Mammifères "de rente"

90 brebis vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis renvoyées en élevage. Chaque animal subit cinq anesthésies générales de 45 minutes en 48 heures, séquence répétée deux mois plus tard, avec des jeûnes de 29 puis 18 heures, pour suivre par IRM la rétention d'un gel contraceptif destiné aux femmes. Le porteur présente ce gel comme une "alternative révolutionnaire" affichant "100 % d'efficacité in vitro" et justifie la brebis par la proximité de son col utérin avec celui de la femme. Il affirme que le comportement du gel dans le tractus ne peut être appréhendé in vitro et nécessite une validation chez l'animal vivant.

Objectifs

La présente demande s’intègre dans un projet plus vaste visant à développer un gel contraceptif d’origine naturelle (non hormonal) à destination des femmes, comme alternative aux méthodes hormonales existantes. En effet, celles-ci provoquent des effets secondaires et/ou del'inconfort, tels que prise de poids, diminution de la libido, augmentation du risque de maladies cardiovasculaires et de dépression. Malheureusement, les contraceptifs non hormonaux existants sont souvent peu pratiques. Ce projet propose de développer in vitro, puis de tester in vivo chez la brebis, un gel à déposer au niveau du col de l’utérus, qui en interagissant avec le mucus, formerait un bouchon empéchant le passage des spermatozoïdes. L’objectif ici est de mieux comprendre le comportement du gel contraceptif une fois introduit dans le vagin de la brebis. En effet, le comportement du gel dans le tractus reproducteur de l’animal est étroitement lié à son efficacité. Cette expérimentation cherche à répondre à 2 questions : 1- quel est le temps de rétention du gel dans le tractus reproducteur, et en quelles quantités ? 2- quelle est la localisation exacte du gel au cours du temps ? En effet l’hypothèse est que plus le gel est proche du col de l’utérus (voire dans le col), plus il sera efficace. Pour ce faire, la technique d’IRM sera utilisée. En effet, cette méthode non invasive permet de suivre le même animal au cours du temps, et ainsi de réduire la variabilité individuelle. Elle permet aussi de quantifier le gel, et d’avoir accès à l’intégralité du tractus reproducteur de la brebis, avec des images de haute qualité. De plus, la morphologie du col de l’utérus de la brebis ne permet pas d’y insérer des outils d’imagerie tels qu’échographe, fibre optique. La seule contrainte de cette méthode est qu’elle nécessite d’anesthésier les brebis avant de les passer à l’IRM, ce qui implique plusieurs anesthésies dans une même journée si l’on souhaite suivre l’évolution dans le temps du comportement du gel dans le tractus. Le gel contraceptif est constitué du polymère et d'excipients différents. Il existe donc de nombreuses possibilités de formulations différentes. Il s'agit ici de tester des gels avec des propriétés physiques, mécaniques et adhésives variables, et d'identifier la ou les formulations les plus adaptées.

Bénéfices attendus

Le gel contraceptif développé dans ce projet est présenté comme une alternative révolutionnaire aux méthodes actuellement existantes : hormonales (avec tous les effets secondaires connus), non hormonales (qui présentent elles aussi des inconvénients), et les méthodes dites non-techniques (qui ont une efficacité relative). Ce gel est en effet très efficace (100% d’efficacité in vitro annoncée), sans hormones, peu invasif et très pratique d’utilisation. Il représente donc une solution de choix pour les millions de femmes qui ne peuvent et ne veulent pas utiliser d’hormones. La partie développée ici permettra de mieux comprendre la cinétique du gel une fois appliqué dans le tractus, et ainsi de renforcer son efficacité, ainsi que sa sécurité d’utilisation (s’assurer que le gel est bien résorbé ou rejeté au bout d’un certain temps).

Procédures

5 anesthésies générales (d'une durée de 45 minutes) en 2 semaines, dont 4 sur 48 heures, espacées d'au moins 3 heures. Ceci répété une fois, après 2 mois de repos. Deux périodes de mise à jeun de 29 et 18 heures respectivement, répétées à 2 mois d'intervalle.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront 5 anesthésies générales, entrecoupées de réveils, sur une période de 48 heures. Le temps de récupération peut être plus long au fur et à mesure de l’avancement de l’expérimentation. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse. Les animaux seront à jeun durant 29 heures pour la première journée de mesures. Du foin leur sera distribué le soir de cette première journée. Puis ils seront de nouveau à jeun pendant 18 heures la deuxième journée.

Devenir

Les animaux retournent à l'élevage à l'issu de l'expérimentation.

Remplacement

L’étude de l’efficacité d’un produit destiné à l’usage chez l’Homme doit d’abord se faire sur animaux, lorsque cela est éthiquement admissible. Dans notre cas, l’efficacité du gel testé a été évaluée in vitro. Elle doit maintenant être confirmée in vivo, avant de pouvoir démarrer une phase d’essai chez la femme. Chaque formulation à tester sera au préalable évaluée in vitro pour la rhéologie, puis ex vivo sur des tractus pour les caractéristiques d'adhésion, et pour finir in vivo en version colorée et visualisation à l'endoscope. La concentration optimale de l’agent de contraste sera déterminée in vitro en amont. Le comportement du gel dans le tractus reproducteur, en tenant compte du mouvement de l’animal, des contractions naturelles du tractus, ne peut être appréhendé in vitro, et nécessite une validation in vivo.vo.

Réduction

L’utilisation de l’imagerie de façon répétée permet de limiter la variabilité individuelle, et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Une étude effectuée en 2012 visant à suivre la rétention de crême vaginale dans la brebis par scintigraphie gamma et par IRM chez la femme, a montré qu’un effectif de 6 brebis ou femmes par groupe est suffisant pour mettre en évidence des différences. Les animaux seront leurs propres témoins et suivis durant 4 périodes successives. L’intensité du signal du produit de contraste inclus dans le gel contraceptif sera mesurée par IRM pour ces 4 répétitions par animal. Les données seront analysées par un test non paramétrique. Un logiciel spécialement dédié au calcul d’effectifs pour tests statistiques, en tablant sur une diminution de 25 % du signal entre les périodes d’analyse, un risque alpha de 0.05 et une puissance de 95 %, nous donne le nombre requis d’animaux de 5 par lot. Pour assurer la réussite de l’essai, nous avons choisi la valeur de 6 brebis par lot.

Raffinement

L’IRM est un outil de choix pour investiguer de façon précise et non invasive des questions au niveau de l’organe ou du tractus entier. D’autres techniques ne nécessitant pas d’endormir les animaux ont déjà été testées, tels qu’utilisation d’un gel coloré et observation à l’endoscope, marquage fluorescent du gel et visualisation par endomicroscopie. Cependant, elles ne permettent pas de quantifier précisément le gel, ni de visualiser l’intérieur du col de l’utérus, ou d’avoir une vue d’ensemble du tractus génital. Les animaux seront maintenus en groupe, manipulés dans le calme. La procédure sera réalisée par du personnel expérimenté, ayant une expertise de l'anesthésie chez des modèles ovins. Etant donné la succession des différentes anesthésies sur 48H, les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Pré-examen imagerie/Anesthésie: les animaux arriveront la veille, et seront mis à jeun 16h avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Induction par voie intraveineuse, puis maintien au masque avec inhalation d’un mélange gazeux d’oxygène et de produit anesthésiant pour obtenir une myorelaxation suffisante avant intubation orotrachéale. Postimagerie – Les animaux sont logés en cases collectives sur paille.

Choix des espèces

La brebis est un bon modèle pour notre étude. En effet, malgré que la morphologie du col de l'utérus de la brebis est plus complexe que celui de la femme, ces 2 espèces ont plusieurs points communs : ce sont toutes les deux des espèces à dépôt de semence au niveau du vagin, la sélection des spermatozoïdes se fait en grande partie par le mucus cervical, la longueur du vagin et le diamètre cervical sont proches. De plus, la brebis a déjà été utilisée à plusieurs reprises comme modèle pour tester des dispositifs contraceptifs; une équipe a montré en 2012 que des données récoltées chez la brebis sont comparables à celles obtenues chez la femme. La vache et la jument ne sont pas des modèles pertinents car ce sont des espèces à dépôt de semence intra-utérine pour les bovins, et les individus sont trop lourds et volumineux pour passer à l'IRM. Brebis adultes multipares pouvant être synchronisées.

48 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant deux interventions chirurgicales sous anesthésie et un prélèvement de 30 ml de sang. Une matrice trachéale décellularisée est implantée dans un muscle pour tester sa vascularisation, avec ou sans immunosuppresseur, en vue d'un futur remplacement de trachée chez l'enfant. Le porteur indique que tous seront tués à l'issue de la seconde intervention pour prélever la matrice, tout en évoquant par ailleurs un possible retour à la ferme pour une partie des animaux. Il présente le recours à l'animal comme "indispensable" avant des essais cliniques, le porc ayant une trachée proche de celle de l'homme.

Objectifs

Chez l’enfant, plusieurs pathologies trachéales congénitales en échec de traitement pourraient bénéficier d’un remplacement trachéal. A ce jour, il n’existe pas de stratégie consensuelle. La technique de décellularisation par ingénierie tissulaire est une stratégie prometteuse : l’élimination des cellules, de leur matériel génétique et de leurs antigènes permet d’obtenir une biocompatibilité accrue avec un risque de rejet faible ; d’autre part, le respect des propriétés biochimiques et biomécaniques de la matrice extracellulaire garantit les capacités de biointégration, limite les risques de malacie cartilagineuse et évite la pose d’un stent prolongé. Nous avons fait le choix de la décellularisation et avons développé une technique fiable et reproductible d’obtention d’une matrice trachéale décellularisée. La première phase du remplacement trachéal est une étape préliminaire de maturation. Elle consiste à implanter la matrice dans un muscle afin d’obtenir une vascularisation adéquate pour assurer la survie du greffon. La néovascularisation induite permet la biointégration et la colonisation cellulaire ; en contrepartie, elle expose également la matrice extra-cellulaire a des phénomènes immunitaires de réaction à corps étranger. Cette réponse non spécifique peut induire une biodégradation rapide et/ou fibrose et sténose. Pour cette raison, l’utilisation d’un traitement immunosuppresseur provisoire durant la phase de maturation pourrait être bénéfique, a fortiori chez l’enfant, chez qui les indications de remplacement sont exceptionnellement tumorales. Ce projet a pour objectif principal de comparer, avec et sans traitement immunosuppresseur, la biointégration d’un substitut trachéal lors de la phase de maturation de la matrice. L’objectif secondaire de ce projet est d’évaluer la durée minimale de maturation pour obtenir une néovascularisation efficace.

Bénéfices attendus

En plus des résultats cliniques, mitigés, déjà publiés, l’une des raisons empêchant un passage en clinique des biomatériaux pour un remplacement trachéal est l’absence d’étude rigoureuse préclinique, dans un modèle animal représentatif de l’anatomie humaine. Ce projet est la première étude systématique de biointégration de MTD dans un modèle porcin. Les bénéfices à court terme seront (1) la connaissance des mécanismes immunologiques en jeu dans la biointégration d’un tissu décellularisé, (2) la détermination de la durée adéqutae de préparation de la matrice à l’implantation afin d’obtenir une vascularisation efficace, (3) l’étude de l’efficacité et la pertinence d’un traitement immunosuppresseur dans un modèle porcin. Les bénéfices à long terme de cette étude seront la preuve de concept de la bio-intégration d’une matrice décellularisée et le passage en clinique pour des remplacements trachéaux. De plus, des résultats positifs permettront d’élargir les indications aux sténoses trachéales courtes. L’interposition d’un tissu biocompatible pourrait être une aide chirurgicale pour limiter les tensions des sutures et les sténoses secondaires. Enfin, le recours à un tissu biocompatible pour d’autres indications de chirurgie des voies aériennes pourrait être possible, notamment pour les chirurgies de sténose du larynx.

Procédures

24 porcs auront deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale. La première intervention dure 60 minutes. La deuxième dure 45 minutes. Un prélèvement sanguin de 30 mL sera réalisé lors de chaque anesthésie générale. Les interventions auront lieu sur une période de 15 jours à 60 jours, en fonction des sous-groupes.

Impact sur les animaux

La première intervention peut être génératrice de stress et de douleur modérée dont la durée prévisible est de 3 à 4 jours. L’infection du site opératoire est une complication potentielle. Le prélèvement du muscle sterno-céphalique peut entrainer des douleurs modérées à la mobilisation de la tête. Il n’y pas de trouble de déglutition attendu. La perte de poids, sauf cause infectieuse, n’est pas attendue. Pour les animaux qui auront un traitement par immunosuppresseurs, la susceptibilité aux infections est augmentée durant toute la durée du traitement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la deuxième intervention pour prélèvement de la matrice trachéale implantée, et pour le prélèvement de la trachée native.

Remplacement

Le remplacement n’est pas possible car l’étude porte sur la bio-intégration d’un substitut au sein d’un organisme vivant complexe (avec une anatomie proche de celle de l’homme). Il n’y a ni modèle in vitro ni modèle in silico. Par ailleurs, cette étude n’a pas été rapportée par une autre équipe à ce jour. Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour ce projet avant la réalisation d’essais cliniques chez l’homme.

Réduction

Nous avons déjà débuté les procédures chirurgicales d’implantation sterno-céphalique (Procédure 1) sur des porcs mis à mort dans d’autres expérimentations animales. Ces chirurgies préliminaires nous permettent d’affiner et de perfectionner les techniques chirurgicales au prélable. Cette stratégie nous permet de ne pas créer de sous-groupe d’étude préliminaire. Le nombre total d’animaux a été calculé en respectant les critères pour une analyse statistique non paramétrique par échantillons appariés. Pour des analyses significatives comparatives, le nombre de 4 animaux dans chaque bras (avec ou sans traitement) pour chaque durée de maturation (J15, J30 ou J60) a été défini a priori, soit 24 animaux au total. Le critère d'évaluation principal est l’activité inflammatoire au sein de la MTD. Les paramètres étudiés seront : la nécrose du muscle sterno-céphalique, la dégradation de la MTD, la présence de trous au sein de la MTD, la réduction de calibre, la quantité d’anticorps antiHLA, la quantité d’ADN circulant, l’infilitration cellulaire et sa caractérisation, les taux plasmatiques de cellules inflammatoires et le taux de cytokines. Lors de l’explantation de la MTD maturée, la trachée native réséquée est prélevée pour des études histologiques, immunologiques et biomécaniques. Les prélèvements non utilisés seront cryopréservés ou fixés pour une possibilité d’étude rétrospective sans recourir à de nouvelles expérimentations animales. Enfin lors de la mise à mort, sur le principe de la mutualisation des prélèvements, d’autres tissus du porc pourront également être mis à disposition de nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, de manière globale, en expérimentation animale.

Raffinement

La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi). Le vétérinaire référent du Laboratoire passera une fois par semaine voir les animaux ainsi qu’à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (alimentation, perte de poids, dyspnée, douleur). Les animaux auront un traitement antalgique adapté. Afin d’éviter une surinfection de la zone de greffe, une antibioprophylaxie systématique sera administrée. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, cachexie, prostration, fièvre) ou de dyspnée persistante pendant plus de 24h, les animaux seront mis à mort pour raisons humanitaires. Pour les porcs qui seront mis à mort à 60 jours, un retour à la ferme sera envisagé.

Choix des espèces

Parmi les différents modèles animaux envisageables (rongeurs, lapins, chèvre, mouton, porc), le porc a une trachée dont les caractéristiques anatomiques et biomécaniques se rapprochent le plus de celle de l’homme. De plus, des modèles de porcs bénéficiant de remplacement trachéal par aorte cryopréservée ou par substitut trachéal ont déjà été étudiés et publiés. Enfin, les mécanismes immunologiques porcins ont été bien décrits. Cette connaissance établie facilitera notre analyse de la réaction inflammatoire potentielle sur le site de greffe, avec ou sans traitement immunosuppresseur. Animaux mâtures sexuellement pour limiter la croissance des tissus, plus intense chez chez les animaux en croissance (juvéniles). L'âge est relativement secondaire en revanche nous visons des animaux dont le poids est stabilisé entre 45 et 60 kg. Cette stabilité (relative) du poids est habituellement atteinte entre 12 et 18 mois.

180 animaux non-humains, 90 cochons et 90 moutons, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins réguliers, des anesthésies générales et des interventions chirurgicales pouvant durer plusieurs heures pour l'implantation de dispositifs médicaux, avant une autopsie et une analyse des tissus. Le projet évalue des dispositifs et techniques chirurgicales pour la santé gynécologique et obstétricale des femmes. Le porteur qualifie le recours à l'animal vivant d'"indispensable" et d'"incontournable", en le présentant comme une obligation réglementaire pour valider les dispositifs implantables.

Objectifs

La santé de la Femme regroupe l’ensemble des spécialités et domaines de la médecine s’intéressant à diagnostiquer, soigner et guérir les troubles, désordres, pathologies ainsi que leurs suites, comme les affections gynécologiques et de la sphère génitale (organes génitaux internes et externes et appareil suspenseur), les troubles obstétricaux, les dysendocrinies, l’infertilité, les pathologies de la glande mammaire comme le cancer du sein et ses conséquences, ou à assurer le suivi des cycles hormonaux ou de certains états physiologiques comme la grossesse par exemple. Le développement des techniques et méthodes d’imagerie et de chirurgie interventionnelles, l’essor de la thérapie génique et cellulaire ou la découverte et l’amélioration des connaissances vis-à-vis de nouvelles entités pathologiques comme par exemple l’endométriose dont la lutte est une stratégie nationale depuis 2021, permettent d’envisager le développement de nouvelles techniques chirurgicales et dispositifs médicaux implantables pour améliorer la santé des patientes, et parfois aussi celle du fœtus ou du nourrisson. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. L'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs, méthodes et techniques chirugicales en faveur de la santé de la Femme, pour le diagnostic et le traitement des pathologies gynécologiques et obstétricales par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase pré-clinique de recherche et de développement. La réponse tissulaire et les modifications anatomophysiologiques au cours des cycles ne peuvent être simulés à l’heure actuelle par des méthodes de remplacement. Durant ce projet le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patientes est indispensable. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans sa phase initiale, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patientes, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patientes, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patientes, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections par le recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites post-opératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. La réponse tissulaire, les cycles hormonaux et les modifications anatomo-physiologiques correspondantes en particulier durant la grossesse ne peuvent être simulés à l’heure actuelle par des méthodes de remplacement. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patientes est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patientes représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s'assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de la femme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles. L'atteinte de l’objectif scientifique passe par l'utilisation d'animaux ayant une anatomie et/ou un contexte clinique (création de défect, modèle lésionnel) comparables à ceux observés chez la Femme.

150 cochons et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins, des anesthésies générales et des chirurgies thoraciques avec pose d'implants et examens d'imagerie, avant leur mise à mort pour une nécropsie et un examen des tissus, afin d'évaluer des dispositifs pour les affections pulmonaires et thoraciques. Le porteur présente le recours à l'animal comme une obligation réglementaire et "incontournable". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou numérique n'est adapté et que l'expérimentation sur "organisme entier" est indispensable.

Objectifs

La chirurgie des structures thoraciques (cage thoracique, plèvre, médiastin et organes du thorax) et le traitement des affections pulmonaires et bronchiques (comme les tumeurs et les suites de cancers, les greffes, les sténoses,) se sont considérablement développés au XXe siècle avec le développement de technologies comme la vidéo endoscopie/thoracoscopie thérapeutique, de techniques chirurgicales peu invasives assistées ou non par la robotique, ou le développement de dispositifs médicaux implantables comme les stents. Il est dorénavant possible d’opérer avec une réduction importante du traumatisme tissulaire. Le développement et l’évaluation de nouveaux dispositifs, molécules, techniques pour le diagnostic et le traitement des affections du thorax, des organes thoraciques et des poumons par des méthodes/dispositifs/tissus et molécules, par des techniques de chirurgie mini-invasives, demandent une phase de recherche/développement préalable. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Les différentes itérations de prototypes doivent être confrontées au modèle animal en reproduisant fidèlement le contexte clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire visé pour les futures applications humaines. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés du projet sont : - Une amélioration de la sécurité et/ou de l'efficacité des implants, dispositifs et techniques évalués. - Une amélioration de la durabilité des implants (permettant par exemple d’éviter le rejet de ceux-ci et les réopérations parfois multiples des patients), la réduction de l'invasivité du geste chirurgical et des temps opératoires (permettant par exemple la réduction du traumatisme tissulaire et du risque infectieux secondaires, corollaires de ces interventions) sont d'autres bénéfices attendus du projet. - Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients, une amélioration des capacités diagnostiques de la pathologie visée peut également être obtenue.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites postopératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients represente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et leur durabilité. Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro ou numérique adapté pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être de tous les stades de développement : juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme. Les animaux utilisés pourront être des : juvéniles ou des adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme, de l'enfant à l'adulte de grande taille.

350 miniporcs génétiquement modifiés vont être utilisés, une partie tuée pour des prélèvements terminaux et environ 125 réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats médicaments par voie intraveineuse ou sous-cutanée de façon répétée sur deux mois, avec des prélèvements de fluides et de tissus, pour évaluer la pharmacocinétique et la sécurité de ces molécules avant leur première administration humaine. Le porteur décrit un modèle au système immunitaire "plus proche de l'Homme". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

Un médicament n’est mis sur le marché et rendu disponible aux patients qu’après une longue phase de Recherche et de Développement. Le défi majeur pour la recherche biomédicale est de découvrir de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux tolérés. Actuellement, de nouveaux besoins et enjeux apparaissent concernant des candidats médicaments biothérapeutiques dans la recherche contre les maladies cancéreuses, les maladies rares et les maladies immuno-inflammatoires. Ce projet utilise le modèle miniporc génétiquement modifié présentant un système immunitaire fonctionnel plus proche de l’Homme en exprimant des anticorps humanisés. Ces animaux génétiquement modifiés sont plus tolérants aux médicaments biothérapeutiques. Les anticorps dirigés contre le candidat médicament dans les études précliniques peuvent réduire l’exposition des candidats médicaments, réduire leur efficacité et dans certains cas peuvent induire des effets secondaires. L’utilisation de ce modèle permet d’être plus prédictif quant à la formation dans l’organisme d’anticorps dirigés contre le candidat médicament et donc de générer des données précliniques davantage transposables à l’Homme.

Bénéfices attendus

Grâce à l’utilisation du modèle miniporc génétiquement modifié, ce projet permettra de générer des informations essentielles avant la première administration chez l’Homme et de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et/ou d’arrêter plus précocement le développement de molécules ayant un profil non satisfaisant en termes de sécurité, d’efficacité et/ou de pharmacocinétique au regard de l’indication thérapeutique.

Procédures

Les molécules sont administrées aux animaux par différentes voies (principalement intraveineuse et sous-cutanée) de façon unique ou répétée (en général hebdomadaire ou toutes les 2 à 3 semaines) sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements de fluides et/ou tissus biologiques associés à une contrainte légère ou modérée de quelques minutes (en début et fin d’étude) sont nécessaires pour évaluer les effets des candidats médicaments et/ou de leurs métabolites. Leur fréquence et volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie quand ils sont invasifs (entre 15 et 60 minutes). Des mesures, comme par exemple la température corporelle (avec une puce électronique) et le poids (deux fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude.

Impact sur les animaux

Les effets attendus chez les animaux seront limités à une contrainte modérée. Ces contraintes correspondent à celles de l’administration des molécules pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une modification du comportement de l’animal, une baisse de la consommation alimentaire, une perte de poids ou une modification de la température corporelle. Par ailleurs, les prélèvements et examens nécessaires au cours des études peuvent entraîner des nuisances de courte durée (ex : contention, isolement de l’animal de quelques heures pour le recueil d’urine).

Devenir

Ces études nécessitent souvent des prélèvements terminaux (analyse anatomo-pathologique ou quantification de l’exposition tissulaire des candidats médicaments). C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas ces analyses que certains animaux pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 30-40%.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui intègre revue bibliographique, modélisation in silico, tests in vitro (cellulaires et organoïdes) ainsi que des données recueillies chez les patients, ce qui permet de limiter le recours à l’animal de laboratoire. Cependant, le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant la complexité des interactions (notamment via le système immunitaire) d’un organisme entier et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. De plus, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Enfin, ce projet permet indirectement de réduire le nombre de primates non humains utilisés dans d’autres projets de Sécurité Préclinique grâce à l’utilisation de ce modèle miniporc.

Raffinement

Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique. La contrainte des prélèvements et administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et training avec distribution systématique de récompenses alimentaires (par exemple, pour certains prélèvements sanguins, mis en hamac après training avec renforcement positif). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et de mettre en place des mesures spécifiques (changement de dose, arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support ou analgésie) par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire en application des points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

​​Le choix de cette espèce est défini par ses similitudes immunologiques à l'Homme qui font du miniporc génétiquement modifié l’espèce appropriée pour générer des données précliniques transposables à l’Homme.​ Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes afin d’évaluer de manière satisfaisante les profils PK, PD, et toxicologiques des candidats médicaments.

60 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation du tendon du genou leur est provoquée par injection de collagénase, un produit irritant, puis ils subissent des angiographies et une embolisation, et juste avant leur mise à mort des embolisations supplémentaires sont pratiquées sur d'autres organes comme les reins, la prostate ou l'utérus. Le porteur indique que le modèle est "maîtrisé" et qu'aucune nuisance supplémentaire n'est attendue, et signale que le projet sert aussi à former des internes en radiologie interventionnelle. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative reproduisant des conditions proches des cas cliniques.

Objectifs

Les inflammations chroniques des tendons et des articulations sont fréquentes et difficiles à soigner. C'est un problème de santé publique avec un coût médico-économique important et des arrêts de travail prolongés (douleur épaule, coude, poigner, genou) et arrêt de sport. Dans cette pathologie, des nouvelles artères (néovaisseaux) se forment et entretiennent cette inflammation. Une équipe de chercheurs rapporte que le fait de boucher ces néovaisseaux, c'est à dire de réaliser une embolisation, permet d'améliorer les patients souffrant de ces maladies chroniques. L’agent utilisé pour boucher les vaisseaux est un antibiotique, et n’a pas l’autorisation en France pour être utilisé dans les artères. Cette approche doit être validée sur un modèle animal avant de pouvoir faire des tests chez l'Homme notamment pour prouver qu'il n'existe pas de risque à priver de sang les tendons ou les articulations inflammatoires et d’étudier les différents agents d’embolisation possibles. Dans une étude précédente, notre équipe a mis au point un modèle porcin reproductible d’inflammation du tendon du genou qui associe une inflammation du tendon et le développement de vaisseaux pathologiques. Il a été utilisé pour tester l'embolisation avec des microbilles définitives, montrant l’absence de complication sévère chez l’animal. Cependant l’embolisation avec ces petites billes semble avoir des résultats nettement moins bons sur la douleur que les publications utilisant l’antibiotique comme agent d’embolisation. Dès lors, il est nécessaire d’étudier l'efficacité de cet antibiotique sur notre modèle animal, ainsi que celle de nouveau agents d’embolisation pour orienter la prise en charge future de ces patients. L’objectif de ce projet est donc de proposer notre modèle validé, reproductible et maîtrisé par les radiologues interventionnels, à différentes équipes pour tester la sécurité et l'efficacité de leurs matériaux d'embolisation.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de l’embolisation dans la pathologie tendineuse. Ceci permettra de mieux comprendre les douleurs des patients et ainsi de leur apporter un nouveau traitement antalgique qui permettra de limiter le recours aux médicaments, soins de kinésithérapie, d’accélérer la reprise du travail et la reprise du sport. De plus, ce projet contribuera également à la formation d'internes en radiologie interventionnelle à la réalisation de gestes techniques.

Procédures

Les animaux seront impliqués dans une seule procédure opératoire qui se déroulera en plusieurs étapes : le 1er jour, induction d'une inflammation au niveau du tendon du genou du porc par injection intra-tendineuse d'une produit irritant (collagénase) sous échographie (30 min maximum). Après une semaine, réalisation d'une angiographie (examen d'imagerie d'environ 1 heure) afin de valider la présence de néovaisseaux et embolisation le cas échéant. Après deux semaines, réalisation d'une angiographie pour vérifier la réussite de l’embolisation. Juste avant la mise à mort, d'autres procédures d'embolisations pourront être réalisées sur d'autres organes (reins, prostate, utérus...) avec différents agents embolisants. L'objectif sera d'évaluer la faisabilité en vue de futurs protocoles de recherche sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. Ce sont des méthodes mini-invasives non chirurgicales, possibles par l'accès à la carotide qui sera déjà utilisé au cours de la procédure expérimentale, et qui permet d'amener le cathéter jusqu'aux artères alimentant les différents organes (artère rénale, prostatique...). Ainsi aucune autre technique ne sera utilisée pour réaliser ces gestes supplémentaires. L'ensemble de cette dernière phase n'excèdera pas 2 heures.

Impact sur les animaux

L’étude précédente ayant permis la validation de la dose de collagénase n’a montré aucun signe d’apparition d’inconfort ou de douleur, ni de changement de comportement chez les animaux. Ainsi, le modèle étant désormais maîtrisé, aucune nuisance supplémentaire n'est attendue. Concernant les effets indésirables, devant le risque ischémique lié à l’utilisation des agents embolisants testés, il conviendra de s'assurer de l'absence de complication locale visible au niveau des cuisses de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer le prélèvement des tendons.

Remplacement

Il s’agit d’une étude ayant pour objectif de vérifier l'efficacité et la précision d'une technique interventionnelle. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence significative entre les groupes en cas de comparaison, ou un groupe suffisamment important pour valider un groupe pilote sur un nouvel agent. Dans un souci de Réduction du nombre d’animaux utilisés, nous souhaitons profiter de l’anesthésie générale finale, après l’artériographie et donc juste avant l’euthanasie de l’animal, pour réaliser ces gestes, similaires à ceux réalisés sur les genoux, sur d’autres organes. Cela permettra de valider leur faisabilité technique soit en prévision de projets futurs, soit pour répondre à des questions ponctuelles, sans engendrer de souffrance supplémentaire pour les animaux déjà anesthésiés profondément et mis à mort juste après, et sans nécessité d’écrire un nouveau protocole impliquant un nombre supplémentaire d’individus. Enfin, cette démarche contribuera également à la formation d'internes en radiologie interventionnelle à la réalisation de ces gestes techniques. Aucun étude statistique ne sera prévu sur ces expérimentation (étude de faisabilité).

Raffinement

Nous attacherons une importance majeure au raffinement des conditions d’hébergement et d'enrichissement pendant la période d'acclimatation d'une semaine et tout au long de la procédure. Afin de limiter leur stress, les animaux seront hébergés en groupe. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. Ce modèle ayant été mis au point dans les mêmes conditions, toutes les techniques expérimentales ont été optimisées. Pour la phase d'injection dans le tendon, une anesthésie légère. Les gestes interventionnels (angiographie) seront toujours réalisés sous anesthésie générale afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal, de même que la mise à mort. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un morphinique. La mise en place des cathéters sera réalisée sous échographie, évitant l'ouverture cutanée à l'exception de la ponction à l'aiguille.

Choix des espèces

De manière générale, le porc est un bon modèle d'étude proche de la physiologie humaine, notamment au niveau de la vascularisation, ce qui permet de se former sur l'animal avant l'usage chez l'Homme. Nous profiterons également de la mise en place de ce projet pour réaliser des formations aux radiologues interventionnels sur cette nouvelle technique d’embolisation. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 2-3 mois, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 25 et 35 kg, permettant des groupes homogènes) et pour des raisons de coût d'autre part.