Macaques à longue queue

Des macaques adultes, voire âgés, se voient induire des symptômes de la maladie d'Alzheimer, puis reçoivent à travers le crâne, au moyen d'un casque, une lumière proche infrarouge censée protéger leurs neurones. 15 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une ou deux chirurgies d'environ six heures, 9 prélèvements sanguins, 9 prélèvements de liquide céphalo-rachidien, des tests comportementaux et une perfusion intracardiaque pour les analyses de leurs tissus. Ni la méthode d'induction des symptômes ni la nature des tests comportementaux ne sont précisées, et le porteur affirme qu'il n'attend "pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d'illumination ou l'induction des symptômes". Face aux difficultés d'approvisionnement, il dit avoir déclaré deux espèces de singes pour voir quel primate est "le plus facilement disponible pour effectuer l'étude dans les temps".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative, c’est-à-dire que la MA perturbe et endommage le bon fonctionnement des neurones jusqu’à entraîner la mort de ces cellules qui conduit à une perte progressive de la mémoire. Cette maladie touche de plus en plus de personnes et devient donc un problème de santé publique majeur au sein des pays développés. Dans les cerveaux des personnes atteintes de la MA, ils existent deux marqueurs neuro-pathologiques cérébrales, qui sont : les dépôts extracellulaires de petites protéines appelées amyloïde-β et les dépôts intracellulaires de protéines nommées Tau. Actuellement, il n’existe pas de traitement médicamenteux permettant de guérir de la maladie d’Alzheimer. Les traitements actuels ont une efficacité faible, inconstante et limitée dans le temps. Ils comportent un risque d’effets indésirables graves, augmentant avec la durée du traitement et n’enrayent pas la progression de la maladie. Une thérapeutique innovante par la lumière, la photobiomodulation, pourrait être une solution thérapeutique pour ralentir le développement de la maladie. Les effets de l’illumination proche infrarouge ont notamment été étudiés pour la maladie de Parkinson sur le plan préclinique (modèles primates et rongeurs), et ont donné des résultats très prometteurs de neuroprotection par la lumière. Ces résultats ont permis de démarrer un essai clinique en 2021 sur des patients parkinsoniens afin d’essayer de ralentir le développement de leur pathologie. Les mécanismes d’actions de la photobiomodulation semblent assez génériques (action sur un composé de la cellule, appelé mitochondrie), et pourrait être bénéfique pour d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie d’Alzheimer. Les régions cérébrales ciblées (cortex) étant plus en surface que pour la maladie de Parkinson (substance noire), la photobiomodulation sera administrée via un casque et les photons traverseront la boite crânienne pour atteindre le cortex. Notre projet nécessite l’utilisation de 15 primates non humains (PNH) et sera réalisé dans le plus strict respect de la règle des 3 R.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce nouveau projet sont une évaluation sur un modèle de primate non humain présentant des symptômes de la maladie d’Alzheimer, du bénéfice possible grâce à un traitement par photobiomodulation pour ralentir le développement de la maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une voir 2 interventions chirurgicales d’une durée moyenne de 6 heures - une phase de quarantaine et d’habituation - la photobiomodulation durant le temps déterminé par le groupe pilote - 9 prélèvements sanguins durant les procédures 2/4 et 3 - 9 prélèvements du liquide céphalo-rachidien durant les procédures 2 et 3 - des tests comportementaux - une perfusion intra-cardiaque afin d’effectuer des analyses immunohistochimique et biochimiques.

Impact sur les animaux

Selon notre expérience et la littérature, les traitements ne seront pas douloureux et un stress pourrait s’observer lors des procédures. Afin de réduire ce stress, la première procédure consistera à habituer les animaux aux actes qui seront réalisés par la suite et de s’assurer de leur coopération. En ce qui concerne la douleur, tout point d’appel conduira à une évaluation conjointe par les membres de l’équipe projet, le vétérinaire et les membres du SBEA, de façon à décider du traitement à adapter ; une euthanasie précoce pourra être envisagée si nécessaire. Dans chaque procédure, nous avons détaillé les signes cliniques à considérer et les actions des expérimentateurs selon la situation.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Des études ont déjà été réalisées sur des modèles murins présentant des données très encourageantes et il est impossible de réaliser de telles expériences in vitro ou in silico. Le modèle primate non humain est maintenant indispensable avant de pouvoir passer à un essai clinique chez l’Homme. Une seule espèce de PNH sera utilisé pendant l’étude mais vu les difficultés d’approvisionnements, nous avons décidé de mettre deux espèces afin de voir quel PNH est le plus facilement disponible pour effectuer l’étude dans les temps.

Réduction

le nombre d’animaux utilisé sera réduit au maximum tout en permettant une validité statistique des résultats. Si les tests préalables de mise en place sont probants, le nombre d’animaux prévus pour la phase de test sera réduit. Les animaux pilotes seront donc inclus dans l’étude des effets neuro-protecteurs et considérés comme contrôle.

Raffinement

afin de limiter au maximum le stress infligé aux animaux, ils seront préalablement habitués aux manipulations. Ils bénéficieront également d’une surveillance quotidienne, d’une médication adéquate lors de la chirurgie (anesthésique, anti-douleur et anti-inflammatoire) et tout signe anormal fera l’objet d’un signalement au chef de projet et au vétérinaire, afin que les animaux bénéficient aussitôt de soins adaptés. Une euthanasie précoce pourra être décidée en concertation avec l’équipe de recherche, la Structure Chargée du Bien Etre Animal et le vétérinaire si besoin. Les conditions d’hébergement des animaux respecteront strictement toutes les normes relatives au bien-être animal en vigueur. De plus, un enrichissement du milieu de vie des animaux utilisés pour les procédures de ce projet sera utilisé. D’après la littérature, nous n’attendons pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d’illumination ou l’induction des symptômes.

Choix des espèces

Le modèle primate non-humain (PNH) est le modèle le plus proche de l’humain. Les résultats obtenus permettront un transfert rapide à l’humain s’ils sont positifs. Pour l’étude nous allons bien sûr prendre une seule espèce de PNH mais les conditions sanitaires actuelles et la non validation du CEA d’obtenir des PNH d’origine asiatique induisent une pénurie d’approvisionnement des PNH et donc nous chercherons quel PNH est-il le plus simple à obtenir avec les âges voulus. Par la suite, on continuera exclusivement avec la même espèce. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes, voir âgés, afin que les résultats obtenus ne soient pas biaisés par d’éventuels processus développementaux non impliqués dans la pathologie et pour que nous soyons le plus en adéquation avec la temporalité de la Maladie d’Alzheimer présente chez l’Homme.

60 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés d'une étude à l'autre puis tués pour des analyses ex vivo. Chaque animal peut subir une chirurgie du cerveau de deux à quatre heures, l'implantation d'électrodes, l'administration de vecteurs viraux, jusqu'à dix prélèvements de sang en 24 à 48 heures, des ponctions de liquide céphalorachidien et des séances quotidiennes en chaise de contention, avec injection d'harmaline pour provoquer des troubles moteurs. Le porteur teste de nouvelles électrodes de stimulation cérébrale profonde et des vecteurs de thérapie génique dans un cadre de prestation commerciale. Il justifie le recours au primate en invoquant que l'"éthique spéciste actuelle" interdit ces approches invasives chez l'humain.

Objectifs

La stimulation cérébrale profonde (DBS) est une procédure neurochirurgicale pratiquée chez les personnes souffrant de troubles du mouvement notamment dans la maladie de Parkinson (MP). La stimulation interfère avec les signaux pathologiques dans le cerveau pour restaurer les fonctions motrices normales. Cette thérapie a été reconnue comme sûre et efficace pour l'amélioration des symptômes chez les patients atteints de MP tel que les tremblements, rigidité ou autres fluctuations motrices. Cette méthodologie a été une évolution technique majeure pour le traitement de la MP et l’intervention chirurgicale est maintenant explorée également pour d'autres conditions, comme l'épilepsie et la dépression. Ceci explique le développement permanent de nouvelles sondes DBS capables d'enregistrer l'activité cérébrale dans les structures cibles afin de contribuer au développement de nouvelles thérapies chez les patients atteints d’autres affections neurologiques. D’un autre côté, de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique pourraient également bénéficier aux patients atteints de ces affections. Cette approche utilise des virus modifiés ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. On parle alors de vecteurs viraux ou non viraux (peptides, anticorps...) ou plus génériquement d’inocula. Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces vecteurs tout comme la DBS reste l’approche chirurgicale par stéréotaxie. Si la validation de nouvelles sondes DBS passent par des enregistrements des signaux, la mesure des effets des inocula se fait par des analyses biochimiques sur des prélèvements biologiques puis cellulaires après mise à mort. Les études précliniques nécessitent de valider ces outils (sondes pour la DBS ou inocula) chez le primate non humain (PNH). Le projet a donc pour objectif de valider d’une part de nouveaux vecteurs qu’ils soient porteurs d’une molécule «contrôle» ou de protéines d’intérêt à visée thérapeutique et d’autre part de nouvelles sondes DBS chez le PNH.

Bénéfices attendus

Les animaux sont soumis aux différentes étapes décrites dans la procédure. - Prélèvements sanguins sur animal anesthésié ou vigile (10 min), fréquence max en 24/48 h = 10 prélèvements et volume max sur une semaine entre 5 à 7 ml/kg / semaine - Prélèvements LCR, sur animal anesthésié, 1 ml max sur un mois (10 min) - Imagerie (3 heures) sur animal anesthésié - Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie pour l'implantation, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administration d'inoculum sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). - Traitement prophylaxique par gavage (fréquence variable, max 2 fois par jour) sur animal vigile pour une durée entre une semaine et 10 jours. Ceci afin de conserver un score inférieur à 5 sur l’«Échelle d'évaluation du bien-être PNH» - Tache en chaise avec enregistrements électrophysiologiques et/ou stimulation (séances quotidiennes de 1-2h, sur jour ouvré pendant toute la durée du projet) sur animal vigile en absence ou en présence de fluctuations motrices (induites par l’harmaline, max 1 fois par semaine).

Procédures

Les animaux sont soumis aux différentes étapes décrites dans la procédure. - Prélèvements sanguins sur animal anesthésié ou vigile (10 min), fréquence max en 24/48 h = 10 prélèvements et volume max sur une semaine entre 5 à 7 ml/kg / semaine - Prélèvements LCR, sur animal anesthésié, 1 ml max sur un mois (10 min) - Imagerie (3 heures) sur animal anesthésié - Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie pour l'implantation, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administration d'inoculum sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). - Traitement prophylaxique par gavage (fréquence variable, max 2 fois par jour) sur animal vigile. - Tache comportementale en chaise avec enregistrements électrophysiologiques et/ou stimulation (séances quotidiennes de 1-2h, sur jour ouvré pendant toute la durée du projet) sur animal vigile en absence ou en présence de fluctuations motrices (induites par l’harmaline, max 1 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées aux différentes étapes. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. Pour l’aspect comportemental : stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tache comportementale, administration systémique d’harmaline entrainant les fluctuations motrices. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie, hématome, douleur possible. Pour l’imagerie : réaction imprévue à l’administration de produit de contraste, inconfort liée à l’anesthésie durant le transport. Bien que les vecteurs viraux soient réputés pour leur faible toxicité, une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de les détecter.

Devenir

A la fin du projet les animaux pourront être réutilisés un autre projet et ceci conformément à l’article 16 de la directive européenne 2010/63 EU, et après avis favorable du vétérinaire référent. Cela concerne les cas où les études n’impliquent pas de prélèvement de tissus et de contrôle post-mortem. Ainsi si une étude de sévérité légère ou modérée ne se termine pas sur un prélèvement de tissus, l'animal pourra être ré-utilisé dans une nouvelle étude. En tout état de cause, l'ensemble des animaux à la fin du projet seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo. Des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité pré-clinique de service. Il recourt exclusivement à l’utilisation du primate non-humain (PNH), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs); 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. Dans bien des cas par exemple les immunothérapies testées ne peuvent interagir qu’avec des tissus provenant de PNH, ce qui impose souvent l’utilisation du modèle primate.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques ou le développement de nouveaux dispositifs médicaux (ici électrodes de stimulation/enregistrement) avec un nombre estimé de 3 études par an, comprenant 4 animaux maximum par étude, soit un total de 60 animaux maximum sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 4 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Les inocula auront été testés préalablement in vitro ou chez le petit animal (rongeur) par nos clients pour déterminer les doses à utiliser et s’affranchir d’éventuels effets toxiques nécessitant un apport supplémentaire d’animaux. Dans le cadre d’une étude de validation de dispositif médical (électrode), la chirurgie implantatoire peut ne concerner qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Pour le transport à la plateforme d’imagerie située à 200 m de l’animalerie, une cage dédiée placée sur un chariot protégée des regards extérieurs par une housse est préparée et l’animal sous sédation légère et dont les constantes sont toujours contrôlées, est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillote. Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal, et sont réalisé sur animaux sédatés. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le PNH a été retenu car (i) les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique ; (ii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du PNH est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du porc et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Adultes afin que de pouvoir appréhender un système nerveux central en pleine maturité (2 ans minimum). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.

100 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections de vecteurs de thérapie génique dans le cerveau ou en intraveineuse, suivies de chirurgies sous anesthésie, d'examens IRM, d'électromyogrammes et de multiples prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien. Le porteur indique des risques d'arrêt cardiaque, de fuite de liquide céphalorachidien, d'hématomes et de douleurs postopératoires, et prévoit de tuer tous les animaux pour analyser leurs organes. Il justifie le recours au macaque par la proximité de son cerveau avec celui de l'humain et par le caractère réglementaire de l'étude avant un essai clinique.

Objectifs

Dans ce projet notre objectif sera d’évaluer la biodistribution, la tolérance et l’efficacité de thérapies géniques dans le domaine des maladies neurodégénératives. Ces thérapies consisteront en l’injection de gènes dans différentes régions du cerveau variant en fonction de la pathologie d’intérêt (maladie de charcot, Alzheimer, Parkinson, Huntington, Ataxie, etc).

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’obtenir toutes les données précliniques d’efficacité, de tolérance et de toxicité de l’utilisation d’une thérapie génique fondée sur l’injection intracérébrale ou intraveineuse de vecteurs Adéno- Associés (AAV) sur un modèle animal extrêmement proche de l’être humain afin de pouvoir proposer sur les différentes pathologies d’intérêt, un traitement et sa mise en place, au cours d’un essai clinique chez l’Homme, dans les prochaines années.

Procédures

- Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : injection intracérébrale de vecteurs suivi d’une imagerie par résonance magnétique post-opératoire immédiate (durée globale environ (5h)) ou une injection intraveineuse de 45min max - 6 à 8 prélèvements sanguins maximum respectivement pour les études à court et long terme , 5 à 7 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (durée du geste maximum 30min) respectivement pour les primates participants aux études à court et long terme, sous anesthésie générale et analgésie. - 4 à 6 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h), sous anesthésie générale respectivement pour les primates participants aux études à court et long terme pour l’injection intracérébrale-3 à 5 électromyogrammes (EMG) (environ 10min) sous anesthésie générale respectivement pour les primates participants aux études à court et long terme Dans ce projet, comme décrit précédemment, une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien + IRM + EMG selon les temps d’intérêt de l'étude).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont: - Une chirurgie sous anesthésie générale ou une injection intraveineuse avec un risque anesthésique (dépression respiratoire, arrêt cardiaque), un risque de contamination post opératoire et de douleurs post opératoires (pour l’injection intracérébrale) - Plusieurs prélèvements de sang et de liquide cephalo rachidien (LCR) sous anesthésie générale avec un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques) et la formation possible d’hématomes, l’anémie transitoire d’une dizaine de jours -La réalisation d’un electromyogramme qui nécessite d’être fait sous anesthésie générale pour des raisons de contention et de bonne réalisation sur un animal sauvage - stress lié aux Injections intra-musculaire avec contention en cage pour le suivi (anesthésies, analgésiques, immunomodulateurs, antibiotiques) - potentiellement des douleurs post opératoires pour la chirurgie

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour permettre les études post-mortem des tissus et des organes et vérifier la distribution du vecteur médicament dans les organes afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de cette approche.

Remplacement

Les études in vitro pour valider la cible thérapeutique sont effectuées en amont de ce projet afin de valider l’utilisation de notre cible thérapeutique dans les modèles murins de la pathologie. Enfin, notre stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de nos vecteurs ont été réalisées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude d’efficacité, de toxicité, sur un modèle ayant un système nerveux plus développé que le rongeur et le plus pertinent pour reproduire ce qui se passera chez l’Humain, est le primate non humain. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence francaise du médicament pour toute demande d’autorisation pour la réalisation d’étude clinique (chez l’homme).

Réduction

Il y a 100 animaux maximum sur ce projet, correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité des différentes approches avec des lots d’animaux allant de 2 pour une étude d’évaluation de diffusion et d’expression à 12 pour une étude de toxicité. Le temps de l’étude (suivi longitudinal) peut varier entre 6 semaines et 6 mois post injection. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié. Selon le nombre d’animaux inclus par étude cela peut représenter de 10 à 50 projets

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement, perchoir, échelle, hamac…). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie. L'utilisation d’un analgésique pour les ponctions lombaires et les injections virales, permettra d’éviter au maximum les inconforts. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Si un animal ne présente pas d'amélioration suite à une prise en charge vétérinaire, il sera euthanasié (avec avis vétérinaire) après avoir été anesthésié. Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, elles sont réalisées par du personnel formé et expérimenté́. Enfin, les étapes du suivi sont prévues pour optimiser le nombre d'anesthésies en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandations en termes de Bien-être animal), ponction lombaire, imagerie par résonance magnétique et Electromyogramme (EMG) si besoin en fonction des étapes du suivi) au sein de la même anesthésie générale. Les prélèvements, les examens type EMG ne sont réalisés que lorsqu'ils sont nécessaires au suivi planifié, il se peut que certaines études contractualisées avec nos collaborateurs demandent moins de prise de sang ou ne nécessitent pas la réalisation d'EMG, il y aura alors moins d'actes pratiqués sur les animaux que le schéma maximal décrit ici

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du macaque en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en termes de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur médicament dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres (volume de vecteur à injecter, vitesse d’injection etc) du protocole qui sera réalisé chez l’Homme. L'injection de vecteurs adeno associés chez le macaque est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance pour l’Homme d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́ compte tenu des patients ciblés par nos approches

3 macaques, deux rhésus et un macaque à longue queue, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés ou renvoyés en élevage. Chaque animal subit une IRM sous anesthésie, deux chirurgies d'implantation de matrices d'électrodes de douze heures, puis une mise en chaise de contention cinq jours par semaine pendant quatorze à quarante-huit mois, avec restriction hydrique partielle. Le porteur décrit une perte de poids, un stress répété lié à la contention de la tête et un risque d'infection lié aux implants cérébraux. Il précise que le cerveau peut être prélevé en fin de projet, mais que les animaux jugés inutiles à cette vérification sont gardés vivants pour un autre projet ou, pour les femelles, renvoyés en élevage.

Objectifs

Du fait de l’importante variabilité de nos comportements moteurs, nous produisons souvent des mouvements qui ne correspondent pas précisément à ce que nous avions anticipé. Un exemple frappant est notre incapacité à reproduire des mouvements identiques, même dans des conditions très contrôlées. Cette variabilité irréductible de nos comportements pose un défi fondamental au système nerveux : pour que les individus apprennent et s'épanouissent dans leur environnement, le cerveau doit être doté de la capacité de détecter, d'attribuer et, finalement, de corriger les erreurs qui génèrent des résultats négatifs. Cette fonction est au cœur de bon nombre de nos comportements quotidiens et se trouve au cœur de nos capacités d'apprentissage. Pourtant, sa base neuronale reste largement inconnue : quels mécanismes permettent au cerveau d’évaluer ses propres performances motrices ? Notre hypothèse est qu’une grande partie de la variabilité de nos mouvements et de ses ajustements provient de processus cérébraux en lien avec la planification du mouvement, c'est-à-dire avant même que l’exécution du mouvement n'ait commencé. Ces processus mettraient en jeu la capacité des sujets à auto-évaluer si le mouvement à venir est correctement planifié. Pour aborder cette problématique nous allons entraîner des singes macaques dans des tâches comportementales dans lesquelles les animaux devront planifier puis exécuter un mouvement, avant d’évaluer leur performance motrice. Pour étudier les bases cérébrales de ces comportements, nous utiliserons des techniques d’enregistrements électrophysiologiques permettant de mesurer localement l’activité de populations de neurones du cortex cérébral. Nous utiliserons pour cela des matrices d’électrodes implantées de manière durable dans différentes aires cérébrales des parties postérieures et antérieures du cerveau. Selon la qualité de ces enregistrements chroniques, nous opterons éventuellement pour une approche d’enregistrement complémentaire qui consistera en l’implantation d’une chambre d’enregistrement à travers laquelle des électrodes type laminaire seront introduites quotidiennement afin d’enregistrer l’activité neuronale.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu, à court et moyen terme, est l’élargissement des connaissances sur les réseaux fronto-pariétaux impliqués dans les comportements sensorimoteurs et métacognitifs. Le jeu de données récolté sera d’une précision spatiale et temporelle inédite et couvrira différents états cérébraux. Les objectifs sont de : (i) Caractériser les réseaux fronto-pariétaux fonctionnels. Cela comprend la dynamique des interactions corticales, et cela au travers de différents états cognitifs allant de l’anesthésie, à l’auto-évaluation motrice, en passant par la préparation et l’exécution de mouvements dans des tâches visuomotrices complexes. (ii) Quantifier la contribution des réseaux fronto-pariétaux à la communication neuronale ascendante et descendante. (iii) Caractériser la dynamique des activités neuronales unitaires dans et à travers différentes aires fronto-pariétales. Cela comprend les fréquences et la variabilité d’occurrence des potentiels d’action des neurones supposés excitateurs et inhibiteurs. Ces informations pourront être comparées à celles rapportées pour les aires sensorielles des primates et d'autres espèces de mammifères. (iv) Manipuler les états cérébraux durant des processus sensorimoteurs et métacognitifs via l’utilisation d’une interface cerveau machine. (v) Fournir ces jeux de données à la communauté scientifique pour contraindre/valider/étendre les modèles computationnels existants.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Déplacement au centre IRM pour acquisition d'images, sous anesthésie, 1 fois pour une durée d'environ 4h. - Chirurgies d'implantation de matrices d'électrodes, sous anesthésie, 2 chirurgies pour une durée d'environ 12h chacune. Si nécessaire, deux chirurgies supplémentaires seront réalisées pour l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement. - La prise quotidienne de l'animal en chaise pour entrainement et enregistrements électrophysiologiques, environ 1h30 (jusqu'à 3h), 5 jours par semaine, durant 14 à 48 mois. - La prise de l'animal en chaise pour microstimulations, 20 sessions d'environ 1h30 (jusqu'à 3h). - La prise de l'animal en chaise pour enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie gazeuse ou pharmacologiques, 25 sessions (habituation + enregistrement) d'environ 2h (jusqu'à 3h).

Impact sur les animaux

Ce projet utilisera des macaques qui entreront dans une procédure avec une sévérité classée modérée. La plupart des étapes de la procédure utilisée seront susceptibles de créer une nuisance aux animaux. i) Les premières fois où les animaux seront mis en chaise pour leur venue dans le laboratoire pourront causer du stress lié à la prise de l’animal à l’aide d’une canne et à son déplacement depuis sa cage d’hébergement jusqu’à la chaise primate. ii) La restriction des mouvements de la tête des animaux à l’aide d’un masque de contention ou d’un plot, nécessaire pour l’enregistrement des mouvements oculaires et électrophysiologiques, sera également source de stress lors des premières mises en place du masque. Nous pouvons tout de même prévoir plusieurs semaines de stress liées à la mise en contention dans le masque. iii) La restriction hydrique partielle liée au besoin expérimental pourra engendrer une perte de poids partielle durant toute la durée de l’expérience. Les animaux seront donc pesés au minimum deux fois par semaine et surveillés quotidiennement afin de prévenir toute perte excessive de poids. iv) L’anesthésie et l’intubation de l’animal nécessaires aux procédures d’IRM et de chirurgie d’implantation du plot ou des matrices d’électrodes pourront créer de la douleur post-opératoire à l’animal durant plusieurs jours. v) L’animal pourrait ressentir de la douleur et développer une infection liée à l’implantation des matrices d’électrodes ou (le cas échéant) à la chambre d’enregistrement. vi) Afin de laisser l’animal cicatriser, il devra être isolé durant une semaine du contact physique de ses congénères après l’opération d’implantation des matrices d’électrodes pouvant potentiellement créer un stress supplémentaire. vii) Durant les enregistrements sous anesthésie partielle mais pendant lesquels l’état d’éveil sera maintenu, un masque délivrant le gaz anesthésique sera fixé à la tête de l’animal et cela pourrait augmenter le niveau de stress de l’animal. viii) Bien que la partie du protocole prévoyant des enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie soit de courte durée, elle induira un effet cumulatif lié à la répétition des anesthésies dont les conséquences potentielles sur le bien–être des animaux devront être surveillées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort ou gardés en vie. L’objectif est de prélever le cerveau de l'animal en fin de projet afin de préciser par une analyse post-mortem la localisation et l'état de préservation des zones corticales ayant fait l'objet des enregistrements électrophysiologiques. En particulier, deux scénarios peuvent nécessiter une analyse post-mortem de la localisation et l'état de préservation des zones enregistrées. 1) les données obtenues chez différents animaux sont très dissimilaires, mettent en question la bonne implantation dans les zones ciblées. 2) Une mauvaise qualité des signaux électrophysiologiques, ou une forte détérioration des signaux à travers le période d’enregistrement peut suggérer un dommage important de tissu cortical autour des matrices. Cela sera important à considérer pour l’analyse des données, et pour une future utilisation du même dispositif dans des autres animaux. Si chez certains animaux, après la fin de l'enregistrement des données, on estime qu'il n'est pas nécessaire de procéder à une vérification post-mortem, les animaux seront gardés en vie. Dans ce cas, le connecteur et les câbles pour les matrices seront coupés, laissant les matrices en place. Les connecteurs seront explantés du crâne et la peau sera fermée et suturée. Après une récupération complète de l’état de santé et de bien-être général, les animaux gardés en vie peuvent 1) si possible, être inclus dans un autre projet basé sur un dispositif expérimental similaire, permettant d’éviter l’utilisation des autres animaux naïfs (réduction). Les animaux réutilisés seront déjà habitués au contexte expérimental (interactions quotidiennes avec l’homme, mis en chaise, travail dans le dispositif comportemental). Sinon, 2) en particulier les femelles peuvent retourner dans un établissement d’élevage pour être inclues dans un programme de reproduction.

Remplacement

Le projet implique l’utilisation d’animaux car à ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant de répondre à nos objectifs scientifiques. Aucune simulation informatique ou culture cellulaire ne peut remplacer le modèle animal vivant pour l'étude des substrats neuronaux de comportements visuomoteurs complexes. Les techniques électrophysiologiques utilisées dans le projet, permettant une mesure de l'activité de neurones unitaires, bien qu'utilisées en milieu clinique, restent trop invasives pour être utilisées chez l'homme pour des approches expérimentales.

Réduction

Les procédures chirurgicales prévues comportent un certain risque. En outre, la qualité des enregistrements à long terme est difficile à évaluer, car l’intégration de l’implant dans le cortex peut être variable d’un animal à l’autre. Nous prévoyons d'inclure un maximum de trois animaux dans cette étude. Si nous obtenons suffisamment de données (neurophysiologiques et comportementales) pour une analyse statistique satisfaisante chez deux animaux, nous n'utiliserons pas de troisième animal. L’entrainement dans la tâche comportementale visera à limiter au maximum la variabilité entre animaux pour homogénéiser les observations. L’enregistrement avec plusieurs matrices multi-électrodes permettra de mesurer l’activité de populations neuronales dans plusieurs structures corticales. Le nombre de neurones enregistrés peut varier d’une matrice à l’autre en fonction du succès de la procédure d’implantation. La richesse des enregistrements multi-électrodes offre la possibilité de réaliser de très nombreux types d’analyses portant sur les potentiels d’actions de neurones isolés (modulation de fréquence de décharges ou de synchronisation entre neurones dans différentes périodes de la tâche ou dans différentes structures), sur les populations de neurones (distribution spatiale de l’activité, moyennes de populations), sur les potentiels de champs locaux (LFP) et sur la synchronisation entre LFP et potentiels d’actions. La répétition des séances d’enregistrement sur une durée de 2 à 12 mois a pour objectif d’augmenter le nombre de neurones différents enregistrés dans chaque structure. Cette augmentation permet d’augmenter la puissance statistique de nos analyses, et d'évaluer la stabilité des modulations neuronales et comportementales détectées à travers plusieurs mois. La durée totale des enregistrements pour un animal est étroitement dépendante de la qualité du signal lors des premiers enregistrements et de sa stabilité sur le long terme. De fait, elle ne peut être définie à priori mais dans une situation optimale, elle peut se prolonger sur plusieurs années.

Raffinement

La cage et volière de l’animal sont enrichies de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus et sont en contact visuel et sonore avec les cages de leurs congénères pour favoriser les comportements exploratoires et sociaux de l'animal et aussi le retour à une activité normale en période post-chirurgicale. Après un délai minimal d'une semaine et selon l'état de récupération, l'animal sera sorti en chaise afin de reprendre une routine qui lui est familière. Les méthodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilisées afin de réduire le stress des sujets. L’IRM anatomique pre-chirurgicale permet de mieux planifier l’implantation des matrices chroniques, pour bien atteindre les aires corticales ciblées. L'utilisation du masque de contention au lieu d’un plot de tête fixé sur l’os est moins invasive et sera favorisée si elle permet d’atteindre les objectifs du projet. Les matrices multi-électrodes de nouvelle génération permettent des enregistrements simultanés de neurones dans différentes aires et couches corticales, ce qui implique une réduction d'études et de sujets utilisés, comparé aux recherches effectuées avec des électrodes simples. Le connecteur pour l’implant dans le deuxième hémisphère sera connecté sur la même base de connecteur, déjà fixée sur l’os.

Choix des espèces

Les singes macaque sont les primates non humains les plus couramment utilisés par les laboratoires de recherche étudiant les processus visuomoteurs. Ce choix s’appuie sur la proximité des systèmes visuel (vision diurne binoculaire et trichromatique) et moteur (utilisation du bras pour saisir et manipuler les objets) ainsi que celle de l’anatomie fonctionnelle du cerveau entre les macaques et l’homme. L’utilisation répandue des macaques en neuroscience a permis l’optimisation des procédures d’entraînement ainsi que celle de la gestion de leur alimentation, de leur hébergement et des soins vétérinaires. Les macaques s’adaptent rapidement aux protocoles de conditionnement comportemental et présentent des performances comportementales très similaires à celles observées chez l’homme. Dans ce projet, nous utiliserons indifféremment des macaques rhésus ou fascicularis pour la réalisation de l’étude, en fonction de la disponibilité des animaux. En effet ces deux espèces présentent des habiletés visuomotrices et une organisation cérébrale comparable. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte/adulte. A ce stade du développement, les animaux ne sont plus en croissance et leurs besoins physiologiques sont stabilisés. Cela permet un contrôle plus précis des protocoles expérimentaux, que ce soit en termes de volume des récompenses utilisées pour l'apprentissage par renforcement, de contrôle du régime alimentaire dans la cage ou de localisation des structures cérébrales cibles pour les implants chirurgicaux. Par ailleurs, les animaux étant encore jeunes, ils présentent une meilleure tolérance aux procédures expérimentales et une meilleure récupération suite aux procédures nécessitant une anesthésie.

10 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées modérées malgré leur lourdeur. Une pathologie de type Alzheimer et des déficits cognitifs leur sont induits, et chaque animal subit trois neurochirurgies de six à huit heures pour injection intracérébrale et implantation d'électrodes, des IRM et scanners sous anesthésie, des injections de scopolamine, des ponctions lombaires tous les six mois et des tâches en chaise de contention. Le porteur mentionne des restrictions alimentaires ou hydriques, un risque d'infection lié aux électrodes percutanées, puis une euthanasie pour analyse histologique du cerveau. Il affirme que le cortex préfrontal dorsolatéral "n'existe que chez le primate" et conclut au caractère "indispensable" du modèle primate.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans l’objectif général de développer de nouvelles approches de neurostimulation pour les déficits mnésiques, observés en particulier dans la maladie d'Alzheimer. Malgré leur incidence très élevée, il n’existe actuellement pas de traitement pharmacologique adéquat, et la neurostimulation représente une approche alternative qui a déjà fait l’objet de plusieurs études préliminaires. Cependant, les approches testées chez l’humain actuellement produisent des effets variables et insuffisants, et qui ne sont pas statistiquement significatifs. Ces protocoles sont relativement simples car ils ne ciblent qu’une seule aire cérébrale et ce, de manière continue au cours du temps. Nous faisons l’hypothèse qu’une intervention ciblant plusieurs aires cérébrales et modulée au cours du temps mènera à une amélioration plus robuste des performances mnésiques dans un phénotype similaire à celui de la maladie d’Alzheimer. Pour tester cette hypothèse, nous allons implanter chez le primate non-humain des technologies d’électrodes intracrâniennes similaires à celles utilisées chez l’humain, et que nous avons déjà testées dans des modèles imprimés en 3D et chez le cochon. Ces électrodes seront implantées dans des aires critiques pour la mémoire de travail et la mémoire épisodique, dont certaines sont spécifiques aux primates (cortex préfrontal dorsolatéral). Nous allons induire chez 10 macaques cynomolgus une physiopathologie similaire à la maladie d’Alzheimer, ainsi que des déficits cognitifs temporaires, et étudier l’impact de nouvelles méthodes de neurostimulation (ciblant plusieurs aires et adaptées en temps réel en fonction de l’état cérébral) sur cette physiopathologie et sur les performances cognitives de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : (1) d'élucider les mécanismes physiologiques sous-tendant l'apprentissage et la mémoire chez le primate dans des états sains et pathologiques, notamment dans un nouveau modèle physiopathologique de la maladie d’Alzheimer ; (2) de développer une nouvelle catégorie d'interfaces cerveau-machine bidirectionnelles permettant d'enregistrer l'activité neuronale et de la stimuler en temps réel dans plusieurs aires cérébrales différentes, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les troubles mnésiques et la maladie d'Alzheimer, qui ne connaît aucun traitement à l'heure actuelle. Le développement et l’amélioration de ces technologies de neurostimulation est en effet en plein essor, en raison de leur potentiel thérapeutique pour plusieurs maladies neurologiques, incluant non seulement la maladie d’Alzheimer, mais également la maladie de Parkinson, la dépression, les troubles obsessionnels compulsifs, etc. Les applications cliniques sur la maladie d’Alzheimer se limitent actuellement à la stimulation d’une aire unique, avec des protocoles relativement simples, et mènent à des effets très limités et variables. Ce projet va au-delà des protocoles utilisés cliniquement car il stimule plusieurs aires simultanément afin de restaurer leur activité naturelle, et les protocoles de stimulation dépendent de l’état du cerveau grâce à des algorithmes dits en boucle fermée. Un tel développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tâches comportementales en chaise et en comportement libre avec enregistrements électrophysiologiques et neurostimulation (séances quotidiennes de 1-2h pendant toute la durée du projet), à des imagerie par résonance magnétique sous anesthésie (environ 5 séances de 2-3h maximum), à des tomodensitométries sous anesthésie (2 séances de 30 minutes), à 3 procédures neurochirurgicales de 6-8 heures environ (1 pour l'injection intracérébrale de protéines, et 2 pour l'implantation d'électrodes intracérébrales), à des injections intramusculaires de scopolamine (5-10 séances estimées, avec un effet durant 4h maximum), à des ponctions lombaires (réalisées tous les 6 mois à partir de l'implantation et pendant la durée du projet), et à une euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce projet peut avoir les effets indésirables suivants sur les animaux : (1) stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tâche comportementale, (2) douleurs suite à des procédures neurochirurgicales et à l'injection intramusculaire de substances (scopolamine, anesthésiants), (3) potentielles infections liées à la présence d'un système percutané d'électrodes intracérébrales, (4) nuisances liés à la potentielle restriction alimentaire ou hydrique, (5) nuisances liées à l'imagerie, (6) nuisances liées aux transports entre établissements utilisateurs

Devenir

Les animaux seront eutahanasiés et une analyse histologique du cerveau sera effectuée.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les effets de la neurostimulation intracrânienne sur la mémoire lors d’une tâche cognitive. Ceci ne peut être réalisé in vitro. Par ailleurs, les modèles informatiques actuels ne permettent pas de remplacer l’expérimentation animale car les processus mnésiques ne sont pas suffisamment bien compris. Néanmoins, nos travaux de recherche incluent déjà une partie modélisation afin de guider la sélection de certains paramètres de stimulation. Dans le futur, de tels modèles permettraient de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, l’expérimentation humaine n’est pas encore possible à ce stade car les méthodes utilisées sont invasives, impliquent une craniotomie, et nécessitent donc une preuve de concept pré-clinique. En termes de modèle pré-clinique, notre développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.

Réduction

Chaque animal sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, les mêmes animaux seront réutilisés pour plusieurs interventions (effets de la stimulation dans l'état sain et dans différents états pathologiques, i.e. après injection de scopolamine et dévelopement de la tauopathie). Un nombre de 5 animaux est le minimum pour effectuer des tests statistiques de comparaison entre plusieurs états. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur primates non-humains se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Par ailleurs, ces animaux seront divisés en deux groupes d'âge. Au total, nous planifions donc d'utiliser un maximum de 10 animaux. Enfin, certains des animaux utilisés dans ce projet seront des animaux réutilisés de projets précédents.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes, dans une structure spécialement agréée pour l’hébergement et l’utilisation des primates en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce. Les hébergements seront enrichis par des approches standards (jouets pour animaux, nourriture variée, fonds sonore) ainsi que l’utilisation d’un système d’écran tactile pour primates permettant de délivrer des récompenses alimentaires lors de l’exécution de tâches de pointage ou de mémorisation. L’habituation aux interactions avec l’humain et aux diverses procédures expérimentales se fera progressivement et par renforcement positif, à un rythme adapté à chaque animal et qui s’étendra sur une durée de plusieurs mois. Nous utiliserons des méthodes chirurgicales aseptiques ainsi qu’une anesthésie gazeuse suivant au plus près les standards cliniques. Les procédures chirurgicales seront menées par un neurochirurgien, à l’aide d’un système de neuronavigation fondé sur des imageries non-invasives du cerveau par IRM et de la morphologie crânienne par tomodensitométrie, permettant d’atteindre une précision d’implantation submillimétrique. Nous effectuerons un suivi post-opératoire accru, plusieurs fois par jour, qui sera consigné par le personnel en charge de l’animalerie sur une feuille de suivi post-opératoire suivant une échelle d'évaluation du bien-être adaptée au primate, basée sur des critères tels que la posture, l’activité motrice, les interactions sociales, la nutrition, l’hydratation, etc. Le suivi post-opératoire inclura également des antalgiques pour contrôler la douleur, des antibiotiques pour réduire le risque d’infection, et si nécessaire des corticoïdes afin de contrôler de possibles augmentations de pression intracrânienne. Les cicatrices seront inspectées quotidiennement et désinfectées à la bétadine. Les transports entre différents établissements s’effectueront dans une cage dédiée placée sur un chariot protégé des regards extérieurs par une housse, l’animal étant sédaté, maintenu au chaud sous une couverture, et bordé d’une bouillotte. Les éventuelles restrictions alimentaires ou hydriques seront introduites ou arrêtées de manière progressive, maintenues au niveau minimal efficace, et feront l’objet d’une surveillance et d’une réévaluation régulières. Ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité SBEA. Enfin, les procédures seront arrêtées en cas d'atteinte d'un des points limites.

Choix des espèces

Au niveau scientifique, ce projet vise à étudier l’impact de la neurostimulation sur un réseau cérébral à grande échelle constitué notamment de l’hippocampe, du cortex entorhinal et du cortex préfrontal. Il existe une grande homologie de ce réseau entre le macaque et l’humain, mais cette homologie est nettement réduite avec d’autres espèces de vertébrés tels que les rongeurs, chez lesquels la définition du cortex préfrontal fait même débat. De plus, l’entraînement à des tâches cognitives suffisamment élaborées pour avoir un équivalent chez l’humain requiert l’usage de primates. Au niveau technologique, ce projet vise à développer des technologies de neurostimulation qui pourrait par la suite être appliquées à l’humain, ce qui nécessite un modèle anatomique suffisamment proche. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte (i.e. de plus de 5 ans environ). Le premier groupe contiendra des animaux entre 5 et 15 ans environ (âge adule moyen). Le deuxième groupe utilisera des animaux plus âgés (15-30 ans) dans le but d’observer des déficits de mémoire liés au vieillissement cognitif et de les compenser par la neurostimulation.

12 primates non-humains, six macaques à longue queue et six babouins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Importés pour une "expérimentation terminale", ils subissent des séances d'imagerie répétées sous anesthésie générale et une chirurgie du cortex visuel avec pose d'électrodes, précédées de mises à jeun. Le porteur indique un caractère répétitif de l'anesthésie et des irritations aux oreilles et à la gorge liées à la contention et à l'intubation. Il affirme que le primate non-humain est "la seule espèce pertinente" et qu'aucun modèle computationnel ne peut le remplacer, l'étude étant présentée comme un "raffinement".

Objectifs

L’activité du cerveau et en particulier des neurones dépends de l’apport énergétique (nutriments + oxygène) qui est régulé par le flux sanguin. Connaître précisément la relation entre l’activité des neurones et l’apport sanguin, un phénomène connu comme « couplage neurovasculaire », permettrait ainsi de détecter un mauvais fonctionnement du cerveau qui est présent dans un grand nombre de maladies neurologiques. Aujourd’hui, aucune mesure non-invasive est capable de mesurer le couplage neurovasculaire chez l’homme ou chez l’animal de laboratoire. L’objectif de ce projet de recherche est de comparer une méthode sans intervention chirurgicale et donc non-invasive (par imagerie par résonance magnétique) avec une méthode invasive standard pour la quantification de l’activité neuronale et métabolique chez le primate non-humain anesthésié. Deux grands principes seront étudiés dans ce projet : le couplage neuro-vasculaire et le couplage « métabo-vasculaire », par l’enregistrement simultané de l’activité électrique neuronale à l’aide d’électrodes et de l’activité vasculaire à l’aide de l’imagerie fonctionnelle ultrasonore, et par l’enregistrement simultané de grandeurs métaboliques (comme la quantité locale de lactate, de glucose ou d’oxygène) et de l’activité vasculaire. Si la méthode non-invasive est validée, cela aura un impact majeur dans les projets de recherche qui font appel à l’animal pour ce type de mesure (raffinement et réduction) et pour l’homme, vu que les séquence d’imagerie RMN (résonnance magnetique nucléaire) peuvent facilement s’implémenter en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une compréhension plus fine du couplage neurovasculaire dans deux modèles de primates non-humains (chez le babouin et le macaque) afin de mieux comprendre le lien entre activité et le métabolisme neuronale et activité vasculaire qui apporte l’énergie nécessaire à cette activité. La comparaison entre les mesures non-invasives obtenues grâce à l’imagerie RMN et invasives en plaçant des électrodes permettra de valider la mesure par imagerie et remplacer une méthode invasive par une méthode non-invasive. Ceci constitue un raffinement et impacte directement le bien-être des animaux utilisés en recherche et des patients qui pourront bénéficier de cette nouvelle technologie. Il serait ainsi possible d’obtenir des données sur le dysfonctionnement du lien entre la vascularisation et l’activité neuronale chez les patients atteints de maladies neurologiques et utiliser cette mesure comme un biomarqueur pour suivre l’efficacité d’un traitement. De plus, grâce au réseau du don de tissus, les tissus biologiques éventuellement récupérés pourront être utilisés à la réalisation d’autres objectifs scientifiques, différents de ceux prévus dans cette étude.

Procédures

Les animaux seront soumis à un maximum de 6 séances d’imagerie de 3h max sous anesthésie générale non-invasive et pratiqué en routine chez l’animal d'une durée maximale de 7 heures comprenant une chirurgie réalisée en condition d'asepsie au niveau du cortex visuel primaire ainsi que des enregistrements de l'activité vasculaire (par ultrasons fonctionnels), électriques (par électrophysiologie) et métaboliques (avec des électrodes adaptées à ces enregistrements).

Impact sur les animaux

La procédure d’imagerie est non-invasive et indolore. Cependant, le caractère répétitif de l’anesthésie et la mise à jeun la veille de chaque séance d’imagerie sont prises en compte et des point limites sont établis à cet égard. Le risque d’hypothermie est contrôlé par le soutien thermique (couverture chauffante et plaides) pendant les examens d’imagerie et la chirurgie. L’irritation locale au niveau des oreilles pour fixation de la tête dans le cadre stéréotaxique et de la gorge suite à l’intubation sont minimisés grâce à l’utilisation de la lidocaïne en gel et la xylocaïne en spray respectivement comme détaillé dans la procédure expérimentale. Le temps d’acclimatation et le respect de temps de pause entre séances d’imagerie devraient résulter en une nuisance minime pour les animaux. La pesée hebdomadaire permettra de dépister toute altération du poids causée par les mises à jeun répétées et compenser avec un supplément de nourriture comme indiqué dans les points d’alerte avant d’arriver aux points limites.

Devenir

A la fin de l’étude les primates non-humains seront euthanasiés pour valider la sensibilité et la robustesse d’une mesure non-invasive du métabolisme neuronal versus une mesure invasive dans une optique de remplacement technologique. A l'issue de cette dernière, un don de tissus sera effectué dans une optique de réduction de nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques afin de valoriser l'animal.

Remplacement

Le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour atteindre les objectifs fixés dans ce projet, les couplages « neuro-vasculaire » et « métabo-vasculaire » nécessitant un fonctionnement normal du système cardio-vasculaire, il n’est pas possible d’utiliser des systèmes computationnels ou autres dispositifs alternatifs à l’utilisation d’animaux. Le modèle primate non-humain très utilisé pour sa proximité anatomo-fonctionnelle avec le cerveau humain est la seule espèce pertinente pour ce type d’étude.

Réduction

Un total de 12 (2x n=6) primates sera prévu dans ce projet pour s’assurer de la robustesse des mesures IRM (nombre habituel pour obtenir des valeurs moyennes fiables à ~10% chez le rongeur dans l’expérience du laboratoire). Le suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives (imagerie) permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet significatif. L’utilisation de macaques (le modèle le plus répandu en laboratoire) et babouins (un modèle avec volume et densité neuronale plus proche de l’homme) vise à rajouter de la robustesse et prédictivité des mesures non-invasives chez l’homme

Raffinement

Afin de minimiser le stress et l’angoisse des animaux importés à des fins d’expérimentation terminale, les babouins et les macaques seront importés au moins un mois avant la date de la première séance d’IRM. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation d’examens d’imagerie dans le laboratoire comporte des analgésiques pour minimiser les sensations désagréables lors de l’intubation et l’emplacement dans le cadre d’imagerie. Des point limites ont été définis en lien avec une potentielle réaction à l’anesthésie de certains individus qui est très rarement observé dans notre laboratoire. Les primates non-humains seront hébergés en groupes sociaux dans des cages équipées spécifiques de l’espèce. On limitera la durée de l’hébergement individuel lors des mises à jeun pour les séances d’IRM tout en gardant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres primates. Un enrichissement adapté sera mis en place : structurel (balançoire et visuelle, miroir); alimentaire (fruits, graines dans le fourrage); manipulable (jouets); auditif (musique).

Choix des espèces

Les macaques et les babouins possèdent une architecture cérébrale semblable à celle chez l’humain, avec notamment un cortex plissé présentant de nombreux circonvolutions et sillons cérébraux. De plus, le métabolisme des primates non-humains est plus proche du métabolisme humain que ne l’est le métabolisme du rongeur. De plus, le cortex visuel des primates est particulièrement développé et sa structure est stabilisé, donc l’étude vasculaire, électrophysiologique et métabolique chez le primate anesthésié est une expérimentation appropriée pour la compréhension du fonctionnement du système nerveux central chez l’humain. Les animaux seront à un stade adulte (macaque) ou jeune adulte (babouin) pour uniformiser la taille de la tête et donc la sensibilité lors des mesures par RMN notamment.

10 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois neurochirurgies de six à huit heures pour l'injection de protéines et l'implantation d'électrodes intracérébrales, puis des séances de neurostimulation, des injections de scopolamine et des ponctions lombaires répétées. Le projet induit une pathologie proche de la maladie d'Alzheimer pour tester des méthodes de neurostimulation de la mémoire. Le porteur affirme qu'un modèle primate est "indispensable" car le cortex préfrontal dorsolatéral "n'existe que chez le primate".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans l’objectif général de développer de nouvelles approches de neurostimulation pour les déficits mnésiques, observés en particulier dans la maladie d'Alzheimer. Malgré leur incidence très élevée, il n’existe actuellement pas de traitement pharmacologique adéquat, et la neurostimulation représente une approche alternative qui a déjà fait l’objet de plusieurs études préliminaires. Cependant, les approches testées chez l’humain actuellement produisent des effets variables et insuffisants, et qui ne sont pas statistiquement significatifs. Ces protocoles sont relativement simples car ils ne ciblent qu’une seule aire cérébrale et ce, de manière continue au cours du temps. Nous faisons l’hypothèse qu’une intervention ciblant plusieurs aires cérébrales et modulée au cours du temps mènera à une amélioration plus robuste des performances mnésiques dans un phénotype similaire à celui de la maladie d’Alzheimer. Pour tester cette hypothèse, nous allons implanter chez le primate non-humain des technologies d’électrodes intracrâniennes similaires à celles utilisées chez l’humain, et que nous avons déjà testées dans des modèles imprimés en 3D et chez le cochon. Ces électrodes seront implantées dans des aires critiques pour la mémoire de travail et la mémoire épisodique, dont certaines sont spécifiques aux primates (cortex préfrontal dorsolatéral). Nous allons induire chez 10 macaques cynomolgus une physiopathologie similaire à la maladie d’Alzheimer, ainsi que des déficits cognitifs temporaires, et étudier l’impact de nouvelles méthodes de neurostimulation (ciblant plusieurs aires et adaptées en temps réel en fonction de l’état cérébral) sur cette physiopathologie et sur les performances cognitives de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : (1) d'élucider les mécanismes physiologiques sous-tendant l'apprentissage et la mémoire chez le primate dans des états sains et pathologiques, notamment dans un nouveau modèle physiopathologique de la maladie d’Alzheimer ; (2) de développer une nouvelle catégorie d'interfaces cerveau-machine bidirectionnelles permettant d'enregistrer l'activité neuronale et de la stimuler en temps réel dans plusieurs aires cérébrales différentes, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les troubles mnésiques et la maladie d'Alzheimer, qui ne connaît aucun traitement à l'heure actuelle. Le développement et l’amélioration de ces technologies de neurostimulation est en effet en plein essor, en raison de leur potentiel thérapeutique pour plusieurs maladies neurologiques, incluant non seulement la maladie d’Alzheimer, mais également la maladie de Parkinson, la dépression, les troubles obsessionnels compulsifs, etc. Les applications cliniques sur la maladie d’Alzheimer se limitent actuellement à la stimulation d’une aire unique, avec des protocoles relativement simples, et mènent à des effets très limités et variables. Ce projet va au-delà des protocoles utilisés cliniquement car il stimule plusieurs aires simultanément afin de restaurer leur activité naturelle, et les protocoles de stimulation dépendent de l’état du cerveau grâce à des algorithmes dits en boucle fermée. Un tel développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tâches comportementales en chaise et en comportement libre avec enregistrements électrophysiologiques et neurostimulation (séances quotidiennes de 1-2h pendant toute la durée du projet), à des imagerie par résonance magnétique sous anesthésie (environ 5 séances de 2-3h maximum), à des tomodensitométries sous anesthésie (2 séances de 30 minutes), à 3 procédures neurochirurgicales de 6-8 heures environ (1 pour l'injection intracérébrale de protéines, et 2 pour l'implantation d'électrodes intracérébrales), à des injections intramusculaires de scopolamine (5-10 séances estimées, avec un effet durant 4h maximum), à des ponctions lombaires (réalisées tous les 6 mois à partir de l'implantation et pendant la durée du projet), et à une euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce projet peut avoir les effets indésirables suivants sur les animaux : (1) stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tâche comportementale, (2) douleurs suite à des procédures neurochirurgicales et à l'injection intramusculaire de substances (scopolamine, anesthésiants), (3) potentielles infections liées à la présence d'un système percutané d'électrodes intracérébrales, (4) nuisances liés à la potentielle restriction alimentaire ou hydrique, (5) nuisances liées à l'imagerie, (6) nuisances liées aux transports entre établissements utilisateurs.

Devenir

Les animaux seront eutahanasiés et une analyse histologique du cerveau sera effectuée.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les effets de la neurostimulation intracrânienne sur la mémoire lors d’une tâche cognitive. Ceci ne peut être réalisé in vitro. Par ailleurs, les modèles informatiques actuels ne permettent pas de remplacer l’expérimentation animale car les processus mnésiques ne sont pas suffisamment bien compris. Néanmoins, nos travaux de recherche incluent déjà une partie modélisation afin de guider la sélection de certains paramètres de stimulation. Dans le futur, de tels modèles permettraient de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, l’expérimentation humaine n’est pas encore possible à ce stade car les méthodes utilisées sont invasives, impliquent une craniotomie, et nécessitent donc une preuve de concept pré-clinique. En termes de modèle pré-clinique, notre développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.

Réduction

Chaque animal sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, les mêmes animaux seront réutilisés pour plusieurs interventions (effets de la stimulation dans l'état sain et dans différents états pathologiques, i.e. après injection de scopolamine et dévelopement de la tauopathie). Un nombre de 5 animaux est le minimum pour effectuer des tests statistiques de comparaison entre plusieurs états. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur primates non-humains se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Par ailleurs, ces animaux seront divisés en deux groupes d'âge. Au total, nous planifions donc d'utiliser un maximum de 10 animaux. Enfin, certains des animaux utilisés dans ce projet seront des animaux réutilisés de projets précédents.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes, dans une structure spécialement agréée pour l’hébergement et l’utilisation des primates en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce. Les hébergements seront enrichis par des approches standards (jouets pour animaux, nourriture variée, fonds sonore) ainsi que l’utilisation d’un système d’écran tactile pour primates permettant de délivrer des récompenses alimentaires lors de l’exécution de tâches de pointage ou de mémorisation. L’habituation aux interactions avec l’humain et aux diverses procédures expérimentales se fera progressivement et par renforcement positif, à un rythme adapté à chaque animal et qui s’étendra sur une durée de plusieurs mois. Nous utiliserons des méthodes chirurgicales aseptiques ainsi qu’une anesthésie gazeuse suivant au plus près les standards cliniques. Les procédures chirurgicales seront menées par un neurochirurgien, à l’aide d’un système de neuronavigation fondé sur des imageries non-invasives du cerveau par IRM et de la morphologie crânienne par tomodensitométrie, permettant d’atteindre une précision d’implantation submillimétrique. Nous effectuerons un suivi post-opératoire accru, plusieurs fois par jour, qui sera consigné par le personnel en charge de l’animalerie sur une feuille de suivi post-opératoire suivant une échelle d'évaluation du bien-être adaptée au primate, basée sur des critères tels que la posture, l’activité motrice, les interactions sociales, la nutrition, l’hydratation, etc. Le suivi post-opératoire inclura également des antalgiques pour contrôler la douleur, des antibiotiques pour réduire le risque d’infection, et si nécessaire des corticoïdes afin de contrôler de possibles augmentations de pression intracrânienne. Les cicatrices seront inspectées quotidiennement et désinfectées à la bétadine. Les transports entre différents établissements s’effectueront dans une cage dédiée placée sur un chariot protégé des regards extérieurs par une housse, l’animal étant sédaté, maintenu au chaud sous une couverture, et bordé d’une bouillotte. Les éventuelles restrictions alimentaires ou hydriques seront introduites ou arrêtées de manière progressive, maintenues au niveau minimal efficace, et feront l’objet d’une surveillance et d’une réévaluation régulières. Ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité SBEA. Enfin, les procédures seront arrêtées en cas d'atteinte d'un des points limites.

Choix des espèces

Au niveau scientifique, ce projet vise à étudier l’impact de la neurostimulation sur un réseau cérébral à grande échelle constitué notamment de l’hippocampe, du cortex entorhinal et du cortex préfrontal. Il existe une grande homologie de ce réseau entre le macaque et l’humain, mais cette homologie est nettement réduite avec d’autres espèces de vertébrés tels que les rongeurs, chez lesquels la définition du cortex préfrontal fait même débat. De plus, l’entraînement à des tâches cognitives suffisamment élaborées pour avoir un équivalent chez l’humain requiert l’usage de primates. Au niveau technologique, ce projet vise à développer des technologies de neurostimulation qui pourrait par la suite être appliquées à l’humain, ce qui nécessite un modèle anatomique suffisamment proche. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte (i.e. de plus de 5 ans environ). Le premier groupe contiendra des animaux entre 5 et 15 ans environ (âge adule moyen). Le deuxième groupe utilisera des animaux plus âgés (15-30 ans) dans le but d’observer des déficits de mémoire liés au vieillissement cognitif et de les compenser par la neurostimulation.

170 rats et 6 macaques vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les uns et les autres reçoivent une injection de vecteurs de thérapie génique sous la rétine des deux yeux, puis subissent des séries d'imageries et de tests rétiniens sous anesthésie, répétés jusqu'à quinze fois chez les macaques, ainsi que des prélèvements sanguins. L'objectif déclaré est de tester l'efficacité d'un traitement de la maladie de Stargardt chez les rats et sa toxicité chez les macaques, que le porteur juge indétectable chez les rongeurs. Il présente la rétine comme non reconstituable in vitro et retient le macaque pour son œil proche de celui de l'humain.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie génétique liée à des mutations sur le gène ABCA4. Elle a une prévalence de 1 pour 8000 à 10000 personnes, et se traduit par une dégénérescence rétinienne avec une cécite diurne, qui impacte à la fois les hommes et les femmes à partir de l’adolescence. La protéine ABCA4 est un transporteur essentiel pour le métabolisme des photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. En absence d’ABCA4, on observe une accumulation de déchets métaboliques dans les photorécepteurs, qui finissent par dégénérer. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace pour cette maladie. La thérapie génique, qui consisterait à venir ramener une copie fonctionnelle du gène ABCA4 dans les cellules rétiennes, est une approche prometteuse. Mais une limite de cette approche est que le gène ABCA4 est trop grand pour être intégré dans les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV), vecteurs de choix pour transférer un gène dans la rétine. Une approche alternative consiste à délivrer deux vecteurs rAAVs, chacun porteur d’une moitié du gène ABCA4, associé à des structures spécifiques appelées ‘intéines’. Les deux moitiés de la protéine ABCA4 sont produites dans les cellules transduites, et une ligation s’effectue grâce aux intéines pour reconstruire une protéine ABCA4 entière. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité et la potentielle toxicité d’un traitement de thérapie génique basé sur l’utilisation de vecteurs recombinants «AAV-ABCA4-intéine» pour la maladie de Stargardt. L’évaluation de l’efficacité de ces vecteurs sera réalisée après injection sous-rétinienne chez le rat ABCA4-/-, modèle de la maladie de Stargardt dans lequel le gène ABCA4 est non fonctionnel. L’objectif sera de réduire le taux de déchets métaboliques dans la rétine, après expression de la protéine complète d’ABCA4, tout en vérifiant qu’une structure correcte de la rétine est maintenue. En parallèle de cette étude d’efficacité chez ce modèle de rat, nous évaluerons le risque de toxicité des «AAV-ABCA4-intéine» chez le macaque sain. En effet, les intéines étant des éléments protéiques exogènes, étrangers au système immunitaire, elles pourraient induire une toxicité immunitaire. Une telle toxicité ne pouvant pas être mise en évidence chez les rongeurs (connus pour tolérer un certain nombre de protéines exogènes, après transfert avec un vecteur AAV), il est donc nécessaire de passer au modèle macaque pour répondre à cette question.

Bénéfices attendus

Le but de cette étude est d’évaluer l’effet thérapeutique des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine» après injection sous rétinienne chez des rats pour lesquels le gène ABCA4 n’est pas fonctionnel et de valider l’absence de toxicité de cette approche thérapeutique chez le macaque. L’évaluation in vivo des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. De plus, si cette approche est validée pour le gène ABCA4, elle pourra potentiellement être transposée pour soigner d’autres maladies génétiques ayant un gène trop grand pour être inséré dans un seul vecteur AAV.

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » dans les 2 yeux : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 2h maximum pour les macaques. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 4 fois le premier mois puis maximum deux fois par mois, soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats et 1h pour les macaques. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 2 fois le premier mois puis maximum une fois par mois, soit un maximum de 8 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 1h30 pour les macaques. (iv) Injection intramusculaire d'un traitement immunosuppresseur: Geste réalisé sur animaux vigiles (sous contention dans leur cage), pour les macaques une fois avant l'injection du vecteur, puis une fois par semaine pendant les 5 semaines suivant l'injection du vecteur. (v) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois avant l’injection des vecteurs puis une fois par mois post-injection, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Pour les macaques lors des mêmes anesthésies que les imageries rétiniennes soit un maximum de 10 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée du geste 10 minutes maximum pour les deux espèces.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide après les chirurgies car les animaux seront sous anesthésie gazeuse.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. D’autre part, la pathologie de Stargardt est induite par une toxicité liée au métabolisme de la vitamine A présent dans l’œil à la naissance et supplémenté via la circulation choroidale. Cet effet systémique de la vitamine A ne peut pas être reproduit in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Ce nombre basé sur celui de nos précédentes études, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles, que ce soit avec le modèle de rat ABCA4-/- ou le macaque sain. Pour les rats ABCA4-/-, nous nous laissons la possibilité d’inclure entre 1 et 3 animaux supplémentaires par groupe, en cas d’échec des injections sous-rétiniennes. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses quantitatives et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes non injectés ou injectés avec un tampon, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes. Le suivi longitudinal non invasif par imagerie de la rétine permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour les analyses chez le macaque le nombre d'animaux utilisés est réduit à son strict minimum (n= 2 animaux par groupe, avec injections bilatérales). Malgré tout, nous savons que ce nombre permettra d'apporter les réponses aux questions posées dans cette étude. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression du gène ABCA4, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre ABCA4 et une analyse statistique sur les amplitudes des résultats d’électrorétinogrammes (analyse de la réponse électrique de la rétine). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats, et dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés pour les macaques. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts et un suivi des animaux à l’aide de grilles de score, d’un arbre décisionnel nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés voire de décider d'une mise à mort prématurés.

Choix des espèces

Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large pour permettre une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt. Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. Mais les études menées chez les rongeurs ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’œil comparable à celle de l’homme, comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système visuel, une dimension et une structure du globe oculaire mais également de la rétine, avec la présence d’une macula (absente chez les rongeurs) ainsi qu’un système immunitaire comparable à ceux de l’homme.

50 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un vecteur de thérapie génique, parfois par une chirurgie cérébrale de cinq heures, puis subit des séances répétées d'imagerie sous anesthésie avant l'euthanasie pour analyse des tissus. L'objectif est d'obtenir une "preuve de concept" avant un essai clinique contre la maladie de Parkinson. Le porteur justifie le recours au macaque par la taille de son cerveau et sa proximité immunitaire avec l'humain, et affirme que ni les cultures ni le rongeur ne sont "prédictifs".

Objectifs

La maladie de Parkinson, fait partie d’un groupe de maladies du cerveau dont la signature est l’accumulation anormale d’une protéine l’alpha-synucléine (α-syn). A l’état normal, α-syn régule le trafic et la libération des neurotransmetteurs qui sont essentiels pour la communication entre neurones. Son accumulation excessive et en forme insoluble, contribue à l’apparition d’agrégats multi-protéiques qui encombrent les neurones et empêchent leur bon fonctionnement. Une stratégie thérapeutique contre cette accumulation et agrégation d’α-syn est de réduire sa quantité dans les tissus ou des molécules intermédiaires (ARN messager, ou ARNm) nécessaires à sa production. Des essais cliniques sont déjà en cours sur des patients atteints de la maladie de Parkinson pour évaluer l’efficacité de cette stratégie. Cependant, ces approches laissent la protéine et/ou ARNm s’accumuler jusqu’à qu’ils rencontrent une molécule qui les élimine. Ce processus engorge à terme la machinerie cellulaire et il serait plus efficace de réduire l’expression du gène directement, c’est-à-dire d’agir en amont de la production d’ARNm et de protéines. Grâce à une technologie d’édition du génome qui est inductible et réversible, nous proposons de tester une nouvelle approche pour réduire partiellement la quantité d’α-syn produite de novo. Des résultats obtenus chez le rongeur montrent que l’approche est efficace et bien tolérée. Il s’agit maintenant d’étoffer ces données et de mettre à l’échelle le traitement dans une espèce plus proche de l’humain en termes de taille et organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau, et par rapport au système immunitaire. Les expériences proposées dans un modèle primate non-humain permettront ainsi d’établir si la réduction partielle de l’expression du gène est efficace et bien tolérée. Pour ceci, il faut réaliser la mise à l’échelle du traitement chez le gros animal et étudier différentes voies d’administration, en comparant l’effet de la thérapie génique après injection du vecteur thérapeutique directement dans le cerveau, dans le compartiment de liquide céphalorachidien, ou dans le compartiment sanguin. Toutes les voies d’administration citées sont utilisées chez l’humain et sont donc pertinentes pour le traitement des patients atteints de la maladie de Parkinson. Dans un souci de raffinement, la voie moins invasive donnant une efficacité satisfaisante chez le primate non humain sera privilégiée pour la translation de cette thérapie en clinique.

Bénéfices attendus

Les données déjà obtenues dans des modèles rongeurs de la maladie de Parkinson montrent bien que la réduction de la quantité de protéines ou d’ARNm de l’α-syn a un effet bénéfique. Ce projet vise à établir pour la première fois chez le primate non-humain l’effet d’une thérapie qui réduit partiellement l’expression du gène de l’α-syn en vue de son utilisation chez le patient atteint de la maladie de Parkinson. Notre approche devrait éviter d’encombrer et perturber la machinerie cellulaire, et limiter le risque d’engorgement empêchant l’élimination des produits accumulés et causant une inflammation chronique autour des neurones, où ils s’accumulent. Les données acquises pendant le projet permettront d’établir les meilleurs paramètres d’administration chez le patient, ce qui constitue une preuve de concept essentielle avant de démarrer un essai clinique.

Procédures

Le protocole expérimental comporte 4-5 séances de prélèvements sous anesthésie (~30 min) avant et après administration de la thérapie. L’imagerie IRM non-invasive, sera utilisée pour observer l’anatomie du cerveau et la présence d’inflammation (4-5 fois 1-2H). De même, 4-5 séances d’imagerie TEP (4H max) seront délivrées en respectant 3 semaines d’écart entre les examens. Une seule délivrance de thérapie est prévue par animal et sa durée sera de 1H à 6H selon la voie. L’euthanasie en fin de protocole sera nécessaire pour prélever les organes et tissus et les analyser, afin de comparer les résultats aux mesures fonctionnelles et anatomiques acquises par imagerie IRM et TEP, et ainsi valider les résultats d’innocuité et efficacité. Toutes ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale en prenant en compte l’inconfort, la douleur lors des chirurgies et le suivi de l’état général des animaux comme le poids, la mobilité et la sociabilité avec les congénères.

Impact sur les animaux

Les nuisances possibles suite à la délivrance du traitement par chirurgie sont une infection au niveau de l’incision de la peau (5-7 jours maximum avec prise en charge par un traitement antibiotique), une douleur au niveau de l’incision (2-3 jours post-incision avec prise en charge par un traitement analgésique), perte de poids (2 jours post-chirurgie avec prise en charge par un soutien alimentaire). Toute modification du comportement moteur ou social des animaux hébergés en groupe social sera noté et notifié au vétérinaire.

Devenir

Suite à des données prometteuses obtenues chez le rongeur, et dans l’optique d’obtenir une preuve de concept de l’efficacité et la sureté d’une stratégie de thérapie génique pour la maladie de Parkinson chez une espèce fonctionnellement et immunitairement proche de l’Homme, il est nécessaire d’analyser les tissus après euthanasie pour obtenir des mesures concrètes et reproductibles. En effet, le cadre règlementaire pour transposer une thérapie en clinique chez l’humain impose une vérification directe de la distribution dans l’organisme du vecteur viral et une évaluation de sa capacité à induire une réponse immunitaire. Ces données sont inaccessibles chez le patient humain et le recours à l’animal reste nécessaire. Ainsi, la présence du vecteur viral et de la protéine surexprimée seront mesurées et cartographiées dans le système nerveux central et les organes périphériques à l’aide de techniques biochimiques ou histopathologiques.

Remplacement

Le recours à l’animal est nécessaire, aucun milieu de culture, organoïde ou système synthétique, ne permettant aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale du cerveau au point de prédire la biodistribution d’un agent thérapeutique, ou de comparer cette distribution en fonction des voies d’administration utilisées. Le rongeur, vu la petite taille de son cerveau, n’est pas pertinent pour informer correctement le design clinique de l’administration de cette approche, c’est-à-dire le nombre d’injections et la concentration de l’agent thérapeutique à utiliser pour couvrir une région du cerveau. La taille et la structure du cerveau du primate non-humain – en rapport avec la résolution intrinsèque des équipements d’imagerie existants – permettent aussi des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées chez les patients et impossibles chez le rongeur par exemple. Par ailleurs, la réaction du système immunitaire suite à la surexpression d’une protéine exogène doit aussi être évaluée dans un modèle animal proche de l’Homme pour augmenter sa valeur prédictive. Il est possible de dépister ces effets grâce à des examens d’imagerie et de confirmer ces résultats par analyse immunohistochimique des marqueurs d’inflammation post-mortem. Le protocole expérimental pourra être révisé pour éviter une réaction immunitaire, en modulant des paramètres d’administration comme la concentration et le volume de l’agent thérapeutique, sa répartition par site d’injection et l’administration d’un traitement anti-inflammatoire. Tous ces éléments pourront être utilisés pour mettre au point les protocoles de délivrance et de suivi chez le patient.

Réduction

Une veille de la littérature démontre que ces expériences n’ont pas été déjà réalisées et que le nombre d’animaux choisi, en tenant compte de l’espèce, est pertinent puisqu’il a déjà permis de mettre en évidence des effets thérapeutiques dans d’autres études. De plus, le laboratoire dispose d’une solide expérience dans le design d’expériences d’évaluation thérapeutique chez le primate non-humain et du nombre d’individus nécessaires par groupe expérimental pour conclure sur des effets pertinents et prédictifs chez l’humain. Un suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives comme l’imagerie permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet thérapeutique significatif, en évitant l’euthanasie pour une confirmation histologique à différents temps.

Raffinement

Une seule séance par individu est prévue pour délivrer les vecteurs viraux. La durée et le caractère invasif de la procédure de délivrance seront variables entre les groupes expérimentaux, selon qu’il s’agira d’une simple injection (~1h) ou une chirurgie pour délivrance dans le cerveau (~5h). Un suivi d’observation journalière sera mis en place les deux premières semaines après administration pour vérifier l’absence de réaction aigue (réaction cutanée locale, gonflement, rougeur, infection). Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie locale et systémique le jour de l’intervention et, dans le cas de la chirurgie, dans les deux jours qui suivront. D’après l’expérience du laboratoire, grâce à ces protocoles, les chirurgies ne modifient pas le comportement de l’animal ni sa prise de nourriture, même dans les 48 heures post-intervention. De plus, un suivi du poids sera réalisé toutes les semaines durant toute la durée de l’expérience. Le comportement sera évalué une fois par semaine pendant toute la durée du protocole à l’aide d’une grille prenant en compte différents critères, dont la présence ou absence d’un penchement de la tête, la difficulté de déplacement à cause d’un membre inférieur ou supérieur, les rotations, la prostration, l’apparence du pelage, la prise de nourriture fournie par l’expérimentateur (motricité fine et apathie).

Choix des espèces

Des études préalables chez le rongeur montrent que la réduction de l’expression de la protéine aSyn est suffisante pour modifier ou empêcher le développement de la maladie de Parkinson. Notre projet vise à réduire partiellement l’α-syn au niveau de l’ADN. Le développement clinique de l’approche demande d’étudier la biodistribution et la sureté de cette thérapie dans un modèle bien connu et proche de l’homme en termes d’organisation anatomo-fonctionnel cérébrale et d’immunologie. Ni les modèles in vitro ni les modèles rongeurs ne sont prédictifs du fait de la petite taille du cerveau et des différences au niveau du système immunitaire, et c’est pourquoi nous avons fait appel au modèle macaque. En effet, des études comparatives entre rats, primates et humains montrent que le nombre de cellules dopaminergiques dans la substance noire est de 12.7x10e3, 203x10e3 et 382x10e3 respectivement ce qui illustre la pertinence de l’espèce de choix. Animaux adultes dans la perspective de l’application clinique chez des patients atteints de la maladie de Parkinson et dans le but de s'éloigner d'une plasticité trop importante observée chez l'enfant et le jeune adulte et qui pourrait entrainer la mise en jeu de mécanismes adaptatifs de compensation.