Macaques à longue queue

Tués sous anesthésie 113 jours après l'injection pour que leurs organes soient récoltés, trois macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un candidat médicament différent contre le diabète de type 2, puis subit seize prélèvements sanguins sur dix-sept semaines et quatre biopsies du quadriceps sous anesthésie. Les prises de sang se font sur animal vigile, avec des contentions de trois à quinze minutes, le porteur expliquant que l'anesthésie modifierait les paramètres étudiés. L'étude sert à désigner lequel des trois produits poursuivra son développement, et le porteur affirme que seul un "organisme entier", où tous les organes interagissent, permet d'y répondre.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de comprendre comment trois nouveaux candidats médicaments contre le diabète de type 2 agissent dans le corps : comment ils circulent, combien de temps ils restent actifs, quels effets ils produisent et dans quels organes ils s’accumulent. Les candidats médicaments testés bloquent sélectivement certains gènes impliqués dans la résistance à l’insuline, mécanisme central du diabète de type 2. Contrairement aux traitements qui contrôlent principalement la glycémie, ces candidats médicaments visent donc à corriger la cause physiopathologique sous-jacente de la maladie. L’hypothèse est qu’une administration unique de ces médicaments permettra d’induire une amélioration durable de la sensibilité à l’insuline des patients et, par conséquent, un meilleur contrôle métabolique. Cette étude préliminaire sur primate est nécessaire pour déterminer les caractéristiques principales des produits une fois administrés dans un organisme entier, avant de futurs études précliniques et cliniques. Les résultats de cette étude permettront de comparer les trois candidats médicaments afin de sélectionner le produit leader qui poursuivra son développement avant d’être mis sur le marché. L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, les dosages utilisés dans ce projet sont efficaces mais a priori non toxiques (d’après des études toxicologiques préliminaires).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont à terme la validation et la mise sur le marché du traitement innovant le plus efficace contre le diabète de type 2, qui pourrait être administré en une seule injection et offrir des effets durables. Ce médicament pourrait améliorer significativement la qualité de vie des patients en réduisant les contraintes liées aux traitements chroniques.

Procédures

Après plus de deux semaines d’acclimatation et d’habituation, les 3 animaux inclus dans le projet recevront une injection intra-veineuse lente du candidat médicament (perfusion d’un produit différent pour chaque animal durant 5 à 10 minutes). Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration sur animal vigile afin d'étudier la concentration du produit dans le sang au cours du temps et de mesurer certains paramètres physiologiques des animaux (16 prélèvements sanguins seront réalisés sur une période de 17 semaines). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 15 minutes. 4 biopsies de muscles seront réalisées au niveau des quadriceps des animaux (prélèvements réalisés à minimum un mois d’intervalle). L’intervention sera réalisée sous anesthésie et analgésie (après mis à jeun) et durera environ 20 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée sera réalisée chaque semaine. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x le jour de l’administration, et 1x/jour 3 jours après administration. Le projet prendra fin 113 jours après administration des candidats médicaments et les 3 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes.

Impact sur les animaux

L’administration intra-veineuse par perfusion lente peut provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les biopsies de muscles sous anesthésie et analgésie pourront provoquer des douleurs légères ainsi que des réactions locales au niveau du site de ponction ou une infection post-opératoire. L'anesthésie des animaux dans le cadre de ces interventions (biopsies) pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

Les 3 animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter leurs organes pour déterminer la biodistribution des produits testés.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de comprendre comment trois nouveaux candidats médicaments agissent dans le corps : comment ils circulent, combien de temps ils restent actifs, quels effets ils produisent et dans quels organes ils s’accumulent. Ce type d'étude in vivo chez l’animal est indispensable au développement de nouvelles thérapies. Les données issues de ce projet ne pourraient être obtenues in vitro, car les modèles cellulaires utilisés en laboratoire restent trop simplifiés : ils ne reproduisent qu’une partie d’un organe isolée du reste du corps. Or, les paramètres étudiés dépendent d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant complexe (exemples : le débit sanguin, les échanges entre les tissus, le fonctionnement du foie et des reins, les barrières biologiques, …). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante, permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 3 animaux seront utilisés (1/groupe). Chaque animal recevra un candidat thérapeutique différent, il est donc impossible de réduire d’avantage le nombre d’animaux utilisé par groupe. Le suivi longitudinal de chaque animal (analyses biologiques et suivi métabolique avant et après administration) permettra de recueillir un maximum de données à partir de chaque individu, réduisant ainsi le besoin d’animaux supplémentaires. Cette étude étant préliminaire et non règlementaire, elle ne nécessite pas d’utiliser de grandes cohortes d’animaux pour réaliser des tests statistiques.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux, de la litière pour permettre aux primates de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine, des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs), de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant minimum deux semaines avant le début du projet. Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les biopsies seront réalisées sous anesthésie et analgésie et un traitement analgésique post-opératoire sera mis en place. Les prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile car l'anesthésie modifie les paramètres physiologiques étudiés et engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Les primates sont utilisés comme modèle de recherche avant de tester certains traitements chez l’Homme. Leur système immunitaire réagit de façon très semblable au nôtre, ce qui permet de prévoir d’éventuelles défenses du corps contre le traitement. Leur grande proximité génétique et physiologique avec l’Homme les rend aussi très utiles pour étudier combien de temps le traitement reste actif, comment il agit et dans quels organes il se diffuse. Ainsi, son emploi est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. À ce stade de développement, les animaux présentent un système immunitaire pleinement fonctionnel, comparable à celui d’un patient adulte, ce qui est indispensable pour évaluer la réponse du corps vis-à-vis du candidat médicament testé. Leur organisme a atteint la maturité physiologique et métabolique, mais ne subit pas encore de variations néfastes liées au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes permet de réduire les facteurs associés à des pathologies liées à l’âge qui pourraient interférer dans l’analyse des résultats et la qualité des échantillons prélevés. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Chacun des 180 macaques à longue queue de ce projet peut subir une quarantaine d'anesthésies générales, autant de prélèvements sanguins, une trentaine d'écouvillonnages nasaux, trachéaux et rectaux, quatre ponctions de moelle osseuse, quatre biopsies de ganglions et jusqu'à dix lavages broncho-alvéolaires, le tout classé en souffrance modérée. Une puce de télémétrie est implantée sous la peau, et les animaux exposés au SARS-CoV-2 ou à la grippe passent jusqu'à huit semaines seuls en cage. La modification déposée pour cette version ajoute quatre biopsies de peau, quatre biopsies de muqueuse rectale ou buccale et quatre prélèvements de liquide séminal, pour "avoir accès à plus de compartiments". 108 macaques sont tués pour prélever leurs tissus, les 72 autres gardés comme modèles de réinfection ou comme convalescents, avec une réattribution à d'autres études que le porteur n'exclut pas.

Objectifs

La grippe et le Covid sont des maladies respiratoires causés respectivement par les virus influenza et le SARS-CoV-2. La transmission interhumaine de ces virus se fait principalement par l’excrétion de gouttelettes dans l’air (toux, éternuement, parole, respiration).Les personnes à risque et les stratégies thérapeutiques de ces deux maladies étant assez similaires, nous avons choisi de mener nos recherches à l’intérieur d’un seul projet. Actuellement, aucun traitement spécifique ne permet d’atténuer efficacement et systématiquement les maladies causées par le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. De nombreuses personnes notamment les personnes immunodéprimées (personne au système immunitaire fragile) ou âgées sont encore lourdement impactées par la Covid-19 ou la grippe avec des effets secondaires qui demeurent importants. De plus, dans le cas du SARS-CoV-2, l’émergence continuelle de variant d’intérêt (VOC) et l’absence de vaccins efficaces contre l’ensemble de ces variants anciens ou émergents nécessite le développement permanent de nouveaux traitements par immunothérapie. Dans le cas de la grippe, les souches qui circulent en hivers sont différentes d’une année sur l’autre. Cette diversité impose d’ajuster chaque année la composition du vaccin pour y introduire les souches les plus récentes en circulation et qui circuleront aussi probablement dans les mois suivants. De plus, ces virus saisonniers diffèrent en termes d’impact sur la population et de sévérité. Le développement de nouveaux traitements thérapeutiques nous permettrait de mieux faire face à une épidémie de grippe en cas de faible efficacité du vaccin. Dans ce contexte, nous testerons différentes types de traitements comme des anticorps permettant d’améliorer la réponse adaptive ou ciblant directement les virus du SARS-CoV-2 ou les virus grippaux. La mise en place de traitements par immunothérapie efficaces contre ces virus respiratoires pourrait aussi représenter une alternative capable de stimuler la réponse immunitaire en cas de baisse d’efficacité des vaccins (population immunodéprimée, apparition d’une souche génétiquement très éloignée…). Ces traitements sont en phase de développement préclinique et la démonstration d’une efficacité dans notre modèle macaque permettrait une avancé en phase clinique. MODIFICATION : Nous avons effectué des modifications pour pouvoir prélever plus de type d’échantillons différents lors des étude de biodistribution pour avoir accès à plus de compartiments.

Bénéfices attendus

Les molécules thérapeutiques qui auront montré des résultats satisfaisants chez le primate non-humain pourront à court terme être utilisés lors d’essais cliniques chez l’Homme. Elles pourront notamment, à long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés à grande échelle et ainsi protéger la population mondiale contre les virus respiratoires tels que le SARS-CoV2 ou la grippe.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - Anesthésie générale (40 fois environ, 30min, tous les groupes) - Traitements avec des molécules thérapeutiques (4 fois environ, 5 minutes, tous les groupes) - Infection par le virus de la grippe ou de la covid (1 fois, 15 minutes, groupes exposés) - Prélèvement de sang (40 fois environ, 5 minutes, tous les groupes). - Prélèvement de moelle osseuse (4 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Biopsie de ganglions lymphatiques (4 fois environ, 30 minutes, groupes exposés) - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux ET RECTAUX (30 fois environ, 2 minutes, tous les groupes) - Lavage broncho-alvéolaire (10 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Prélèvement de LCR (liquide cérébrospinal) (4 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, 30 minutes, tous les groupes) - Imagerie in vivo (10 fois environ, 45 minutes, tous les groupes) - Pléthysmographie (mesure de l'ensemble des volumes pulmonaires) (10 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Hébergement individuel (1 fois, 8 semaines maximum, groupes exposés) - MODIFICATIONS : -Biopsie de peau (4 fois maximum, 30 minutes)-Biopsie de muqueuse rectale ou buccale (4 fois maximum, 20 minutes). -Prélèvement de liquide séminal (4 fois maximum, 20 minutes, animaux de l’étude pilote)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux traitements: Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant le traitement. Nuisances liées à l’infection par le virus influenza ou le SARS-CoV2 : Fatigue, difficultés respiratoires, fièvre, déshydratation, troubles de l’appétit. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Les nuisances sont peu attendues chez les animaux traités. Nuisances liées aux anesthésies répétées, prélèvements de sang, moelle osseuse et biopsies : Troubles de l’appétit avec plus ou moins de pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélever différents tissus et procéder à des analyses (charge virale, lésions pulmonaires…). L’autre partie des animaux sera conservée pour servir de modèle de réinfection ou d’animaux convalescents. Il n’est pas exclu que ces animaux soient réattribués à d’autres études après avis vétérinaire.

Remplacement

L’objectif est d’évaluer la protection induite par différents traitements par immunothérapie contre des virus respiratoires comme le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. Ce type d’évaluation nécessite un modèle expérimental proche de l’Homme, permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorales, cellulaires) et les changements induits suite au traitement et à l’infection virale. A ce jour, le macaque est le modèle qui représente le mieux ces infections respiratoires chez l’Homme. Du fait de sa proximité génétique avec l’Homme, les cibles des immunothérapies sont aussi exprimées chez le macaque, et pas nécessairement dans le modèle des petits animaux. Toutefois, les traitements par immunothérapie évalués ont été préalablement testés in vitro et dans un modèle de petits animaux avant d’être testés chez le PNH.

Réduction

Les études pilotes de distribution et persistance du traitementse font sur 2 animaux et nous permettent de sélectionner les traitements par immunothérapie les plus pertinents, la dose et la voie d’administration. Nous maitrisons les modèles de grippe et de SARS-CoV-2, cette expérience nous permets d’utiliser des contrôles historiques dans les études d’efficacité ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux contrôles tout en permettant une analyse statistique robuste. Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

L’ensemble des interventions et les prélèvements seront réalisés regroupés au maximum et sous anesthésie générale des animaux. Une diversification de l’alimentation et complémentation de celle-ci pourra être instaurée en cas d’une baisse de l’alimentation due à des anesthésies répétées Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être appliquée par une désinfection et une analgésie locale. L’implantation de puce permettant un suivi régulier de la température peut induire une réaction tel qu’un gonflement et un suintement de la plaie. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique comme une désinfection et une analgésie locale. L’administration des traitements pouvant entrainer une réaction locale comme des démangeaisons et douleurs, une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. L’exposition aux virus influenza et SARS-CoV2 peut conduire à l’apparition de difficultés respiratoires, fièvre, dysorexie, déshydratation et fatigue. Si apparition de ces symptômes, un signalement au vétérinaire sera réalisé.. Une grille de score sera utilisée pour le suivi de l’infection chez l’animal. Les modèles d’infection par le SARS-CoV2 ou par les virus grippaux chez le macaque sont déjà mis au point dans notre département. Des grilles de score avec des points limites ont déjà été établis et utilisés au sein de notre département lors de différentes infections avec ces virus. L’hébergement se fera en groupe pour les études pilotes. Pour les études d’efficacités, les animaux seront mis en individuel pour la période d’adaptation avant l’exposition virale. Suite à l’exposition et une fois la production virale terminée, ils seront remis en groupe. Cet hébergement individuel pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie. Cet hébergement individuel est nécessaire pour l’évaluation de certains paramètres biologiques notamment la température corporelle et pour limiter la surexposition virale.

Choix des espèces

Les modèles de petits animaux comme la souris ne sont pas un hôte naturel du SARS-CoV-2 et des virus influenza et leur le système immunitaire est très différent de celui de l’humain. Toutefois, la majorité des candidats sont déjà testés dans un modèle petit animal ou in vitro avant d’être testés chez le macaque PNH. Le macaque a été choisi comme modèle animal, car il présente une réponse immunitaire et physiopathologique semblable à celle de l’humain pour la plupart des infections respiratoires similaires. A ce jour, a été mis au point un modèle d’infection efficace des macaques cynomolgus par voie respiratoire. Les macaques sont d’excellents modèles pour reproduire la forme non sévère des maladies COVID19 et grippes, ils sont donc pertinents pour tester des molécules thérapeutiques. Ces espèces représentent le modèle le plus pertinent réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de traitements par immunothérapie contre les virus respiratoires : la réponse immunitaire et la réponse aux traitements sont similaires à celles de l’humain, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire est maitrisés chez ces espèces contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires comme le furet. La grippe et le Covid infectant des personnes de tout âge en clinique, nous pouvons réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature, donc au minimum 2 ans. Enfin, les traitements candidats pourront être évalués chez des adultes lors des essais cliniques donc il est plus pertinent d’utiliser des animaux ayant un système immunitaire similaire.

50 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, un émetteur implanté dans l'abdomen et des électrodes placées sous la peau enregistrant leur fonction cardiovasculaire. Ils reçoivent, une fois ou de façon répétée, des molécules en cours de test, et les prises de sang peuvent atteindre 19,5 ml toutes les deux semaines, soit 10 % de leur volume sanguin total. Le porteur écrit que l'implant, dont la durée de vie est d'environ deux ans, rend ces animaux inaptes à toute réhabilitation, et qu'ils seront réutilisés dans d'autres projets ou tués. La finalité est réglementaire : produire le rapport de pharmacologie de sécurité qui accompagne une demande d'essai clinique, étape que le porteur qualifie d'"indispensable" faute de "modèle de substitution".

Objectifs

L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie réglementaires, lesquelles sont indispensables pour initier l’évaluation clinique d’un composé thérapeutique (potentiellement futur médicament). La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique des ces composés. Préalablement aux études cliniques, leurs effets sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. Du fait de la complexité des organismes vivants, il n’existe actuellement aucun modèle de remplacement pour prédire ces effets pharmacologiques. Seule l’expérimentation animale permet de définir l’innocuité des composés thérapeutiques afin de sécuriser les premiers essais chez l’homme. Pour atteindre cet objectif, et en accord avec les recommandations vétérinaires et pharmaceutiques internationales, la présente autorisation de projet permettra de caractériser les effets adverses de ces composés sur le système cardiovasculaire du macaque. L’évaluation de la fonction cardiovasculaire se fera par l’utilisation d’électrodes sous-cutanée et d’un émetteur placer dans l’abdomen, avant et après administration du composé thérapeutique test. La conduite de ces études de pharmacologie de sécurité conduira à la production d’un rapport décrivant les effets adverses du composé test sur la fonction cardiovasculaire. Ce rapport, requis par la réglementation, fera partie intégrante de la demande d’essai clinique.

Bénéfices attendus

À l’échelle mondiale, les maladies cardiovasculaires demeurent la première cause de décès avec environ 17,9 millions de morts par an, suivies des cancers (10 millions/an), des maladies neurologiques (9 millions/an), des maladies infectieuses (7,7 millions/an), des maladies respiratoires chroniques (3,9 millions/an) et du diabète (1,5 million/an). Pour ces pathologies, il n’existe à ce jour aucune solution thérapeutique satisfaisante. Ce projet vise à couvrir une étape indispensable dans le développement de solutions thérapeutiques. La pharmacologie de sécurité est une phase règlementaire indispensable au développement préclinique, préalable aux études cliniques. Elle permet de caractériser les effets d’un composé thérapeutique sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. 10 à 12 % des xénobiotiques échouent en essais cliniques en raison de problèmes de sécurité cardiovasculaire. Ces risques cardiovasculaires sont mieux identifiés et anticipés aujourd’hui grâce à l'intégration des études de pharmacologie de sécurité chez le macaque en raison de sa valeur prédictive, notamment dans le cadre des recommandations médicales internationnales. A court terme, le bénéfice premier de ce projet sera l’établissement du profil toxicologique/pharmacologique, spécifique à la fonction cardiovasculaire, d’un composé. A long terme, les données obtenues de ces études de pharmacologie de sécurité feront partie intégrante des dossiers de demandes d’autoristion d’essais cliniques. Ces études réduiront les risques cardiovasculaires lors de ces essais et contribueront à : 1. améliorer la qualité de vie des patients, en permettant à de nouvelles molécules d’entrer en clinique 2. améliorer la sécurité des patients, en identifiant/caractérisant les effets cardiovasculaires indésirables 3. optimiser les doses thérapeutiques en identifiant précocement les doses efficaces optimales et les effets secondaires 4. contribuer à la recherche scientifique. Les résultats de ces projets enrichiront les connaissances scientifiques sur les mécanismes d'action et profils de sécurité de nouvelles familles de molécules 5. réduire les coûts de santé (améliorer la sécurité/efficacité des traitements) 6. répondre aux exigences réglementaires en matière de sécurité.

Procédures

Les animaux seront soumis à l'administration, unique ou répété, d'une molécule thérapeutique en phase de test ou d'un composé de référence (témoin). Chaque administration dure quelques minutes ou quelques dizaines de minutes. Des prélèvements sanguins peuvent être effectués (5 minutes environ). La quantité et la fréquence acceptables dépendent du volume sanguin total (VST). Chez le macaque, il est estimé à 195 ml pour un macaque de 3 kg. Environ 10 % du VST peut être prélevé en toute sécurité toutes les 2 semaines (soit 19.5mL) , 7,5 % tous les 7 jours (15 ml) selon les recommandations internationnales vétérinaires. En cas de cinétique (plusieurs prélèvements rapprochés pour déterminer l'évolution de la concentration de la molécule dans le sang), les temps de prélèvement sont déterminés sont les caractéristiques de la molécule testée tout en respectant le volume maximal possible de 7,5% sur 7 jours glissant. Par exemple : prélèvement avant administration, puis 3h, 6h, 12h et 24h après, 0.5 à 1 ml à chaque temps. Dans une étude standard, 5 administrations sont nécessaires : 1 avec un placebo, 3 avec une doses différentes de la molécule thérapeutique, et une dernière avec le dose la plus importante utilisé afin d'effectuer des dosages de la molécule et s'assurer de la bonne exposition de l'animal.

Impact sur les animaux

Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. - Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress. - Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang et l’administration répétée d'une molécule peut provoquer des lésions locales et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. De plus, même si ces effets délétères sont rares lorsque le geste est réalisé par un opérateur expérimenté, il existe un risque de lésions ou d’infection lors d’administration intrathécale, intracraniale (lésions neurologiques, paralysie partielle) ou intra-articulaire (boiterie, arthrite). - Liées à une toxicité du xénobiotique testé : il n’est pas attendu d’effets toxiques majeurs dans les études de pharmacologie en raison de la faible dose administrée de xénobiotique ou d'une administration unique.

Devenir

Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet ne sont pas aptes à une réhabilitation en raison du système d'enregistrement cardiovasculaire implanté. Le système a une durée de vie d'environ 2 ans. Dans la mesure du possible, les animaux seront ré-utilisés (après validation vétérinaire prenant en compte l'ensemble de la vie de l'animal) dans d'autres projets afin de limiter le nombre total d'animaux utilisés. S'ils ne sont pas aptes à une réutilisation, ils seront euthanasiés.

Remplacement

La pharmacologie de sécurité étudie les interactions entre une molécule étrangère à l’organisme (le composé thérapeutique) et une ou plusieurs cibles liées au système cardiovasculaire (objet de cette DAP). Ces interactions englobent les effets du composé ou de ses produits de dégradation, sur des cibles, mais aussi l’influence éventuelle de ces cibles sur le composé. Une compréhension fine des mécanismes toxique et pharmacologique est donc indissociable d’une connaissance approfondie des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. À ce jour, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes impliqués dans la toxicité cardiovasculaire ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe pas, en conséquence, de modèle de substitution. C’est pourquoi la réglementation impose l’évaluation de la sécurité pharmacologique d’un composé thérapeutique avant toute administration chez l’humain. Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont encadrées par des directives internationnales. Elles peuvent être réalisées chez des espèces rongeurs ou non rongeurs. Le macaque, en raison de sa proximité avec l’humain, est l’une des espèces non rongeurs retenue pour ce type d’étude, lorsque le composé thérapeutique testé est suceptible de déclencher une réaction immunitaire, que sa cible dans l’organisme est présente que chez les primates (dont l’humain) ou que son métabolisme est plus proche de celui de l’humain chez le macaque par rapport aux autres espèces non primates.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie cardiovasculaire de sécurité : • nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • des études pilotes seront réalisées, si nécessaire, sur un nombre limité d’animaux. L’objectif sera d’identifier les doses les plus favorables et les moins toxiques • un même animal pourra participer à plusieurs études si et seulement si : o les composés testés précédemment n’ont présenté ni effets cardiovasculaires irréversibles, ni effets toxiques oUne période de repos de 15 jours minimum entre la fin de dernière étude et la prochaine. Cette période peut être allongé selon les profils pharmacocinétiques des produits, un avis vétérinaire. o les paramètres biochimiques et hématologiques évalués avant l’étude se situent dans les valeurs de référence attendues pour cette espèce Le nombre d’animaux par étude est de 4 (4 males) et peut aller jusqu’à 8 (4 males et 4 femelles). Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation statistique pertinente des données, et la caractérisation correcte des effets cardiovasculaires potentiels.

Raffinement

Le raffinement de nos procédures inclue : La gestion du stress et de l’angoisse : à leur arrivé sur site, les animaux seront acclimatés (3 semaines) aux conditions d’hébergement, et suivent un programme d’habituation et d’entrainement aux procédures expérimentales ainsi qu'aux manipulations vigiles, basés sur le renforcement positif. Ils seront également hébergés en collectivité, pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi, validé par la structure en charge du bien-être animal et le service vétérinaire La prise en charge précoce de la souffrance : un opérateur observera a minima matin et soir chaque animal. La douleur sera objectivée en fonction de modifications de l'apparence, de la posture et du comportement selon une procédure interne rédigé par le service vétérinaire. Dès les premiers signes de douleur, une intervention vétérinaire sera effectuée. L’utilisation de grilles de signes cliniques ou de score de douleurs permettra aux opérateurs et aux vétérinaires de mettre en place les mesures les mieux adaptés à l’état de l’animal. Un vétérinaire est toujours présent aux heures ouvrées et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7 Certaines administrations seront effectuées systématiquement sous anesthésie Des soins vétérinaires adaptés si nécessaires : compléments alimentaires, sérum physiologique, antibiotiques, analgésiques. En fonction des effets attendus ou observés du composé testé sur la fonction cardiaque, des molécules permettant de traiter ces éventuels effets peuvent être utilisées. L’intégration de points limites stricts afin de limiter toutes souffrances prolongées Spécifiquement pour les études de cardiologie, la méthode validée nécessite l'implantation chirurgicale d'un module de télémétrie. Afin de rendre cette technique moins invasive, l'utilisation d'un module externe avec des électrodes de surface et un gilet porté le temps des enregistrements est à l’étude.

Choix des espèces

Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont encadrées par des directives internationnales. Elles peuvent être réalisées chez des espèces rongeurs ou non rongeurs. Le macaque, en raison de sa proximité avec l’humain, est l’une des espèces non rongeurs retenue pour ce type d’étude, lorsque le composé thérapeutique testé est suceptible de déclencher une réaction immunitaire, que sa cible dans l’organisme est présente que chez les primates (dont l’humain) ou que son métabolisme est plus proche de celui de l’humain chez le macaque par rapport aux autres espèces non primates. Les macaques sont inclus dans les études de pharmacologie à partir de 2 ans.

Quatre macaques à longue queue subissent une chirurgie d'une heure trente à deux heures sous anesthésie générale pour recevoir un vecteur de thérapie génique dans un rein, l'autre rein servant de témoin. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec six prises de sang sous sédation et des injections d'un traitement immunorégulateur. Le porteur qualifie cette administration de "non invasive" et la présente comme un raffinement, alors qu'elle passe par une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et par un abord des voies urinaires exposant à une infection, une inflammation locale et des saignements. Deux à trois semaines plus tard, une seconde chirurgie précède la mise à mort des quatre animaux pour prélèvement d'organes.

Objectifs

La cystinurie est une maladie rénale qui aboutit à l’insuffisance rénale suivies de dialyse/transplantation. L’incidence de la cystinurie est faible (≈1/7000), mais les calculs de cystine sont très récurrents et entraînent une morbidité importante : interventions chirurgicales fréquentes et lésions rénales dans près de 80% des cas. La précipitation de cystine est la seule manifestation de cette maladie, qui se traite par des mesures diététiques visant à obtenir des urines non sursaturées en cystine. Malheureusement, malgré cela, plus de 85% des patients récidivent. Il existe des traitements médicamenteux qui visent à modifier la cystine urinaire pour la rendre incapable de former des cristaux mais ces médicaments entraînent des effets secondaires. Ce projet vise à tester une nouvelle solution de thérapie génique injectée administrée dans les voies urinaires de manière non-invasive. Des études préliminaires chez le primate ont permis de valider l’intégration du gène dans les cellules cibles chez le primate mais en administration invasive. D’autres études ont permis de valider chez le porc, une méthode chirurgicale non invasive d’administration d’un produit de thérapie génique dans le rein par voie rétrograde. Nous souhaitons maintenant appliquer ce même protocole chez le primate (macaques cynomolgus) dont l’anatomie rénale est beaucoup plus proche de celle de l’Homme par rapport au porc afin de confirmer l’efficacité du transfert de gène et conforter à terme cette approche chez l’Homme.

Bénéfices attendus

- Opportunités thérapeutiques : La confirmation que la technique d’administration non invasive permet de reproduire ces résultats ouvrirait de multiples opportunités pour traiter un ensemble important de maladies rénales originaires du néphron, tels que la cystinurie. - Sécurité thérapeutique : éviter les effets secondaires : La validation de la méthode d’administration non invasive permet de concentrer le vecteur de thérapie génique dans l’organe cible limitant ainsi la circulation sanguine et les effets secondaires comme ont pu en être observés dans le cas de thérapies géniques contre la myoptahie de Duchenne par exemple. - Mode d’administration raffiné : une fois validée l’administration par les voies naturelles offrira aux patients un traitement rapide, non invasif, précis et ne nécessitant pas d’hospitalisation.

Procédures

Sur la durée du projet, les animaux subiront les interventions suivantes : -6 prises de sang sous sédation ce qui représente une injection intramusculaire du sédatif d’une durée de moins d’une minute. La prise de sang dure environ 2 minutes. La sédation complète dure environ une demi-heure. -Un traitement immunorégulateur (pour éviter le rejet de la thérapie génique) qui se présentera sous la forme de 2 d’injections intramusculaires (2 pour chaque molécules administrées) (durée moins d’une minute). -une chirurgie pour administration de vecteur de thérapie génique sous anesthésie générale (durée entre 1h30 et 2h) -A la fin du projet (au bout de 2-3 semaines) : une chirurgie sous anesthésie générale (max 1h).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les animaux sont: - pour l’anesthésie : douleur transitoire au site d'injection de l’anesthésique, risque d'hématome au niveau du point d’entrée du cathéter - Injection de la thérapie génique dans les voies urinaires : risque d’infection urinaire, de réaction inflammatoire locale, et de saignement transitoire, - injections intraveineuses : risque d'hématome, risque de réaction allergique. - pour les prises de sang répétées sous anesthésie générale : risque d’hématome.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole (prélèvements d'organes)

Remplacement

Compte tenu du fait que le but du projet est de valider une approche non invasive raffinée pour réaliser de la thérapie génique au niveau rénale, il ne peut y avoir d’alternative à l’usage d’un modèle animal. Après administration de la thérapie génique, il sera nécessaire de maintenir l’animal en vie afin de pouvoir évaluer le niveau et la distribution de l’expression du gène transféré. Ainsi, nous ne pourrions substituer un animal vivant pour un animal mort.

Réduction

Il s’agit ici d’un travail exploratoire donc purement qualitatif sans statistique. Les 4 primates permettront d’explorer le protocole finalisé utilisé chez le cochon en injectant le même vecteur de thérapie génique sur 1 rein par primate en utilisant le deuxième rein comme control négatif ne recevant que le tampon de formulation. Au total, 4 reins seront exposés au vecteur de thérapie génique et le deuxième rein sera systématiquement utilisé comme témoin négatif. Avec les résultats déjà obtenus précédemment sur 4 primates injectés de manière invasive, les 4 nouveaux primates de ce projet suffiront pour confirmer la reproductibilité des résultats mais après administration non invasive par un protocole directement applicable à l’Homme. Nous pourrons également explorer l’intensité et la distribution dans le rein du transfert de gène en utilisant la même dose utilisée jusqu’à présent chez le porc et ainsi pouvoir comparer.

Raffinement

*****Conditions d’hébergement : Une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée avant le début de l’étude. La compatibilité sociale sera vérifiée tout au long de l’étude pour garantir un bien être social. Tous les animaux sont habitués à la présence humaine dès leur arrivée sur site et au préalable à tout protocole expérimental. Les animaux seront hébergés au minimum par paire. Un programme d’enrichissement spécifique à l’éspèce et à l’âge des animaux utilisés est mis en place sur tout le site et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. ******Conditions expérimentales : l’administration dans le rein par les voies naturelles est justement choisie comme méthode d’administration des vecteurs de thérapie génique car cette voie n’est pas invasive. En effet, en clinique humaine, ce type de protocole ne nécessite pas de prise en charge particulière après l’examen. De plus, cet examen mobilisera l’intervention d’un urologue spécialisé dans cette pratique chez des patients humains mais également lors d’enseignements sur des porcs pour former des chirurgiens à cet abord chirugical non-invasif. Les animaux sont anesthésiés pour toutes les procédures et recevront des analgésiques pour les chirurgies et ils font l’objet d’un suivi au réveil afin de s’assurer qu’ils ont bien récupéré de leur anesthésie. Nous travaillerons de manière aseptique (matériel stérile, à usage unique ou autoclavable, champs stériles, tenue stérile de l'opérateur et du chirurgien, désinfection cutanée et des muqueuses) afin de pouvoir éviter les risques infectieux et garder en vie pendant une période de 2-3 semaines l’animal injecté sans que sa fonction rénale et son état général n’en soit affectés. L'usage d'une antibiothérapie de couverture en peropératoire et postopératoire immédiat permettra également d'éviter les risques infectieux. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure si besoin.

Choix des espèces

Afin que l’étude que nous proposons ait une pertinence forte pour ensuite déposer un dossier de demande d’essai clinique aux agences réglementaires ad hoc, l’espèce animale doit permettre d’évaluer précisément la procédure d’administration du traitement avec un équipement identique et un protocole adapté à celui déjà utilisé chez les patients humains. De plus, nous disposons de données scientifiques montrant que le vecteur de thérapie génique employé permet une intégration remarquable du gène au niveau du rein de souris, rat, macaque et porc. Après avoir optimisé les conditions d’administration du vecteur de thérapie génique chez le porc nous souhaitons maintenant appliquer ce même protocole chez le primate dont l’anatomie rénale est beaucoup plus proche de celle de l’Homme par rapport au porc afin de confirmer l’efficacité du transfert de gène et conforter à terme cette approche chez l’Homme. Cela permettra à terme de proposer un dossier de demande d’essai clinique complet. Les animaux sélectionnés pour ce projet sont de jeunes adultes.

12 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse de leur cerveau. Huit reçoivent des traceurs injectés dans le cerveau au cours d'opérations de quatre à six heures, suivies de trois jours de traitement antidouleur, quatre portent un implant crânien et une barre de tête, et quatre vivent sous restriction d'eau pendant sept à seize mois. Le but est fondamental, comprendre comment les voies descendantes du cortex fabriquent des prédictions, question posée en parallèle chez des humains par IRM fonctionnelle. Sur le remplacement, le porteur écarte l'informatique en affirmant qu'il n'existera pas de modèle assez précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible.

Objectifs

Les études neurophysiologiques classiques sur le traitement de l’information au sein du cortex montrent que les voies ascendantes de la hiérarchie corticale génèrent des représentations du monde de plus en plus complexes au sein des aires dites de haut niveau hiérarchique, chaque niveau traitant les données sensorielles dans des fenêtres spatiotemporelles de plus en plus étendues. Par contraste, la fonction des voies descendantes reste largement inconnue, constituant ainsi un obstacle majeur à la compréhension du fonctionnement du cerveau dans sa globalité. On attribue pourtant aux voies descendantes, non pas un seule mais plusieurs fonctions complexes telles que l’imagination de représentations sensorielles à partir de concepts issus de l’expérience d’objets visuels (e.g. imagerie mentale d’une orange). La théorie du codage prédictif propose que notre représentation interne du monde se base sur l’interaction entre connexions descendantes (qui transmettent les informations de prédiction sur l’origine des messages ascendants) et les connexions ascendantes (qui 1. encodent la différence entre prédictions des niveaux hiérarchiques supérieurs et signal reçu des niveaux inférieurs et 2. transmettent cette erreur de prédiction aux niveaux supérieurs afin d’adapter en continu leurs prédictions). Les théories sur le traitement hiérarchique prédictif ont un impact significatif sur la compréhension des mécanismes neuronaux liés aux processus de perception, cognition, langage ou encore conscience dans le cerveau humain, en condition saine et pathologique. Malgré cette importance, il existe peu d’évidences empiriques chez les primates dont fait partie l’homme concernant les réseaux de voies descendantes et la nature fonctionnelle des signaux transmis, et les processus d’intégration entre signaux ascendants et descendants restent largement indéterminés. Le but du projet est d’identifier les circuits neuronaux anatomiques et fonctionnels du traitement prédictif dans le système visuel. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez l’animal sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux qui sont impliqués dans la représentation neuronale des sens (en particulier la perception visuelle), ce qui permet une compréhension mécanistique du codage prédictif, mais aussi de son rôle dans des processus tels que l'imagerie mentale et l'imagination. Nos recherches sont menées en parallèle chez l’homme avec des paradigmes comportementaux similaires ; où, dans le modèle animal, les techniques invasives permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et, chez l’homme, de confirmer et d’extrapoler ces résultats au cerveau entier grâce à l’IRMf. Notre objectif global est de comprendre le traitement hiérarchique dans le cerveau humain, ce qui, dans le domaine émergent de la psychiatrie computationnelle, permettra de mieux comprendre les mécanismes neuronaux en cause dans de nombreux troubles cérébraux.

Procédures

Étapes d’imagerie sous anesthésie générale : scan CT - EU2 (n=12, 1 fois/animal, 10min); IRM - EU1 (n=12, 2 fois/animal, 3-5h). Étape d’injection de traceurs sous anesthésie générale - EU1 (n=8, 1 fois/animal, 4-6h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=8, 1 fois/animal, 3j). Étape d’enregistrements électrophysiologiques aigus sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 1-3j). Étape d'implantation de l'implant pour enregistrements semi-chroniques sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h). Étape de fixation de la barre de tête sur l'implant sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 4-5h). Étape d'injection de traceurs et insertion des électrodes - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=4, 1 fois/animal, 3-5j) - EU1, avec adaptation ou prolongation des traitements post-opératoires selon l’avis du vétérinaire référent. Étape de mis à jeun avant anesthésie générale (max 16h). Étape de contrôle hydrique (n=4, 1 fois/animal, 28-64sem).

Impact sur les animaux

Injection intramusculaire = légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille et de l’injection du liquide médicamenteux. Contrôle hydrique = possible perte de poids et baisse du niveau d’hydratation. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place. Injection intracérébrale de traceurs et Implantation intracrâniale = douleurs post-opératoires liées à l’acte chirurgical, 3 à 5 jours. Un suivi de la douleur en période post-opératoire est réalisé pour adapter le traitement contre la douleur.

Devenir

À l’issue de chacune des trois procédures, les animaux seront euthanasiés (12 animaux, 3 Lots). Le passage d’une étape à l’autre se fait systematiquement sous condition de récupération complète de l’animal après chaque étape. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 12 animaux est nécessaire à la validation scientifique du projet (identification de la signature cellulaire et moléculaire des connexions ascendantes et descendantes ; quantification anatomique et fonctionnelle des connexions ascendantes et descendantes ; validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).

Remplacement

La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Il a été demontré par ailleurs que la tractographie par IRM de diffusion (IRMd) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.

Réduction

Le principal facteur nous contraignant au choix de 2 animaux au minimum par procédure réside dans le minimum internationalement reconnu pour la publication et la validation des résultats dans des journaux internationaux avec relecture par des pairs. Les statistiques étant réalisés sur le nombre total de cellules séquencées afin de pouvoir les classer en groupes ou clusters qui différent de par leur expression génomique. D'autres animaux sont prévus uniquement en remplacement (par exemple en cas d’atteinte de point limite avant la fin de la procédure et l’impossibilité d’exploiter les résultats pour cet animal), ou dans le cas où nous devrions augmenter la quantité totale de cellules nécessaire pour le séquençage (environ 10000 cellules par type de projection). Notre expérience montre qu’une injection dans 2 aires différentes permet le marquage de 12000-60000 cellules par type de projection de l’aire source vers deux aires cibles injectées. Le nombre de traceurs pouvant être utilisés simultanément a été récemment augmenté de 4 à 5, ce que devrait suffire pour obtenir un nombre suffisant de cellules par type de projection ; réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. L’analyse statistiques portant sur les mesures répétées (nombre d’essais par neurone et par condition) pour les différents types de neurones unitaires enregistrés. L’utilisation des mesures répétées augmente considérablement la puissance statistique permettant d’étudier l’effet sur un échantillon de petite taille (

Raffinement

Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie avec la mise en place de points limites pour le passage d'une étape à une autre. Une grille de score post-op nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, sous anesthésie génerale, en supprimant l’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce à un nouveau système qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par un laser connecté au système de navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal. Pour les actes de scan CT (ou tomodensitométrie) effectués dans l'EU2, le transport de l'EU1 à l'EU2 d'une durée de 10 minutes est effectué sous anesthésie en cage de transport avec couverture de survie et couverture rembourée.

Choix des espèces

1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous devons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre le carnivore et l’homme est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications de l’équipe de recherche démontrent une forte homologie entre le connectome cortical humain et non-humain mais également de leurs différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.

Tués à l'issue pour que leur cerveau soit découpé et analysé, 12 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des IRM de trois à cinq heures, des injections de traceurs directement dans le cerveau lors d'opérations de quatre à six heures, la pose d'un implant crânien et d'une barre de tête, puis l'insertion d'électrodes. Quatre d'entre eux vivent sous contrôle hydrique pendant vingt-huit à soixante-quatre semaines, avec un risque de déshydratation dont le porteur détaille les signes, muqueuses sèches, peau qui perd son élasticité, urine concentrée. Le choix du macaque tient à ce que le rongeur ne convient pas pour l'IRM des fibres cérébrales et que l'homologie du carnivore avec l'humain est jugée trop pauvre.

Objectifs

Les études neurophysiologiques classiques sur le traitement de l’information au sein du cortex montrent que les voies ascendantes de la hiérarchie corticale génèrent des représentations du monde de plus en plus complexes au sein des aires dites de haut niveau hiérarchique, chaque niveau traitant les données sensorielles dans des fenêtres spatiotemporelles de plus en plus étendues. Par contraste, la fonction des voies descendantes reste largement inconnue, constituant ainsi un obstacle majeur à la compréhension du fonctionnement du cerveau dans sa globalité. On attribue pourtant aux voies descendantes, non pas un seule mais plusieurs fonctions complexes telles que l’imagination de représentations sensorielles à partir de concepts issus de l’expérience d’objets visuels (e.g. imagerie mentale d’une orange). La théorie du codage prédictif propose que notre représentation interne du monde se base sur l’interaction entre connexions descendantes (qui transmettent les informations de prédiction sur l’origine des messages ascendants) et les connexions ascendantes (qui 1. encodent la différence entre prédictions des niveaux hiérarchiques supérieurs et signal reçu des niveaux inférieurs et 2. transmettent cette erreur de prédiction aux niveaux supérieurs afin d’adapter en continu leurs prédictions). Les théories sur le traitement hiérarchique prédictif ont un impact significatif sur la compréhension des mécanismes neuronaux liés aux processus de perception, cognition, langage ou encore conscience dans le cerveau humain, en condition saine et pathologique. Malgré cette importance, il existe peu d’évidences empiriques chez les primates dont fait partie l’homme concernant les réseaux de voies descendantes et la nature fonctionnelle des signaux transmis, et les processus d’intégration entre signaux ascendants et descendants restent largement indéterminés. Le but du projet est d’identifier les circuits neuronaux anatomiques et fonctionnels du traitement prédictif dans le système visuel. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez l’animal sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux qui sont impliqués dans la représentation neuronale des sens (en particulier la perception visuelle), ce qui permet une compréhension mécanistique du codage prédictif, mais aussi de son rôle dans des processus tels que l'imagerie mentale et l'imagination. Nos recherches sont menées en parallèle chez l’homme avec des paradigmes comportementaux similaires ; où, dans le modèle animal, les techniques invasives permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et, chez l’homme, de confirmer et d’extrapoler ces résultats au cerveau entier grâce à l’IRMf. Notre objectif global est de comprendre le traitement hiérarchique dans le cerveau humain, ce qui, dans le domaine émergent de la psychiatrie computationnelle, permettra de mieux comprendre les mécanismes neuronaux en cause dans de nombreux troubles cérébraux.

Procédures

Étapes d’imagerie sous anesthésie générale : scan CT - EU2 (n=12, 1 fois/animal, 10min); IRM - EU1 (n=12, 2 fois/animal, 3-5h). Étape d’injection de traceurs sous anesthésie générale - EU1 (n=8, 1 fois/animal, 4-6h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=8, 1 fois/animal, 3j). Étape d’enregistrements électrophysiologiques aigus sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 1-3j). Étape d'implantation de l'implant pour enregistrements semi-chroniques sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h). Étape de fixation de la barre de tête sur l'implant sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 4-5h). Étape d'injection de traceurs et insertion des électrodes - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=4, 1 fois/animal, 3-5j) - EU1, avec adaptation ou prolongation des traitements post-opératoires selon l’avis du vétérinaire référent. Étape de mis à jeun avant anesthésie générale (max 16h). Étape de contrôle hydrique (n=4, 1 fois/animal, 28-64sem).

Impact sur les animaux

Injection intramusculaire = légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille et de l’injection du liquide médicamenteux. Contrôle hydrique = possible perte de poids et baisse du niveau d’hydratation. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place. Injection intracérébrale de traceurs et Implantation intracrâniale = douleurs post-opératoires liées à l’acte chirurgical, 3 à 5 jours. Un suivi de la douleur en période post-opératoire est réalisé pour adapter le traitement contre la douleur.

Devenir

À l’issue de chacune des trois procédures, les animaux seront euthanasiés (12 animaux, 3 Lots). Le passage d’une étape à l’autre se fait systematiquement sous condition de récupération complète de l’animal après chaque étape. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 12 animaux est nécessaire à la validation scientifique du projet (identification de la signature cellulaire et moléculaire des connexions ascendantes et descendantes ; quantification anatomique et fonctionnelle des connexions ascendantes et descendantes ; validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).

Remplacement

La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Il a été demontré par ailleurs que la tractographie par IRM de diffusion (IRMd) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.

Réduction

Le principal facteur nous contraignant au choix de 2 animaux au minimum par procédure réside dans le minimum internationalement reconnu pour la publication et la validation des résultats dans des journaux internationaux avec relecture par des pairs. Les statistiques étant réalisés sur le nombre total de cellules séquencées afin de pouvoir les classer en groupes ou clusters qui différent de par leur expression génomique. D'autres animaux sont prévus uniquement en remplacement (par exemple en cas d’atteinte de point limite avant la fin de la procédure et l’impossibilité d’exploiter les résultats pour cet animal), ou dans le cas où nous devrions augmenter la quantité totale de cellules nécessaire pour le séquençage (environ 10000 cellules par type de projection). Notre expérience montre qu’une injection dans 2 aires différentes permet le marquage de 12000-60000 cellules par type de projection de l’aire source vers deux aires cibles injectées. Le nombre de traceurs pouvant être utilisés simultanément a été récemment augmenté de 4 à 5, ce que devrait suffire pour obtenir un nombre suffisant de cellules par type de projection ; réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. L’analyse statistiques portant sur les mesures répétées (nombre d’essais par neurone et par condition) pour les différents types de neurones unitaires enregistrés. L’utilisation des mesures répétées augmente considérablement la puissance statistique permettant d’étudier l’effet sur un échantillon de petite taille (

Raffinement

Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie avec la mise en place de points limites pour le passage d'une étape à une autre. Une grille de score post-op nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, sous anesthésie génerale, en supprimant l’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce à un nouveau système qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par un laser connecté au système de navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal. Pour les actes de scan CT (ou tomodensitométrie) effectués dans l'EU2, le transport de l'EU1 à l'EU2 d'une durée de 10 minutes est effectué sous anesthésie en cage de transport avec couverture de survie et couverture rembourée.

Choix des espèces

1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous devons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre le carnivore et l’homme est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications de l’équipe de recherche démontrent une forte homologie entre le connectome cortical humain et non-humain mais également de leurs différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.

36 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, huit d'entre eux étant tués pour le prélèvement d'organes et vingt-huit réutilisés dans d'autres procédures du projet ou d'autres études. Chacun subit jusqu'à huit prises de sang dans une même journée, vingt-cinq au total sur douze semaines, trois prélèvements de ganglions de trente minutes, et pour certains un prélèvement de moelle osseuse. Les anesthésies s'enchaînent sur vingt-quatre heures, dont une de deux heures et, pour une seconde procédure, une de huit heures, que le porteur reconnaît inconfortables. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace un système immunitaire complet, ce qui rend selon lui l'usage d'animaux non-humains "indispensable".

Objectifs

Les immunothérapies sont des traitements qui agissent sur le système immunitaire du patient pour lutter contre la pathologie. Dans le cadre du cancer, les immunothérapies ont pour objectifs de réactiver le système immunitaire affaibli par la tumeur. Dans le cadre des maladies auto-immunes ou maladie inflammatoire chronique, les immunothérapies ont pour but d’inhiber ou de réguler le système immunitaire. Malgré des avancées et plusieurs immunothérapies efficaces, les patients non-répondeurs/en rechutes sont nombreux. Il est donc essentiel de continuer de chercher d’autres combinaisons de thérapie pour améliorer les soins actuels dans le cancer ou maladies inflammatoires chroniques ou aigues.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’une part d’évaluer la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’un produit destiné à la médicamentation humaine permettant ainsi d’anticiper un schéma d’administration, valider l’intérêt thérapeutique et d’estimer d’éventuels effets secondaires liés à l’injection de ce médicament. La biodistribution de la molécule thérapeutique d’intérêt dans les tissus permettra de renforcer ces données.

Procédures

Les animaux seront soumis à des anesthésies pour effectuer une injection intraveineuse de la molécule thérapeutique d’intérêt, à plusieurs prélèvements : - sanguins (au maximum 8 dans une même et seule journée, 25 sur la totalité de la procédure expérimentale sur 12 semaines maximum) durée 15 min -de ganglions (3, avant et pendant le traitement,) durée 30 min. Des animaux pourront avoir un prélèvement de moelle osseuse (durée 30 min). Des anesthésies prolongées seront effectuées (maximum 2 heures pour une procédure et 8h pour une seconde) lors de l’injection intraveineuse et le prélèvement de ganglions.

Impact sur les animaux

Les protocoles d’anesthésie répétés sur 24h, et notamment une anesthésie prolongée de 2h, lors de l’injection de la molécule pour évaluer la pharmacodynamique seront inconfortables et à ce titre, les animaux spécifiquement lors de cette journée seront suivis de manière accrue et l’inconfort le plus adéquatement maîtrisé. Une légère douleur peut être induite par le prélèvement de moelle osseuse, qui sera traitée par antalgique.

Devenir

Les protocoles utilisés dans cette étude permettent une réutilisation de 28 des animaux dans ce projet après accord du vétérinaire et du SBEA pour une nouvelle procédure. Effectivement, un même animal pourra être réutilisé dans une autre procédure de cette même étude, mais également dans un protocole d'une autre étude. Les 8 animaux (ré-)utilisés pour évaluer la biodistribution de la molécule seront mis à mort pour permettre le prélèvement de différents organes, ces animaux auront pû précédemment étre utilisés dans une procédure expérimentale légère ou modérée.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires, sur des lignées cellulaires, sur des cellules et biopsies humaine (ex vivo) ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule. Des analyses computationnelles de banques de données humaines et animales ont également permis de confirmer la cohérence des traitements étudiés. Les résultats obtenus lors d’études préliminaires in vivo chez la souris nous permettent maintenant d’étudier la molécule de façon plus précise chez le primate non humain.

Réduction

Ce genre de protocole chez le macaque ne peut être réalisé comme une étude statistique, en effet, dans le respect de la règle des 3R et d’un point de vue éthique, nous limitons le nombre d’animaux au strict minimum,. Cependant, compte tenu de la variabilité individuelle, un nombre minimal d’animaux est essentiel pour obtenir une relevance scientifique quant à l’interprétation des résultats obtenus et l’identification d’un éventuel effet thérapeutique tout en réalisant de manière fiable une étude Pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule. Dès que cela est possible, les animaux seront réutilisés entre les différentes procédures expérimentales de la même molécule ou d’une autre molécule, cela permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé dans ce projet. Lors de l’étude, les animaux seront leur propre contrôle. Si une dose testée répond à toutes les attentes, les autres doses ne seront pas étudiées. Une étude bibliographique approfondie de l’art antérieur sera effectuée pour espère trouver cette dose. Si une molécule n’a pas un profil satisfaisant pour passer en essai clinique chez l’homme, l’étude complémentaire au niveau tissulaire ne sera pas effectuée.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées chez le macaque sous anesthésie. La douleur sera dans la mesure du possible évitée par injection d’analgésique Les animaux sont hébergés avant et après protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.

Choix des espèces

Les primates non humains, et plus précisément les macaques dans cette étude, représentent l’espèce animale de choix comme modèle préclinique étant donné leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’Homme. La constitution du système immunitaire est dépendante de l’âge des animaux donc il s’agira de préférence d’animaux jeunes adultes dont le système immunitaire est alors mature.

Pour savoir dans quels organes s'accumule un candidat médicament contre le diabète de type 2, quatre macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois reçoivent le produit par injection lente dans une veine de la jambe, isolée de la circulation générale par un garrot, sous anesthésie et pendant une heure environ. Ils subissent ensuite seize prises de sang sur dix-sept semaines et quatre biopsies sur chaque quadriceps, avec des œdèmes, des hématomes et une boiterie aiguë parmi les effets attendus, puis sont mis à mort cent treize jours après l'injection pour que leurs organes soient prélevés. Le quatrième, dit "pilote", sert uniquement à roder la technique d'injection et reste en vie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de comprendre comment un nouveau candidat médicament contre le diabète de type 2 agit dans le corps : comment il circule, combien de temps il reste actif, quels effets il produit et dans quels organes il s’accumule. Le candidat médicament testé bloque sélectivement avec certains gènes impliqués dans la résistance à l’insuline, mécanisme central du diabète de type 2. Contrairement aux traitements qui contrôlent principalement la glycémie, ce candidat médicament vise donc à corriger la cause physiopathologique sous-jacente de la maladie. L’hypothèse est qu’une administration unique de ce médicament permettra d’induire une amélioration durable de la sensibilité à l’insuline des patients et, par conséquent, un meilleur contrôle métabolique. Cette étude préliminaire sur primate est nécessaire pour déterminer les caractérisitiques principales du produit une fois administré dans un organisme entier, avant de futurs études précliniques et cliniques. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de ce candidat médicament. L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, les dosages utilisés dans ce projet sont efficaces mais a priori non toxiques (d’après des études toxicologiques préliminaires).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont à terme la validation et la mise sur le marché d’un traitement innovant pour le diabète de type 2, qui pourrait être administré en une seule injection et offrir des effets durables. Ce médicament pourrait améliorer significativement la qualité de vie des patients en réduisant les contraintes liées aux traitements chroniques.

Procédures

Après plus un mois d’acclimatation et d’habituation, 3 animaux recevront une seule fois le candidat médicament par injection intra-veineuse sur membre isolé (injection lente du produit dans une veine sur une jambe coupée de la circulation sanguine générale à l’aide d’un garrot). L’intervention durera environ une heure et sera réalisée sous anesthésie et analgésie (après mis à jeun de moins de 16h). Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration du candidat médicament sur animal vigile afin d'étudier sa concentration dans le sang au cours du temps et de mesurer certains paramètres physiologiques des animaux (16 prélèvements sanguins seront réalisés sur une période de 17 semaines). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 15 minutes. 4 biopsies de muscles seront réalisées sur chaque quadriceps (à minimum un mois d’intervalle). L’intervention sera réalisée sous anesthésie et analgésie (après mis à jeun) durera environ 30 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée sera réalisée chaque semaine. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x le jour de l’administration, et 1x/jour 3 jours après administration. Le projet prendra fin 113 jours après administration de du candidat médicament et les 3 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes. Un 4eme animal sera utilisé uniquement pour la mise au point technique et au raffinement de la procédure d’administration de du candidat médicament (l’animal ne subira aucun prélèvement ou autre manipulation au cours du projet). Cet individu recevra une injection de solution physiologique inerte et ne sera pas exposé au du candidat médicament. L’animal bénéficiera d’une période d’acclimatation et d’un suivi clinique rapproché au même titre que les 3 animaux du projet principal. Il sera gardé en vie à l’issue du projet.

Impact sur les animaux

Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux. L’administration du candidat médicament (sous anesthésie et analgésie) peut provoquer une douleur légère, un œdème aigue (durant environ 24h maximum), des hématomes et une boiterie aigue (se résorbant en quelques heures). Les biopsies de muscles sous anesthésie et analgésie pourront provoquer des douleurs légères ainsi que des réactions locales au niveau du site de ponction ou une infection post-opératoire. L'anesthésie des animaux dans le cadre de ces interventions (biopsies et administration) pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

Les 3 animaux qui recevront une injection du candidat médicament seront mis à mort afin de récolter leurs organes pour déterminer dans quels tissus le produit s’accumule. Seul l’animal « pilote » n’ayant pas reçu le candidat médicament sera gardé en vie.

Remplacement

Les études pharmacocinétique, pharmacodynamie et de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer combien de temps un médicament reste actif, son efficacité et sa localisation dans les tissus. Ceci ne pourrait être obtenu in vitro, car les modèles cellulaires utilisés en laboratoire restent trop simplifiés : ils ne reproduisent qu’une partie d’un organe isolée du reste du corps. Or, les paramètres étudiés dans ce projet dépendent d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant complexe (exemples : le débit sanguin, les échanges entre les tissus, le fonctionnement du foie et des reins, les barrières biologiques, …). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante, permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 4 animaux seront utilisés, 3 pour le projet principal qui subiront l’ensemble des manipulations et 1 animal « pilote » utilisé uniquement pour la mise au point technique du modèle d’administration du médicament. Concernant les 3 premiers animaux : Chaque animal recevra une dose différente du candidat thérapeutique (faible, intermédiaire, élevée). Cette approche permet de tester l’ensemble des doses potentiellement efficaces chez l'Homme, sans multiplier les groupes. Le suivi longitudinal de chaque animal (analyses biologiques et suivi métabolique avant et après administration) permettra de recueillir un maximum de données à partir de chaque individu, réduisant le besoin d’animaux supplémentaires. Cette étude étant préliminaire et non règlementaire, elle ne nécessite pas d’utiliser de grands groupes d’animaux pour réaliser des tests statistiques. En amont de l’utilisation de ces 3 animaux, un 4eme animal sera utilisé uniquement pour la mise au point technique de la procédure d’administration du médicament. L’ajout de cet animal « pilote » permet de sécuriser et d’optimiser la procédure avant l’administration du candidat thérapeutique, évitant ainsi toute perte ou souffrance inutile. En fonction des résultats obtenus à partir de cet animal, l’administration du médicament pourra donc être adaptée pour raffiner la procédure.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux, de la litière pour permettre aux primates de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine, des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs), de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant un mois avant le début du projet. Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les biopsies et l’administration du candidat médicament seront réalisées sous anesthésie et analgésie et un traitement analgésique post-opératoire sera mis en place. L’animal « pilote » bénéficiera d’un programme d’enrichissement, d’une période d’acclimatation et d’un suivi clinique rapproché au même titre que les 3 animaux du projet principal. En fonction des résultats obtenus à partir de cet animal, l’administration du candidat médicament pourra être optimisée afin de raffiner la procédure. Les prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile car l'anesthésie modifie les paramètres physiologiques étudiés et engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Les primates sont utilisés comme modèle de recherche avant de tester certains traitements chez l’Homme. Leur système immunitaire réagit de façon très semblable au nôtre, ce qui permet de prévoir d’éventuelles défenses du corps contre le traitement. Leur grande proximité génétique et physiologique avec l’Homme les rend aussi très utiles pour étudier combien de temps le traitement reste actif, comment il agit et dans quels organes il se diffuse. Ainsi, son emploi est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. À ce stade de développement, les animaux présentent un système immunitaire pleinement fonctionnel, comparable à celui d’un patient adulte, ce qui est indispensable pour évaluer la réponse du corps vis-à-vis du candidat médicament testé. Leur organisme a atteint la maturité physiologique et métabolique, mais ne subit pas encore de variations néfastes liées au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes permet de réduire les facteurs associés à des pathologies liées à l’âge qui pourraient interférer dans l’analyse des résultats et la qualité des échantillons prélevés. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

8 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit trois administrations d'anticorps sur une chaise de contention, quarante minutes par séance, subit vingt-trois prélèvements sanguins pour 74 ml au total, quatre biopsies de peau sous anesthésie, et cinq isolements de moins de six heures sans eau ni nourriture pour récolter son urine. Le porteur s'attend à des lésions cutanées, à de la fièvre et à d'éventuelles déhiscences de plaie. Il présente cette étape comme "indispensable", son objet immédiat restant de choisir laquelle des quatre formulations passera en étude de toxicité réglementaire, et affirme qu'aucune méthode alternative n'apporterait le même niveau d'information qu'un "organisme vivant entier".

Objectifs

Ce projet va permettre d’évaluer les effets et le devenir de quatre formulations composées d’anticorps administrées à la même dose de manière répétée (x3) chez le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) dans le cadre du développement d’un traitement anti-cancéreux chez l’homme. L’étude permettra de sélectionner la formulation la plus pertinente pour une future étude de toxicité réglementaire. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement et de sélection du candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’une nouvelle modalité d'anticorps multifonctionnels capable de créer une monothérapie anticancéreuse ciblée et puissante. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de sélectionner le meilleur candidat mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Tous les animaux du projet auront les mêmes procédures. Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à trois reprises un candidat médicament. L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre les administrations. Les animaux auront également 23 prélèvements de 1 à 9,3ml, pour une volume total prélevé de 74 ml sur 5 semaines. Les animaux seront vigiles. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris) Quatre prélèvements de peau par animal seront réalisés chez tous les animaux et sous anesthésie générale et analgésie (après une mise à jeun inférieur à 16h). Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie comprise) Cinq récoltes d’urine (environ 2 ml) seront également réalisées. Pour cela, les animaux seront isolés dans les compartiments de la volière afin de réaliser une collecte d’urine individuelle. Les urines seront récoltées de manière non invasive L’isolement durera moins de 6 heures. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible cutanée, des lésions au niveau de la peau pourront être observées. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Une réaction systémique de type fièvre peut éventuellement apparaître les jours suivant les administrations. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation. Les prélèvements de peau sous anesthésie pourront provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (inférieur à 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). La récolte d'urine sera réalisée directement dans le module d'isolement présent dans les volières d'hébergement L'animal sera physiquement isolé de ses congénères pendant une durée inferieur à 6h, ce qui peut induire un stress léger. Pendant cet isolement l’animal n’aura pas accès à l’eau et à l’alimentation ce qui pourra engendrer un stress et un inconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la toxicité des candidats médicaments.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de toxicité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la biodisponibilité des candidats médicaments et permettent d’affiner la connaissance de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les modèles animaux permettent dans ce cas d'objectiver l'apparition des signes cliniques et donc de mettre en évidence une éventuelle toxicité de la molécule en test. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 8 primates répartis en 4 lots de 2. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux primates d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain a été retenu dans le cadre de ce projet. De plus, une analyse de la conservation phylogénétique de la cible de l’anticorps testé a montré une divergence de séquence et une conservation incomplète des profils d'expression chez la souris et le rat alors que les séquences de cette cible chez les primates se sont révélées identiques à 95–100 % à la séquence humaine. Ces résultats démontrent rigoureusement que les espèces de primates constituent des modèles fiables pour tester la pharmacocinétique (PK) et la toxicité de cet anticorps. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements de peau pendant l’étude et des prélèvements d’organes seront réalisés en fin d’étude dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.