Primates

Réutilisés ensuite dans d'autres projets, 90 souris, 90 rats et six macaques subissent des IRM répétées sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut passer jusqu'à 120 examens de deux heures sur cinq ans, avec prises de sang et administrations de molécules le jour de l'examen. Le porteur reconnaît que le stress de la contention et les anesthésies répétées entraînent une perte de poids, et que la stimulation des pattes des rongeurs provoque des douleurs les jours suivants. Quand les rongeurs deviennent trop lourds pour le scanner, il annonce leur transfert vers des projets de formation, ce qui prolonge leur utilisation dans un autre cadre.

Objectifs

Notre projet vise à repousser les limites de l’imagerie métabolique par résonance magnétique nucléaire (RMN) à travers le développement et la validation d’outils dédiés à la résonance magnétique nucléaire à haut champ, notamment les antennes radiofréquences servant à l’excitation des spins nucléaires et la détection des signaux RMN, et les schémas d’acquisition optimisés pour les différents noyaux non-proton observables in vivo. Nous mènerons d’une part des expériences chez le rongeur (rat et souris) et le primate non humain sain anesthésié pour développer et valider nos nouveaux outils d’imagerie cérébrale. Nous attendons de ces expériences qu’elles nous permettent d’acquérir des données de référence qui seront comparées aux données de la littérature afin d’apporter la « preuve de concept » que nos outils sont performants et précis. D’autre part, ces méthodes seront mises en œuvre pour étudier l’activation cérébrale chez l’animal sain.

Bénéfices attendus

Les méthodes validées et données de référence acquises à l’occasion de ce projet seront utiles pour préfigurer les études de recherche biomédicale et de neurosciences à venir chez le rongeur, le primate non-humain et ultimement chez l’Homme par IRM à ultra-haut champ magnétique.

Procédures

Des prélèvements sanguins (de quelques secondes) seront éventuellement réalisées chez l’animal anesthésié (juste avant, juste après ou pendant l’examen IRM) pour la détermination de certains paramètres physiologiques). Des molécules à dose thérapeutique seront administrés occasionnellement (réalisée typiquement en quelques minutes) le jour de l’examen IRM. Le projet prévoit des examens IRM chez l’animal anesthésié à une fréquence maximale bimensuelle et une durée typique de 120 minutes. En pratique, nous envisageons moins de 50 examens IRM sur 5 ans pour les macaques et moins d’une dizaine pour les rongeurs. Un nombre maximal de 5 expériences de stimulations somato-sensorielle (quelques minutes) seront menées par animal durant certains examens IRM.

Impact sur les animaux

Les examens IRM sont en eux-mêmes non-invasifs. Par contre, le stress de la contention et les contrecoups de l’anesthésie répétée peuvent être délétères entrainant typiquement une perte de poids. A noter également que la stimulation somato-sensorielle des pattes chez le rongeur implique le plus souvent des douleurs les jours suivants nécessitant un traitement analgésique.

Devenir

Pour les rongeurs, les dispositifs expérimentaux présupposent un poids maximum au-delà desquels les souris ou les rats (ne peuvent plus être positionnés correctement et de façon stable dans le scanner IRM préclinique. Dans ce cas de figure, nous chercherons à transférer les animaux vers d’autres projets de formation en particulier. Après avis favorable du vétérinaire, les PNH pourront être réutilisés dans de nouveaux projets.

Remplacement

Nos tests préliminaires seront systématiquement menés sur des objet-tests aux dimensions et caractéristiques électromagnétiques comparables à celles d’un cerveau de souris, de rat ou de macaque adulte. Toutefois, la complexité anatomique, fonctionnelle et métabolique du cerveau ne peut être appréciée à l’aide d’objets-test aussi évolués soient-ils. Le passage par l’expérimentation animale (rongeur ou primate) est donc une nécessité.

Réduction

Nous comptons utiliser le nombre minimum d’animaux nécessaires à la mise au point et à l’affinement de nos méthodes. Aucun test statistique précis n’est envisagé à ce stade mais les analyses statistiques nécessaires à la validation de nos méthodes, notamment pour l’évaluation de leur reproductibilité et l’établissement de valeurs/images de référence seront déployées. Pour chaque espèce, les effectifs suffisant pour acquérir des données de références ont été évalué sur la base de nos études précédentes. Chaque animal sera réexaminé à plusieurs reprises avec un intervalle minimum de 15 jours (soit un nombre maximum de 120 examens par animal sur une période de 5 ans). Concernant la détection des variations locales de signal liée à l’activation cérébrale, nous considérons empiriquement que les effectifs prévus seront suffisants pour atteindre une significativité statistique. Dans la mesure du possible, nous comptons utiliser des macaques ayant déjà participé à d’autres projets de recherche afin de limiter globalement le nombre de primate nécessaires en recherche biomédicale.

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés lors des examens RMN et leurs paramètres physiologiques (température corporelle, nombre de respirations par minute) seront suivis en continus afin d’éviter tout effet négatif ou inconfort pour les animaux. Le réveil après les anesthésies est également surveiller de près pour s’assurer que l’animal récupère bien et se nourrit. Un contrôle minutieux des points-limites est également mené tout le long du projet afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux . Les animaux seront hébergés en groupe sociaux stables.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces ubiquitaires en recherche biomédicale. L’organisation, la physiologie et le métabolisme du cerveau des rongeurs sont bien connues dans le monde scientifique. Par ailleurs, de très nombreux modèles de souris transgéniques permettent aujourd’hui de valider la pertinence de nos biomarqueurs vers une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques en jeu chez la maladie humaine. Chacune de ces deux espèces de rongeur propose des challenges techniques spécifiques en terme de dimensionnement des dispositifs expérimentaux mais aussi en terme de quantité ou de stabilité des signaux RMN. Ainsi certaines méthodes ne seront pas réalisables pratiquement chez l’une ou l’autre espèce. Phylogénétiquement très proche de l'homme (développement cortical et sous-cortical), le macaque permet de poursuivre le développement des méthodes préalablement mises au point chez les rongeurs dans des conditions plus proches de l'examen chez l'homme notamment en termes de résolution et d'équipement. Il s'agit d'une étape nécessaire à la validation de nos approches avant l'application chez l’Homme. Pour des raisons pratiques (conceptions des équipements IRM et autres appareillages) de mise en œuvre, des animaux adultes seront examinés. Pour les rats, les individus devront être pesés de 200 à 450g. Pour les souris, leur poids devra être compris entre 20 et 40g. Des groupes homogènes en âge seront constitués. Pour le macaque, dans le souci de réduire, nous souhaitons réutiliser dans la mesure du possible des macaques adultes sains âgés de moins de 15 ans au début du projet.

Équipés d'un dispositif d'enregistrement fixé en permanence sur le crâne sous anesthésie générale, 36 prosimiens vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour analyser leur cerveau. Ils portent pendant les séances jusqu'à 15 grammes de matériel, soit 20 % de leur poids, explorent une arène une heure par jour pendant trois à six semaines, puis passent en cage plus petite et en volière individuelle. Le porteur indique que la ration alimentaire quotidienne dépend de l'exploration active du dispositif, ce qui fait du rationnement un ressort de l'expérience, et signale une gêne possible dans les sauts et la locomotion. Il affirme que l'expérimentation animale reste "le seul moyen" d'accéder à ces circuits, l'objectif annoncé portant sur l'évolution du système visuel des premiers primates.

Objectifs

L’exploration de notre environnement est cruciale dans notre quotidien et la vision, notamment chez les primates, est particulièrement sollicitée lors de cette activité. Due à des limitations techniques, la plupart des études sur la vision des primates est faite sous anesthésie ou en éveil, mais avec des dispositifs d’enregistrement filaires, limitant ainsi les mouvements de la tête. Comment sont représentés les différents éléments de l’espace environnant au niveau neuronal pendant l’exploration libre reste une question encore ouverte. Dans ce projet, nous essaierons de répondre à cette question en étudiant des primates de petite taille, ce qui va nous permettre d’utiliser une série d’outils d’enregistrement optiques et électrophysiologiques innovants (légers, portables et sans fil), initialement développés pour la recherche avec les rongeurs, et permettant une liberté totale de mouvements pendant l’exploration comportementale. Nous allons en particulier étudier l’activité neuronale dans les aires visuelles du cortex, ainsi que dans l’hippocampe, une région du cerveau où les paramètres spatiaux sont bien représentés. Cette recherche promet donc de nous donner des informations importantes sur la façon dont le système visuel a évolué chez nos ancêtres et de mieux comprendre comment notre cerveau traite l’information visuelle lors de l’exploration active.

Bénéfices attendus

Cette étude livrera des informations précieuses sur la façon dont les primates, y compris les humains, perçoivent visuellement leur environnement pendant l’exploration active. En particulier, nous espérons mieux comprendre comment les informations spatiales et des objets sont intégrés avec des paramètres internes (mémoire, prise de décision, motivation). La compréhension fondamentale des circuits cérébraux impliqués dans la vision des primates peut avoir des implications importantes pour trouver de nouvelles solutions lorsque la vision est altérée au cours du développement, lors de maladies neurodégénératives ou lors d’un AVC. Les résultats de cette étude pourraient également être généralisés à d’autres circuits cérébraux, tels que les systèmes sensitifs (ex : le toucher) et moteurs.

Procédures

La procédure 1 consiste en une étude histologique de l’anatomie du système visuel par injection sous anesthésie générale d’un marqueur fluorescent dans le cerveau. Après une durée de 3-4 semaines, temps d’action du marqueur, les animaux seront euthanasiés pour une analyse histologique des cerveaux. L’objectif des procédures 2 et 3 est de combiner l’enregistrement de l’activité neuronale par électrophysiologie (résolution temporelle, procédure 2) et imagerie optique (résolution spatiale, procédure 3) pendant l’exploration active des animaux. Pour cela, des dispositifs permanents (maximum 3.5g, soit moins de 5% du poids de l’animal) seront disposés sur la tête des animaux sous anesthésie générale et seront gardés par les animaux jusqu’à la fin de chaque procédure. Dans la procédure 2, les animaux seront également équipés d’un collier (4gr ; dispositif temporaire) pourvu d’une diode pour suivre les mouvements des animaux. Les animaux seront ensuite suivis dans une grande arène, pendant des sessions d’exploration (1 session de 1h par jour). Les animaux porteront alors, en plus du dispositif permanent et du collier (pour la procédure 2), un dispositif temporaire permettant soit l’enregistrement électrophysiologique (procédure 2) ou optique (procédure 3) de l’activité neuronale. Dans les deux cas, la charge totale portée par les animaux pendant l’exploration libre sera au maximum de 15g, soit au maximum 20% du poids de l’animal. Les dispositifs temporaires seront enlevés à la fin de chaque session exploratoire (1 session de 1h par jour). Cette première phase durera 3 à 6 semaines, en fonction du temps nécessaire pour obtenir assez de données exploitables. Les animaux suivront ensuite une évaluation psychophysique (3 à 6 semaines, 1 session de 1h par jour) dans une petite cage offrant un meilleur contrôle expérimental. A l’issue des procédures 2 et 3, les animaux seront euthanasiés pour réaliser des analyses histologiques des cerveaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles liées aux différents actes expérimentaux pourraient être: risque de complications (douleurs résiduelles ou gêne) après les chirurgies pour la pose sur la tête des dispositifs permanents d'enregistrement (prise en charge des douleurs éventuelles et protocole analgésique); inconfort (gêne au niveau des sauts et de la locomation par exemple) liée au port de dispositifs temporaires d’enregistrement automatiques sur la tête pendant les sessions expérimentales; inconfort ou stress lié à l'hébergement provisoire dans des systèmes automatisé pour tests et volière individuelle; inconfort ou stress lié au conditionnement alimentaire nécessitant une exploration active du dispositif pour que l'animal reçoive sa ration alimentaire journalière.

Devenir

Les animaux impliqués dans les 3 procédures seront euthanasiés pour étudier leur anatomie cérébrale.

Remplacement

Nos recherches sont axées sur la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans la vision active des primates. Pour comprendre ces fonctions complexes et intégrées du système nerveux central et périphérique nous allons travailler avec des animaux éveillés et libres de déplacement pendant des tâches d’exploration comportementale. Les alternatives in vitro telles que les cultures cellulaires et les organoïdes (une version simplifiée d'un organe, fabriquée in vitro) n'ont pour le moment pas atteint le niveau approprié d'organisation biologique pour étudier ces questions. Finalement, en ce qui concerne les alternatives in silico, l'éthologie computationnelle est un domaine qui n’en est encore qu'à ses débuts. Les modèles théoriques sont encore très loin de la complexité comportementale des animaux. Ils ne peuvent ni proposer, ni empiriquement prouver les réponses à nos questions. L'expérimentation animale nous semble donc le seul moyen de découvrir les processus constitutifs de ces comportements visuels, les algorithmes sous-jacents et les circuits neuronaux impliqués.

Réduction

Nous avons pris plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette étude. Tout d'abord, nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés au strict minimum nécessaire statistiquement. Le nombre d’animaux maximum prévu par expérience (N=12) est calculé sur notre expérience de taux de succès (études publiées sur des modèles rongeurs) et sur le pouvoir statistique requis. Compte-tenu du fait que les animaux seront inclus séquentiellement dans les procédures (par groupe de 2 à 4) et dans le cas où le taux de succès serait atteint plus tôt que prévu, cela nous permettrait d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux finalement utilisés dans chaque procédure. Les méthodes proposées, notamment l’imagerie optique, vont permettre d’enregistrer plusieurs centaines de neurones en parallèle, ce qui réduit aussi le nombre d’expériences nécessaires. Enfin, nous allons documenter et rendre les données accessibles à la communauté scientifique afin de réduire la nécessité de futures expériences sur le terrain.

Raffinement

La prise en charge de la douleur avant, pendant et après les interventions chirurgicales est assurée par une anesthésie et une analgésie optimisées, ainsi que par une surveillance quotidienne. Des mesures compensatoires telles que l’utilisation d’un tapis chauffant ou la réhydratation (pour limiter la déshydratation des animaux pendant l’anesthésie) sont mises en place pour toutes nos interventions. Les animaux inclus dans les procédures seront habitués à être manipulés régulièrement par des biologistes, en accord avec leur rythme journalier d’activité, ce qui contribue à diminuer leur stress. Dans leur cage, ils bénéficient d’un enrichissement environnemental multimodal (aménagement cage, social, alimentaire, cognitif). La recherche active de la nourriture pendant les tâches comportementales complexes, bien que réalisée dans un contexte de conditionnement alimentaire, motive l’animal à développer des stratégies flexibles, ce qui réduit le risque de développer des stéréotypies motrices. Enfin, nous avons réduit le nombre de session à 1 par jour, limitant ainsi à 1h le temps passé par un animal avec une charge dépassant 5% de son poids, notamment pour les procédures 2 et 3.

Choix des espèces

Dans notre recherche nous voulons déterminer les éléments essentiels qui ont permis l'émergence des adaptations visuelles chez les premiers primates et de les comparer à d’autres primates (y compris à l’humain). Les lémuriens sont d’excellents modèles vivants aux caractéristiques primitives très similaires aux primates ancestraux. Ils présentent la plupart des traits des premiers primates: petite taille, yeux dirigés vers le devant, mains préhensiles, métabolisme rapide, vie nocturne et arboricole, alimentation omnivore, etc. L'objectif de ce projet est d’utiliser une combinaison de tests comportementaux et d’enregistrements neuronaux complémentaires chez un petit primate, à l’âge adulte (2-4 ans, après la phase de développement, avant les effets du vieillissement) pour découvrir si et comment le système visuel des premiers primates était adapté (et potentiellement optimisé) pour l’exploration visuelle dans un environnement nocturne et arboricole.

Une partie réutilisée dans d'autres protocoles, 163 macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré : les 69 chez qui une polyarthrite rhumatoïde est induite seront tués pour des analyses après leur mort, les 94 autres, contrôles ou sans symptômes, seront réaffectés après avis vétérinaire. Le porteur décrit une maladie provoquée qui détruit les cartilages et bloque les articulations, avec douleur, gonflement, perte de mobilité et perte de poids. Chaque animal subit quinze anesthésies, quinze prélèvements sanguins, trois biopsies ganglionnaires et des séances d'imagerie pouvant durer jusqu'à trois heures. Le porteur indique que de nombreux tests sont réalisés in vitro avant de passer au primate non-humain, sans que la dynamique des cellules immunitaires à l'échelle du corps entier puisse selon lui s'étudier autrement.

Objectifs

En France, 5 millions de personnes sont touchées par des maladies auto-immunes (comme le diabète de type 1, ou la polyarthrite rhumatoïde). Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire. Ce dysfonctionnement peut se traduire par la production d’anticorps dirigés contre les propres cellules du malade ou par une atteinte et une inflammation des organes touchés. Certaines d’entre elles évoluent en maladies inflammatoires chroniques (comme la polyarthrite rhumatoïde). Le domaine de l'imagerie médicale avec la Tomographie à Emission de Positons (TEP), l’imagerie par résonance magnétique et l’imagerie optique est en plein essor. Cependant son application à la mesure et à la surveillance du suivi de l'état immunitaire des patients en est encore à ses débuts. Le développement d’outils, comme des immuno-traceurs, permettrait de visualiser directement in vivo certaines populations cellulaires spécifiques du système immunitaire et de pouvoir le suivre au cours du temps en conditions saines ou pathologiques. Ceci permettrait de caractériser la réponse immunitaire survenant lors de pathologies d’intérêt. Le développement de traceurs pour l’imagerie contribuera à une approche personnalisée de prise en charge de ces pathologies. Ainsi, le développement et l’évaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques sera simplifié. Ce projet a ainsi pour but de développer des approches en imagerie pour mieux caractériser les processus inflammatoires dans un modèle de polyarthrite rhumatoïde et par la suite de pouvoir disposer d’outils permettant de tester l’efficacité thérapeutique de nouvelles immunothérapies. Cette maladie auto-immune se manifeste par une inflammation chronique des articulations conduisant à la destruction de certaines d’elles. Il serait donc pertinent de pouvoir visualiser, par imagerie immuno-TEP, les cellules impliquées dans l’inflammation. Cette application d’imagerie in vivo est la combinaison de modalité d’imagerie TEP avec l’injection de radiotraceurs à base d’anticorps ou dérivés d’anticorps ayant une grande spécificité pour leur cible. Localement, la microscopie optique permettra de visualiser les recrutements cellulaires au niveau des articulations inflammées. Ces données d’imagerie permettront de mieux comprendre et de prédire la réponse immune à l’inflammation et par conséquent d’élaborer des immunothérapies ciblées plus efficaces. Ce projet se déroulera par études successives afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués.

Bénéfices attendus

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune se manifestant notamment par un dérèglement des cellules immunitaires de la première ligne de défense de l’organisme déclenchant à elles seules une inflammation chronique qui conduit à la destruction de certaines articulations. Il est donc important de visualiser, par imagerie TEP, de manière préventive les cellules impliquées dans l’inflammation. Par conséquent, le bénéfice de ce projet est de disposer d’outils, comme des immuno-traceurs, permettant de cibler et visualiser les cellules du système immunitaire dans un contexte inflammatoire de manière minimalement invasive. De cette manière et dans le but ultime de mieux comprendre et prédire la réponse immune à l’inflammation et par la suite d’élaborer des immunothérapies ciblées plus efficaces. Actuellement, les traitements utilisés sont adaptés à chaque personne selon l’importance de la pathologie, l’efficacité et tolérance des personnes face aux médicaments. Il existe des traitements antirhumatismaux de fond qui agissent directement sur la maladie. Malheureusement, ces traitements sont insuffisants pour certains patients. De ce fait, les immunothérapies cherchent à moduler plus précisément la réponse immunitaire et inflammatoire pour éviter son dérèglement. Ainsi, cette thérapie contribue à rétablir l’équilibre dans l’organisme en tenant compte de ses mécanismes naturels.

Procédures

- Anesthésie générale (15 anesthésies, durée 30min) pour les prélèvements et observations cliniques (température, poids…) - Prélèvement de sang pendant 6 semaines (15 prélèvements). Un prélèvement de sang prend environ 2 minutes par animal. - Biopsie ganglionnaire : 3 biopsies lors de l’études espacées d’au moins deux semaines - Imagerie TEP sur corps entier (4 séquences). Les séquences d’imagerie effectuées sur animaux anesthésiés pourront durée jusqu’à 3h. - Imagerie Bi-photon sur les articulations distales (2 séquences). Les séquences d’imagerie pourront durer jusqu’à 2h

Impact sur les animaux

La polyarthrite rhumatoïde est une affection inflammatoire chronique qui touche principalement les articulations distales de la main et du pied. Sa progression mène à une destruction des cartilages articulaires et une ankylose (diminution voire impossibilité de mouvement) des articulations. Cela se traduit cliniquement par de la douleur, un gonflement articulaire, une perte de mobilité, une perte de poids, qui peuvent être source de stress chez l’animal. D’un point de vue biologique, la polyarthrite rhumatoïde peut entraîner une anémie, une neutropénie, une éosinophilie ou encore une thrombopénie. Ainsi que les anesthésies nécessaires aux prélèvements de suivi de la pathologie et aux examens d’imagerie peuvent provoquer une légère perte de poids et un stress transitoire chez les animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant développés une arthrite rhumatoïde seront euthanasiés en fin d’étude pour des analyses post-mortem. Ces analyses permettront d’identifier les cellules immunitaires présentes dans les articulations inflammées et de pouvoir les corréler aux résultats d’imageries in vivo réalisés précédemment. Les animaux contrôles ou ne présentant pas de symptômes seront réutilisés dans d’autres protocoles après évaluation favorable par le vétérinaire.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles stratégies d’imagerie, transposables directement chez l’homme, permettant de détecter spécifiquement des cellules immunitaires spécifiques dans le contexte du modèle de pathologies auto-immunes. Ainsi, les radiotraceurs mis en œuvre et testés permettront d’évaluer la distribution et dynamique de certains acteurs de la réponse immunitaire à l’échelle de l’organisme entier et à l’échelle cellulaire au niveau des sites d’inflammation dans un modèle de maladie inflammatoire chronique, la polyarthrite rhumatoïde. L’impact de molécules thérapeutiques sur cette réponse avant leur utilisation chez l’homme sera aussi évalué. Ces analyses nécessitent un modèle expérimental permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorale et cellulaire) ainsi que le changement induit par un traitement. A ce jour, la distribution et la dynamique des cellules immunitaires au niveau du corps entier ne peuvent pas être étudiés in vitro. Néanmoins, un grand nombre de tests (toxicité, criblage…) seront réalisés in vitro avant de le tester sur le modèle primate non humain.

Réduction

Pour mettre en place ce modèle d’arthrite rhumatoïde chez le macaque Cynomolgus et de permettre de tester des molécules thérapeutiques, nous nous baserons, dans la mesure du possible, sur les modèles déjà décrit dans la littérature afin de maximiser nos chances de réussites. Nous commencerons sur des groupes de 3 animaux. Le nombre d’animaux pourra être réduit, dans la procédure 1, si les premiers schémas d’induction de polyarthrite rhumatoïde sont satisfaisants. Concernant les tests statistiques, le nombre d’animaux retenu par groupe a été limité au minimum permettant une comparaison des résultats obtenus par l’utilisation de tests statistiques non paramétriques pour comparer les groupes entre eux.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera effectué sur des animaux anesthésiés. Nous serons cependant très vigilants lorsque nous mettrons en place le modèle et ferons des analyses d’indicateurs réguliers en utilisant des grilles de score (la fréquence des observations augmentera pendant la phase aigüe). De plus, nous possédons, par exemple, un système d’alerte automatique via notre base de données en cas de perte de poids supérieure à 10% en 15 jours, des numérations formules sanguines anormales ou bien atteinte de critère d’arrêt spécifique au projet. Lors de la mise en place du modèle, un vétérinaire examinera lui-même les animaux régulièrement (en fonction de l’apparition des symptômes) afin d’anticiper une détérioration trop importante de la santé de l’animal et, au besoin, pouvoir procéder à une euthanasie en cas d’atteinte des points limites. Les animaux seront surveillés quotidiennement et plusieurs grilles de score permettant d’évaluer l’état clinique d’avancement de la pathologie, le comportement et la douleur de l’animal seront mises en place. De plus, une analgésie sera instaurée en fonction de l’état clinique de l’animal, ou même en amont pour prévenir un phénomène douloureux. Enfin, ce projet ne nécessite pas de mise en hébergement en individuel, ainsi les liens sociaux seront conservés dans les groupes.

Choix des espèces

Le macaque Cynomolgus est retenu pour ce projet pour plusieurs raisons : - La réponse immunitaire similaire à celle de l’homme, et évaluation de la réponse immune possible dans les tissus. - Les réponses aux vaccins et aux traitements dans cette espèce sont semblables à celles observées chez l’homme - Ils ont déjà fait l’objet de publications scientifiques en tant que modèles de polyarthrite rhumatoïde Les animaux utilisés seront au stade de développement adulte (à partir de 3 ans) car ils ont un système immunitaire mature. Le système immunitaire évolue en fonction du stade de développement et de l’âge des animaux. Les candidats radiotraceurs ou candidats traitements étudiés pourront faire l’objet d’essais cliniques chez l’adulte, il est donc nécessaire de réaliser ces études chez un animal au système immunitaire « mature ».

40 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres études après une période de repos. Sous anesthésie générale, chaque animal peut subir jusqu'à cinq fois sur deux ans des prélèvements de moelle osseuse, de liquide cérébrospinal, des lavages broncho-alvéolaires ou des prises de sang. L'objectif est de fournir du matériel biologique de primate pour mettre au point des techniques d'analyse. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, la proximité des primates avec l'humain étant présentée comme sans équivalent.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre à disposition de la communauté scientifique du matériel biologique de primate (liquide cérébrospinal, échantillons pulmonaires ou de moelle osseuse, accompagnés ou non de prélèvement sanguin), qui ne peut être collecté que sous anesthésie générale des animaux. Ces prélèvements sont nécessaires à la mise au point de techniques d'analyses sur ces échantillons, à la sélection d'animaux sur certains critères physiologiques, ou encore à la réalisation de test in vitro afin d’appréhender la toxicité ou l'efficacité d’un produit, au lieu de ou avant de le tester chez l’animal. Ce projet vise donc à pouvoir prélever certains échantillons biologiques de primate sous anesthésie, dans le but de réaliser des tests préliminaires ou en remplacement d'études in vivo sur cette espèce.

Bénéfices attendus

Tout test de matériel biologique obtenu lors de protocoles expérimentaux utilisant l'animal nécessite au préalable d'être mis au point, affiné, voir validé selon un certain cadre réglementaire. Ces mises au point nécessitent elles-mêmes l'utilisation de matériel biologique, qui doit être obtenu sur la même espèce. Beaucoup de tests sont basés sur des produits sanguins, mais certains nécessitent d'autres matrices biologiques plus difficile d'accès, comme la moelle osseuse, le liquide cérébrospinal ou les lavages pulmonaires. La moelle osseuse pourrait par exemple être utilisée dans le cadre de la mise au point d'un test visant à caractériser les cellules progénitrices du sang, pour le développement d'une thérapie contre des maladies héréditaires. Le liquide cérébrospinal pourrait être utilisé pour mettre au point une méthode de mesure d'un produit injecté dans le sang d'un patient, pour évaluer sa capacité à passer dans le cerveau. Cela peut avoir des implications pour évaluer la potentielle neurotoxicité d'un produit, ou au contraire sa capacité à atteindre le cerveau pour lutter contre des maladies neurodégénératives. Finalement, les lavages pulmonaires permettent d'avoir accès à du liquide et à des cellules de poumons, sans pour autant sacrifier l'animal : cela permettrait d'étudier le microbiote pulmonaire d'animaux, ou encore d'utiliser ces échantillons pour mettre au point des méthodes d'investigation de virus pulmonaires comme le SARS-CoV-2 (ex: PCR). Ces prélèvements sous anesthésie de matrices biologiques spécifiques pourront potentiellement être accompagnés de prélèvements sanguins dans la limite des recommandations de volume et fréquence pour l'espèce. Ces prélèvements de sang pourront être réalisés seulement s'il est jugé scientifiquement ou éthiquement pertinent de les faire sur le même animal plutôt que sur une cohorte différente. Dans certains cas, ces échantillons pourraient être utilisés pour réaliser des tests in vitro remplaçant l'utilisation de l'animal, comme par exemple dans le cadre de tests de toxicité d'un produit sur les cellules progénitrices de la moelle. Dans ce contexte, les différents prélèvements réalisés sont nécessaires pour mettre au point ou améliorer des méthodes d'analyses existantes. Ce projet contribuera donc à réduire le nombre d’animaux utilisés en étude, en permettant le développement de méthodes d'analyses plus fines ou de test in vitro remplaçant l'animal lors de phases expérimentales précoces.

Procédures

Les animaux seront manipulés afin de réaliser une injection d’anesthésique. Les procédures se déroulent entièrement sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à une parmi les 4 procédures différentes, chacune nécessitant entre moins d’une minute et trois minutes . Les prélèvements possibles seront : prélèvement de moelle osseuse, prélèvement de liquide cérébrospinal, lavage broncho-alvéolaire et prélèvements sanguins. Le temps entre l’induction de l’anesthésie de l’animal et son réveil est d’environ 1h.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de liquide cérébro-spinal est réalisé sous anesthésie. Une légère gêne au lieu de ponction peut être ressentie au réveil par l’animal. Le lavage broncho-alvéolaire peut provoquer une gêne chez l'animal suite à l'administration de liquide dans les poumons. De plus, dans le cadre de ce protocole, les prélèvements seront par définition ponctuels et donc non répétés dans le temps. Le prélèvement de moelle osseuse peut quant à lui provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement. ire un hématome sur la zone de prélèvement.

Devenir

Après une période de repos adéquate, les animaux seront disponibles pour intégrer d'autres études, sur avis vétérinaire.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'animal dans le cadre de ce projet. L'utilisation de celui-ci est indispensable afin d'obtenir le matériel biologique nécessaire à la mise au point, la calibration et la validation de méthodes d'analyses biologiques. Ces méthodes visent en effet directement les cellules de l'espèce animale concernée (cytométrie en flux, tests de stimulation de cellules immunitaires, caractérisation de l'expression de certains gènes…), ou peuvent être fortement influencées par le milieu biologique dans lequel elles sont réalisées (mesure de la quantité d'un anticorps ou d'une protéine exogène par ELISA ou spectroscopie de masse). Le raffinement de ces méthodes d'analyses sert d'une part à transférer des protocoles d'analyses d'une espèce à l'autre, et à améliorer leurs sensibilité et spécificité, réduisant ainsi potentiellement le nombre d'animaux nécessaires lors d'études subséquentes. De plus, la disponibilité de matériel biologique permet de la réalisation d'étude d'efficacité ou de toxicité in vivo, qui pourront potentiellement permettre de remplacer ou réduire le besoin d'études in vivo.

Réduction

Afin de ne pas surestimer le nombre d'animaux utilisés, le nombre d’animaux pour ce projet a été défini par une analyse rétrospective des prélèvements de liquide cérébrospinal et de prélèvements pulmonaires fait au sein de l’entreprise au cours des dernières années, modulée par la trajectoire de croissance de notre activité . Afin d’assurer un nombre minimum d’animaux, les animaux pourront être prélevé un maximum de 5 fois sur une période de 2 ans dans le cadre de cette DAP.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets sont mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises sont distribuées quotidiennement aux animaux (après les manipulations et fin de journée) dans la litière et dans des dispositifs à friandises (tube, jouets...). Les fruits et légumes frais qui leurs seront fournis seront variés d'un jour à l'autre, tout comme la façon de les préparer, afin de stimuler les animaux. Un fond musical sera diffusé dans l'animalerie tout au long de la journée afin d'habitue les animaux à la voix humaine et de masquer les sons liés à l'utilisation quotidienne de l'animalerie. Toutes les procédures décrites dans ce protocole auront lieux sous anesthésie, accompagnées de mesures de soutien en fonction de la procédure en question. Par exemple, les prélèvements de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal seront précédés d'injection d'analgésique, les prélèvements pulmonaires seront accompagnés de monitoring dédié et de supplémentation en oxygène. Les animaux seront gardés sur coussin chauffant durant la procédure afin de ne pas occasionner d'hypothermie. Les volumes maximum de matrice biologique à prélever sont basés sur une analyse de la littérature disponible, ou sur les pratiques utilisées en clinique humaine le cas échéant. L'animal sera suivi par le personnel d’étude tout au long de l'anesthésie et surveillé au moment de son réveil ainsi que durant les heures suivantes. Un suivi clinique quotidien ainsi que la mise en place de points limites spécifique à chaque procédure permet d’évaluer quotidiennement le bien-être de l’animal. En fonction de la procédure réalisée, un score neurologique pourra aussi être réalisé, si nécessaire, les jours suivant les prélèvements afin d’assurer qu’il n’y ait pas de dommage neurologique.

Choix des espèces

Par leur origine phylogénétique, les primates non humains présentent une forte proximité avec les humains en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Cette proximité permet de les utiliser dans le cadre de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et/ou prophylactiques. Cette espèce est donc particulièrement utilisée pour tester l'efficacité ou la toxicité de drogues visant des processus biologiques spécifiques à l'homme ou aux espèces proches. Ces études peuvent couvrir les thérapies géniques ou cellulaires visant à corriger l'expression de gènes défectueux, les études infectieuses sur des virus n'infectant que l'homme ou certains primates, ou encore les thérapies visant le système nerveux central (la barrière hémato-encéphalique de l'humain étant très proche de celle du singe). Ce type d'étude nécessites la mise au point de méthodes d'analyses dédiées, pour lesquelles l'accès au matériel biologique de l'espèce cible est nécessaire. Ainsi, des études visant des maladies génétiques ou des leucémies auront besoin d'analyser la moelle osseuse des animaux, les études infectieuses de virus respiratoire (le singe étant le modèle de référence pour l'infection au SARS-CoV-2) auront besoin d'échantillons pulmonaires, et les études visant le système nerveux auront besoin d'échantillons de liquide cérébrospinal pour mettre au point leur méthode de dosage. Les mises au point et/ou test préliminaires de ce projet concerneront des candidats médicaments humains. Les animaux pourront être des juvéniles à mature, en fonction des besoins de l’étude. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou des matures en fonction des objectifs des études. Par exemple, des prélèvements de moelle osseuse peuvent chercher certaines populations de cellules précurseurs plus fréquentes chez le juvénile que chez l'animal mature.

10 macaques à longue queue, tous des femelles, vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections intraveineuses de vecteurs de thérapie génique et subissent de nombreux prélèvements sanguins sous anesthésie répétée, avant d'être tués un mois plus tard pour prélèvement des tissus. Le porteur affirme que le macaque apporte les meilleures connaissances transposables à l'humain et qualifie le recours à cette espèce d'"indispensable", la complexité des réactions immunitaires excluant selon lui les méthodes in vitro. Il décrit les gestes comme peu ou pas invasifs, tout en pratiquant euthanasie et prélèvements terminaux.

Objectifs

Les vecteurs dérivés du virus adéno-associé (vecteurs AAV) sont actuellement les candidats-médicaments les plus utilisés dans cadre de traitement des maladies génétiques, par leur capacité à pénétrer dans un organe/tissus et y faire exprimer un gène thérapeutique. Ces vecteurs sont efficaces et bien tolérés. Cependant, leur utilisation en thérapie génique peut être limitée soit (i) en raison d’une immunité pré existante à l’AAV due à l'exposition naturelle de l'homme à certains virus AAV, (ii) de leur efficacité thérapeutique limitée dans certains organes et (iii) du risque d’une concentration importante dans des organes non ciblés. Ces problèmes sont, à ce jour, les principaux défis à relever pour accroître l'efficacité et la sécurité des vecteurs AAV. Afin de surmonter ces limites, plusieurs travaux ont été menée par notre laboratoire et ont aboutis aux résultats suivants : (i) Identification d’un nouveau vecteur AAV thérapeutique qui cible spécifiquement les muscles, tout en préservant le foie et le cœur, chez des primates non humains. (ii) Développement d’une nouvelle stratégie de thérapie génique pour la maladie de stockage du glycogène de type III (accumulation du glycogène, réserve de sucre, dans les organes tels que le muscle et le foie notamment) par utilisation d’un nouveau vecteur AAV thérapeutique dans un modèle de souris. (iii) Démonstration de l'efficacité d’une enzyme (endopeptidase), capable par son action spécifique, de diminuer l’immunité préexistante chez des primates non humains, et donc d’augmenter l’efficacité de l’AAV thérapeutique. Les objectifs de l’étude que nous envisageons de réaliser chez le primate non humain sont : (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles (ii) Étudier l’efficacité, la sécurité et la toxicité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez cette espèce (iii) Démontrer qu’un traitement par l’enzyme endopeptidase couplé à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène), permettrait d’obtenir un transfert de gène efficace.

Bénéfices attendus

Les objectifs de l’étude que nous envisageons de réaliser chez le primate non humain sont : (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles. Ce qui permettrait d'éviter une accumulation du vecteur dans d'autres organe, notamment foie et coeur (ii) Étudier l’efficacité et la sécurité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez cette espèce (iii) Démontrer qu’un traitement par l’enzyme endopeptidase couplé à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène). Ce traitement combiné permettrait de diminuer, voire d’annuler 1-soit une pré immunité, ainsi un plus grand nombre de patients pourront bénéficier de de la thérapie génique AAV 2-soit une réponse immune suite à l'administration du vecteur AAV thérapeutique, permettant ainsi la possibilité d'une deuxième injection thérapeutique

Procédures

Les animaux de cette étude seront soumis aux interventions suivantes : - Dans le mois avant l’injection, les 10 animaux auront 2 prélèvements sanguins (J-30 et J-8), sous anesthésie de courte durée (15-20 min) afin de répartir les macaques dans 3 groupes en fonction du niveau de leur immunité préexistante. - Pour le groupe 1 (n=2) : le jour de l’injection (J0) : une prise de sang et une injection par voie intraveineuse lente du vecteur AAV thérapeutique testé précédé ou non par une injection de « l’AAV à capside vide » par voie intraveineuse en fonction de leur immunité préexistante à l’AAV. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures) - Pour le groupe 2 (n=4) : Le jour de l’injection (J0) : une prise de sang et une injection par voie intraveineuse lente du vecteur AAV thérapeutique testé, précédé ou non par une injection de « l’AAV à capside vide » par voie intraveineuse en fonction du niveau de l’immunité préexistante à l’AAV. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures). - Pour le groupe 3 (n=4) : La veille de l’injection (J-1) : un traitement immunosuppresseur et antihistaminique par voie intraveineuse. Le jour de l’injection (J0) : une injection par voie intraveineuse lente du vecteur AAV thérapeutique testé, précédé par une injection de « l’AAV à capside vide » ou d’une solution saline (contrôle) par voie intraveineuse. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures). Le nombre de prises de sang sous anesthésie (entre 15 et 30 min) seront les suivants : à J0 : n= 8 et entre 1 et 30 jours post-injection : n = 5 - A 30 jours post-injection (J30) : un prélèvement sanguin, avant euthanasie par injection intraveineuse d’une dose létale d’anesthésique.

Impact sur les animaux

Tous les gestes réalisés sur ces animaux seront non ou peu invasifs : (i) administration lente des produits par voie intraveineuse, et (ii) prélèvements sanguins par ponction veineuse. Aucune douleur ni aucun stress physique ou thermique n'est anticipé pendant la procédure ou en post-injection. Dans le but de réduire au maximum le stress des animaux lié à la contention, toutes les manipulations, à l'exception des observations biquotidiennes, seront effectuées sous anesthésie, ainsi qu’une induction de cette dernière par injection intramusculaire sur des primates préalablement isolés dans des cages individuelles. Un jeûne d'une durée maximale de 12 heures, sera mis en place pour tous les animaux avant leur anesthésie, dans le but de prévenir les régurgitations et les fausses routes pendant la procédure. Cependant, il est important de noter que ces injections n'auront aucun impact sur leur consommation alimentaire et hydrique. Les primates seront réintégrés dans leur cage ou volière une fois pleinement réveillés de leur anesthésie afin de réduire au maximum tout stress environnemental. Malgré tout, un suivi rapproché des paramètres cliniques (observations quotidiennes et examens cliniques) et des paramètres sanguins (hématologie et chimie clinique) des animaux sera mis en place afin de pouvoir détecter toute potentielle anomalie non phénotypique en post-injection.

Devenir

Les 10 animaux concernés par cette procédure seront suivis pendant 1 mois après l’injection du vecteur testé puis euthanasiés pour prélèvements de tissus post-mortem. L’euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir des prélèvements de tissus sur lesquels s’appuieront des analyses de biodistribution et d’expression du transgène, ainsi que des analyses histopathologiques et immunohistochimiques

Remplacement

Les études réalisées chez le Primate Non Humain (macaque fascicularis) apportent les meilleures connaissances transposables à l’homme en termes de toxicité, d’efficacité et d’immunogénicité de l’AAV. La complexité des réactions en jeu ne permet pas le recours à des méthodes substitutives, telles que les études in vitro isolées et justifie notre recours à des animaux. Les résultats obtenus sont transposables en terme de biodistribution et tolérance et permettent d'envisager de futurs essais cliniques chez l'homme (Primate Humain).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude (n=10) a été déterminé sur la base d’études précédentes en thérapie génique. Ce nombre est réduit à son minimum tout en assurant une exploitation possible des résultats. En effet, la constitution de 3 groupes différents permettra de (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles (ii) Étudier l’efficacité, l’innocuité la sécurité et la toxicité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez le primate non humain (iii) Evaluer la synergie et l’efficacité d’un traitement par l’enzyme endopeptidase combinée à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène).

Raffinement

L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement tout le long du projet (techniciens animaliers et vétérinaire). Des protocoles anesthésiques seront mis en place selon la procédure à réaliser. Les administrations expérimentales (injections par voie intraveineuse d’antihistaminique, d’immunosuppression et des vecteurs) se dérouleront sous anesthésie générale. Les prélèvements sanguins seront effectués sous protocole anesthésique permettant d'obtenir une anesthésie de courte durée (environ 10 min). Ces actes étant peu ou pas douloureux, le protocole analgésique ne sera pas basé sur des opioïdes mais par contre sur les effets analgésiques des molécules anesthésique utilisées. Pour favoriser les échanges sociaux entre animaux et favoriser leur bien-être, les macaques seront hébergés en cage en post-injection, et en volières dès que possible pour favoriser les déplacements verticaux.

Choix des espèces

La capacité des vecteurs AAV à pénétrer dans un organe/tissu et y faire exprimer un gène thérapeutique est espèce dépendante. Les objectifs principaux de ce projet étant : (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles (ii) Étudier l’efficacité, l’innocuité la sécurité et la toxicité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez le primate non humain (iii) Evaluer la synergie et l’efficacité d’un traitement I par l’enzyme endopeptidase combinée à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène), Il est donc indispensable de choisir l’espèce en conséquence. Un vecteur peut être efficace chez le rongeur mais pas chez l'homme. Le macaque fascicularis représente l’espèce animale de choix dans le modèle préclinique de par sa morphologie, sa physiologie, sa proximité phylogénétique et sa similitude avec le système immunitaire de l’homme. 10 singes (Macaca fascicularis) femelles (2-3 ans, 2.5-4.5 kg) seront inclus dans l’étude. Par conséquent, les animaux utilisés dans cette étude sont de jeunes adultes ayant leur système immunitaire mature, indispensable pour notre étude.

15 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue pour études histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation sous anesthésie, trois IRM et jusqu'à neuf ponctions de sang et neuf ponctions de liquide céphalo-rachidien, pour tester la faisabilité d'une thérapie de la leucodystrophie métachromatique. Le porteur reconnaît des risques anesthésiques, des douleurs post-opératoires et des fuites de liquide provoquant maux de tête et vomissements. Il présente l'étape chez le primate comme "indispensable" et "requise" par l'agence du médicament avant un essai chez l'humain, l'efficacité n'ayant été montrée que chez la souris.

Objectifs

La leucodystrophie métachromatique (MLD) est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (gaine qui isole la fibre nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une dégradation très rapide dans les 6 mois suivant les premiers symptômes et un décès des patients dans les deux ans au maximum. De nos jours la majorité des patients atteints de MLD sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités avant l’apparition des symptômes mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques. Une composante particulière de la MLD est la neuro-inflammation que développent les patients et qui est présente aussi dans le modèle souris de la pathologie. Dans ce contexte, nous proposons de mener le projet de recherche qui a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la pathologie. L’efficacité de la thérapie a été évaluée préalablement dans le modèle murin de la pathologie et les résultats préliminaires démontrent des résultats très encourageant. L’objectif ici est de démontrer la faisabilité et la tolérance de notre approche chez le primate non humain (PNH).

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de leucodystrophie métachromatique (MLD) ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Ce projet a pour but d'identifier une nouvelle voie thérapeutique pour ces patients. Le projet sera mené sur un modèle animal extrêmement proche de l’être humain afin de pouvoir proposer pour les différentes pathologies d’intérêt, un traitement et sa mise en place. A terme l’objectif est de pouvoir mettre en place un essai clinique chez l’Homme dans les prochaines années.

Procédures

- 3 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h), sous anesthésie générale repartis dans le projet ( un pré op, un immédiatement après la chirurgie et un avant la necropsie - Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie sera pratiquée sur les animaux (durée environ 1h30). - 9 prélèvements sanguins maximum et 9 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (durée du geste maximum 30min pour les 2 gestes, respectivement 10 min et 15 min max) réalisés sous anesthésie générale et analgésie. Dans ce projet, une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien + IRM selon les temps d’intérêt de l'étude, ou chirurgie + IRM). des administrations IM en vigile pour induire l'anesthésie et la pose de cathéter à chaque IRM

Impact sur les animaux

L’animal sera confronté à une chirurgie sous anesthésie générale générant un risque anesthésique et infectieux, et de potentielles douleurs post-opératoires. Sur le protocole, plusieurs prélèvements de sang et de LCR seront réalisés amenant un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques ) et la formation possibles d’hématomes au niveau des sites de ponctions. Enfin, l’animal sera soumis à un stress lié à la contention en cage pour la réalisation des injections (anesthésie, analgésie, antibiotique,…) même s’il est réalisé par des personnes formées et auxquelles les PNH sont habitués.

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux (n=15) sera euthanasié pour permettre les etudes histologiques et de biodistribution composant l'etude preclinique permettant de supporter une étude de Toxicologie et la soumission aux agences reglementaires.

Remplacement

Toutes les études possibles sur des cellules ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des constructions et des implants. Une preuve de concept a été établie dans le modèle souris de la pathologie. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude d’efficacité et de tolérance chez le gros animal (primate non humain). Ces étapes sont requises par l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé pour toute demande d’autorisation d’étude clinique chez l’Homme.

Réduction

Il y a 15 animaux maximum prévus sur ce projet, correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité des différentes approches avec des lots d’animaux. Une première étude de faisabilité sur 4 animaux suivi d’une étude de toxicité sur 11 PNH maximum, repartis en lot de 2 à 3 individus selon les demandes de nos partenaires et des agences réglementaires. L'étude concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié sans analyse statistique.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté. Le nombre d'anesthesies est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandation en terme de Bien être animal validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la même anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie. Un analgésique sera utilisé pour éviter tout inconfort. La procédure chirurgicale est raffinée avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, un suivi et un maintien des paramètres physiologiques de l’animal. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si necessaire. Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Enfin, en termes de raffinement nous avons travaillé sur la taille de notre puce à implanter qui est 10 à 15 fois plus petite que celle de notre étude précédente qui avait été utilisée chez la souris et donc parfaitement adaptée à l’implantation prévue dans ce projet. Tout ce projet sera réalisé en conditions de Bonnes Pratiques de Laboratoire (BPL) pour bénéficier du meilleur suivi qualité et permettre la valorisation de ces expériences auprès des agences réglementaires françaises et internationales en vue d’un essai clinique de phase I/II chez l’homme.

Choix des espèces

La capacité des implants a secréter de manière efficace de la protéine d'interet qui soit mobilisable par les systèmes nerveux centraux et périphériques est dépendante de l’organisme dans lequel on réalise l’implantation. Ainsi à finalité clinique, l’implantation chez le primate non humain est une étape indispensable en vue de la préparation d’un dossier d’essai clinique afin d’obtenir les donner de faisabilité et de tolerance dans un organisme entier qui soit en plus comparable à l’homme d’un point de vue physiologique et immunitaire notamment. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (2-8 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́, de plus compte tenu des patients ciblés par nos approches, ils auront une taille similaire à nos patients pédiatriques.

42 macaques à longue queue vont être utilisé·es, 5 tués pour prélèvement d'organes et 37 réutilisés ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des injections intradermiques, une immunisation, l'injection intraveineuse d'une molécule anti-inflammatoire, jusqu'à 16 prélèvements de sang sur 48 jours dont une anesthésie prolongée de deux heures, ainsi que des ponctions de moelle osseuse et de ganglions. Le porteur décrit le protocole d'anesthésies répétées sur 24 heures comme "inconfortable" et affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer un "système immunitaire complet", ce qui rendrait l'animal "indispensable". Il justifie le macaque par sa "proximité phylogénétique" avec l'Homme.

Objectifs

Les traitements anti-inflammatoires actuels visent à éteindre une inflammation chronique préexistante mais cette atténuation de la réponse du système immunitaire n’est souvent que transitoire et s’accompagne très souvent de rechutes. Les études scientifiques visant à déterminer les mécanismes associés à l’inflammation ont mis en lumière un processus actif de l’extinction de l’inflammation s’appelant résolution de l’inflammation Nous avons déjà démontré dans notre laboratoire que le traitement prorésolutif constitué par notre molécule d'intérêt (anticorps monoclonal ciblant un des récepteurs de la résolution exprimé par les neutrophiles et les macrophages) est cliniquement actif chez la souris dans de nombreux modèles inflammatoires. En effet, dans des modèles de colite induite ou spontanée, nous avons pu apprécier un retour plus rapide ou une stabilisation/amélioration de la colite lorsque les animaux ont été injectés avec ce traitement prorésolutif. Par ailleurs nous avons chez l’Homme, observé in vitro un effet de cette même molécule sur les neutrophiles et les macrophages. En outre, dans une précédente étude chez le primate non humain, nous avons pu apprécier la pharmacocinétique ainsi qu’un effet biologique du produit sur un modèle d’inflammation réalisée par l’injection intradermique de bactéries inactivées aux UV. Ce projet sera dans la continuité du précédent pour évaluer les doses minimales et maximales requises pour observer un effet biologique et évaluer la toxicité du produit ainsi qu’identifier des biomarqueurs d’activité permettant de suivre la pharmacodynamique du produit et orienter les analyses chez l’Homme lors d’essai clinique. En outre, l’étude de biodistribution du traitement n’a pas été réalisée et pourra être évaluée dans cette étude, paramètre indispensable pour l’évolution du produit vers la clinique. Enfin, de manière complémentaire, un modèle de vaccination et rechallenge sera évalué pour répondre à la question d’un éventuel impact du traitement sur la vaccination, notamment la réponse humorale liée aux anticorps.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’une part d’évaluer la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’un produit destiné à la médicamentation humaine permettant ainsi d’anticiper un schéma d’administration et d’estimer d’éventuels effets secondaires liés à l’injection de ce médicament. En outre, la réalisation en parallèle d’un modèle inflammatoire intradermique permettra d’apprécier un effet biologique de la molécule sur un modèle déjà utilisé dans une phase I lors d’essais cliniques et pour lequel nous avons obtenu des résultats préliminaires encourageants nécessitant d’être confirmés. Enfin, l’étude sur la capacité vaccinale après injection de la molécule permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament et s’assurer que l’administration d’une telle drogue de manière concomitante à une vaccination de trouble pas la réponse immunitaire primaire et/ou secondaire.

Procédures

Certains animaux seront soumis sous anesthésie à l’induction d’une inflammation suite à des injections intradermiques (sur 5 min) sur une seule journée. D’autres animaux seront soumis sous anesthésie à une injection intramusculaire ou sous-cutanée (5 min) d’une protéine immunogène de mollusque puis une injection sous-cutanée de cette même protéine (5 min) à 8 jours d’intervalle. Les animaux seront soumis également, sous anesthésie, après injection intraveineuse de la molécule thérapeutique d’intérêt (30 min), à plusieurs prélèvements sanguins (au maximum 6 dans une même journée, 16 sur la totalité de la procédure expérimentale sur 48 jours), notamment lors d’une anesthésie prolongée de 2h, quelques prélèvements de moelle osseuse (N=3, avant traitement, j10 et j21) et de ganglions (N=3, avant traitement, j7 et j21).

Impact sur les animaux

Les protocoles d’anesthésie répétés sur 24h lors de l’injection de la molécule pour évaluer la pharmacodynamique seront inconfortables et à ce titre, les animaux spécifiquement lors de cette journée seront suivis de manière accrue et l’inconfort le plus adéquatement maîtrisé. Les modèle d’inflammation pourrait créer une démangeaison locale qui sera alors protégée si tel est le cas.

Devenir

Les protocoles utilisés dans cette étude permettent une réutilisation de l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet après accord du vétérinaire pour une nouvelle procédure légère ou modérée exceptés ceux utilisés pour évaluer la biodistribution de la molécule qui nécessite un prélèvement de différents organes après euthanasie (N=5 animaux).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule. Les résultats obtenus lors d’études préliminaires in vivo chez la souris nous permettent maintenant d’étudier la molécule de façon plus précise chez le primate non humain.

Réduction

Ce genre de protocole chez le macaque ne peut être réalisé comme une étude statistique, en effet, dans le respect de la règle des 3R et d’un point de vue éthique, nous limitons le nombre d’animaux au strict minimum, à savoir 3 animaux par groupe, ce qui rend impossible tout test statistique. Cependant, compte tenu de la variabilité individuelle, le nombre de 3 animaux/groupe est essentiel pour obtenir une relevance scientifique quant à l’interprétation des résultats obtenus et l’identification d’un éventuel effet thérapeutique tout en réalisant de manière fiable une étude cinétique dans le sérum de la molécule. De plus, si le modèle d’inflammation cutanée (injection bactéries inactivées) n’a pas d’impact sur la cinétique, l’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé. D’autre part, de façon à réduire le nombre d’animaux, il s’agit de réutilisation d’animaux dans le cadre strict de la loi après avis vétérinaire.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées chez le macaques sous anesthésie. La douleur sera dans la mesure du possible évitée par injection d’analgésique qui devra toutefois ne pas être dans la catégorie des anti-inflammatoires pour ne pas perturber ou annihiler l’effet de la molécule thérapeutique injectée et évaluée. Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Au cours du protocole expérimental les individus traités sont hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Il est en effet fondamental pour ne pas stresser davantage aussi bien l’animal traité que les autres animaux, de pouvoir lui faire facilement (sous anesthésie légère) des injections ou prélèvements qui seraient impossibles dans un environnement commun. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.

Choix des espèces

Les primates non humains, et plus précisément les macaques dans cette étude, représentent l’espèce animale de choix comme modèle préclinique étant donné leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’Homme. Différents modèles chez le macaque peuvent être ainsi développés pour mimer des situations cliniques connues, voire des protocoles similaires déjà existants chez l’Homme comme c’est le cas pour cette étude tout en étant moins douloureux, et tester différents protocoles thérapeutiques innovants en conditions précliniques. La constitution du système immunitaire est dépendante de l’âge des animaux donc il s’agira de préférence d’animaux jeunes adultes (3 à 4 kg) dont le système immunitaire est alors mature.