Primates

Porteurs d'un capteur de télémétrie implanté chirurgicalement, 4 chiens beagle, 4 miniporcs Göttingen et 4 macaques à longue queue appartiennent au "stock d'animaux télémétrés" de l'établissement, où ils sont replacés à la fin de la procédure. Les 12 animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, faites de contentions répétées, d'administrations par sonde gastrique et de prises de sang veineux répétées. La molécule administrée provoque, aux doses élevées, des vomissements et des fèces liquides que le porteur décrit comme rétrocédant en vingt-quatre à quarante-huit heures. L'objet réel est de démontrer que la procédure d'enregistrement de l'électrocardiogramme du site détecte bien un allongement de l'intervalle QT, une validation exigée par l'évolution des lignes directrices internationales et qui permettra aux laboratoires clients de demander une exemption d'essai clinique chez le volontaire sain.

Objectifs

L’objectif du projet est de démontrer que la procédure d’enregistrement de l’électrocardiogramme (ECG) de l’Etablissement est apte à détecter une augmentation de la durée de l'intervalle spécifique mesuré sur un tracé ECG à l'aide d'un capteur de télémétrie implanté chirurgicalement. Cet intervalle est celui entre l'onde Q et l'onde T d'un complexe ECG, appelé intervalle QT. La prolongation de l'intervalle QT (appelé ci-après "risque QT") sera évaluée après administration d'un produit de référence chez le miniporc Göttingen, le chien Beagle et le macaque Cynomolgus. Cette évaluation sera conduite dans les mêmes conditions expérimentales que celles adoptées pour évaluer le risque QT chez l'animal (risque QT préclinique) d'un candidat-médicament (CM). En effet, la prolongation de l'intervalle QT peut prédisposer un individu sain ou malade à une arythmie cardiaque mortelle. On doit donc s'assurer, avant de tester un CM chez l'Homme, que celui-ci n'a préalablement pas démontré de risque QT chez l'animal (risque QT préclinique négatif). Afin de renforcer la prédictivité de ces données de risque QT de l'animal à l'Homme, les lignes directrices ICH E14 (évaluant le risque QT chez l'Homme dans des essais cliniques dédiés) et ICH S7B (évaluant le risque QT préclinique chez les miniporc, chien et macaque) ont récemment évolué. Ainsi, les Autorités de Santé ont édicté des bonnes pratiques de conduite des études et exigent un renforcement de la prédictivité de l'évaluation du risque QT préclinique. Ce nouveau contexte législatif a été entériné par l'Industrie Pharmaceutique et les sociétés de sous-traitance préclinique, dont l'Etablissement. Ce renforcement de la prédictivité repose sur une plus grande robustesse statistique des données ECG précliniques. En particulier, la sensibilité des études précliniques est à démontrer, c’est-à-dire leur capacité à mettre en évidence le risque QT préclinique dans les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées pour évaluer le risque QT clinique. Ceci est effectué par administration d'une molécule de référence. Ainsi, si un CM démontre un risque QT préclinique négatif (= absence de prolongation de l'intervalle QT) dans les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées pour démontrer le risque QT préclinique positif de la molécule de référence, alors ce risque QT préclinique négatif sera considéré comme réel et non pas comme traduisant une incapacité de l'étude préclinique à démontrer ce risque QT.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont les suivants: La démonstration de la sensibilité de la procédure d’enregistrement de l’ECG par télémétrie implantée à l'aide d'une molécule de référence permettra, à terme, de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études préclinique d’évaluation du risque QT d'un CM en développement. En effet, l’inclusion d’un groupe d’animaux traités par cette molécule de référence ne sera pas nécessaire. L'amélioration de la prédictivité du risque QT clinique sur la base du risque QT préclinique permettra au laboratoire développant un CM de demander une exemption de conduite de l'essai clinique TQT chez le volontaire sain; cette disposition permettra ainsi de mettre plus rapidement sur le marché des molécules thérapeutiques offrant un service médical rendu prometteur.

Procédures

4 chiens Beagle, 4 macaques Cynomolgus et 4 miniporcs Göttingen seront inclus dans ce projet. Quelle que soit l'espèce, les nuisances seront similaires et consisteront en: - Plusieurs occasions de contention des animaux, durant de quelques secondes à quelques minutes, pour les traitements et les prises de sang veineux, - Plusieurs occasions d'administrations - par intubation gastrique à l'aide d'une sonde adaptée - de formulations liquides de traitement, durant quelques secondes, - Des prises de sang veineux répétées, durant quelques secondes, à l'aide d'une aiguille et d'un dispositif de collecte adapté.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont connus, communs aux 3 espèces, et généralement observés aux doses élevées de la molécule de référence: épisodes occasionnels de vomissements et/ou de fèces liquides, sans atteinte de l'état général. Ces signes rétrocèdent généralement spontanément dans les 24 à 48 heures après traitement.

Devenir

Au terme de la procédure, les animaux seront replacés dans le stock d'animaux télémétrés de l'Etablissement.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro ou modélisables par ordinateur (modélisation "in silico") permettant de reproduire la procédure d’enregistrement de l'ECG par télémétrie sur des animaux implantés avec un capteur et traités préalablement avec une molécule de référence dans les conditions environnementales de l’Etablissement. En effet, cette procédure vise à détecter un changement de l'activité électrique cardiaque d'un animal en réponse à l'activité pharmacologique d'une molécule de référence administrée dans certaines conditions environnementales. Ce changement est capté par un système complexe d'électrodes ECG, reliées à un implant préalablement positionné chirurgicalement et un système Bluetooth de transmission du signal vers un ordinateur. L'ensemble des paramètres, leur interaction et la réaction pharmacologique de l'animal ne peuvent pas être reproduits in vitro ou in silico

Réduction

Le traitement des animaux télémétrés selon un carré latin est le design d'étude permettant la plus grande réduction du nombre d'animaux testés car il fournit la puissance statistique la plus élevée par rapport à d'autres designs d'études (traitement par groupes parallèles ou selon des doses croissantes). Ceci est dû au fait que chaque animal reçoit le placebo et plusieurs doses de la molécule de référence, et est donc son propre contrôle. Ce design permet de diminuer la variabilité interindividuelle et d'augmenter ainsi la sensibilité de la réponse de l'intervalle QT à la molécule de référence (c’est-à-dire que la probabilité de détecter un risque QT préclinique positif est augmentée). Sur la base de données statistiques pour les designs d'études de télémétrie en carré latin, 4 animaux seront inclus dans chaque procédure.

Raffinement

Compte-tenu des nuisances induites par les contraintes environnementales et techniques liées aux études de télémétrie et les effets indésirables (et anticipés) liés à l'administration de la molécule de référence, les mesures suivantes seront prises: - Zootechniques: hébergement des animaux en groupes sociaux, programme d'enrichissement adapté à chaque espèce, distribution de récompenses alimentaires après interventions contraignantes, habituation à la contention et à la procédure d’administration à plusieurs occasions, séances dédiées et régulières de regroupement des chiens ("courettes") avec interactions chien-techniciens animaliers. - Cliniques: évaluation quotidienne de l'état général des animaux, examen physique ou détaillé, vidéomonitorage des animaux dans les salles d’hébergement, observations cliniques en direct et rapprochée des animaux après traitement, suivi vétérinaire. - Médicales: mise en vigueur de soins médicamenteux et/ou sanitaires en cas de troubles gastro-intestinaux si ceux-ci ne régressent pas spontanément et tout soin adapté en cas d'altération notable de l'état général des animaux.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce incluse dans les études évaluant de risque QT préclinique avec un CM est dicté par la capacité de ce modèle animal à prédire ce risque chez l'Homme. Cette prédiction repose sur des caractéristiques telles que la pharmacocinétique, le métabolisme et la cible pharmacologique du CM. Un autre critère de choix plus récent est lié à la grande diversité de structure chimique des CM testés, de la nouvelle entité chimique à la molécule biologique tels que les anticorps monoclonaux. L'ensemble de ces critères de choix converge pour indiquer qu'une seule espèce ne peut prétendre, à elle seule, prédire le risque QT chez l'Homme. Par ailleurs, les lignes directrices E14 et S7B récemment actualisées dans le cadre de l'évaluation du risque QT préclinique et clinique recommandent de choisir l'espèce animale la plus appropriée, sur la base des effets pharmacodynamiques du CM, et de la relation entre ces effets et l'exposition plasmatique à un CM; il est également attendu à ce que cette espèce soit la même que celle incluse dans les études de toxicologie précliniques réglementaires conduites avec ce même CM. L’étude de télémétrie implantée destinée à évaluer le risque QT préclinique d'un CM peut donc être réalisée sur le miniporc, le chien et le primate non humain. Par conséquent, dans le cadre de ce projet, la validation du risque QT par la molécule de référence sera effectuée chez ces trois espèces. Les animaux seront de jeunes adultes ou des adultes afin que leurs fonctions vitales (dont l'électrocardiogramme) soient matures.

Non mis à mort à l'issue mais rendus disponibles pour une prochaine expérience après une période de repos, trois macaques à longue queue déjà utilisés dans un projet antérieur subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une sonde est introduite dans leurs narines jusqu'à l'œsophage pour administrer deux fois, à trois semaines d'écart, un candidat médicament contre le cancer du foie. Leur sang est ensuite prélevé sans anesthésie à la veine ou à l'artère fémorale, jusqu'à 10 % du volume circulant, avec un risque d'hématome et d'anémie transitoire. Le donneur d'ordres n'attend aucun effet indésirable puisqu'il a déjà testé la molécule sur des primates non humains à doses plus élevées, et le porteur décrit cette étape comme "indispensable" à la poursuite des essais réglementaires chez l'être humain.

Objectifs

Ce projet repose principalement sur la réalisation de prélèvements sanguins pour l’isolement de plasma et de cellules mononuclées du sang périphérique après administration d’un candidat médicament chez le primate non humain. Le candidat médicament servira dans le traitement des carcinomes hépatocellulaire, une forme de cancer primitif du foie. Les doses qui seront testées dans ce projet sont des doses que l'on sait non toxiques car déjà testées à des concentrations plus élévées sur le primate non humain par le doneur d'ordres. L’objectif sera double : tout d’abord l’étude pharmacocinétique de la molécule et l’étude de sa pharmacodynamie dans le sang du primate non humain.

Bénéfices attendus

L’étude de la pharmacocinétique d’une molécule à une concentration donnée permettra de prédire la dose administrable à l’homme. Réaliser ces tests sur un petit nombre d’animaux permet de déterminer les doses qui seront utilisées par la suite dans des études réglementaires plus conséquentes, mais permet également de réduire le nombre d’animaux et de raffiner leur utilisation en administrant une molécule dont on a déjà établi un profil, ce qui va permettre d’adapter le suivi.

Procédures

Les animaux de cette étude recevront un candidat médicament pour le traitement des carcinomes hépatocellulaire par voie orale à deux reprises espacées d’environ 3 semaines. Pour ce faire, la contention de l’animal se fera dans son hébergement à travers les barreaux dans le module d’isolement. Ce mode de contention permettra d’éviter de sortir l’animal complètement, réduisant son stress, et la durée de contention. Pour l’administration par voie orale, une sonde sera insérée dans l’œsophage de l'animal via les narines. Une seringue sera ensuite adaptée sur la sonde et la solution sera administrée à l’animal. L’administration durera quelques secondes. Les volumes administrés aux animaux seront en accord avec les procédures internes validées par le vétérinaire et avec les recommandations éthiques en vigueur. Tous les animaux de cette étude seront soumis à des prélèvements sanguins au niveau des veines et/ou artères fémorales et/ou céphaliques, sans anesthésie, d'une durée de quelques secondes (de 10 secondes à 30 secondes) en fonction du nombre de tubes à remplir. Les prélèvements de sang seront réalisés à hauteur du volume maximum prélevable en fonction du pourcentage du volume sanguin circulant, selon les recommandations éthiques et ne dépasseront pas 7mL/Kg soit 10% du volume sanguin circulant suivi d'une période de repos de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins peuvent provoquer du stress et/ou l’apparition d’hématome(s) au niveau de la zone de ponction. Lors de prélèvements fréquents ou en grande quantité, une anémie transitoire peut également apparaître. Une réaction systémique de type fièvre peut éventuellement apparaître les jours suivants les administrations. Un suivi de la température corporelle sera donc réalisé pendant plusieurs jours post-administration. Pour ce protocole, le donneur d’ordres n’attend aucun effet indésirable spécifique lié à son candidat médicament car celui-ci a déjà été testé sur le primate non humain à des doses plus élevées que celles qui seront utilisées dans ce protocole.

Devenir

A la fin de cette procédure, les animaux ne seront pas mis à mort et pourront être réutilisés après une période de repos selon les recommandations éthiques, selon l’avis du vétérinaire et de la structure du bien être animal.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet il n’est pas possible de remplacer l’utilisation de l’animal. En effet, déterminer le profil pharmacocinétique et pharmacodynamique de la molécule en fonction de la dose administrée permettra d’obtenir des informations sur le candidat médicament chez l’animal, indispensable au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. L’évaluation clinique des animaux effectuée avant et après administration de la molécule permettra d’observer et d’anticiper d’éventuels effets secondaires. Tous ces résultats permettront d’ajuster la dose optimale qui pourra être administrée chez l’homme, indispensable à la poursuite des essais réglementaires en clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus pour ce projet est de 3 (1 mâle et 2 femelles) non naïfs. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats interprétables et transposables à l’homme. En raison du faible nombre d’animaux, seules des analyses statistiques descriptives seront réalisées. Les animaux utilisés dans ce protocole sont non naïfs, donc issus d’un projet antérieur, de classe légère. Ils ont bénéficié d’un temps de repos adéquat et le vétérinaire ainsi que la structure du bien être animal ont autorisé leur réutilisation.

Raffinement

Afin d’optimiser le bien-être des animaux et de leur permettre d’exprimer leurs besoins comportementaux primaires, les animaux sont hébergés en groupes sociaux, avec des congénères qui ne seront pas inclus dans cette procédure, (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets sont mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises sont distribuées quotidiennement (après les manipulations et en fin de journée) dans la litière et dans des dispositifs à friandises (tube, jouets...). De la musique est diffusée dans les salles d’hébergements en continu pendant la journée à un volume raisonnable, afin d’avoir une homogénéité sonore de leur environnement et contribue à diminuer le stress lié aux activités du personnel ou autres animaux des autres salles de l’animalerie. La température et l’hygrométrie des hébergements sont suivies et contrôlées quotidiennement. Les animaux disposent d’eau de boisson à volonté, d’une quantité quotidienne d’aliment adaptée à leur poids et de fruits et/ou légumes frais pour compléter et diversifier leur régime alimentaire. Les animaux sont suivis quotidiennement par le personnel d’étude, formé et compétent. Deux observations sont faites quotidiennement avec prise en compte du stress et de la douleur potentiels. Enfin, un suivi pondéral des animaux est fait au minimum une fois par semaine pour suivre leur état de santé. Des points limites sont définis, adaptés aux besoins physiologiques des animaux. Un vétérinaire attitré est, au besoin, appelé afin d’évaluer l’état des animaux et de prescrire tous les soins nécessaires. Les animaux sont non naïfs, ils sont donc habitués à leur environnement et aux interactions avec les techniciens. Cependant, ils auront 28 jours d’acclimatation avant le démarrage de l’étude pendant lesquels ils auront des séances d’entrainement aux différents actes de l’étude avec un renforcement positif. Enfin, les animaux auront des temps de repos entre les prises de sang et les administrations du candidat médicament (environ 3 semaines). Les prélèvements de sang seront réalisés à hauteur du volume maximum prélevable en fonction du pourcentage du volume sanguin circulant, selon les recommandations éthiques.

Choix des espèces

Par leur origine phylogénétique, les primates non humains présentent une forte proximité avec les humains en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Le candidat médicament en développement étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent. Enfin, la séquence d'acides aminés cible et déterminante dans le mécanisme d'action du candidat médicament n'a pas de différence significative entre l'homme et le primate non humain. De jeunes adultes seront utilisés de préférence pour des raisons de maturité du système immunitaire.

60 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chirurgie stéréotaxique de deux à quatre heures pour implanter des électrodes dans le cerveau ou y injecter des vecteurs viraux, jusqu'à dix prélèvements sanguins en quarante-huit heures, ponctions de liquide céphalorachidien, imagerie de trois heures sous anesthésie, séances quotidiennes d'une à deux heures en chaise de contention, et injections d'harmaline pour provoquer des troubles moteurs. Ce travail relève d'une "activité pré-clinique de service" menée pour des clients qui font tester électrodes et molécules avant un passage éventuel chez l'humain. Le porteur justifie le recours au macaque en écrivant que "l'éthique spéciste actuelle interdit l'utilisation d'approches neurobiologiques invasives chez l'homme", et retient cette espèce pour sa proximité anatomique avec l'espèce humaine.

Objectifs

La stimulation cérébrale profonde (DBS) est une procédure neurochirurgicale pratiquée chez les personnes souffrant de troubles du mouvement notamment dans la maladie de Parkinson (MP). La stimulation interfère avec les signaux pathologiques dans le cerveau pour restaurer les fonctions motrices normales. Cette thérapie a été reconnue comme sûre et efficace pour l'amélioration des symptômes chez les patients atteints de MP tel que les tremblements, rigidité ou autres fluctuations motrices. Cette méthodologie a été une évolution technique majeure pour le traitement de la MP et l’intervention chirurgicale est maintenant explorée également pour d'autres conditions, comme l'épilepsie et la dépression. Ceci explique le développement permanent de nouvelles sondes DBS capables d'enregistrer l'activité cérébrale dans les structures cibles afin de contribuer au développement de nouvelles thérapies chez les patients atteints d’autres affections neurologiques. D’un autre côté, de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique pourraient également bénéficier aux patients atteints de ces affections. Cette approche utilise des virus modifiés ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. On parle alors de vecteurs viraux ou non viraux (peptides, anticorps...) ou plus génériquement d’inocula. Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces vecteurs tout comme la DBS reste l’approche chirurgicale par stéréotaxie. Si la validation de nouvelles sondes DBS passent par des enregistrements des signaux, la mesure des effets des inocula se fait par des analyses biochimiques sur des prélèvements biologiques puis cellulaires après mise à mort. Les études précliniques nécessitent de valider ces outils (sondes pour la DBS ou inocula) chez le primate non humain (PNH). Le projet a donc pour objectif de valider d’une part de nouveaux vecteurs qu’ils soient porteurs d’une molécule «contrôle» ou de protéines d’intérêt à visée thérapeutique et d’autre part de nouvelles sondes DBS chez le PNH.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament ou d’un nouveau dispositif médical (électrode), indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de nouvelles électrodes sur les animaux visant à améliorer l’impact de la DBS dans les troubles neurologiques sont fondamentaux pour confirmer que les prototypes atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus et pourrait permettre à terme de maximiser le temps du patient "en thérapie". Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’implanter un nouveau dispositif médical ou d’administrer un nouveau composé à l’homme - sain ou malade - compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils de thérapie génique chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de formes génétiques (en particulier) des maladies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux sont soumis aux différentes étapes décrites dans la procédure. - Prélèvements sanguins sur animal anesthésié ou vigile (10 min), fréquence max en 24/48 h = 10 prélèvements et volume max sur une semaine entre 5 à 7 ml/kg / semaine - Prélèvements LCR, sur animal anesthésié, 1 ml max sur un mois (10 min) - Imagerie (3 heures) sur animal anesthésié (2 à 3 max. selon la durée du suivi longitudinal) - Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie pour l'implantation, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administration d'inoculum sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). - - Traitement prophylaxique par gavage (fréquence variable, max 2 fois par jour) sur animal vigile pour une durée entre une semaine et 10 jours. Ceci afin de conserver un score inférieur à 5 sur l’«Échelle d'évaluation du bien-être PNH». - Tache en chaise avec enregistrements électrophysiologiques et/ou stimulation (séances quotidiennes de 1-2h, sur jour ouvré pendant toute la durée du projet) sur animal vigile en absence ou en présence de fluctuations motrices (induites par l’harmaline, max 1 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées aux différentes étapes. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. Pour l’aspect comportemental : stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tache comportementale, administration systémique d’harmaline entrainant les fluctuations motrices. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie, hématome, douleur possible. Pour l’imagerie : réaction imprévue à l’administration de produit de contraste, inconfort liée à l’anesthésie durant le transport. Bien que les vecteurs viraux soient réputés pour leur faible toxicité, une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de les détecter. Une échelle d’évaluation du bien-être décrite en annexe 1 est applicable pour ces points limites.

Devenir

L'ensemble des animaux à la fin du projet seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo. Des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité pré-clinique de service. Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH, vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs); 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. Dans bien des cas par exemple les immunothérapies testées ne peuvent interagir qu’avec des tissus provenant de PNH, ce qui impose souvent l’utilisation du modèle primate.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques ou le développement de nouveaux dispositifs médicaux (ici électrodes de stimulation/enregistrement) avec un nombre estimé de 3 études par an, comprenant 4 animaux maximum par étude, soit un total de 60 animaux maximum sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 4 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Les inocula auront été testés préalablement in vitro ou chez le petit animal (rongeur) par nos clients pour déterminer les doses à utiliser et s’affranchir d’éventuels effets toxiques nécessitant un apport supplémentaire d’animaux. Dans le cadre d’une étude de validation de dispositif médical (électrode), la chirurgie implantatoire peut ne concerner qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Pour le transport à la plateforme d’imagerie située à 200 m de l’animalerie, une cage dédiée placée sur un chariot protégée des regards extérieurs par une housse est préparée. et l’animal sous sédation légère et dont les constantes sont toujours contrôlées, est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillote. Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal, et sont réalisé sur animaux sédatés. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le PNH a été retenu car (i) les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique ; (ii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du PNH est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du porc et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Adultes afin que de pouvoir appréhender un système nerveux central en pleine maturité (2 ans minimum). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.

Tous réutilisés ensuite dans un autre projet, de gravité sans réveil, légère ou modérée, après accord du vétérinaire, 84 macaques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : 72 macaques à longue queue et 12 macaques rhésus. Chacun peut subir une chirurgie de quatre heures trente à cinq heures trente pour l'implantation d'un émetteur de télémétrie, parfois avec un cathéter dans le ventricule gauche du cœur, puis passer six à huit jours seul en cage à métabolisme. Viennent ensuite des candidats médicaments donnés par la bouche, en injection ou en perfusion sous contention jusqu'à une heure, des privations de nourriture, des prises de sang, plusieurs anesthésies de quatre heures au plus et des tests neurologiques et comportementaux que le résumé ne nomme pas. Les effets indésirables possibles sont discutés avec les fabricants de ces produits, dont il s'agit de vérifier l'effet sur le cœur avant un usage humain ou vétérinaire, le porteur qualifiant ce recours aux macaques de "passage obligatoire".

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de différents candidats médicaments sur les paramètres cardio-vasculaires chez le primate non-humain vigile en utilisant la télémétrie, méthode d'enregistrement de différents paramètres permettant de laisser l'animal totalement libre de ses mouvements dans la volière pendant les mesures.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la vérification de l'absence d'effet ou la détermination du seuil d'effet de nouveaux médicaments sur le système cardiovasculaire, qui permettront par la suite une utilisation sécurisée du médicament en médecine humaine ou vétérinaire . Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (le primate non humain) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.

Procédures

Dans ce projet, les animaux pourront être soumis à une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie avec ou sans cathéter de mesure de la pression ventriculaire gauche cardiaque (PVG). La durée de la chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie sera entre 4h30 et 5h30. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang (durée environ 1min/prélèvement), des tests neurologiques et comportementaux (durée de 10 min max par observation). Les animaux seront maintenus pendant l’administration du candidat médicament (ou du placebo) par voie orale, sous-cutanée, transdermique, intranasale, intramusculaire ou intraveineuse (bolus ou perfusion) (durée 1 -2minutes, sauf pour la perfusion intraveineuse où les animaux sont maintenus en contention pendant la durée de la perfusion, maximum 1h). Dans le cas d'expérience sous anesthésie, les animaux seront soumis à plusieurs anesthésies d'une durée de 4h maximum chacune.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits font l'objet d'échanges avec les fabricants des candidats médicaments testés pour adapter les outils d'observation des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques. Les animaux subiront une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie pouvant induire des douleurs post-chirurgicales. Les animaux de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture avant administration du produit, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, de l'administration et de l'anesthésie avant chirurgie ou avant expérience sous anesthésie, un stress lié à l'hébergement individuel en cage à métabolisme (6-8j) post-chirurgie. Lors de l'administration de candidats médicaments en perfusion intraveineuse de durée supérieure à 10 min, les animaux pourront subir un stress lié à la contention.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le primate non humain car il n'existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets cardiovasculaires. Or, avant toute utilisation chez l'homme, l'animal constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou la sécurité d'un médicament. A ce jour, le primate non humain est une des espèces de non-rongeurs adaptée à ce type de modèle.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • l'utilisation de la technique de télémétrie permettant de recueillir des informations sans manipulations animaux, •la validation du système de télémétrie et validation pharmacologique du modèle, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le primate non humain est, pour certains candidats-médicaments, l’espèce animale la plus adaptée car la plus proche de l’homme en termes de métabolisme et d’exposition. Le système cardiovasculaire du primate non humain est également très proche de celui de l'homme, donc les effets observés sont plus facilement extrapolables. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Porteurs pour une partie d'entre eux de récepteurs à l'ocytocine génétiquement modifiés, 12 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une à trois neurochirurgies d'une journée sous anesthésie générale, pour l'injection de marqueurs intracrâniens, l'implantation d'électrodes puis leur retrait, ainsi que deux IRM, un scanner et quatre examens de tomographie par émission de positons, tous sous anesthésie. Ils reçoivent en plus une injection intramusculaire trois fois par semaine pendant dix semaines, avant des séances d'observation en volière portant sur des intrusions dans leur territoire. Le porteur prévoit des micro-lésions cérébrales dues à la présence des électrodes, annonce la mise à mort de 4 macaques à des fins scientifiques et présente les 8 autres comme candidats à la reproduction en centre de primatologie, ou à défaut au placement en sanctuaire, sous réserve de l'évaluation rétrospective.

Objectifs

L'espace est une ressource limitée pour de nombreuses espèces, les poussant à délimiter et à défendre leur territoire. L’objet de ce projet est de comprendre les mécanismes neuronaux qui régulent le comportement territorial. Ce comportement est à la source de nombreux conflits, chez l’humain comme chez l’animal, lorsqu’un individu franchit les frontières d'un territoire. Nous faisons l’hypothèse que l'ocytocine (OT), un neuropeptide hypothalamique connu pour son rôle de régulation sociale chez les mammifères, module l'activité neuronale dans les zones clés liées à la perception de l’espace dans le processus d'appropriation et de défense territoriale. Notre étude se concentre sur le macaque dont les systèmes neuronaux et comportementaux sont proches de ceux des humains. Des données préliminaires suggèrent que la distribution des récepteurs d'ocytocine diffère considérablement entre les rongeurs et les primates, ce qui justifie notre choix du macaque comme modèle. De plus, la régulation territoriale chez le macaque repose davantage sur des indices visuels et des règles sociales hiérarchiques que sur des indices olfactifs, comme c'est le cas chez les rongeurs. Nous analyserons comment les neurones spatiaux et émotionnels réagissent aux changements territoriaux tels que l’approche d’un intrus sous l'influence de l'ocytocine. Comprendre ces mécanismes pourrait éclairer les conflits territoriaux humains et les moyens de les résoudre.

Bénéfices attendus

1. Le projet apportera une connaissance approfondie de l'anatomie du système oxytocinergique chez le primate, de son effet sur l’activité neuronale au sein du complexe amygdalo-hippocampique, Ces données sont impossibles à obtenir chez l'humain du fait de l'impossibilité de faire des marquages pré mortem qui seront révélés dans l'anatomie post mortem. 2. Ce projet renseignera sur les systèmes neuronaux qui contrôlent les comportements sociaux et territoriaux ainsi que leur modulation par l’action de l'ocytocine. 3. Le projet permettra d'apporter des éléments sur la faisabilité et l'action potentielle des approches pharmaco-génétiques pour agir sur le comportement et l'activité neuronale chez le primate non humain. Cette étape est essentielle au développement d’outils pharmaco-génétiques dans une perspective translationnelle. De fait, le projet vise à ouvrir la voie à la possibilité de manipulation pharmacologique ciblant des zones spécifiques du cerveau humain afin de bénéficier à des patients ayant des troubles psychiatriques.

Procédures

Les animaux des deux premier lots seront soumis trois procédures chirurgicales sous anesthésie générale d’une journée : une première destinée à l’administration de marqueur intracrânien, une deuxième destinée à l'implantation d'électrode et la dernière à retirer les implants. Les animaux seront aussi soumis à 2 examens d'imagerie par résonnance magnétique et de CT scan d’une durée d’une ½ chacun, et 4 examens de tomographie par émission de positon, couplés à des prises de sang pour des dosages hormonaux (1/2 journée). Les animaux seront mis sous anesthésie générale pour ces 1examens. Les animaux recevront une injection intramusculaire par jour de ligands pharmacogénétiques 3x par semaine pendant 10 semaines avant des sessions de mesures comportementales en volière. Les animaux du deuxième lot seront soumis à un examen sous anesthésie générale d’une ½ journée et une chirurgie d’une journée.

Impact sur les animaux

Les animaux seront tous soumis à 1 ou 3 neuro-chirurgies (selon les lots) effectuées sous anesthésie générale. La chirurgie suscitera un inconfort post-opératoire passager. A terme, des micro-lésions cérébrales sont à prévoir, dûes à la présence d’électrodes dans le cerveau. Les aninaux recevront des injections intramusculaires qui peuvent génèrer une douleur localisée mais passagère. Nous nous attendons à ce que le produit injecté modifie le comportement territorial pour induire moins de compétition territoriale. Les animaux seront testés sans mise en conflit, mais plutôt en observant des intrusions dans leur territoire. Ces situations peuvent générer un stress passager, mais équivalent à un stress naturel. Les animaux seront aussi soumis à des examens d'imagerie par résonnance magnétique, radio (Tomographie à émission de positon) et les prises de sang capillaire à l’oreille pour des dosages, pour lesquels ils seront mis sous anesthésie générale, ce qui provoquera également un inconfort au réveil.

Devenir

A la fin du protocole, 8 des animaux subiront une chirurgie de dés-implantation et seront candidats à une réutilisation pour de la reproduction en centre de primatologie si l'évaluation rétrospective le permet. En cas contraire, ils seront candidats pour un replacement en sanctuaire. Par ailleurs, notre protocole nécessite l'euthanasie de 4 des animaux pour des fins scientifiques.

Remplacement

Dans notre cas, le remplacement des primates par d'autres espèces vertébrées ou non vertébrées, voire par d'autres espèces de primates n'est pas encore possible. Les humains ne peuvent pas être utilisés en raison de la nature invasive des méthodes expérimentales. Il est impossible d'injecter des marqueurs en prémortem pour effectuer du traceur anatomique et ni d’injecter des vecteurs viraux permettant de cibler les circuits anatomies précis chez l'homme et d'en vérifier les effets des manipulations sur le comportement. De même une approche in silico, ne permet pas d'appréhender ni la complexité des circuits anatomiques ni le comportement. Phylogénétiquement, le modèle d’étude pré-clinique (macaque) est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Aucun autre modèle animal ne présente ces caractéristiques.

Réduction

La taille de la cohorte a pour but d'utiliser le moins d'animaux possible permettant d’obtenir des résultats significatifs et généralisables. Nous déterminerons les effets de la manipulation du système ocytocynergiques en comparant les effets obtenus d’un agent activateur (ligand) chez des animaux porteurs de récepteurs modifiés de l’ocytocine (groupe test, n=6) et chez les animaux contrôle (n=4). L’utilisation du groupe contrôle permet de vérifier que notre effet est bien le fruit d’une activation des récepteurs modifiés et non, un simple effet du ligand. C’est pourquoi, la condition sans stimulation du groupe test ne peut être son propre contrôle. De plus, les résultats électrophysiologiques du groupe contrôle sont intéressants en soi car ils permettront d’établie une physiologie de base. Le nombre d’animaux a été déterminé selon une approche statistique conservatrice et, mais les expériences n’engageront pas 10 animaux simultanément. Nous procéderons au test d’une première cohorte, puis les données seront évaluées et complétées afin d’atteindre une significativité en procédant par étape, notamment en évaluant l’expression des récepteurs modifiés grâce à l’examen TEP (tomographie à émission de positon) chez le groupe test et la caractérisation de l’activité neuronale chez le groupe contrôle. Comme indiqué, les résultats du groupe contrôle seront traités même si le groupe test n’est pas continué, et complétés au fur et à mesure.

Raffinement

Plusieurs éléments de raffinement sont mis en œuvre : Recours à l’imagerie (IRM et TEP), qui se substitue pour la plupart des animaux à l’histologie post-mortem et permet d’envisager leur replacement en sanctuaire à l'issue des expériences. Utilisation de microélectrodes chroniques à contacts multiples de supprimer la phase de manipulation des électrodes et de réduire à minima les moments d’immobilisation de la tête. Les expériences seront conduites en conditions semi-éthologiques sans contrainte physique. Pré-entraînement par renforcement positif des animaux en salle de stabulation visant à réduire le temps et le stress induit par les prélèvements buccaux ou les injections. Nous utilisons des analgésiques, et anesthésiants pendant et après les chirurgies. La douleur et le comportement de l’animal sont scorés en post chirurgical, et le bien-être de l’animal est scoré de façon quotidienne. Enfin, les point limites stricts et spécifiques du projet sont déterminés et un score quotidien ou hebdomadaire est obtenu en fonction des étapes, et permet de mener les actions adéquates en fonction du score obtenu.

Choix des espèces

Notre projet utilise des singes macaques car certaines parties de leur cerveau et certains comportements sociaux que nous étudions ne se trouvent pas chez les rongeurs. Par exemple, les macaques utilisent principalement la vue pour comprendre leur environnement et montrent leurs émotions à travers leurs expressions faciales. Contrairement aux rongeurs, les macaques ont un système cérébral plus développé pour reconnaître les visages, les expressions faciales et interpréter le regard, ce qui est important pour réguler leur territoire. En utilisant des singes, nous pouvons mieux comprendre comment le cerveau traite ces informations. De plus, notre projet se concentre sur l'impact de l'ocytocine sur le comportement territorial. Chez les primates, les récepteurs de l'ocytocine sont présents dans plusieurs parties du cerveau liées à la vision et à l'attention, ce qui n'est pas le cas chez les souris. Nous allons également utiliser des techniques génétiques et pharmacologiques qui ont été efficaces chez les souris, mais qui nécessitent encore des tests chez les singes avant d'être appliquées chez l'homme. Nous travaillons avec des singes adultes car c'est à cet âge qu'ils développent un comportement territorial. Chez les macaques, les deux sexes participent à la défense du territoire. Ils vivent en groupes où plusieurs femelles cohabitent avec un mâle dominant, qui tolère quelques autres mâles. Les disputes territoriales ne sont pas seulement une question de hiérarchie, mais aussi de rivalité entre les groupes. En laboratoire, nous pouvons recréer cette situation en délimitant des "territoires" différents pour chaque groupe dans les volières.

Déjà utilisés dans d'autres projets et pour cette raison présentés comme habitués aux manipulations, trois macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin du protocole. Ils subissent quatre anesthésies, dont une chirurgie de quatre heures avec ouverture des vertèbres pour poser un cathéter dans l'espace sous-arachnoïdien, des ponctions de liquide céphalorachidien et des prises de sang. L'injection d'un virus adéno-associé vise à provoquer une atteinte des ganglions de la racine dorsale, que l'équipe cherche à détecter par IRM, et du bleu de méthylène est injecté en fin de procédure pour vérifier le trajet du cathéter. Le porteur affirme que cette étude est "nécessairement réalisée chez l'animal", au motif qu'elle a "pour but ultime le raffinement de protocoles en expérimentation animale".

Objectifs

Ce projet a pour but d’investiguer la possibilité d'un suivi en IRM (imagerie par résonance magnétique) de la neurotoxicité induite par l'injection intrathécale d'un AAV (Virus adéno-associé) au niveau des ganglions spinaux de la racine dorsale (GRD), chez le primate non humain. Les AAVs sont des vecteurs viraux dont le plasmide a été modifié de manière à en diminuer la pathogénicité, supprimer la capacité de réplication, et surtout permettre au vecteur d'exprimer un gène d'intérêt dans les cellules de l'hôte. Dans le cadre de thérapie génique visant le système nerveux central, les AAVs peuvent être injectés directement en intrathécale (=dans l’espace sous-arachnoïdien). Cependant, de récentes recherches ont montré une toxicité au niveau des GRD, lors du passage en clinique de certains médicaments, mais aussi chez le primate non humain. Cette toxicité a pris la forme de dégénérescence neuronale ou axonale, et elle ne peut être investiguée que par enregistrement électrophysiologique invasif ou par une inspection microscopique des GRD post-mortem. Le but de ce projet est d’investiguer la possibilité d’observer cette toxicité par IRM chez le primate non humain. Il est en effet possible que de nouvelles séquences d'IRM permettent de mettre à jour une désorganisation des fibres nerveuses au niveau spinal liée à cette toxicité, comme cela a déjà été montré dans le cas d'Alzheimer. Une telle méthode non-invasive permettrait un meilleur suivi de la toxicité potentielle de nouveaux AAV. Cela représentera une meilleure maitrise scientifique du suivi des thérapie génique, et une limitation du recours à des méthodes invasives pour les animaux. Enfin, ce projet va permettre de comparer deux méthodes de cathétérisations intrathécale en région lombaire : une méthode chirurgicale invasive, et une méthode moins décrite dans la littérature mais ne nécessitant pas de chirurgie. En effet, des méthodes de cathétérisations peuvent être nécessaire afin d’injecter de manière lente un AAV dans le système nerveux centrale. La deuxième méthode étant moins décrite, elle doit être comparée à la première méthode et ne sera testée qu'au moment de la mise à mort de l'animal. Une fois maitrisée, cette méthode produira un net gain en termes de bien-être animal, en supprimant le recours à la chirurgie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’investiguer l’observation de la dégénérescence des GRD par IRM suite à l’injection d’un AAV. L’IRM est une méthode non-invasive et pourra être utilisée dans des études précliniques pour détecter la neurotoxicité d’un AAV sans avoir besoin d’euthanasier l’animal en fin de procédure ou de le soumettre à des examens électrophysiologiques invasifs. Plus réalistement, l'IRM agirait comme une première sélection permettant d’objectiver une suspicion de toxicité pour certains candidats AAV. De plus, cette méthode permettrait d'enrichir les études d'efficacités sur l'expression des transgènes chez les animaux, en permettant un suivi longitudinal de la toxicité neuronale des AAV. Une telle méthode diagnostique permettrait de faire la différence entre une lésion temporaire et une lésion définitive, ce qui permettrait de raccourcir la durée d'investigation nécessaire et d'enrichir la qualité scientifique des données. Les séquences d’IRM utilisées se feront avec un système 1.5T. Ce système permet, par rapport à un système 3T d’obtenir des images de diffusion de meilleure qualité du fait de l’homogénéité du champ magnétique . De plus, nous ajouterons au protocole une qualification de la graisse, qui nous donnera un taux de graisse avant et après injection des AAVs dans les muscles pour pouvoir observer les conséquences indirectes de l’atteinte des DRG. A la vue de la taille relativement fine des structures analysées, un focus sera mis sur l’acquisition d’images avec une résolution spatiale importante. L’injection de l’AAV sera réalisée par une cathétérisation intrathécale suite à une laminectomie. Cette méthode permet d’assurer que tout le produit est bien injecté dans l’espace sous-dural. Cependant, cette méthode étant assez invasive (nécessitant une chirurgie longue), une seconde méthode de cathétérisation sera évaluée (collecte de LCS propre, injection de marqueur coloré). Cette deuxième méthode est moins documentée et moins connue, et sera donc réalisée juste avant l’euthanasie de l’animal. Si cette deuxième méthode fonctionne, elle pourra permettre dans le futur de réaliser des injections intrathécales longues et répétées, en réduisant l'invasivité pour l’animal.

Procédures

Les animaux subieront des anésthésies. Deux d'entre elles dureront environ 1h (pour l'imagerie IRM), la chirurgie lourde sera d'une durée de 4h environs et la dernère anesthésie sera réalisé avant l'euthanasiedes animaux. Les prélèvements sanguins se feront sur animaux anesthésiés. Les prélèvements de liquide cerebrospinale se feront pendant la chirurgie et avant l'euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux seront anesthésiés pour chacun des actes qu’ils subiront (IRM et injection de l’AAV), ce qui représente un total de 4 fois sur la totalité du projet. Ceci nécessitera une mise à jeun (diète hydrique). Lors des IRM, l’animal présentera un risque d’hypothermie dans la machine ou lors du transport de son hébergement à la salle d’IRM . L’injection intrathécale de l’AAV et la collecte de LCS présentent un risque de douleur ou de réactions locales au site de la chirurgie. Éventuellement, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivants les administrations. De plus, les animaux pourraient présenter des signes cliniques neurologiques dus à la méthode d’injection, ainsi qu’au potentiel dommage provoqué par l’AAV au niveau des ganglions dorsaux (même si les travaux publiés jusqu'alors chez le primate ne font pas état de troubles visibles). Un suivi neurologique sera réalisé tout au long de l’étude afin de surveiller de près ce paramètre. Lors de l’évaluation neurologique quotidienne, les animaux devront être isolés de leurs congénères le temps d’évaluer leur vision et motricité faciale. Les prises de sang peuvent provoquer un hématome au site de prélèvement. Les animaux seront sous anesthésie lors de celle-ci.

Devenir

Afin de pouvoir corréler les résultats observés à l’IRM, les animaux seront mis à mort à la fin du projet. Les ganglions dorsaux seront récoltés ainsi que le cerveau, d’une part pour investiguer sur la présence du transgène injecté (afin de valider que l’AAV est bien présent dans les tissus nerveux) et d’autre part afin de réaliser de l’histologie pour observer et corréler la dégénérescence neuronal et axonal, avec les résultats d’imagerie IRM. De plus, pour valider la deuxième méthode de cathétérisation, du bleu de méthylène sera injecté dans le cathéter à la fin de la procédure. L’observation de la présence de bleu de méthylène au niveau des tissus nerveux, ainsi que le prélèvement de LCS propre, permettra de valider la méthode d’injection.

Remplacement

Cette étude permet de développer une méthode de détection de la neurotoxicité de manière non invasive grâce à l’IRM. Cette étude est nécessairement réalisée chez l'animal, car elle a pour but ultime le raffinement de protocoles en expérimentation animale. La ressemblance physiologique du système nerveux et immunitaire du primate avec celui de l’homme permettra ensuite de transférer les méthodes développées aux essais cliniques chez l'humain.

Réduction

Dans cette étude, 3 animaux seront utilisés lors de cette étude afin de pouvoir répondre à des objectifs scientifiques. Cela permettra de rapprocher différents possibles niveaux de toxicité neuronale avec leur valeur en signal IRM correspondante et permettra d'établir des corrélations. Étant donné qu'un seul type d'AAV sera utilisé, Il n'est pas nécessaire d'utiliser plus d'animaux que cela. Enfin, une méthode de cathétérisation moins invasive, mais moins documenté, sera réalisé sur ces animaux avant leurs euthanasies, afin de pouvoir confirmer que cette méthode fonctionne par l’injection de bleu de méthylène. L’observation des tissus nerveux sera une étape clef de la validation de ce protocole. Ce projet permet donc de ne pas mettre à mort des animaux dans le seul but de valider cette méthode de cathétérisation.

Raffinement

Les animaux utilisé dans ce projet ont déjà été utilisé pour d’autres projets et sont donc habitués au contact ainsi qu’aux manipulations avec les techniciens d’animalerie. Ils seront hébergés et socialisés dans des volières conformes à la réglementation. Un fond musical sera diffusé en journée. L’entretien sanitaire des hébergements et le contrôle des paramètres environnementaux seront réalisés quotidiennement. Les animaux disposeront d’eau de boisson à volonté. Un aliment adapté à l’espèce et au poids de l’animal, ainsi que des fruits et légumes frais, seront distribués quotidiennement. Des jouets seront mis à disposition et renouvelés une fois par semaine. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse et de le prendre en charge. Un score neurologique sera mis en place en place à cet effet. Il permet d’évaluer précisément les fonctions suivantes : l’état de conscience de l’animal, sa posture, la coordination motrice et équilibre de l’animal, la motricité des membres et enfin un examen rapproché permet d’évaluer la neuro-ophtalmologie (oscillation des yeux, tailles des pupilles etc..). Ce score prend aussi en compte des signes cliniques plus classique tel que des fèces liquides ou des vomissements. Les mises à jeûn hydrique n’excèderont pas les 16h. Si nécessaire, du sirop et/ou des fruits pourront être distribués tôt le matin pour les animaux dont l'anesthésie est en fin de matiné ou dans l'après-midi. Un minimum de 3 jours de repos sera accordé suite aux anesthésies. Le jour des prélèvements de LCS, de sang ainsi que le jour de la chirurgie, les animaux recevrons de la buprénorphine afin de limiter toute douleurs potentiel. L’analgésie pourra être prolongé jusqu’à trois jour suivant la chirurgie afin de prévenir de toute douleur. Les volumes de prélèvement de LCS ainsi que de sang respecteront des normes et des volumes précis. Des points limites spécifiques seront définis et si nécessaire pourront amener une euthanasie des animaux. Lors des anesthésies, il sera suivi au minimum la fréquence cardiaque, la saturation en oxygène ainsi que la température rectale des animaux. Des coussins chauffants, ainsi que des couvertures pourront être mise en place. Enfin, un relais d’oxygène sera mis en place si nécessaire.

Choix des espèces

Le but de ce projet est d’investiguer l’observation d’une neurotoxicité par IRM suite à l’injection d’AAV chez le primate on humain. La proximité phylogénétique de l’homme et du primate non humain permet d’obtenir des résultats prédictibles au niveau neurologiques et immunitaires. Les animaux utilisé seront des jeunes adultes ou adultes, afin que le système nerveux central et immunitaire soient suffisamment développés.

Une laminectomie de quatre heures, quatre anesthésies, des jeûnes hydriques allant jusqu'à seize heures et des ponctions de liquide céphalorachidien : trois macaques à longue queue subissent ces actes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin du projet. Un virus adéno-associé leur est injecté dans l'espace sous-arachnoïdien pour provoquer une atteinte des ganglions de la racine dorsale, que l'équipe cherche à visualiser par IRM. Chaque jour, l'animal est isolé de ses congénères le temps d'évaluer sa vision et sa motricité faciale, et une seconde technique de cathétérisation, moins documentée, est essayée juste avant la mise à mort. Le porteur présente ce projet comme un gain de bien-être qui supprimera le recours à la chirurgie, alors que son protocole repose sur une chirurgie lourde et se termine par le prélèvement du cerveau et des ganglions.

Objectifs

Ce projet a pour but d’investiguer la possibilité d'un suivi en IRM (imagerie par résonance magnétique) de la neurotoxicité induite par l'injection intrathécale d'un AAV (Virus adéno-associé) au niveau des ganglions spinaux de la racine dorsale (GRD), chez le primate non humain. Les AAVs sont des vecteurs viraux dont le plasmide a été modifié de manière à en diminuer la pathogénicité, supprimer la capacité de réplication, et surtout permettre au vecteur d'exprimer un gène d'intérêt dans les cellules de l'hôte. Dans le cadre de thérapie génique visant le système nerveux central, les AAVs peuvent être injectés directement en intrathécale (=dans l’espace sous-arachnoïdien). Cependant, de récentes recherches ont montré une toxicité au niveau des GRD, lors du passage en clinique de certains médicaments, mais aussi chez le primate non humain. Cette toxicité a pris la forme de dégénérescence neuronale ou axonale, et elle ne peut être investiguée que par enregistrement électrophysiologique invasif ou par une inspection microscopique des GRD post-mortem. Le but de ce projet est d’investiguer la possibilité d’observer cette toxicité par IRM chez le primate non humain. Il est en effet possible que de nouvelles séquences d'IRM permettent de mettre à jour une désorganisation des fibres nerveuses au niveau spinal liée à cette toxicité, comme cela a déjà été montré dans le cas d'Alzheimer. Une telle méthode non-invasive permettrait un meilleur suivi de la toxicité potentielle de nouveaux AAV. Cela représentera une meilleure maitrise scientifique du suivi des thérapie génique, et une limitation du recours à des méthodes invasives pour les animaux. Enfin, ce projet va permettre de comparer deux méthodes de cathétérisations intrathécale en région lombaire : une méthode chirurgicale invasive, et une méthode moins décrite dans la littérature mais ne nécessitant pas de chirurgie. En effet, des méthodes de cathétérisations peuvent être nécessaire afin d’injecter de manière lente un AAV dans le système nerveux centrale. La deuxième méthode étant moins décrite, elle doit être comparée à la première méthode et ne sera testée qu'au moment de la mise à mort de l'animal. Une fois maitrisée, cette méthode produira un net gain en termes de bien-être animal, en supprimant le recours à la chirurgie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’investiguer l’observation de la dégénérescence des GRD par IRM suite à l’injection d’un AAV. L’IRM est une méthode non-invasive et pourra être utilisée dans des études précliniques pour détecter la neurotoxicité d’un AAV sans avoir besoin d’euthanasier l’animal en fin de procédure ou de le soumettre à des examens électrophysiologiques invasifs. Plus réalistement, l'IRM agirait comme une première sélection permettant d’objectiver une suspicion de toxicité pour certains candidats AAV. De plus, cette méthode permettrait d'enrichir les études d'efficacités sur l'expression des transgènes chez les animaux, en permettant un suivi longitudinal de la toxicité neuronale des AAV. Une telle méthode diagnostique permettrait de faire la différence entre une lésion temporaire et une lésion définitive, ce qui permettrait de raccourcir la durée d'investigation nécessaire et d'enrichir la qualité scientifique des données. Les séquences d’IRM utilisées se feront avec un système 1.5T. Ce système permet, par rapport à un système 3T d’obtenir des images de diffusion de meilleure qualité du fait de l’homogénéité du champ magnétique . De plus, nous ajouterons au protocole une qualification de la graisse, qui nous donnera un taux de graisse avant et après injection des AAVs dans les muscles pour pouvoir observer les conséquences indirectes de l’atteinte des DRG. A la vue de la taille relativement fine des structures analysées, un focus sera mis sur l’acquisition d’images avec une résolution spatiale importante. L’injection de l’AAV sera réalisée par une cathétérisation intrathécale suite à une laminectomie. Cette méthode permet d’assurer que tout le produit est bien injecté dans l’espace sous-dural. Cependant, cette méthode étant assez invasive (nécessitant une chirurgie longue), une seconde méthode de cathétérisation sera évaluée (collecte de LCS propre, injection de marqueur coloré). Cette deuxième méthode est moins documentée et moins connue, et sera donc réalisée juste avant l’euthanasie de l’animal. Si cette deuxième méthode fonctionne, elle pourra permettre dans le futur de réaliser des injections intrathécales longues et répétées, en réduisant l'invasivité pour l’animal.

Procédures

Les animaux subieront des anésthésies. Deux d'entre elles dureront environ 1h (pour l'imagerie IRM), la chirurgie lourde sera d'une durée de 4h environs et la dernère anesthésie sera réalisé avant l'euthanasiedes animaux. Les prélèvements sanguins se feront sur animaux anesthésiés. Les prélèvements de liquide cerebrospinale se feront pendant la chirurgie et avant l'euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux seront anesthésiés pour chacun des actes qu’ils subiront (IRM et injection de l’AAV), ce qui représente un total de 4 fois sur la totalité du projet. Ceci nécessitera une mise à jeun (diète hydrique). Lors des IRM, l’animal présentera un risque d’hypothermie dans la machine ou lors du transport de son hébergement à la salle d’IRM . L’injection intrathécale de l’AAV et la collecte de LCS présentent un risque de douleur ou de réactions locales au site de la chirurgie. Éventuellement, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivants les administrations. De plus, les animaux pourraient présenter des signes cliniques neurologiques dus à la méthode d’injection, ainsi qu’au potentiel dommage provoqué par l’AAV au niveau des ganglions dorsaux (même si les travaux publiés jusqu'alors chez le primate ne font pas état de troubles visibles). Un suivi neurologique sera réalisé tout au long de l’étude afin de surveiller de près ce paramètre. Lors de l’évaluation neurologique quotidienne, les animaux devront être isolés de leurs congénères le temps d’évaluer leur vision et motricité faciale. Les prises de sang peuvent provoquer un hématome au site de prélèvement. Les animaux seront sous anesthésie lors de celle-ci.

Devenir

Afin de pouvoir corréler les résultats observés à l’IRM, les animaux seront mis à mort à la fin du projet. Les ganglions dorsaux seront récoltés ainsi que le cerveau, d’une part pour investiguer sur la présence du transgène injecté (afin de valider que l’AAV est bien présent dans les tissus nerveux) et d’autre part afin de réaliser de l’histologie pour observer et corréler la dégénérescence neuronal et axonal, avec les résultats d’imagerie IRM. De plus, pour valider la deuxième méthode de cathétérisation, du bleu de méthylène sera injecté dans le cathéter à la fin de la procédure. L’observation de la présence de bleu de méthylène au niveau des tissus nerveux, ainsi que le prélèvement de LCS propre, permettra de valider la méthode d’injection.

Remplacement

Cette étude permet de développer une méthode de détection de la neurotoxicité de manière non invasive grâce à l’IRM. Cette étude est nécessairement réalisée chez l'animal, car elle a pour but ultime le raffinement de protocoles en expérimentation animale. La ressemblance physiologique du système nerveux et immunitaire du primate avec celui de l’homme permettra ensuite de transférer les méthodes développées aux essais cliniques chez l'humain.

Réduction

Dans cette étude, 3 animaux seront utilisés lors de cette étude afin de pouvoir répondre à des objectifs scientifiques. Cela permettra de rapprocher différents possibles niveaux de toxicité neuronale avec leur valeur en signal IRM correspondante et permettra d'établir des corrélations. Étant donné qu'un seul type d'AAV sera utilisé, Il n'est pas nécessaire d'utiliser plus d'animaux que cela. Enfin, une méthode de cathétérisation moins invasive, mais moins documenté, sera réalisé sur ces animaux avant leurs euthanasies, afin de pouvoir confirmer que cette méthode fonctionne par l’injection de bleu de méthylène. L’observation des tissus nerveux sera une étape clef de la validation de ce protocole. Ce projet permet donc de ne pas mettre à mort des animaux dans le seul but de valider cette méthode de cathétérisation.

Raffinement

Les animaux utilisé dans ce projet ont déjà été utilisé pour d’autres projets et sont donc habitués au contact ainsi qu’aux manipulations avec les techniciens d’animalerie. Ils seront hébergés et socialisés dans des volières conformes à la réglementation. Un fond musical sera diffusé en journée. L’entretien sanitaire des hébergements et le contrôle des paramètres environnementaux seront réalisés quotidiennement. Les animaux disposeront d’eau de boisson à volonté. Un aliment adapté à l’espèce et au poids de l’animal, ainsi que des fruits et légumes frais, seront distribués quotidiennement. Des jouets seront mis à disposition et renouvelés une fois par semaine. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse et de le prendre en charge. Un score neurologique sera mis en place en place à cet effet. Il permet d’évaluer précisément les fonctions suivantes : l’état de conscience de l’animal, sa posture, la coordination motrice et équilibre de l’animal, la motricité des membres et enfin un examen rapproché permet d’évaluer la neuro-ophtalmologie (oscillation des yeux, tailles des pupilles etc..). Ce score prend aussi en compte des signes cliniques plus classique tel que des fèces liquides ou des vomissements. Les mises à jeûn hydrique n’excèderont pas les 16h. Si nécessaire, du sirop et/ou des fruits pourront être distribués tôt le matin pour les animaux dont l'anesthésie est en fin de matiné ou dans l'après-midi. Un minimum de 3 jours de repos sera accordé suite aux anesthésies. Le jour des prélèvements de LCS, de sang ainsi que le jour de la chirurgie, les animaux recevrons de la buprénorphine afin de limiter toute douleurs potentiel. L’analgésie pourra être prolongé jusqu’à trois jour suivant la chirurgie afin de prévenir de toute douleur. Les volumes de prélèvement de LCS ainsi que de sang respecteront des normes et des volumes précis. Des points limites spécifiques seront définis et si nécessaire pourront amener une euthanasie des animaux. Lors des anesthésies, il sera suivi au minimum la fréquence cardiaque, la saturation en oxygène ainsi que la température rectale des animaux. Des coussins chauffants, ainsi que des couvertures pourront être mise en place. Enfin, un relais d’oxygène sera mis en place si nécessaire.

Choix des espèces

Le but de ce projet est d’investiguer l’observation d’une neurotoxicité par IRM suite à l’injection d’AAV chez le primate on humain. La proximité phylogénétique de l’homme et du primate non humain permet d’obtenir des résultats prédictibles au niveau neurologiques et immunitaires. Les animaux utilisé seront des jeunes adultes ou adultes, afin que le système nerveux central et immunitaire soient suffisamment développés.

Déjà utilisés dans d'autres expériences et présents sur le site depuis au moins un an, trois macaques à longue queue vont subir une injection directe dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'IRM et l'injection intracérébrale se déroulent en une seule séance d'environ six heures sous anesthésie générale, après intubation, et le réveil peut s'accompagner de désorientation, de perte d'équilibre, de perte de réflexes et d'hypothermie. Convulsions, tremblements, chutes, ulcères cornéens et œdème aux points d'entrée du cadre stéréotaxique figurent parmi les suites possibles. Le porteur affirme qu'il n'existe aucune alternative non animale pour vérifier qu'une injection intracérébrale est bien tolérée, et destine ce modèle validé à des études réglementaires de toxicologie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de valider le modèle d’administration intracérébrale chez le primate non-humain. Ce modèle sera validé grâce à l’injection d’un produit de référence associé à un agent de contraste et via une évaluation histopathologique complète afin d’évaluer l’impact et qualité de la procédure d’administration intracérébrale nécessaire pour la conduite d’étude de toxicologie générale. Une fois validé, ce modèle sera utilisé sera utilisé dans des études précliniques d'évaluation de la sécurité de candidats médicaments destinés à être administrées par voie intracérébrale chez l'homme.

Bénéfices attendus

La validation du modèle d’administration intracérébrale chez le primate non-humain permettra la réalisation d’études de toxicologie règlementaire qui sont nécessaires pour démontrer la sécurité des produits pharmaceutiques en développement, avant leur mise sur le marché ou les premiers essais cliniques (notamment pour le développement de thérapie innovante telle que la thérapie génique administrée par voie intracérébrale chez l’homme). De plus la validation pourra contribuer à la mise sur le marché de nouvelles thérapies sûres pour les patients atteints de pathologie du système nerveux central (exemples: maladies de Parkinson et Alzheimer).

Procédures

L’imagerie IRM et l’injection intracérébrale (1 occasion, d’une durée d’envion 6 heures) seront réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale). Une évaluation neurocomportementale sera réalisée en post-administration/prélèvement (durée d’environ quelques minutes) afin de déceler toute potentielle atteinte neurologique en lien avec la procédure. Des prélèvements sanguins seront réalisés à raison de 3 temps (prétest, durant la phase d’observation et à la mise à mort). Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux vigile et seront de courte durée (quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les procédures d’administration intracérébrale sont pratiquées sur animaux anesthésiés qui seront mis à jeun la veille de la procédure. Des événements anesthésiques peuvent survenir (ex : hypothermie, hypotension…). Lors du réveil anesthésique, une désorientation/perte d’équilibre, perte de certains réflexes neurologiques (palpébral…) ains qu’une hypothermie et baisse d’activité (en raison de la durée de la chirurgie, envion 6 heures) peuvent être observées temporairement. Des signes locaux (oedème) au niveau des points d'entrée des cadres ou des ulcères cornéens pourraient être observés et être associés à de la douleur. Des symptômes neurologiques (risque de pertes d'équilibres ou chutes, tremblement, convulsions,…) peuvent être observé à la suite de la procédure d’administration intracérébrale. Pour les prélèvements sanguins (PS) qui seront réalisés sur animaux vigiles, ceux-ci pourraient être associés à des sensations désagréables de ponction mais seulement pendant une courte durée et des hématomes post-prélèvement. Les signes cliniques suivant pourraient être observés en cas de réaction exagérée au produit pharmaceutique de référence : • Troubles de la coordination des mouvements • Diminution de l’appétit • Somnolence • Vomissement • Diarrhée. Ces signes cliniques devraient être seulement transitoires et seront surveillés par un vétérinaire.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et une évaluation histopathologique et une analyse de biodistribution seront réalisées au niveau du tissu cérébral à la fin de la procédure afin d’évaluer l’impact de la procédure d’administration intracérébrale. Ceci afin de valider le modèle, dans le contexte des études réglementaires de toxicologie.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animale permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité, notamment systémique et neurocomportementale des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapies innovantes, telle que la thérapie génique. Il n’existe pas non plus d’alternative non animale pour valider que la technique d’administration intracérébrale aboutit à une exposition de l’animal au produit pharmaceutique de référence et que celle-ci est bien tolérée (analyse histopathologique).

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique (biodistribution du produit réference). De plus, dans les études réglementaires de toxicologie 3 animaux par groupe sont généralement utilisés. Au total, 3 animaux seront utilisés dans ce projet. Des animaux non-naïfs seront utilisés dans le cadre de ce projet afin de réduire l’utilisation d’animaux.

Raffinement

Le produit de référence associé à l’agent de contraste sera injecté à une seule occasion (volume maitrisé de 100 µL par hémisphère, débit maximal 3 µL/min) et à une dose bien tolérée sans effet toxique attendu. Les animaux non-naïfs sont présents sur le site depuis au moins 1 an, et sont acclimatés aux conditions de vie dans le laboratoire. Les animaux auront au moins 5 jours d’acclimatation dans la salle d’étude avant le J1. Un entrainement pour les pesées corporelles et des interactions positives seront mis en place. Pour limiter le stress des animaux, les animaux seront manipulés régulièrement par les personnes en charge des procédures expérimentales (contention, suivi du poids). Des récompenses alimentaires seront distribuées après les actes contraignants. Une protection mécanique préventive des yeux et des soins locaux seront mise en place pré- et post-opératoire afin de réduire le risque d’ulcéres cornéens. L’injection intracérébrale sera réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique. Une analgésie/anti-inflammatoire et antibiothérapie préventive sera mise en place avant (entre 30min et 1h avant l’anesthesie) et après administration (jusqu’à 6h et 7 jours après administration pour l’antibiothérapie et l’analgésie/anti-inflammatoire, respectivement) du produit de contraste et élément d’essai afin d’anticiper toute douleur ou détresse. Des mesures de prévention de l’hypothermie seront appliquées pendant l’anesthésie et au réveil. Une évaluation neurocomportementale sera réalisée duant le pretest et à deux occasions après adminisration (+4h et +24h post-procédure). La mise à mort sera considérée pour les points limites suivants : convulsions ne rétrocédant pas spontanément ou à l'administration d'anti-convulsivants ou convulsions répétées dans la même journée, incapacité prolongée de l'animal à se déplacer ou pertes d'équilibres durables impactant la qualité de vie de l'animal, perte d'appétit ne rétrocédant pas aux mesures de soutien, perte de poids supérieur à 15% et infection des plaies chirurgicales ne rétrocédant pas aux soins. Des soins locaux quotidiens seront appliqués à la suite de l’administration, jusqu’à 7 jours post-administration. Les animaux sont gardés isolés 2h pour limiter le risque de chutes. En cas d’hypothermie, une prise en charge par lampe chauffante (et/ou coussin chauffant) sera mise en place. Les primates seront socialisés.

Choix des espèces

Les études réglementaires de toxicologie doivent se faire chez une espèce pertinente pour l’évaluation de la sécurité des futurs candidats médicaments. La pertinence du primate non humain (PNH) pour la conduite des études de sécurité préclinique est basée sur une homologie phylogénétique, anatomique et transcriptomique importante avec l’Homme. De nombreuses nouvelles stratégies thérapeutiques du système nerveux central (SNC) sont basées sur des produits biologiques ou de thérapie génique qui nécessitent une homologie phylogénétique ou transcriptomique importante avec l’Homme afin d’évaluer les propriétés pharmacodynamiques du produit mais également les potentiels effets toxiques. Par conséquent, l’utilisation d’autres modèles non-rongeur (tel que porc et chien) est inapproprié dans ces études. L’utilisation du primate non humain pour la validation du modèle d’administration intracérébrale est donc justifiée puisque les études précliniques non rongeurs sur ces nouvelles thérapies seront réalisées chez le macaque. La validation du modèle d’administration intracérébrale ne nécessite pas de pré-requis d’âge et se fera sur jeunes adultes/adultes comme pour les études de toxicologie réglementaire. Des animaux d’environ 3 ans seront utilisés pour ce projet.

Environ trente anesthésies et trente prélèvements sanguins par animal, quatre ponctions de moelle osseuse, quinze prélèvements urinaires dont trois par sonde vésicale : 168 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est infectée par le virus Zika ou par le chikungunya après immunisation avec des candidats vaccins, puis hébergée seule pendant quatre à huit semaines pour éviter les contaminations croisées. Aucun n'est tué à l'issue selon le champ de devenir, le porteur indiquant qu'ils seront gardés en vie sur avis vétérinaire et inclus dans d'autres projets, ce qui réduit le nombre d'animaux comptés dans chacun. Le macaque est présenté comme le "seul modèle" possible avant les essais chez l'humain, pour sa proximité phylogénétique et sa réponse vaccinale semblable.

Objectifs

Les agents du Zika et du chikungunya appartiennent à la famille des arbovirus, large famille de virus véhiculés par des insectes qui se nourrissent du sang d’animaux. Ils sont essentiellement transmis par les moustiques du genre Aedes (hémisphère Sud) et Culex (hémisphère Nord). . Restreint il y a encore quelques années à des zones tropicales, le moustique tigre se répand de plus en plus en Europe, étant maintenant implanté dans les pays du nord de la méditerranée (France, Italie, Croatie, Albanie, Grèce). Il pourrait être le point de départ de nouvelles épidémies. Actuellement, la surveillance sur le chikungunya et zika a été renforcée en France métropolitaine. Si la plupart des infections qu’ils provoquent sont sans gravité, ces virus peuvent parfois conduire à des complications sévères voire mortelles : - une microcéphalie chez des bébés nés de mères infectées par le virus Zika et dans de très rare cas des atteintes neurologiques (syndrome de Guillain Barré). - des douleurs articulaires persistantes et sévères en cas d’infection par le chikungunya. Le virus Zika est déjà à l’origine de plusieurs épidémies en Océanie (2006, 2013) et plus récemment sur le continent Sud-Américain en 2015. Le 1er février 2016, l’OMS a déclaré que le virus Zika constitue une urgence de santé publique. Le virus Chikungunya est endémique en Asie du Sud et en Afrique mais s’est étendu en 2005 dans l’océan indien, notamment à l’île de la Réunion suite à une forte épidémie. En 2007, la maladie est arrivée en Europe, avec des cas autochtones dans le sud de la France en 2010. Les facteurs tels que le réchauffement climatique, l’élargissement du biotype des vecteurs, l’émergence de cas autochtone de certains arbovirus en Europe, conduisent dernièrement à une menace accrue d’épidémie qui nécessite de chercher et tester des candidats vaccins, idéalement pouvant protéger contre plusieurs type d’arbovirus.L’objectif du projet est d’évaluer sur des modèles précliniques l’immunogénicité (le type de réponse immunitaire déclenchée) et l’efficacité de candidats vaccins lors d’infection par les virus Zika et Chikungunya.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats permettront de justifier le passage à des essais cliniques du candidat vaccin sélectionné. A long terme, la preuve de concept d’un vaccin ciblant plusieurs arbovirus permettrait d’envisager des constructions plus complexes, protégeant les populations selon les circulations endémiques des virus en une seule injection. Que ce soit pour les nourrissons et jeunes enfants, pour les populations ayant un accès limité aux soins ou même pour les touristes se vaccinant avant leur voyage, la simplification du régime vaccinal devrait être très bien accepté. De plus, économiquement, les coûts de développement et le prix final d'un vaccin unique seraient fortement réduit.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - immunisation avec des candidats vaccins (pouvant aller jusqu’à 3 fois selon les résultats de l’étude pilote d’immunogénicité, 5 minutes, tous les groupes) - Infection par le virus Chikungunya (une fois, 5 minutes, groupes exposés) - Infection par le virus Zika (une fois, 5 minutes, groupes exposés) - Anesthésie des animaux (30 fois environ, 30 minutes, tous les groupes) - Prélèvements sanguins (30 fois environ, 5 minutes, tous les groupes) - Prélèvements de moelle osseuse (4 fois, 10 minutes, tous les groupes) - Prélèvements salivaires (15 fois, 2 minutes, tous les groupes) - Prélèvements urinaires (15 fois, 15 minutes, tous les groupes) - Implant puce de température (1 fois, 30 minutes, tous les groupes) - Sonde vésicale (3 fois, entre 2 à 30minutes, groupes exposés) - hebergement individuel (1 fois, 4 semaines pour les infections avec Zika et 8 semaines pour les infections avec Chikunguya, groupes exposés)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’immunisation (peu attendu) : Réaction locale, écoulement de pus, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection. Nuisances suite à l’infection (attendu pour les animaux non vaccinés, peu attendu pour les vaccinés) : Chikungunya : L’infection du macaque se caractérise, comme chez l’homme, par une infection par le virus transitoire détectable entre les jours 1 et 5, accompagnée d’un épisode fébrile (1 ou 2 jours d’après les précédentes études), d’un gonflement transitoire des articulations, principalement les chevilles et les poignets, 4 ou 5 jours entre les jours 6 à 10, d’une éruption cutanée transitoire diffuse et d’intensité variable pendant les 3 premiers jours ainsi que d’infiltrations persistantes de monocytes/macrophages (cellules immunitaires) infectés dans les tissus lymphoïdes et à un moindre niveau dans les muscles et les articulations. Ces nuisances ne sont pas accompagnées d’une modification de comportement et se résolvent en quelques jours. Zika : Nausées, vomissements, fièvre, déshydratation (évaluation du pli cutané lors des prélèvements). Nuisances suite aux prélèvements de sang, de moelle osseuse, urine et anesthésies répétées : Troubles de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Pour le prélèvement urinaire par sonde, les nuisances possibles sont un risque d’abrasion des muqueuses et de contamination avec la sonde. Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entrainer un stress. Nuisances possibles chez les animaux après la pose de puce de température: Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie sur avis vétérinaire et pourront être inclus dans d’autres projets compatibles avec la procédure suivie dans notre projet, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Remplacement

L’étude et la caractérisation de la réponse immunitaire induite lors de l’immunisation avec les vaccins candidats contre les maladies virales Zika et Chikungunya nécessitent l’exploration de fonctions physiologiques et d’interactions systémiques à l’échelle de l’organisme entier. A ce jour, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux. Les systèmes expérimentaux in silico et in vitro basés sur l’étude de cellules ou de tissus isolés ne permettant pas de construire des modèles pertinents des interactions hôte-pathogène, de la mise en place et de la persistance de la réponse immunitaire à une infection ou une vaccination. L’espèce macaque cynomolgus a été choisie pour sa proximité phylogénétique et physiologique de l’homme permettant ainsi une transposition des résultats. Les modèles d’infection par le virus Zika et par le virus Chikungunya ayant déjà été développés chez cette espèce, il est plus opportun de poursuivre chez celle-ci.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire. Des études préliminaires sont prévues avec des groupes réduits au minimum à 2 individus pour permettre de sélectionner les meilleures conditions pour les études d’efficacités. Pour ces dernières, le nombre d’animaux a été réduit à 6 animaux par groupe expérimental permettant une analyse statistique adaptés aux petits échantillons.Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriquesstatistiques adaptés aux petits échantillons, comprenant 6 animaux par groupes expérimentaux.

Raffinement

Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule anesthésie. Si trouble alimentaire/anorexie suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée (monkey dough, fruits secs, fruits frais additionnels, fortimel etc.). Puce de température: Une réaction locale au site d’incision peut être observée comme un gonflement, suintement de la plaie (rare). Les réactions sont signalées au vétérinaire (traitement symptomatique). Prélèvements: Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si apparition de réaction locale un traitement symptomatique pourra être instauré. Immunisation Si réaction locale à l’injection du vaccin (écoulement de pus (suppuration), démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection) => signalement au vétérinaire, un traitement symptomatique local pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale si la douleur est marquée). Si la réaction locale est exacerbée (suppuration intense avec nécrose, absence de récupération après mise en œuvre des traitements), l’euthanasie de l’animal sera envisagée. Hébergement individuel: Les animaux seront hébergés individuellement pendant la phase d’exposition virale pour éviter une contamination croisée et/ou une surinfection. Un enrichissement complémentaire sera apporté lors de cet hébergement individuel. Infection: Suite à une infection avec le virus Zika, les animaux peuvent avoir des nausées, vomissements, fièvre et déshydratation. Un signalement au vétérinaire sera fait en cas d’apparition de ces symptômes. Si les symptômes sont plus sévères (type paralysie) la sortie d’étude de l’animal sera envisagée. Les données issues d’un projet précédent n’ont pas montré de dégradation de l’état de santé de l’animal ni de mortalité. Suite à une infection par le virus chikungunya, une surveillance accrue sera mise en place sur les 10 premiers jours avec suivi de la température des animaux, mesure des articulations proches des sites d’injection et d’éventuelles rougeurs cutanées. Ces nuisances n’entrainent pas de changement de comportement et disparaissent au bout de quelques jours d’après les données d’un projet précédent.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus est le modèle animal retenu pour ce projet car il est le seul modèle réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de candidats vaccins avant la mise en place d’essais cliniques chez l’homme, la réponse immunitaire et vaccinale étant similaire à celle de l’homme. De plus, il a déjà été utilisé dans des modèles specifiques de ces infections dans la littérature et au laboratoire pour étudier l’efficacité de vaccin avec des phases cliniques. Enfin, notre laboratoire maîtrise les techniques d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale chez le macaque ce qui permet une exploration complète de ces réponses. Le suivi immunologique et la réponse à l’infection sont des paramètres majeurs dans ce projet, nous avons donc besoin d’animaux adultes avec un système immunitaire pleinement mature, au minimum 3 ans.

Déjà exploitées dans un projet précédent, 5 femelles macaques à longue queue vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis pourront être réutilisées dans un autre projet après accord du vétérinaire. Sous anesthésie, elles reçoivent dans le nez un anticorps antiviral radiomarqué, passent en imagerie scintigraphique, subissent des lavages nasaux et sont intubées sous assistance respiratoire pendant une heure. Les prises de sang s'étalent de quinze minutes à quatre semaines après l'inhalation, une partie sans anesthésie, sous contention pour les femelles qui refusent l'entraînement par renforcement positif. Le porteur affirme que le principe de remplacement "est appliqué", en citant des répliques de cavités nasales de macaque qui permettent de calibrer les expériences sur ces 5 femelles.

Objectifs

Selon l’organisation mondiale de la santé, les infections des voies respiratoires basses demeurent la maladie transmissible qui fait le plus de morts dans le monde, et se placent au quatrième rang des principales causes de mortalité. Ces infections dues, entre autres, à des virus respiratoires entraînent des millions d’hospitalisations chaque année et est une cause importante de décès chez les personnes fragiles (âgées, jeune enfant…). Face à l’hésitation vaccinale, la moindre efficacité des vaccins dans certaines populations et l’émergence et une propagation rapide des virus pharmaco-résistants, de nouveaux traitements sont nécessaires pour contrôler les infections virales respiratoires. Pour de nombreux virus respiratoires, comme celui de la grippe, le virus respiratoire syncitial et celui de la Covid-19, les cavités nasales sont le site d’entrée, de réplication primaire du virus, et constitue un réservoir pour la transmission du virus aux poumons, où l’infection peut provoquer une pneumonie potentiellement mortelle. Le contrôle de la réplication des virus respiratoires et de l’infection dans les cavités nasales offre donc une réelle opportunité de limiter les pneumonies lorsqu’une épidémie émerge. Aujourd’hui, de nombreuses biothérapies à visée intranasale (protéines et vaccins) sont en cours de développement ou commercialisés pour diverses applications. S’appuyant sur des décennies de recherche translationnelle en immunothérapie sur les infections respiratoires, en ingénierie des anticorps et en inhalation le but de ce projet européen est de développer des traitements inhalables (par voie intranasale), à base d’anticorps contre différents virus respiratoires (grippe, COVID) afin de bloquer l’infection dans les cavités nasales. Plus concrètement, cela implique : 1/ d’évaluer le dépôt de l’anticorps dans les voies respiratoires après inhalation par voie intranasale chez le primate non humain afin de déterminer la dose délivrée dans les cavités nasales et 2/ d’analyser le devenir et l’impact de l’anticorps inhalé dans l’organisme.

Bénéfices attendus

Les infections respiratoires représentent un lourd tribut en termes de morbi/mortalité, perte de productivité et coût pour le système de santé. L’impact sociétal potentiel du projet est immense. La prévention des décès et des hospitalisations dus aux virus respiratoires avec des anticorps inhalés aura un avantage direct pour la santé humaine et un potentiel économique et sociétal important. Cette approche anticorps/voie intranasale offrirait une opportunité de mieux contrôler les épidémies. L’approche par inhalation intranasale avec des anticorps capables de neutraliser différentes virus respiratoires est très attractive pour limiter la transmission entre personnes et pour prévenir des pneumonies sévères.

Procédures

- Pose des points de repère spatiale : sous anesthésie chimique légère- 10 minutes - Mesure du coefficient d’atténuation des cavités nasales : sous anesthésie chimique légère- 10 minutes - Administration par voie intranasale de l’anticorps radiotracé : sous anesthésie chimique légère - 1 minute au total - Imagerie scintigraphique du dépôt dans les voies respiratoires de l’anticorps radiotracé : sous anesthésie chimique légère - 15 minutes - Intubation par sonde intratrachéale : sera réalisée à l’occasion des gestes nécessitant l’anesthésie gazeuse à l’isoflurane- le geste lui-même dure environ 2 minutes mais les animaux seront intubés et sous assistance respiratoire pendant 1 heure. - Prélèvements sanguins : sous anesthésie–5-10 minutes par prise de sang Et sur animaux vigiles – 5-10 minutes par prise de sang. - Lavage nasal : sous anesthésie 5 -10 minutes par lavage.

Impact sur les animaux

Nous avons identifié quelques nuisances attendues/prévues : - Stress causé par la contention et manipulation des animaux, - Douleur causée par l’injection d’anesthésiques chimiques De plus, nous avons identifié des facteurs engendrant des potentiels effets indésirables/secondaires : l’utilisation d’anesthésiques pouvant éventuellement entraîner des troubles cardio-respiratoires, des hématomes lors des prises de sang, une irritation locale lors de l’inhalation par voie intranasale de l’anticorps radiotracé et lors des lavages nasaux.

Devenir

Au vu de l'espèce utilisé dans ce projet et de la classification de la gravité de la procédure (moderée), les animaux pourront être réutilisés dans un autre projet après accord du vétérinaire réferent.

Remplacement

Le principe de remplacement de la règle de bien-être animal est appliqué. En effet, les résultats in vitro préalables à l’utilisation des animaux, notamment l’utilisation de répliques anatomiques de cavités nasales macaques, nous permettrons de calibrer les différentes expériences in vivo afin de limiter le nombre d’animaux nécessaire et d’utiliser d’emblée des posologies et modalités d’administration adaptées.

Réduction

Les animaux seront réutilisés d’un autre projet, mais naïfs vis-à-vis de l’anticorps anti-viral. L'étude est réalisée sur un effectif réduit (n=5) et servira à obtenir des données qualitatives, sans analyse statistique, du devenir et de l’impact de l’anticorps inhalé. Comme indiqué dans la saisine, les temps de prélèvements (sanguin et nasal) pourront varier selon les animaux car ils seront ajustés, au cours de l'étude, sur la base des données issues des premiers animaux. Une analyse statistique n'apparaît donc pas compatible compte tenu du n faible à chacun des temps (n

Raffinement

Pour réduire au maximum l’utilisation d’anesthésiques, du renforcement positif est inclus pour les prélèvements sanguins (PS) à T3h-72h post-inhalation (PS sans lavage nasal concomitant). A ces temps les PS seront réalisés sur animaux vigiles sans contention uniquement sur les animaux répondants car, d’après des études, certains animaux n’adhèrent pas à ce type de démarche même après plusieurs semaines d’entrainement. Pour les animaux non réceptifs les PS seront réalisés sur animal vigile mais immobilisé par contention. Le renforcement n’est pas envisagé pour les PS aux temps T15min->T60min car le respect de ces temps précis est primordial pour l’analyse pharmacocinétique. Il n’est pas envisagé pour les lavages nasaux pour des questions de sécurité du personnel car, d’après les zootechniciens, il est difficile d’entrainer un PNH à accepter l’administration nasale d’un soluté et d’en récupérer un volume. Ce geste sur un animal non coopérant amène des questions de sécurité (risque morsures). La totalité des lavages nasaux se fera donc sur des animaux anesthésiés avec des molécules et dosages adaptés. Enfin, vu que les lavages nasaux impliquent une anesthésie nous réaliserons les PS aux temps T0, T1sem, T2sem, T3sem, T4sem durant l’anesthésie. Pour réduire la douleur et éviter des hématomes la taille de l’aiguille sera adaptée et un point de compression sera appliqué. Si insuffisance respiratoire des mesures d’oxygénothérapie et réanimation seront mis en place. Pour réduire le risque d’irritation locale, la taille des embouts narinaires sera adaptée et les lavages seront réalisés avec soin. Au cours de l’anesthésie prolongée : -Gel oculaire pour prévenir la sècheresse des yeux - Humidification et réchauffement des voies aériennes par filtre échangeur d’humidité chaleur - Sonde d’intubation de taille adaptée avec ballonnet pour éviter une lésion trachéale et garantir une bonne ventilation. - Tapis chauffant pour maintien d’une température - Fluides de remplacement (solution isotonique) après des PS multiples. Les animaux sont hébergés par groupe de 3 et de 2 dans 2 volières conformes aux normes en vigueur. Ils disposent dans leur hébergement de plateformes surélevées, de tunnels, de jouets et de piscine. L’alimentation couvre les besoins journaliers et est complétée par une distribution de friandises. La nourriture pourra être cachée dans des jouets pour stimuler la recherche alimentaire. Les friandises distribuées sont différentes d’un jour à l’autre.

Choix des espèces

Le primate non humain est une espèce de référence pour les études de dépôt de particules inhalées dans le tractus respiratoire, permettant de mettre en place différentes conditions de ventilation et d’utiliser des dispositifs à qui seront directement utilisés chez l’homme. Le choix de l’espèce macaque se justifie par : - La tenue bipède, la morphologie du nez et le volume des cavités nasales. La tenue assise lors de l’administration de la molécule et la taille du nez permet l’utilisation de dispositif à visée humaine avec un embout adapté. Le volume des cavités nasales est compatible avec les volumes administrés avec les différents dispositifs. - Proximité anatomique de l’espèce. Les cavités nasales des macaques sont plus similaires à celle de l’homme, que celles d’autres espèces. - Proximité physiologique de l’espèce. La morphologie et la distribution de l’épithélium nasal (où se réplique le virus de la grippe et cible de l’anticorps) chez le macaque est plus proche de celles de l’homme que celles d’autres espèces (rongeurs, chiens) - Similarité des réponses immunologiques et biologique avec l’humain, faisant du PNH une espèce de référence pour les études réglementaires avec des anticorps thérapeutiques. 5 animaux adultes de 3-4 kg réutilisés de projets précédents après accord du vétérinaire référent.