, ne peut se concevoir que dans un modèle animal pré-clinique (donneur), il n’existe pas de remplacement possible pour ces expérimentations qui répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement. Cependant, de façon à réduire le nombre d’animaux utilisés, les modèles porcins seront à la fois leur donneur et leur receveur pour diminuer le nombre de sujet nécessaire.

Réduction

Il s’agit d’une première étude de sécurité. L’inclusion de 3 porcs par groupe permet d’avoir des éléments de sécurité nécessaires pour passer aux groupes suivants. Bien que le nombre de 3 animaux par groupe ne permettent pas une analyse statistique des résultats, il est suffisant pour cette première étude de sécurité. En cas de lésions trop importantes des transplants, les porcs suivants ne seront pas inclus. De façon à réduire le nombre d’animaux utilisés, les modèles porcins seront à la fois leur donneur et leur receveur pour diminuer le nombre de sujet nécessaire.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au raffinement dans l’hébergement individuel et dans la prise en compte des souffrances de l’animal. A leur arrivée les animaux seront hébergés en groupe durant une période d’acclimatation pré-expérimentale de 7 jours minimum. La température de la pièce sera maintenue à la même température que chez l’éleveur et l’alimentation sera poursuivie telle que chez l’éleveur de façon à établir une continuité et diminue le stress thermique et alimentaire. Une alimentation humidifiée sera apportée aux animaux en post-opératoire pour faciliter la prise alimentaire. Un pansement gastrique par Keal 1g per os sera apporté une fois par jour aux porcs pour diminuer le risque d’ulcère gastrique. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée. Durant les opérations, les porcs seront installés sur des tapis chauffants. Un gilet avec une voie veineuse centrale sera installée sur chacun des animaux pour faciliter l’administration IV des antalgiques, faciliter l’hydratation des sujets et enfin faciliter le prélèvement des biologies sanguines. L’utilisation d’un cathéter central permet d’éviter l’usage itératif d’anesthésies légères nécessaires aux prélèvements veineux périphériques. Enrichissement du milieu : Des Jouets et une diversification seront à disposition pendant toute la phase d’expérimentation, conformément aux moyens disponibles dans l’animalerie. Les animaux seront hébergés collectivement pendant la phase d’adaptation. Après début de la phase expérimentale à proprement parler, les animaux seront hébergés individuellement pour permettre le déroulement des expérimentations dans de bonnes conditions. Un hébergement collectif n’est pas possible durant cette phase du fait de l’utilisation de cages métaboliques associée au suivi de la diurèse et à des gilets de maintien de la voie veineuse centrale. Les porcs seront cependant hébergés au sein d’une même pièce, dans des boxes accolés avec contact olfactif, visuel et auditif. Un enrichissement et contact avec les animaliers sera alors accru pendant cette phase.

Choix des espèces

La race de porc utilisée est Landrace x Piétrain x Large White. Le modèle porcin est le modèle de référence en transplantation rénale car la physiologie rénale est proche de celle humaine. L’anatomie abdominale ainsi que la physiologie du porc de 70 kg sont proches de celles de l’homme adulte et font donc de cette espèce un excellent modèle pré-clinique pour l’analyse des transplants rénaux. Jeunes mâles, 70Kg, similitude anatomique et physiologique avec un homme adulte au niveau abdominal. Modèle de référence pour l’analyse des transplants rénaux.