Macaques à longue queue

14 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'environ quatre heures couplée à une IRM, huit prélèvements sanguins, sept ponctions lombaires, six IRM et quatre électromyogrammes, pour comparer deux méthodes d'injection intracérébrale d'un vecteur de thérapie génique visant la maladie de Huntington. Le porteur décrit les nuisances possibles, douleur crânienne, gêne à la cicatrice, hématomes gênant la mobilité et appréhension envers les expérimentateurs après chaque intervention. Il présente l'usage du primate comme "primordial" pour valider la procédure avant l'humain, au motif que son cerveau se rapproche du cerveau humain.

Objectifs

Certains virus (les AAV : Adeno-Associated virus = Virus associés aux Adénovirus) sont très efficaces pour transporter et exprimer des gènes d’intérêts dans des parties précises du système nerveux central, en particulier dans le cerveau. L’utilisation de ces virus non pathogènes et déja testés dans le cadre de traitements thérapeutiques pour d'autres maladies neurodégénératives constitue une approche de choix pour la maladie de Huntington. Le but de cette étude est multiple. Dans un premier temps elle permettra de tester la possibilité d’une injection au cours d’une séance d’imagerie par résonance Magnétique (IRM) permettant de pouvoir suivre en direct l’évolution, la diffusion de notre injection. Grace à cette étude nous pourrons également comparer la précision de nos injections au niveau de nos sites d’injection, en utilisant deux méthodes d’administration (injection avec produit de contraste comparé à injection avec système de guidage informatique). Enfin cette étude nous permettra d’évaluer la toxicité de l’utilisation du produit de contraste et de comparer la diffusion de ce produit avec la diffusion de notre vecteur médicament. Toutes ces informations nous permettront d’évaluer : •la diffusion de notre médicament dans l’organisme •les zones d’expressions de notre médicament dans l’organisme.

Bénéfices attendus

Les benefices attendus pour ce projet sont : - La détermination de la méthode d’injection optimale - La détermination du volume d’injection optimal - Les informations de diffusion du médicament dans l’organisme - La possibilité de trouver des indicateurs biologiques de la maladie. Le but global de l'étude étant de soutenir la demande d'un essai clinique (chez l’homme) pour les patients souffrant de la maladie de Huntington.

Procédures

Dans ce projet tous les gestes techniques sont réalisés sous anesthésie générale et sous analgésie. Une même anesthésie permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + Ponction lombaire + Electromyographie (EMG) ou Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) selon les temps d’intérets de l’étude). - Une procédure chirurgicale (environ 4h) couplé à une IRM - 8 prélèvements sanguins, 7 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (prise de sang (5 minutes), prélèvement de LCR (10 minutes), - 6 examens Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 1h30) - 4 Electromyogramme (EMG) (maximum 30min).

Impact sur les animaux

les nuisances possibles pour l'animal sont : - une douleur possible au niveau de la zone crânienne suite à l’intervention chirurgicale, - une gêne au niveau de la cicatrice due à une douleur ou à des démangeaisons lors de la cicatrisation, - une gêne au déplacement suite aux prélèvements de sang et de LCR qui peuvent de temps en temps induire des hématomes pouvant gêner temporairement la mobilité des primates, - une légère douleur liée au prélèvement de LCR, - une gêne au déplacement lors de la remise en cage suite à l’anesthésie (déséquilibre, faible tonus musculaire), -une gene musculaire possible suite à la stimulation électrique pour la réalisation des EMG, - une légère hypothermie lors de la remise en cage (l’animal étant constamment réchauffé pendant l’intervention, le fait de le remettre en cage stoppe cet apport de chaleur complémentaire), - une difficulté d’alimentation post opératoire dû à de possible reflux gastriques, - une appréhension ou méfiance des animaux vis-à-vis des expérimentateurs suite à chaque intervention.

Devenir

A la fin du projet soit 6 mois apres l'injection, les animaux seront euthanasiés pour permettre les études histologiques et de biodistribution composant l'etude et permettant de déterminer la méthode d’injection optimale de notre traitement de thérapie génique.

Remplacement

Toutes les études possibles sans utilisation d’animaux ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des vecteurs médicaments. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme fait l'obligation d'une étude sur son efficacité, sa toxicité et des réactions du corps sur un autre modèle animal que le rongeur, de plus grande taille (ici le primate) pour affiner avant la transposition chez l’Homme. Notre projet a pour but de valider une procédure opératoire en vue d’une application prochaine à l’Homme. L’utilisation du primate est donc primordiale pour valider celle-ci sur un modèle gros animal présentant des caractéristiques structurelles du cerveau proche des caractéristiques humaines.

Réduction

14 animaux au total: 6 animaux pour l’étude de faisabilité (2 doses) 8 animaux pour l’étude de toxicité (2 doses): 3 animaux par dose de médicament-vecteur (2 doses différentes) et 2 animaux controles, c’est-à-dire injecté avec une substance ne contenant pas de médicament-vecteur (2 volumes différents). C’est le minimum pour une étude statistique permettant de repondre à l'objectif du projet. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, Les animaux sont hébergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie, l'utilisation de buprénorphine pour les ponctions lombaires pour éviter tout inconfort et enfin des antibiotiques lors de la chirurgie. L'administration intracérébrale d'AAV (Adéno Associated Virus=Virus associé aux Adénovirus) est parfaitement tolérée. Les prises de sang et ponctions lombaires (avec les mêmes volumes et fréquence que décrite dans ce projet) sont menées en routine sur tous les animaux suivis par l'équipe et ne génèrent pas d'effet néfaste sur les animaux. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Si un animal ne présentait pas d'amélioration dans le suivi, il sera euthanasié avec avis vétérinaire.Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement)les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté notamment la chirurgie d’administration intracérébrale réalisée par un neurochirurgien expert de la technique. Enfin, le nombre d'anesthésie est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la même anesthésie.

Choix des espèces

La capacité des vecteurs médicaments à pénétrer dans un organe donné et y faire exprimer un gène thérapeutique permettant de soigner les maladies est dépendante de l'espèce. Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisé et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Les organes du primate non humain en particulier le cerveau, se rapprochent le plus de celui chez l’homme en termes de structure anatomique. L’administration du médicament vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole qui sera réalisé chez l’homme (nombre de sites, volumes, débit, nombre de particules). L'injection de médicament-vecteur chez le primate est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 2 ans et 15 ans selon la disponibilité en élevage, nous avons besoin d'individus avec un cerveau complètement développé.

Six macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une ouverture de la barrière hématoencéphalique et l'injection d'un vecteur viral sous anesthésie, quatre prélèvements de sang et quatre de liquide céphalorachidien et deux IRM, le porteur signalant un risque d'œdème cérébral et de fuite de liquide provoquant maux de tête et signes neurologiques. Le projet relève en partie d'une prestation de service pour des entreprises, en vue d'essais cliniques humains. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire n'existe et que le primate est requis par l'agence du médicament pour la toxicologie réglementaire.

Objectifs

Notre equipe est impliquée dans le developpement d’approches de thérapies géniques innovantes dans le domaine des maladies neurodégénératives avec à la fois de la recherche et développement mais aussi de la prestation de service pour des entreprises. Ici nous voulons tester la capacités des vecteurs à permettre une expression significative dans les différentes zones du cerveau suite à un nouveau mode d’ouverture (confidentiel) de la barrière hématoencéphalique qui protège le cerveau des intrusions d’agents pathogènes et des virus, afin d’établir des voies d’administration non invasives de thérapie pour l’application en santé humaine. Au total le projet utilisera 6 primates maximum sur les 5 prochaines années repartis par groupe de 2 à 3 primates selon les doses de vecteurs administrées.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de faisabilité de l’ouverture de la barriere hématoencéphalique qui protège le cerveau par une nouvelle technologique. et nous nous attacherons à démontrer son efficacité couplée à l’administration de vecteurs viraux à but thérapeutique pour le ciblage du cerveau chez le PNH en vue de proposer des essais cliniques de phases I et II chez l’Homme et ainsi de disposer de toutes les données requises pour le dépôt d’un dossier à l’agence du médicament. La barrière hématoencéphalique est une protection du système nerveux central (SNC) des pathogènes et virus mais est pour la même raison une limite à l’atteinte efficace du SNC par les composés injectés en intraveineux.

Procédures

- une ouverture de la Barriere hématoencéphalique sur animal anesthésié et sous analgésie avec corticoides puis une injection Intraveineuse de vecteur adéno-associé sur l'animal sous anesthésie générale (durée 1h30) - 4 prélèvements sanguins, 4 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (durée du geste maximum 30min), sous anesthésie générale et analgésie. - 2 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h), sous anesthésie générale Dans ce projet, comme décrit précédemment, une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien + IRM)

Impact sur les animaux

Une ouverture de la barriere hémato-encéphalique avec injection intraveineuse du traitement avec un risque anesthésique et un risque d’œdème cérébral lors de l’ouverture de barrière Plusieurs prélèvements de sang et de LCR avec un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques ) et la formation possibles d’hématomes - stress lié à la contention en cage pour la réalisation des injections (anesthésie, analgésie, antibiotique,…)

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour permettre les études post-mortem des tissus et des organes et vérifier la distribution du vecteur médicament dans les organes afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de cette approche.

Remplacement

Les études in vitro pour valider la cible thérapeutique sont effectuées en amont de ce projet afin de valider l’utilisation de notre cible thérapeutique dans les modèles murins de la pathologie. À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle de culture ou de système cellulaire pour étudier l’efficacité de l’ouverture de barrière hématoencéphalique, encore moins pour évaluer l’efficacité de transduction consécutive à l’ouverture de cette barrière. Enfin, notre stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de nos vecteurs ont été réalisées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude d’efficacité, de toxicité, sur un modèle ayant un système nerveux plus développé que le rongeur et le plus pertinent pour reproduire ce qui se passera chez l’Humain est le primate non humain. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence francaise du médicament pour toute demande d’autorisation pour la réalisation d’étude clinique (chez l’homme).

Réduction

Il y a 6 animaux maximum sur ce projet, correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité des différentes approches avec des lots d’animaux allant de 2 à 3 animaux et un suivi 6 semaines post injection L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement, perchoir, échelle, hamac…). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie. l'utilisation d’un analgésique pour les ponctions lombaires et les injections virales, permettra d’ éviter au maximum les inconforts. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Si un animal ne présente pas d'amélioration suite à une prise en charge vétérinaire, il sera euthanasié (avec avis vétérinaire) après avoir été anesthésié. Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, elles sont réalisées par du personnel formé et expérimenté́. Enfin, les étapes du suivi sont prévues pour optimiser le nombre d'anesthésies en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandations en termes de Bien-être animal), ponction lombaire, imagerie par résonnance magnétique

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du macaque en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en termes de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur médicament dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole qui sera réalisé chez l’Homme. L'injection de vecteurs AAV chez le macaque est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance pour l’Homme d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́ compte tenu des patients ciblés par nos approches

Onze macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés en vie en vue d'une réutilisation. Pendant un an à un an et demi, chaque animal est colonisé par la bactérie Klebsiella pneumoniae par gavage sous anesthésie, puis subit des prélèvements de sang et des écouvillonnages rectaux répétés, avec radiographie et lavage broncho-alvéolaire en cas de pneumopathie. Le porteur indique que l'infection peut provoquer fièvre, perte d'appétit et gêne respiratoire, traitées par antibiotiques, les animaux étant hébergés seuls au début. Il affirme que le macaque est l'un des seuls modèles permettant de caractériser la réponse immunitaire et qu'aucune alternative n'existe pour cette étude au long cours.

Objectifs

Klebsiella pneumoniae est une bactérie pathogène dont les souches sont souvent résistantes aux antibiotiques, ce qui complique la prise en charge des patients. A ce titre, cette bactérie fait partie de la liste des agents pathogènes prioritaires, émise par l’OMS en 2017, pour lesquels il est nécessaire de mieux caractériser la pathogenèse (processus par lequel la bactérie déclenche la maladie), et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales. K. pneumoniae colonise fréquemment le tube digestif de l’homme, avant d’être à l’origine de différents types d’infections, comme des bactériémies (présence de bactéries dans le sang) ou des pneumopathies (infections des poumons). Le clone ST258 de K. pneumoniae, apparu récemment en Amérique du Nord et en Europe, s’est propagé rapidement, et est responsable de maladies infectieuses chez les patients atteints de déséquilibres de la flore intestinale. La mise en place d’un modèle pertinent de colonisation intestinale, chez un animal proche de l’homme, est une étape indispensable pour comprendre les mécanismes de colonisation et de pathogenèse de cette souche. Dans ce contexte, nous souhaitons mettre en place un modèle de colonisation du tube digestif par le clone ST258 de K. pneumoniae chez le macaque cynomolgus pour étudier sa capacité à coloniser le microbiote intestinal, pour suivre la durée de portage intestinal et examiner les évolutions génétiques de la souche sur le long terme. Les pathologies infectieuses (bactériémie, pneumopathie) éventuelles, faisant suite à la colonisation intestinale, seront également surveillées. Dans cette étude, la souche ST258 sera comparée à une souche de référence de K. pneumoniae ne possédant pas les mêmes capacités épidémiques.

Bénéfices attendus

Le suivi de l’évolution génétique au sein du microbiote intestinal d’un représentant du clone de K. pneumoniae ST258 permettra de comprendre si les raisons de la diffusion mondiale de ce clone résident dans sa capacité à coloniser le tube digestif sur le long terme et à s’adapter à cet environnement particulier. Cette étude permettra de développer des stratégies thérapeutiques mieux ciblées.

Procédures

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie : gavage (1, 15-20 min), prélèvements sanguins et écouvillonnages rectaux (J-6, J-1, J1, J3, J5, J7, J9, J15 puis 1/semaine, réalisés en même temps en 15-30 min). Si un animal développe des signes indicateurs de pneumopathie, des procédures supplémentaires seront réalisées pour pouvoir la diagnostiquer et la traiter : écouvillonnages nasopharyngés et trachéaux (1 tous les 2 jours pendant l’infection, 15-30 min), radiographie pulmonaire et lavage broncho-alvéolaire (1, réalisés en même temps en 45-55 min). Le projet est prévu pour une durée comprise entre 1 et 1,5 an.

Impact sur les animaux

La colonisation digestive par K. pneumoniae ne s’accompagne d’aucun signe clinique particulier. Cependant, en cas de passage des bactéries dans le sang ou de pneumopathie d’inhalation, des signes cliniques de l’infection bactérienne peuvent apparaitre : fièvre, perte d’appétit, gêne respiratoire. Ces infections seront traitées immédiatement par antibiothérapie et ne devraient pas durer au-delà de quelques jours. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet en cas de progression de la maladie. Le traitement antibiotique peut causer des diarrhées et entérites (inflammations de l’intestin grêle). L’état des animaux sera observé tous les 2 jours pendant 10 jours après l’antibiothérapie. En cas de symptômes digestifs, les vétérinaires de l’installation seront alertés et mettront en œuvre des traitements en adéquation avec l’expérience.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie

Remplacement

Aucune méthode alternative n’est possible pour étudier les phénomènes de colonisation et d’infection bactériennes, avec l’intervention notamment du système immunitaire. Cette étude sur le long terme ne peut être réalisée que sur des animaux vivants.

Réduction

Dans ce projet, au maximum 4 doses de la souche ST258 seront testées successivement, chaque fois sur un seul singe, afin de déterminer la charge optimale permettant la colonisation. La dose suivante sera ajustée en fonction du résultat précédent. Pour les deux doses les plus optimales, nous rajouterons 2 singes pour chaque dose de ST258, ce qui permettra de choisir la meilleure dose en ayant des groupes de 3 animaux. Cette stratégie permet de limiter le nombre de singes utilisés. Un groupe de trois autres singes sera infecté avec une souche de référence de K. pneumoniae avec la dose déterminée pour la souche ST258. Les six (2 groupes de 3) singes étudiés sur le long terme représentent le minimum requis pour évaluer et permettre une interprétation statistique fiable des résultats obtenus concernant le portage des bactéries et la comparaison des deux souches.

Raffinement

Le gavage sera effectué sous anesthésie et ne devrait pas provoquer de douleur particulière. Les prélèvements sanguins et les écouvillonnages rectaux seront également pratiqués sous anesthésie. En cas de pneumonie, une radiographie pulmonaire et un lavage broncho-alvéolaire unique pourront être pratiqués sous anesthésie. Hébergement des animaux infectés par K. pneumoniae en individuel conformément à l’agrément (animalerie A2) : - conservation du contact sensoriel par la mise en place de plaques translucides entre les cages latérales, et cages face à face séparées par environ 2 mètres de distance, - distribution 2 fois par semaine d’enrichissements destructibles de type peebletoy ou sachet surprise au lieu d’1 pour les hébergements en groupe. Cet hébergement individuel est nécessaire au début de l'expérience, pour éviter les biais lors de l’évaluation de certains paramètres biologiques tels que la mesure continue de la température (diurne et nocturne) et pour limiter la surexposition bactérienne. Les animaux seront remis en groupe à J21. En cas d’infection, les animaux seront traités par des antibiotiques auxquels les souches bactériennes utilisées sont sensibles.

Choix des espèces

Pour cette étude sur le long terme, le choix s’est porté sur le macaque pour plusieurs raisons : 1/ les PNH sont physiologiquement plus proches de l’homme 2/ les PNH représentent l’un des seuls modèles permettant la caractérisation de la réponse immune au pathogène: les réponses immunitaires sont similaires à l’homme, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés. 3/ Les souris, l’autre modèle permettant une exploration de la réponse immunitaire, sont coprophages (se nourrissant de leurs excréments) et transmettent donc ce pathogène de façon épidémique. Nous utiliserons des singes adultes car ce sont les adultes qui sont colonisés par K. pneumoniae chez l’homme.

31 macaques à longue queue vont être utilisés, une partie tuée à l'issue pour nécropsie et l'autre réutilisée dans de nouvelles procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des anesthésies répétées, plusieurs fois par semaine, pour des séances d'imagerie pouvant durer huit heures, des administrations dans le nez sous anesthésie, des prises de sang jusqu'à quatre fois par semaine et des ponctions lombaires, afin de valider un dispositif d'administration de médicaments par le nez chez le nouveau-né humain. Le porteur qualifie l'administration de peu traumatique tout en reconnaissant un possible manque d'appétit, de la fatigue et une irritation de la narine. Il affirme avoir d'abord testé un moule en trois dimensions mais présente le recours à l'animal vivant comme "indispensable", le macaque cynomolgus ayant selon lui les cavités nasales les plus proches de celles d'un nouveau-né humain.

Objectifs

Cette demande s’inscrit dans le cadre d’un projet international, qui implique 4 partenaires. Elle vise à développer un dispositif biomédical innovant d’administration de médicaments au niveau du système nerveux central chez le nouveau-né humain en utilisant la voie de transport directe de la cavité nasale au cerveau et en contournant la barrière hémato-encéphalique. Ce nouveau dispositif doit permettre de cibler très précisément la lame criblée, une zone perméable entre le nez et le cerveau, et ainsi d’améliorer l’efficacité thérapeutique de l’administration intranasale, jusqu’à présent moindre que par les voies systémiques (intraveineuse ou intramusculaire). Le projet prévoit le développement de candidats thérapeutiques, le développement d’un système d’administration intranasale chez le nouveau-né humain, et des essais précliniques qui permettront d’évaluer à la fois les candidats médicaments et le dispositif d’administration. Le dispositif en cours de développement chez notre partenaire sera pratique, sûr, devra être adapté à l’anatomie des nouveau-nés, aux pratiques cliniques actuelles des néonatologistes, ainsi qu’aux produits biologiques, des anticorps monoclonaux à la thérapie cellulaire. Dans ce projet, nos objectifs sont : -de valider le dispositif innovant d’administration intranasale dans un modèle primate non-humain (PNH) -d’évaluer l’innocuité du dispositif d’administration dans notre modèle PNH -d’étudier la biodistribution des produits administrés chez le PNH.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de développer et faire progresser l’administration intranasale de produits biologiques chez le nouveau-né humain grâce au développement d’un nouveau dispositif biomédical et sa validation préclinique dans un modèle PNH. L’efficacité de l’administration sera validée et caractérisée par la mesure de la molécule d’intérêt au plus près de la zone ciblée dans le cerveau (méninges…). À court terme, nous développerons une technologie innovante de marquage des cellules souches par le complexe 89Zr-oxine pour permettre le suivi spatio-temporel de cellules par une technique d’imagerie non invasive, le PET-CT scan, sans avoir recours à l’euthanasie. Ainsi grâce à cette technique, nous pourrons suivre en temps réel la position des cellules dans les primates. Grâce aux propriétés lipophiles du complexe 89Zr-oxine, qui s’insère dans la membrane plasmique, ce type de marquage pourra s’appliquer ensuite à tous types de cellules. L’étape de validation du dispositif d’administration demeure un prérequis nécessaire avant d’envisager l’évaluation de candidats thérapeutiques et des essais cliniques chez des humains nouveau-nés souffrant d'encéphalopathie hypoxique-ischémique.

Procédures

Lors de chaque intervention, les animaux seront anesthésiés afin d’éviter tout stress ou douleur. Chez les premiers animaux un radiotraceur classiquement utilisé chez l’humain sera administré pour caractériser et localiser le dépôt intranasal en utilisant le nouveau dispositif médical. Ce radiotraceur sera visualisé par imagerie à différents temps pour valider le dispositif et affiner le mode opératoire. La séance d’imagerie durera au maximum 8h avec la possibilité de faire un suivi dynamique de la molécule durant les trois premières heures. Deux autres sessions courtes d’une heure maximum pourront être programmées dans la même journée. Cette séquence d’imagerie pourra être réitérée 2 fois, espacées de 7 jours minimum. Le deuxième groupe d’animaux recevra les cellules souches radiomarquées utilisées comme traitement potentiel (administration simple ou multiple sur un temps de 30 minutes maximum). La migration de ces cellules sera observée par imagerie pendant 2 semaines maximum en fonction des résultats obtenus, avec 3 sessions possibles le jour de l’administration comme décrit précédemment pour le radiotraceur classique, et un maximum de 10 sessions. En parallèle, des échantillons de sang seront prélevés au maximum 4 fois par semaine pour monitorer les effets cliniques (durée 20 minutes). Des prélèvements lombaires seront possibles, au maximum 3 fois par animal avant ou après l’administration de cellules (durée 30 à 45 minutes). Enfin, nous traiterons 4 animaux avec chaque candidat ce qui durera 30 minutes maximum et nous procéderons à une euthanasie pour une nécropsie extensive afin de déterminer la biodistribution exacte de chaque candidat après administration intranasale. Pour chaque animal, nous pourrons procéder 2 fois à des prélèvements de sang, des prélèvements du tractus respiratoire et à des lavages broncho-alvéolaires ainsi que des ponctions lombaires le tout durera au maximum 1 heure.

Impact sur les animaux

Lors de la procédure expérimentale, les animaux seront anesthésiés plusieurs fois par semaine et certaines anesthésies pour les séances d’imagerie seront relativement longues, ceci pourra induire un manque d’appétit et de la fatigue pour les animaux. L’administration intranasale sera faite sous anesthésie et est peu traumatique mais elle pourrait induire un stress et possiblement une petite irritation (introduction d’un cathéter dans la narine).

Devenir

Les animaux utilisés pour suivre par imagerie le dépôt du radiotraceur ou la migration de cellules souches marquées pourront être inclus dans de nouvelles procédures après examen et validation par un vétérinaire. En effet, aucune séquelle n’est a priori attendue suite à ces traitements. Une partie des animaux sera euthanasiée afin de caractériser la biodistribution des candidats thérapeutiques. Dans tous les cas, l’état clinique des animaux sera étroitement surveillé, et une euthanasie sera envisagée en cas de dégradation pour éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Dans une première partie du projet, un modèle de moule en 3 dimensions de la partie supérieure d’un PNH a été conçu pour tester le dispositif d’administration par voie intranasale développé par notre partenaire. Des ajustements du dispositif d’administration ont ainsi pu être réalisés sur ce modèle de moule en remplacement des PNH. Le modèle 3D permettra de plus de déterminer la position optimale du PNH lors des interventions pour déposer la solution contenant le composé d’intérêt au plus près de la lame criblée. Toutefois, nous devrons valider le dispositif sur les animaux grâce au dépôt d’un composé radioactif utilisée en clinique chez l’homme. Le recours à des animaux vivants reste indispensable, aucun modèle ne représentant que partiellement un organisme ne pouvant mimer les muqueuses et les échanges entre le nez et le cerveau, ni ensuite la biodistribution dans le cerveau.

Réduction

Malgré des données encourageantes de notre partenaire sur des PNH juvéniles d’une autre espèce, cette étude reste assez précoce et nous ne disposons pas de données chez l’espèce qui sera utilisée ici. Nous envisageons de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans notre étude, tout en nous assurant de la fiabilité de nos résultats pour valider nos hypothèses. Dans un premier temps, nous prévoyons de tester le mode d’administration sur 3 PNH pour valider le ciblage de la lame criblée. En cas d’échec et après modification du système, le dispositif d’administration sera à nouveau testé sur 3 PNHs, avec un maximum 3 cycles de tests, soient 9 PNH pour cette phase. Dans un second temps, afin de développer la technique et le marquage des cellules, les tests seront réalisés sur 5 groupes de 2 PNH. Après validation de la technique de marquage, une même préparation de cellules marquées sera inoculée à 2 animaux. Pour répondre à cette dernière question, des sous-groupes de 4 animaux seront constitués, avec administration du même candidat médicament et euthanasie au même moment afin d’obtenir des données de biodistribution solides.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera réalisé sur des animaux anesthésiés. Nous serons très vigilants lors des anesthésies répétées au cours d’une même semaine et avons un système d’alerte automatique via notre base de données en cas de perte de poids supérieure à 10% en 15 jours ainsi que pour les analyses sanguines anormales. Lors des sessions d’imagerie, un soin particulier sera apporté au confort de l’animal et notamment au maintien de sa température corporelle par tapis chauffant, et de son hydratation par perfusion. Les animaux seront monitorés en continu pour différents paramètres (oxymétrie, fréquences cardiaque et respiratoire, pressions artérielle, température rectale). Un suivi vétérinaire est en place et l’arrêt de l’expérimentation sera décidé en cas d’observation d’une anomalie sur l’un des paramètres surveillés durant l’anesthésie (hypothermie, hypotension, arythmie etc). Les animaux seront surveillés quotidiennement et tous les cas décrits ensuite seront rapportés à un vétérinaire. Toute modification de comportement comme une agitation ou une apathie sera remontée. Nous suivrons le poids et la température de chaque animaux et les variations déclencheront une alerte automatique grâce à un logiciel de suivi quotidien. A chaque alerte, un examen clinique approfondi sera alors réalisé afin d’évaluer les chances de survie de l’animal et de procéder à une euthanasie précoce si nécessaire.

Choix des espèces

Le modèle de PNH macaque cynomolgus a été sélectionné pour plusieurs raisons : -Il représente (avec le babouin) l’espèce dont les cavités nasales sont les plus proches de celles de l’humain. Il est indispensable de mener l’étude sur un modèle dont les cavités nasales proches de celles d’un nouveau-né, ce qui est le cas des macaques cynomolgus âgés de 2 à 4 ans, qui présentent une taille et un poids comparables à ceux d’un nouveau-né humain. Des analyses morphologiques à partir de scan de macaques et de babouins, nous ont permis de visualiser que la cavité nasale la plus comparable à l’homme est celle du macaque cynomolgus. -Pour étudier le passage de molécules/cellules du nez vers le cerveau via la lame criblée, le modèle doit se rapprocher au maximum du cerveau et des tissus muqueux humains. -Notre partenaire a déjà montré un passage possible du nez vers le cerveau dans un modèle de PNH. Dans cette étude, des animaux adultes de 2 ans minimum seront utilisés, pour leur poids semblable à celui d’un nouveau-né humain. Nous utiliserons préférentiellement des animaux jeunes de 2 à 4 ans dont la morphologie de la tête est très proche de celle d’un nouveau-né humain,

120 macaques à longue queue et 30 macaques rhésus vont être utilisés, réutilisés d'un projet à l'autre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements répétés de sang, d'urines, de biopsies cutanées ou d'organes et de liquide cérébrospinal, sous contention ou anesthésie, pour valider des méthodes d'analyse de laboratoire. Le porteur indique que ces prélèvements servent à qualifier des essais réglementaires sur des candidats médicaments, et que les animaux sont euthanasiés en fin de vie sur avis vétérinaire. Il revendique le primate comme seule espèce pertinente et qualifie ces prélèvements d'indispensables.

Objectifs

Aujourd’hui, de plus en plus de candidats médicaments sont des protéines thérapeutiques (ou molécules biologiques plus ou moins complexes), et le primate non humain est souvent la seule espèce adéquate pour évaluer la toxicité ou l’activité pharmacologique de ces composés, du fait des homologies génétiques, immunologiques et physiologiques avec l’homme. Ces études d’évaluations sont requises par les autorités réglementaires et des lignes directrices existent pour définir leur conduite. Elles comportent de nombreuses analyses de laboratoire pour évaluer la concentration plasmatique (ou autres matrices) du composé testé, et la corréler avec son activité pharmacologique ou toxique. Compte tenu des enjeux et de la réglementation, il est indispensable que les résultats générés soient fiables et robustes. Ceci ne peut être assuré qu’après avoir démontré les performances analytiques des essais au cours de leur qualification et/ou validation analytique. Cependant, la composition des échantillons analysés peut influencer les résultats d’analyse et la performance d’un essai, il est donc nécessaire que ces paramètres soient évalués dans le même type d’échantillons que ceux à analyser. Par conséquent, effectuer les prélèvements biologiques provenant de primates non humains, en amont ou en parallèle de la réalisation des études, est indispensable pour valider les essais utilisés lors des analyses d’échantillons d’études. Par ailleurs, le développement et la validation règlementaire de nouvelles méthodes et de techniques plus sensibles et précises dans les laboratoires contribuent aux 3R, notamment en limitant les quantités de matrice biologique nécessaire et en permettant des interprétations plus fines.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’obtenir des matrices (prélèvements sur animaux) nécessaires au développement et à la validation d’essais analytiques au sein de l’établissement utilisateur afin d’assurer la génération de données validées règlementairement, fiables et exploitables, nécessaires et indispensables au développement de candidats médicaments. Le bénéfice est d’une part scientifique et réglementaire (court et moyen terme) : le projet permet d’assurer l’accès pour les laboratoires aux matrices biologiques nécessaires pour les développements et validations, en appui aux études de toxicologie réglementaire et au développement de médicaments, et de bénéficier de prélèvements de qualité, notamment en évitant des contraintes de conservation ou de transport. D’autre part, il y a un bénéfice important sur les 3R (bénéfices à court, moyen et long terme) : les techniques et les méthodes de laboratoires deviennent de plus en plus sensibles et précises et le développement de nouvelles techniques de laboratoire permet de raffiner (ex : diminution des volumes de matrices prélevées, augmentation des paramètres pouvant être analysés et de ce fait amélioration des conclusions des études) et en conséquence de réduire le nombre d’animaux utilisés le cas échéant. Un exemple concret correspond au développement d’approches permettant de doser plusieurs analytes à partir d’un volume réduit de plasma (analyses Multiplex avec la technologie Luminex®, électrochimie luminescence ou PCR digitale).

Procédures

Les prélèvements seront réalisés en respectant les recommandations éthiques en vigueur adaptées au type de prélèvement et en respectant une période de récupération adaptée pour l’animal entre deux prélèvements. Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile : sang (unique ou répété) par les voies veineuses périphériques), urines, selles, frottis vaginal, nécessitent une contention de courte durée, manuelle (moins de 5 minutes) et/ou en chaise de contention (jusqu’à 30 minutes ou 1 heure maximum). Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile (ex jeune animal) ou sous sédation (ex cas des animaux matures) : salive, larmes, sécrétions nasales, récolte du sperme ; si une sédation est requise, elle sera de courte durée (environ 5-15 minutes) et l’animal sera surveillé jusqu’à son réveil complet. Les prélèvements réalisés sous anesthésie générale : biopsie cutanée ou d’organes, liquide cérébrospinal, liquide synovial, humeur aqueuse ; l’animal sera surveillé jusqu’à son réveil complet. Dans certains cas particuliers les prélèvements exigent des contraintes d’hébergement particulières : Mise à jeun (préalablement à une anesthésie, maximum 18 heures) ; Hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores préservés, pour recueil d’urine/fèces en cage à diurèse, en vue d’une analyse individuelle, maximum 18 heures).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont minimes et correspondent essentiellement au stress et douleurs liés à la contention et aux types de prélèvements : -Prélèvements sur animaux vigiles : hématome transitoire sur le site de prélèvement sanguin, légère douleur provoquée par la ponction à l’aiguille, stress provoqué par la contention et/ou l’hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores… préservés), le cas échéant -Sédation/Anesthésie générale : effets cardiorespiratoires, hypothermie, stress provoqué par les manipulations liées à l’anesthésie -Prélèvements plus invasifs comme les biopsies : douleurs au niveau du site de biopsie, stress provoqué par l’intervention post-opératoire comme la contention pour les soins post-opératoires et les injections répétées. -Stress lors de contrainte occasionnelle liée à l’hébergement, notamment lors d’hébergement individuel, et de contention à la main ou en chaise le cas échéant.

Devenir

Après avoir pris en compte les effets subis par l’animal notamment lors de la participation dans les projets précédents et en tenant compte d’autres questions sanitaires, selon l’avis vétérinaire si ces animaux ne peuvent plus être réutilisés, le vétérinaire peut donner l’autorisation d’euthanasie. Dans ce cas-là les différents organes et du sang peuvent être prélevés et mis à disposition des laboratoires à la fin de vie de ces animaux. Selon l’avis vétérinaire les animaux peuvent être gardés en vie sous la responsabilité de l’établissement. Le suivi des animaux est maintenu selon les procédures de l’établissement et conformément aux règlementations et recommandations en vigueur (Directive 2010/63, AAALAC et autres recommandations éthiques internes). Ils pourront possiblement être sélectionnés selon des critères bien définis et réutilisés dans un projet.

Remplacement

Les lignes directrices de validation de méthodes recommandent que les essais soient validés dans les mêmes matrices que les échantillons d’étude (même espèce), afin de s’assurer de la performance des essais dans leur utilisation réelle. A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode in vitro permettant de synthétiser ces produits biologiques en raison de la complexité des matrices biologiques utilisés dans ce projet, et les matrices primates ne peuvent pas être remplacées par des matrices d’autres espèces du fait de la règlementation et de la nature des candidats testés (ex : protéines thérapeutiques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet sera déterminé strictement selon les besoins des laboratoires et la réglementation en vigueur en termes de validation d’essais. Les prélèvements seront effectués pour les analyses prévues en utilisant le nombre d’animaux minimum requis. Par ailleurs, le développement de nouvelles méthodes et de techniques plus sensibles dans les laboratoires permet de limiter la quantité de matrice biologique nécessaire, contribuant ainsi à la réduction (3R).

Raffinement

Les techniques et les méthodes de laboratoire deviennent de plus en plus sensibles et précises, ce qui renforce l’efficacité des analyses. Les essais ex vivo réalisés en amont des études précliniques in vivo s’inscrivent dans une stratégie 3R (réduction et raffinement) car ils permettent de caractériser le candidat médicament (sélection du meilleur candidat, connaissance du profil métabolique, pharmacologique et toxicologique) avant de démarrer les essais sur l’animal. Les méthodes développées et validées dans ce projet permettent en particulier d’optimiser les doses utilisées ensuite pour les études vivo, et de limiter la quantité de matrice biologique nécessaire, ex : approches permettant de doser plusieurs analytes à partir d’un volume réduit de plasma (analyses Multiplex avec la technologie Luminex®) et techniques plus sensibles et plus précises (électrochimie luminescence ou PCR digitale permettant des interprétations plus fines). Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs importantes seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites (ex : plaie, gonflement au niveau du site de prélèvement, amaigrissement) qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les lignes directrices rendent indispensable l’utilisation d’un non-rongeur pour chaque nouveau médicament avant tout essai clinique et mise sur le marché. L’espèce primate est parfois l’unique espèce pertinente pour le développement préclinique de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins anticancer). Le choix du primate non humain est justifié par les homologies génétiques, immunologiques et physiologiques avec l’homme, nécessaires pour prévoir au mieux l’activité toxique ou pharmacologique de nouveaux candidats médicaments chez l’homme. Parmi ces composés, on peut citer les anticorps thérapeutiques (ou autres peptides ou protéines), qui présentent une spécificité importante pour leur cible et qui souvent ne se lient pas sur les cibles d’autres espèces plus éloignées sur le plan phylogénétique comme le chien ou les rongeurs. Par ailleurs, de nombreux composés jouent un rôle dans la modulation du système immunitaire, comme les immunosuppresseurs ou immuno-activateurs (cas des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires en immuno-oncologie). Dans ces conditions, il est indispensable d’administrer ces composés chez l’espèce dont le système immunitaire se rapproche le plus de celui de l’homme. D’autres classes de thérapies avancées, comme certains virus oncolytiques par exemple, n’infectent que l’homme et le primate non humain. Animaux juvéniles d’au moins 22 mois, soit l’âge moyen auquel les animaux sont reçus à l’établissement utilisateur et auquel les animaux sont inclus dans les études réglementaires. Pour certains prélèvements biologiques, des animaux matures (maturité sexuelle ou maturité du système immunitaire) doivent être utilisés en fonction des besoins scientifiques et selon la disponibilité des animaux non attribués dans un autre projet au moment du besoin.

156 primates, 78 macaques à longue queue et 78 macaques rhésus, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une à deux chirurgies cérébrales, des IRM sous anesthésie tous les six mois, des prélèvements de liquide céphalorachidien mensuels et des prises de sang tous les quinze jours, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le projet crée des modèles de maladies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson, dont les retombées thérapeutiques restent une perspective. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico n'est valide et justifie le recours au primate par sa "proximité avec l'homme".

Objectifs

De nos jours dans le monde environ 36 millions de personnes sont atteintes de démences, dont 25 millions pour la maladie d’Alzheimer et 6 millions pour la maladie de Parkinson. En raison du vieillissement progressif de la population et de l'absence de traitement, le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives augmente considérablement et devrait croître de manière régulière dans les années à venir. Qu'elles soient génétiques ou acquises, leurs mécanismes d’initiation liés à des causes multifactorielles sont mal connus. Ainsi, il est nécessaire de créer et maîtriser des modèles le plus proche possible de la réalité pathologique. L’étude proposée ici permettra aux travers de différents modèles de primates non-humains de maladies neurodégénératives, d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de l’initiation et de l’installation des différentes pathologies afin de définir des nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les maladies neurodégénératives sont une cause majeure d’invalidité, de dépendance, d’institutionnalisation et d’hospitalisation. Elles ont un impact très important sur la qualité de vie des personnes atteintes ainsi que sur celle de leurs proches et de leurs aidants, et touchent ainsi une part importante de la population. Les traitements actuellement disponibles sont à visée symptomatique et d’efficacité relative. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces pathologies c’est trouver les traitements de demain.

Procédures

Une chirurgie (2 heures environ), ou deux maximum, espacées de 1 mois. Imagerie : IRM sur animal anesthésié, avant la chirurgie, 48 heures après et tous les 6 mois. La durée de l'IRM est de 1h30 à 2h. Prélèvements sanguins de quelques minutes tous les 15 jours sur animaux vigiles en contention légère. Prélèvements de liquide céphalorachidien de l'ordre de 5 minutes une fois par mois sous anesthésie légère.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou aux prélèvements biologiques. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible et infection au niveau des points de sutures. Pour l’imagerie : anesthésie. Pour les prélèvements liquide céphalorachidien (LCR) et sang : stress de l’anesthésie pour le LCR et de la contention (légère et rapide) pour le sang.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque aux temps expérimentaux définis. Le cerveau et éventuellement d’autres tissus seront alors prélevés puis mis à disposition pour réaliser les analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH car il n’existe pas de modèles mathématiques ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier les processus neurodégénératifs. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à mimer la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus est une étape nécessaire à la découverte de nouvelles voies thérapeutiques

Réduction

Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité (cadre stéréotaxique, Imagerie, stabulation) nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude sont destinés de prime abord aux études histologiques visant à identifier des marqueurs pour déterminer de nouveaux traitements, et servent également à renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque) afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’état des animaux est observé et quantifié selon des critères objectifs permettant d’établir des scores de bien-être et de déterminer des points limites à partir desquels les actions adaptées sont menées (des massages, le maintien de l’animal au chaud à l’aide d’une couverture, la modification de la nature et le change plus régulier de la litière, l’augmentation de la fréquence des pesées, le gavage avec des complément alimentaire, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons en dehors de la sphère médicamenteuse pour améliorer l’état de santé de nos animaux).. . Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adapté au poids de l’animal, Les prélèvements de LCR sont faits sur animaux sédatés. Les prélèvements de sang sont réalisés sur animaux vigiles avec une légère contention. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. L’échelle de bien être est là aussi utilisée pour estimer la gêne occasionnée par ce geste. Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.).

Choix des espèces

Ces modèles ont déjà été réalisés et validés chez les rongeurs (rats, souris), comme base d’étude des maladies neurodégénératives, mais la proximité d’espèce avec l’homme en fera toujours un modèle de choix, surtout dans la détermination de marqueurs prédictifs. Les maladies neurodégénératives sont des maladies chroniques progressives qui touchent le système nerveux central. Leur fréquence augmente avec l'âge chez l’homme. Afin d’être au plus près de cet état, dans ce projet, les animaux utilisés seront donc adultes.

156 macaques, à longue queue et rhésus, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une à deux chirurgies cérébrales par injection stéréotaxique, des prélèvements sanguins tous les quinze jours, des ponctions mensuelles de liquide céphalorachidien et des IRM répétées, avant sa mise à mort par perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico ni cellulaire ne permet d'étudier ces maladies et présente le primate comme "nécessaire" du fait de sa proximité avec l'humain. Les bénéfices annoncés, de nouvelles cibles thérapeutiques contre Alzheimer et Parkinson, restent formulés au conditionnel.

Objectifs

De nos jours dans le monde environ 36 millions de personnes sont atteintes de démences, dont 25 millions pour la maladie d’Alzheimer et 6 millions pour la maladie de Parkinson. En raison du vieillissement progressif de la population et de l'absence de traitement, le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives augmente considérablement et devrait croître de manière régulière dans les années à venir. Qu'elles soient génétiques ou acquises, leurs mécanismes d’initiation liés à des causes multifactorielles sont mal connus. Ainsi, il est nécessaire de créer et maîtriser des modèles le plus proche possible de la réalité pathologique. L’étude proposée ici permettra aux travers de différents modèles de primates non-humains de maladies neurodégénératives, d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de l’initiation et de l’installation des différentes pathologies afin de définir des nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les maladies neurodégénératives sont une cause majeure d’invalidité, de dépendance, d’institutionnalisation et d’hospitalisation. Elles ont un impact très important sur la qualité de vie des personnes atteintes ainsi que sur celle de leurs proches et de leurs aidants, et touchent ainsi une part importante de la population. Les traitements actuellement disponibles sont à visée symptomatique et d’efficacité relative. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces pathologies c’est trouver les traitements de demain.

Procédures

Une chirurgie (2 heures environ), ou deux maximum espacées de 1 mois. Prélèvements sanguins de quelques minutes tous les 15 jours sur animaux vigiles en contention légère. Prélèvements de liquide céphalorachidien de l'ordre de 5 minutes une fois par mois sous anesthésie légère. IRM, avant l’injection stéréotaxique, 48 heures après et tous les 6 mois. La durée de l'IRM est de 1h30 à 2h.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou aux prélèvements biologiques. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible et infection au niveau des points de sutures. Pour l’imagerie : anesthésie. Pour les prélèvements liquide céphalorachidien (LCR) et sang : stress de l’anesthésie pour le LCR et de la contention (légère et rapide) pour le sang.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque aux temps expérimentaux définis. Le cerveau et éventuellement d’autres tissus seront alors prélevés puis mis à disposition pour réaliser les analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH car il n’existe pas de modèles mathématiques ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier les processus neurodégénératifs. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à mimer la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus est une étape nécessaire à la découverte de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité (cadre stéréotaxique, Imagerie, stabulation) nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude sont destinés de prime abord aux études histologiques visant à identifier des marqueurs pour déterminer de nouveaux traitements, et servent également à renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque) afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’état des animaux est observé et quantifié selon des critères objectifs permettant d’établir des scores de bien-être et de déterminer des points limites à partir desquels les actions adaptées sont menées (des massages, le maintien de l’animal au chaud à l’aide d’une couverture, la modification de la nature et le change plus régulier de la litière, l’augmentation de la fréquence des pesées, le gavage avec des complément alimentaire, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons en dehors de la sphère médicamenteuse pour améliorer l’état de santé de nos animaux).. . Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adapté au poids de l’animal, Les prélèvements de LCR sont faits sur animaux sédatés. Les prélèvements de sang sont réalisés sur animaux vigiles avec une légère contention. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. L’échelle de bien être est là aussi utilisée pour estimer la gêne occasionnée par ce geste. Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.).

Choix des espèces

Ces modèles ont déjà été réalisés et validés chez les rongeurs (rats, souris), comme base d’étude des maladies neurodégénératives, mais la proximité d’espèce avec l’homme en fera toujours un modèle de choix, surtout dans la détermination de marqueurs prédictifs. Les maladies neurodégénératives sont des maladies chroniques progressives qui touchent le système nerveux central. Leur fréquence augmente avec l'âge chez l’homme. Afin d’être au plus près de cet état, dans ce projet, les animaux utilisés seront donc adultes.