Primates

8 macaques rhésus vont être utilisés, dans des procédures classées modérées, avec une réutilisation prévue ou un placement en retraite envisagé selon l'avis vétérinaire. Chaque animal subit deux chirurgies implantatoires, dont une craniotomie de six heures, puis des enregistrements d'électrophysiologie et une stimulation transcrânienne par ultrasons, tête fixée dans une chaise de contention. Le porteur mentionne un protocole de contrôle hydrique pouvant provoquer une sensation de soif et un risque de brûlure superficielle de la peau lié aux ultrasons. Il affirme que les primates non humains sont le "seul choix possible" de modèle, cette recherche fondamentale sur le cortex préfrontal étant présentée comme impossible chez l'humain.

Objectifs

L’adaptation comportementale repose sur plusieurs processus importants: établir la valeur des stimuli de l’environnement, des buts à atteindre et des actions en fonction de l’état interne du sujet, sélectionner un comportement et évaluer ses conséquences. La nécessité d’agir dans un contexte sociale implique la prise en compte d’information relative aux valeurs et intentions d’autres agents biologiques. Notre objectif vise à mieux comprendre les interactions au sein de larges réseaux neuronaux dans la régulation flexible de nos comportements. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une region considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Pour cela, il est indispensable 1) d’identifier les relations anatomo-fonctionnelles entre les régions du lobe frontal et temporal, 2) d’étudier l’implémentation des mécanismes de l’adaptation comportementale au niveau neuronal et 3) de comprendre le rôle causal de ces différentes structures sur le fonctionnement intégré de ces réseaux. Ceci nécessite une combinaison d’approches d’imagerie et d’électrophysiogie, dont certaines invasives. Les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs, pour conduire le projet proposé. Ce projet sera réalisé dans 3 étab lissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Une caractéristique de notre survie dans le monde réel est notre capacité à faire preuve d'adaptation comportementale. Les primates en général et les humains en particulier sont très efficaces pour extraire rapidement les signaux informatifs de l'environnement social et non-social, et les intégrer aux conséquences de leurs actions, afin de maintenir ou de modifier si besoin leurs décisions. Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui vise à comprendre les mécanismes par lesquels les différentes régions du cortex frontal et temporal interagissent et comment elles contribuent aux comportements adaptifs en contexte social et non social. Le principal bénéfice attendu sera donc l’amélioration des connaissances scientifiques qui découleront de la réalisation des expériences de ce projet. 1. Le projet nous permettra de mieux d’identifier les circuits neuronaux et les mécanismes physiologiques qui supportent l’expression de comportements adaptatifs. 2. Le projet nous permettra de comprendre comment les perturbations de ces interactions préfronto-temporales conduisent à des altérations des processus cognitifs supportant les comportements adaptatifs Des bénéfices secondaires pourraient inclure des hypothèses en recherche clinique dans le domaine de la neuropsychiatrie. 3. Le projet nous permettra de mieux comprendre le couplage neuro-vasculaire Des bénéfices secondaires pourraient inclure une meilleure utilisation translationnelle des données d’électrophysiologie obtenues chez le singe aux données de neuroimagerie obtenues chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 actes chirurgicaux pour permettre la stimulation transcranienne par ultrasons et la collecte des données d'électrophysiologie et d'imagerie chez l'animal vigile. Les chirurgies seront réalisées après entrainement aux tâches comportementales. Une première chirurgie implantatoire permettra de réaliser les procédures de stimulation transcranienne et d'imagerie par résonance magnétique. Ce type de chirurgie dure en moyenne 4h. La seconde chirurgie sera réalisée à l’issue de la collecte des données d’imagerie fonctionnelle dans ces mêmes tâches. Elle est nécessaire pour la réalisation des procédures d'électrophysiologie et d'imagerie par ultrason. Ce type de chirurgie implantatoire nécessite la réalisation d’une craniotomie et sont plus longues (durée moyenne = 6h). Toutes les actes seront réalisés dans l'EU1, sauf la collecte de données CT préalable aux chirurgies qui sera réalisée dans l'EU3, et les chirurgies qui seront réalisées dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales pour les deux neurochirurgies et au moins un examen en neuroimagerie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d’une chambre d'enregistrement. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. Les marges des implants constituent des zones d’infection potentielle qui seront maitrisés par une surveillance régulière des implants et par l’administration de soins appropriés. Les singes travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis, ou en position dite du sphinx dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et plutôt bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les singes seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions. La stimulation ultrasonore peut induire une sensation de gêne lors de son application. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée. La stimulation ultrasonore peut induire une brûlure superficielle de la peau. Une modélisation au préalable des variations thermiques engendrées par la stimulation préviendra de cet effet négatif potentiel.

Devenir

La potentielle réutilisation des animaux en fin de protocole sera prise en accord avec la vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être utilisés, un placement en retraite sera considéré.

Remplacement

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une région cérébrale considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Sur la base de critères anatomiques et cognitifs, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal pour conduire le projet proposé. Il n'existe pas d’alternative qui permette d'obtenir des informations similaires à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, ou des modèles animaux non-primates.

Réduction

Contrairement à la neuroimagerie chez l’humain qui nécessite un grand nombre de sujet (n>20), les protocoles chez le primate non-humain bénéfient de la possibilité de répéter les sessions chez un même sujet. Chez le singe, 3 est également le nombre minimal d'animaux par étude sur lequel la communauté scientifique s'accorde. Dans le cadre du présent projet, il est important de prendre en compte le facteur social : dominants vs dominés. Nous travaillerons donc sur 2 groupes de 3 sujets. Cependant il arrive parfois que des animaux s’accommodent mal au travail en chaise de contention, ou ne tolèrent pas les implants. Nous envisageons le besoin de 8 animaux mais nous nous arrêterons à 6 si tous les animaux coopèrent, apprennent les tâches comportementales et tolèrent les implants.

Raffinement

Chaque animal reçoit un long pré-entrainement par renforcement positif pour l'habituer à la vie au laboratoire (nettoyage des volières, pesées régulières, etc.). Des protocoles d’enrichissement de l’environnement sont développés pour stimuler l’animal et lui permettre d’exprimer au mieux son répertoire comportemental en dehors des phases de collecte de données. L’utilisation de station de travail mobile permettra de réaliser certaines phases du conditionnement dans les volières des animaux. Un raffinement continu est également pratiqué pour développer des implants moins invasifs et moins sensibles aux infections. L’optimisation des techniques d’enregistrements électrophysiogiques permettra de réduire la phase de collecte des données. Tout sera mis en œuvre pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal grâce aux différentes mesures mises en place dans l’animalerie (hébergement en groupe social, enrichissement, etc.) et un suivi médical régulier de l’animal (perte de poids, alopécie), et des implants sera mis en œuvre (signes d’infections). Un suivi medical plus spécifique sera également mis en oeuvre post intervention chirugical.

Choix des espèces

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex préfrontal. Cette région est considérée comme une specificité de l’organisation cérébrale des primates. Les expériences présentees sont invasives. La combinaison des approches proposées permettront l’obtention d’informations fondamentales impossible à obtenir avec d'autres techniques, et impossible à réaliser chez l’humain. Notre recherche porte sur des animaux post-puberté (>4ans)

10 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées modérées malgré leur lourdeur. Une pathologie de type Alzheimer et des déficits cognitifs leur sont induits, et chaque animal subit trois neurochirurgies de six à huit heures pour injection intracérébrale et implantation d'électrodes, des IRM et scanners sous anesthésie, des injections de scopolamine, des ponctions lombaires tous les six mois et des tâches en chaise de contention. Le porteur mentionne des restrictions alimentaires ou hydriques, un risque d'infection lié aux électrodes percutanées, puis une euthanasie pour analyse histologique du cerveau. Il affirme que le cortex préfrontal dorsolatéral "n'existe que chez le primate" et conclut au caractère "indispensable" du modèle primate.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans l’objectif général de développer de nouvelles approches de neurostimulation pour les déficits mnésiques, observés en particulier dans la maladie d'Alzheimer. Malgré leur incidence très élevée, il n’existe actuellement pas de traitement pharmacologique adéquat, et la neurostimulation représente une approche alternative qui a déjà fait l’objet de plusieurs études préliminaires. Cependant, les approches testées chez l’humain actuellement produisent des effets variables et insuffisants, et qui ne sont pas statistiquement significatifs. Ces protocoles sont relativement simples car ils ne ciblent qu’une seule aire cérébrale et ce, de manière continue au cours du temps. Nous faisons l’hypothèse qu’une intervention ciblant plusieurs aires cérébrales et modulée au cours du temps mènera à une amélioration plus robuste des performances mnésiques dans un phénotype similaire à celui de la maladie d’Alzheimer. Pour tester cette hypothèse, nous allons implanter chez le primate non-humain des technologies d’électrodes intracrâniennes similaires à celles utilisées chez l’humain, et que nous avons déjà testées dans des modèles imprimés en 3D et chez le cochon. Ces électrodes seront implantées dans des aires critiques pour la mémoire de travail et la mémoire épisodique, dont certaines sont spécifiques aux primates (cortex préfrontal dorsolatéral). Nous allons induire chez 10 macaques cynomolgus une physiopathologie similaire à la maladie d’Alzheimer, ainsi que des déficits cognitifs temporaires, et étudier l’impact de nouvelles méthodes de neurostimulation (ciblant plusieurs aires et adaptées en temps réel en fonction de l’état cérébral) sur cette physiopathologie et sur les performances cognitives de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : (1) d'élucider les mécanismes physiologiques sous-tendant l'apprentissage et la mémoire chez le primate dans des états sains et pathologiques, notamment dans un nouveau modèle physiopathologique de la maladie d’Alzheimer ; (2) de développer une nouvelle catégorie d'interfaces cerveau-machine bidirectionnelles permettant d'enregistrer l'activité neuronale et de la stimuler en temps réel dans plusieurs aires cérébrales différentes, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les troubles mnésiques et la maladie d'Alzheimer, qui ne connaît aucun traitement à l'heure actuelle. Le développement et l’amélioration de ces technologies de neurostimulation est en effet en plein essor, en raison de leur potentiel thérapeutique pour plusieurs maladies neurologiques, incluant non seulement la maladie d’Alzheimer, mais également la maladie de Parkinson, la dépression, les troubles obsessionnels compulsifs, etc. Les applications cliniques sur la maladie d’Alzheimer se limitent actuellement à la stimulation d’une aire unique, avec des protocoles relativement simples, et mènent à des effets très limités et variables. Ce projet va au-delà des protocoles utilisés cliniquement car il stimule plusieurs aires simultanément afin de restaurer leur activité naturelle, et les protocoles de stimulation dépendent de l’état du cerveau grâce à des algorithmes dits en boucle fermée. Un tel développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tâches comportementales en chaise et en comportement libre avec enregistrements électrophysiologiques et neurostimulation (séances quotidiennes de 1-2h pendant toute la durée du projet), à des imagerie par résonance magnétique sous anesthésie (environ 5 séances de 2-3h maximum), à des tomodensitométries sous anesthésie (2 séances de 30 minutes), à 3 procédures neurochirurgicales de 6-8 heures environ (1 pour l'injection intracérébrale de protéines, et 2 pour l'implantation d'électrodes intracérébrales), à des injections intramusculaires de scopolamine (5-10 séances estimées, avec un effet durant 4h maximum), à des ponctions lombaires (réalisées tous les 6 mois à partir de l'implantation et pendant la durée du projet), et à une euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce projet peut avoir les effets indésirables suivants sur les animaux : (1) stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tâche comportementale, (2) douleurs suite à des procédures neurochirurgicales et à l'injection intramusculaire de substances (scopolamine, anesthésiants), (3) potentielles infections liées à la présence d'un système percutané d'électrodes intracérébrales, (4) nuisances liés à la potentielle restriction alimentaire ou hydrique, (5) nuisances liées à l'imagerie, (6) nuisances liées aux transports entre établissements utilisateurs

Devenir

Les animaux seront eutahanasiés et une analyse histologique du cerveau sera effectuée.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les effets de la neurostimulation intracrânienne sur la mémoire lors d’une tâche cognitive. Ceci ne peut être réalisé in vitro. Par ailleurs, les modèles informatiques actuels ne permettent pas de remplacer l’expérimentation animale car les processus mnésiques ne sont pas suffisamment bien compris. Néanmoins, nos travaux de recherche incluent déjà une partie modélisation afin de guider la sélection de certains paramètres de stimulation. Dans le futur, de tels modèles permettraient de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, l’expérimentation humaine n’est pas encore possible à ce stade car les méthodes utilisées sont invasives, impliquent une craniotomie, et nécessitent donc une preuve de concept pré-clinique. En termes de modèle pré-clinique, notre développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.

Réduction

Chaque animal sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, les mêmes animaux seront réutilisés pour plusieurs interventions (effets de la stimulation dans l'état sain et dans différents états pathologiques, i.e. après injection de scopolamine et dévelopement de la tauopathie). Un nombre de 5 animaux est le minimum pour effectuer des tests statistiques de comparaison entre plusieurs états. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur primates non-humains se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Par ailleurs, ces animaux seront divisés en deux groupes d'âge. Au total, nous planifions donc d'utiliser un maximum de 10 animaux. Enfin, certains des animaux utilisés dans ce projet seront des animaux réutilisés de projets précédents.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes, dans une structure spécialement agréée pour l’hébergement et l’utilisation des primates en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce. Les hébergements seront enrichis par des approches standards (jouets pour animaux, nourriture variée, fonds sonore) ainsi que l’utilisation d’un système d’écran tactile pour primates permettant de délivrer des récompenses alimentaires lors de l’exécution de tâches de pointage ou de mémorisation. L’habituation aux interactions avec l’humain et aux diverses procédures expérimentales se fera progressivement et par renforcement positif, à un rythme adapté à chaque animal et qui s’étendra sur une durée de plusieurs mois. Nous utiliserons des méthodes chirurgicales aseptiques ainsi qu’une anesthésie gazeuse suivant au plus près les standards cliniques. Les procédures chirurgicales seront menées par un neurochirurgien, à l’aide d’un système de neuronavigation fondé sur des imageries non-invasives du cerveau par IRM et de la morphologie crânienne par tomodensitométrie, permettant d’atteindre une précision d’implantation submillimétrique. Nous effectuerons un suivi post-opératoire accru, plusieurs fois par jour, qui sera consigné par le personnel en charge de l’animalerie sur une feuille de suivi post-opératoire suivant une échelle d'évaluation du bien-être adaptée au primate, basée sur des critères tels que la posture, l’activité motrice, les interactions sociales, la nutrition, l’hydratation, etc. Le suivi post-opératoire inclura également des antalgiques pour contrôler la douleur, des antibiotiques pour réduire le risque d’infection, et si nécessaire des corticoïdes afin de contrôler de possibles augmentations de pression intracrânienne. Les cicatrices seront inspectées quotidiennement et désinfectées à la bétadine. Les transports entre différents établissements s’effectueront dans une cage dédiée placée sur un chariot protégé des regards extérieurs par une housse, l’animal étant sédaté, maintenu au chaud sous une couverture, et bordé d’une bouillotte. Les éventuelles restrictions alimentaires ou hydriques seront introduites ou arrêtées de manière progressive, maintenues au niveau minimal efficace, et feront l’objet d’une surveillance et d’une réévaluation régulières. Ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité SBEA. Enfin, les procédures seront arrêtées en cas d'atteinte d'un des points limites.

Choix des espèces

Au niveau scientifique, ce projet vise à étudier l’impact de la neurostimulation sur un réseau cérébral à grande échelle constitué notamment de l’hippocampe, du cortex entorhinal et du cortex préfrontal. Il existe une grande homologie de ce réseau entre le macaque et l’humain, mais cette homologie est nettement réduite avec d’autres espèces de vertébrés tels que les rongeurs, chez lesquels la définition du cortex préfrontal fait même débat. De plus, l’entraînement à des tâches cognitives suffisamment élaborées pour avoir un équivalent chez l’humain requiert l’usage de primates. Au niveau technologique, ce projet vise à développer des technologies de neurostimulation qui pourrait par la suite être appliquées à l’humain, ce qui nécessite un modèle anatomique suffisamment proche. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte (i.e. de plus de 5 ans environ). Le premier groupe contiendra des animaux entre 5 et 15 ans environ (âge adule moyen). Le deuxième groupe utilisera des animaux plus âgés (15-30 ans) dans le but d’observer des déficits de mémoire liés au vieillissement cognitif et de les compenser par la neurostimulation.

12 primates non-humains, six macaques à longue queue et six babouins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Importés pour une "expérimentation terminale", ils subissent des séances d'imagerie répétées sous anesthésie générale et une chirurgie du cortex visuel avec pose d'électrodes, précédées de mises à jeun. Le porteur indique un caractère répétitif de l'anesthésie et des irritations aux oreilles et à la gorge liées à la contention et à l'intubation. Il affirme que le primate non-humain est "la seule espèce pertinente" et qu'aucun modèle computationnel ne peut le remplacer, l'étude étant présentée comme un "raffinement".

Objectifs

L’activité du cerveau et en particulier des neurones dépends de l’apport énergétique (nutriments + oxygène) qui est régulé par le flux sanguin. Connaître précisément la relation entre l’activité des neurones et l’apport sanguin, un phénomène connu comme « couplage neurovasculaire », permettrait ainsi de détecter un mauvais fonctionnement du cerveau qui est présent dans un grand nombre de maladies neurologiques. Aujourd’hui, aucune mesure non-invasive est capable de mesurer le couplage neurovasculaire chez l’homme ou chez l’animal de laboratoire. L’objectif de ce projet de recherche est de comparer une méthode sans intervention chirurgicale et donc non-invasive (par imagerie par résonance magnétique) avec une méthode invasive standard pour la quantification de l’activité neuronale et métabolique chez le primate non-humain anesthésié. Deux grands principes seront étudiés dans ce projet : le couplage neuro-vasculaire et le couplage « métabo-vasculaire », par l’enregistrement simultané de l’activité électrique neuronale à l’aide d’électrodes et de l’activité vasculaire à l’aide de l’imagerie fonctionnelle ultrasonore, et par l’enregistrement simultané de grandeurs métaboliques (comme la quantité locale de lactate, de glucose ou d’oxygène) et de l’activité vasculaire. Si la méthode non-invasive est validée, cela aura un impact majeur dans les projets de recherche qui font appel à l’animal pour ce type de mesure (raffinement et réduction) et pour l’homme, vu que les séquence d’imagerie RMN (résonnance magnetique nucléaire) peuvent facilement s’implémenter en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une compréhension plus fine du couplage neurovasculaire dans deux modèles de primates non-humains (chez le babouin et le macaque) afin de mieux comprendre le lien entre activité et le métabolisme neuronale et activité vasculaire qui apporte l’énergie nécessaire à cette activité. La comparaison entre les mesures non-invasives obtenues grâce à l’imagerie RMN et invasives en plaçant des électrodes permettra de valider la mesure par imagerie et remplacer une méthode invasive par une méthode non-invasive. Ceci constitue un raffinement et impacte directement le bien-être des animaux utilisés en recherche et des patients qui pourront bénéficier de cette nouvelle technologie. Il serait ainsi possible d’obtenir des données sur le dysfonctionnement du lien entre la vascularisation et l’activité neuronale chez les patients atteints de maladies neurologiques et utiliser cette mesure comme un biomarqueur pour suivre l’efficacité d’un traitement. De plus, grâce au réseau du don de tissus, les tissus biologiques éventuellement récupérés pourront être utilisés à la réalisation d’autres objectifs scientifiques, différents de ceux prévus dans cette étude.

Procédures

Les animaux seront soumis à un maximum de 6 séances d’imagerie de 3h max sous anesthésie générale non-invasive et pratiqué en routine chez l’animal d'une durée maximale de 7 heures comprenant une chirurgie réalisée en condition d'asepsie au niveau du cortex visuel primaire ainsi que des enregistrements de l'activité vasculaire (par ultrasons fonctionnels), électriques (par électrophysiologie) et métaboliques (avec des électrodes adaptées à ces enregistrements).

Impact sur les animaux

La procédure d’imagerie est non-invasive et indolore. Cependant, le caractère répétitif de l’anesthésie et la mise à jeun la veille de chaque séance d’imagerie sont prises en compte et des point limites sont établis à cet égard. Le risque d’hypothermie est contrôlé par le soutien thermique (couverture chauffante et plaides) pendant les examens d’imagerie et la chirurgie. L’irritation locale au niveau des oreilles pour fixation de la tête dans le cadre stéréotaxique et de la gorge suite à l’intubation sont minimisés grâce à l’utilisation de la lidocaïne en gel et la xylocaïne en spray respectivement comme détaillé dans la procédure expérimentale. Le temps d’acclimatation et le respect de temps de pause entre séances d’imagerie devraient résulter en une nuisance minime pour les animaux. La pesée hebdomadaire permettra de dépister toute altération du poids causée par les mises à jeun répétées et compenser avec un supplément de nourriture comme indiqué dans les points d’alerte avant d’arriver aux points limites.

Devenir

A la fin de l’étude les primates non-humains seront euthanasiés pour valider la sensibilité et la robustesse d’une mesure non-invasive du métabolisme neuronal versus une mesure invasive dans une optique de remplacement technologique. A l'issue de cette dernière, un don de tissus sera effectué dans une optique de réduction de nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques afin de valoriser l'animal.

Remplacement

Le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour atteindre les objectifs fixés dans ce projet, les couplages « neuro-vasculaire » et « métabo-vasculaire » nécessitant un fonctionnement normal du système cardio-vasculaire, il n’est pas possible d’utiliser des systèmes computationnels ou autres dispositifs alternatifs à l’utilisation d’animaux. Le modèle primate non-humain très utilisé pour sa proximité anatomo-fonctionnelle avec le cerveau humain est la seule espèce pertinente pour ce type d’étude.

Réduction

Un total de 12 (2x n=6) primates sera prévu dans ce projet pour s’assurer de la robustesse des mesures IRM (nombre habituel pour obtenir des valeurs moyennes fiables à ~10% chez le rongeur dans l’expérience du laboratoire). Le suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives (imagerie) permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet significatif. L’utilisation de macaques (le modèle le plus répandu en laboratoire) et babouins (un modèle avec volume et densité neuronale plus proche de l’homme) vise à rajouter de la robustesse et prédictivité des mesures non-invasives chez l’homme

Raffinement

Afin de minimiser le stress et l’angoisse des animaux importés à des fins d’expérimentation terminale, les babouins et les macaques seront importés au moins un mois avant la date de la première séance d’IRM. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation d’examens d’imagerie dans le laboratoire comporte des analgésiques pour minimiser les sensations désagréables lors de l’intubation et l’emplacement dans le cadre d’imagerie. Des point limites ont été définis en lien avec une potentielle réaction à l’anesthésie de certains individus qui est très rarement observé dans notre laboratoire. Les primates non-humains seront hébergés en groupes sociaux dans des cages équipées spécifiques de l’espèce. On limitera la durée de l’hébergement individuel lors des mises à jeun pour les séances d’IRM tout en gardant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres primates. Un enrichissement adapté sera mis en place : structurel (balançoire et visuelle, miroir); alimentaire (fruits, graines dans le fourrage); manipulable (jouets); auditif (musique).

Choix des espèces

Les macaques et les babouins possèdent une architecture cérébrale semblable à celle chez l’humain, avec notamment un cortex plissé présentant de nombreux circonvolutions et sillons cérébraux. De plus, le métabolisme des primates non-humains est plus proche du métabolisme humain que ne l’est le métabolisme du rongeur. De plus, le cortex visuel des primates est particulièrement développé et sa structure est stabilisé, donc l’étude vasculaire, électrophysiologique et métabolique chez le primate anesthésié est une expérimentation appropriée pour la compréhension du fonctionnement du système nerveux central chez l’humain. Les animaux seront à un stade adulte (macaque) ou jeune adulte (babouin) pour uniformiser la taille de la tête et donc la sensibilité lors des mesures par RMN notamment.

8 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une réutilisation ou un placement en retraite envisagé à l'issue. Ils subissent deux chirurgies dont une craniotomie de six heures, une stimulation transcrânienne par ultrasons, des enregistrements d'électrophysiologie et d'imagerie sur animal vigile, la tête fixée par un plot implanté, dans le cadre d'un contrôle hydrique pouvant provoquer une sensation de soif. Le porteur reconnaît que la stimulation peut induire une gêne et une "brûlure superficielle de la peau" et que les marges des implants sont des zones d'infection potentielle. Il affirme que les primates non humains sont "le seul choix possible" de modèle et prévoit huit animaux, ramenés à six "si tous coopèrent".

Objectifs

L’adaptation comportementale repose sur plusieurs processus importants: établir la valeur des stimuli de l’environnement, des buts à atteindre et des actions en fonction de l’état interne du sujet, sélectionner un comportement et évaluer ses conséquences. La nécessité d’agir dans un contexte sociale implique la prise en compte d’information relative aux valeurs et intentions d’autres agents biologiques. Notre objectif vise à mieux comprendre les interactions au sein de larges réseaux neuronaux dans la régulation flexible de nos comportements. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une region considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Pour cela, il est indispensable 1) d’identifier les relations anatomo-fonctionnelles entre les régions du lobe frontal et temporal, 2) d’étudier l’implémentation des mécanismes de l’adaptation comportementale au niveau neuronal et 3) de comprendre le rôle causal de ces différentes structures sur le fonctionnement intégré de ces réseaux. Ceci nécessite une combinaison d’approches d’imagerie et d’électrophysiogie, dont certaines invasives. Les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs, pour conduire le projet proposé. Ce projet sera réalisé dans 3 étab lissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Une caractéristique de notre survie dans le monde réel est notre capacité à faire preuve d'adaptation comportementale. Les primates en général et les humains en particulier sont très efficaces pour extraire rapidement les signaux informatifs de l'environnement social et non-social, et les intégrer aux conséquences de leurs actions, afin de maintenir ou de modifier si besoin leurs décisions. Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui vise à comprendre les mécanismes par lesquels les différentes régions du cortex frontal et temporal interagissent et comment elles contribuent aux comportements adaptifs en contexte social et non social. Le principal bénéfice attendu sera donc l’amélioration des connaissances scientifiques qui découleront de la réalisation des expériences de ce projet. 1. Le projet nous permettra de mieux d’identifier les circuits neuronaux et les mécanismes physiologiques qui supportent l’expression de comportements adaptatifs. 2. Le projet nous permettra de comprendre comment les perturbations de ces interactions préfronto-temporales conduisent à des altérations des processus cognitifs supportant les comportements adaptatifs Des bénéfices secondaires pourraient inclure des hypothèses en recherche clinique dans le domaine de la neuropsychiatrie. 3. Le projet nous permettra de mieux comprendre le couplage neuro-vasculaire Des bénéfices secondaires pourraient inclure une meilleure utilisation translationnelle des données d’électrophysiologie obtenues chez le singe aux données de neuroimagerie obtenues chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 actes chirurgicaux pour permettre la stimulation transcranienne par ultrasons et la collecte des données d'électrophysiologie et d'imagerie chez l'animal vigile. Les chirurgies seront réalisées après entrainement aux tâches comportementales. Une première chirurgie implantatoire permettra de réaliser les procédures de stimulation transcranienne et d'imagerie par résonance magnétique. Ce type de chirurgie dure en moyenne 4h. La seconde chirurgie sera réalisée à l’issue de la collecte des données d’imagerie fonctionnelle dans ces mêmes tâches. Elle est nécessaire pour la réalisation des procédures d'électrophysiologie et d'imagerie par ultrason. Ce type de chirurgie implantatoire nécessite la réalisation d’une craniotomie et sont plus longues (durée moyenne = 6h). Toutes les actes seront réalisés dans l'EU1, sauf la collecte de données CT préalable aux chirurgies qui sera réalisée dans l'EU3, et les chirurgies qui seront réalisées dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales pour les deux neurochirurgies et au moins un examen en neuroimagerie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d’une chambre d'enregistrement. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. Les marges des implants constituent des zones d’infection potentielle qui seront maitrisés par une surveillance régulière des implants et par l’administration de soins appropriés. Les singes travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis, ou en position dite du sphinx dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et plutôt bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les singes seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions. La stimulation ultrasonore peut induire une sensation de gêne lors de son application. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée. La stimulation ultrasonore peut induire une brûlure superficielle de la peau. Une modélisation au préalable des variations thermiques engendrées par la stimulation préviendra de cet effet négatif potentiel.

Devenir

La potentielle réutilisation des animaux en fin de protocole sera prise en accord avec la vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être utilisés, un placement en retraite sera considéré.

Remplacement

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une région cérébrale considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Sur la base de critères anatomiques et cognitifs, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal pour conduire le projet proposé. Il n'existe pas d’alternative qui permette d'obtenir des informations similaires à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, ou des modèles animaux non-primates.

Réduction

Contrairement à la neuroimagerie chez l’humain qui nécessite un grand nombre de sujet (n>20), les protocoles chez le primate non-humain bénéfient de la possibilité de répéter les sessions chez un même sujet. Chez le singe, 3 est également le nombre minimal d'animaux par étude sur lequel la communauté scientifique s'accorde. Dans le cadre du présent projet, il est important de prendre en compte le facteur social : dominants vs dominés. Nous travaillerons donc sur 2 groupes de 3 sujets. Cependant il arrive parfois que des animaux s’accommodent mal au travail en chaise de contention, ou ne tolèrent pas les implants. Nous envisageons le besoin de 8 animaux mais nous nous arrêterons à 6 si tous les animaux coopèrent, apprennent les tâches comportementales et tolèrent les implants.

Raffinement

Chaque animal reçoit un long pré-entrainement par renforcement positif pour l'habituer à la vie au laboratoire (nettoyage des volières, pesées régulières, etc.). Des protocoles d’enrichissement de l’environnement sont développés pour stimuler l’animal et lui permettre d’exprimer au mieux son répertoire comportemental en dehors des phases de collecte de données. L’utilisation de station de travail mobile permettra de réaliser certaines phases du conditionnement dans les volières des animaux. Un raffinement continu est également pratiqué pour développer des implants moins invasifs et moins sensibles aux infections. L’optimisation des techniques d’enregistrements électrophysiogiques permettra de réduire la phase de collecte des données. Tout sera mis en œuvre pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal grâce aux différentes mesures mises en place dans l’animalerie (hébergement en groupe social, enrichissement, etc.) et un suivi médical régulier de l’animal (perte de poids, alopécie), et des implants sera mis en œuvre (signes d’infections). Un suivi medical plus spécifique sera également mis en oeuvre post intervention chirugical.

Choix des espèces

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex préfrontal. Cette région est considérée comme une specificité de l’organisation cérébrale des primates. Les expériences présentees sont invasives. La combinaison des approches proposées permettront l’obtention d’informations fondamentales impossible à obtenir avec d'autres techniques, et impossible à réaliser chez l’humain. Notre recherche porte sur des animaux post-puberté (>4ans)

10 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois neurochirurgies de six à huit heures pour l'injection de protéines et l'implantation d'électrodes intracérébrales, puis des séances de neurostimulation, des injections de scopolamine et des ponctions lombaires répétées. Le projet induit une pathologie proche de la maladie d'Alzheimer pour tester des méthodes de neurostimulation de la mémoire. Le porteur affirme qu'un modèle primate est "indispensable" car le cortex préfrontal dorsolatéral "n'existe que chez le primate".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans l’objectif général de développer de nouvelles approches de neurostimulation pour les déficits mnésiques, observés en particulier dans la maladie d'Alzheimer. Malgré leur incidence très élevée, il n’existe actuellement pas de traitement pharmacologique adéquat, et la neurostimulation représente une approche alternative qui a déjà fait l’objet de plusieurs études préliminaires. Cependant, les approches testées chez l’humain actuellement produisent des effets variables et insuffisants, et qui ne sont pas statistiquement significatifs. Ces protocoles sont relativement simples car ils ne ciblent qu’une seule aire cérébrale et ce, de manière continue au cours du temps. Nous faisons l’hypothèse qu’une intervention ciblant plusieurs aires cérébrales et modulée au cours du temps mènera à une amélioration plus robuste des performances mnésiques dans un phénotype similaire à celui de la maladie d’Alzheimer. Pour tester cette hypothèse, nous allons implanter chez le primate non-humain des technologies d’électrodes intracrâniennes similaires à celles utilisées chez l’humain, et que nous avons déjà testées dans des modèles imprimés en 3D et chez le cochon. Ces électrodes seront implantées dans des aires critiques pour la mémoire de travail et la mémoire épisodique, dont certaines sont spécifiques aux primates (cortex préfrontal dorsolatéral). Nous allons induire chez 10 macaques cynomolgus une physiopathologie similaire à la maladie d’Alzheimer, ainsi que des déficits cognitifs temporaires, et étudier l’impact de nouvelles méthodes de neurostimulation (ciblant plusieurs aires et adaptées en temps réel en fonction de l’état cérébral) sur cette physiopathologie et sur les performances cognitives de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : (1) d'élucider les mécanismes physiologiques sous-tendant l'apprentissage et la mémoire chez le primate dans des états sains et pathologiques, notamment dans un nouveau modèle physiopathologique de la maladie d’Alzheimer ; (2) de développer une nouvelle catégorie d'interfaces cerveau-machine bidirectionnelles permettant d'enregistrer l'activité neuronale et de la stimuler en temps réel dans plusieurs aires cérébrales différentes, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les troubles mnésiques et la maladie d'Alzheimer, qui ne connaît aucun traitement à l'heure actuelle. Le développement et l’amélioration de ces technologies de neurostimulation est en effet en plein essor, en raison de leur potentiel thérapeutique pour plusieurs maladies neurologiques, incluant non seulement la maladie d’Alzheimer, mais également la maladie de Parkinson, la dépression, les troubles obsessionnels compulsifs, etc. Les applications cliniques sur la maladie d’Alzheimer se limitent actuellement à la stimulation d’une aire unique, avec des protocoles relativement simples, et mènent à des effets très limités et variables. Ce projet va au-delà des protocoles utilisés cliniquement car il stimule plusieurs aires simultanément afin de restaurer leur activité naturelle, et les protocoles de stimulation dépendent de l’état du cerveau grâce à des algorithmes dits en boucle fermée. Un tel développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tâches comportementales en chaise et en comportement libre avec enregistrements électrophysiologiques et neurostimulation (séances quotidiennes de 1-2h pendant toute la durée du projet), à des imagerie par résonance magnétique sous anesthésie (environ 5 séances de 2-3h maximum), à des tomodensitométries sous anesthésie (2 séances de 30 minutes), à 3 procédures neurochirurgicales de 6-8 heures environ (1 pour l'injection intracérébrale de protéines, et 2 pour l'implantation d'électrodes intracérébrales), à des injections intramusculaires de scopolamine (5-10 séances estimées, avec un effet durant 4h maximum), à des ponctions lombaires (réalisées tous les 6 mois à partir de l'implantation et pendant la durée du projet), et à une euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce projet peut avoir les effets indésirables suivants sur les animaux : (1) stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tâche comportementale, (2) douleurs suite à des procédures neurochirurgicales et à l'injection intramusculaire de substances (scopolamine, anesthésiants), (3) potentielles infections liées à la présence d'un système percutané d'électrodes intracérébrales, (4) nuisances liés à la potentielle restriction alimentaire ou hydrique, (5) nuisances liées à l'imagerie, (6) nuisances liées aux transports entre établissements utilisateurs.

Devenir

Les animaux seront eutahanasiés et une analyse histologique du cerveau sera effectuée.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les effets de la neurostimulation intracrânienne sur la mémoire lors d’une tâche cognitive. Ceci ne peut être réalisé in vitro. Par ailleurs, les modèles informatiques actuels ne permettent pas de remplacer l’expérimentation animale car les processus mnésiques ne sont pas suffisamment bien compris. Néanmoins, nos travaux de recherche incluent déjà une partie modélisation afin de guider la sélection de certains paramètres de stimulation. Dans le futur, de tels modèles permettraient de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, l’expérimentation humaine n’est pas encore possible à ce stade car les méthodes utilisées sont invasives, impliquent une craniotomie, et nécessitent donc une preuve de concept pré-clinique. En termes de modèle pré-clinique, notre développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.

Réduction

Chaque animal sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, les mêmes animaux seront réutilisés pour plusieurs interventions (effets de la stimulation dans l'état sain et dans différents états pathologiques, i.e. après injection de scopolamine et dévelopement de la tauopathie). Un nombre de 5 animaux est le minimum pour effectuer des tests statistiques de comparaison entre plusieurs états. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur primates non-humains se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Par ailleurs, ces animaux seront divisés en deux groupes d'âge. Au total, nous planifions donc d'utiliser un maximum de 10 animaux. Enfin, certains des animaux utilisés dans ce projet seront des animaux réutilisés de projets précédents.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes, dans une structure spécialement agréée pour l’hébergement et l’utilisation des primates en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce. Les hébergements seront enrichis par des approches standards (jouets pour animaux, nourriture variée, fonds sonore) ainsi que l’utilisation d’un système d’écran tactile pour primates permettant de délivrer des récompenses alimentaires lors de l’exécution de tâches de pointage ou de mémorisation. L’habituation aux interactions avec l’humain et aux diverses procédures expérimentales se fera progressivement et par renforcement positif, à un rythme adapté à chaque animal et qui s’étendra sur une durée de plusieurs mois. Nous utiliserons des méthodes chirurgicales aseptiques ainsi qu’une anesthésie gazeuse suivant au plus près les standards cliniques. Les procédures chirurgicales seront menées par un neurochirurgien, à l’aide d’un système de neuronavigation fondé sur des imageries non-invasives du cerveau par IRM et de la morphologie crânienne par tomodensitométrie, permettant d’atteindre une précision d’implantation submillimétrique. Nous effectuerons un suivi post-opératoire accru, plusieurs fois par jour, qui sera consigné par le personnel en charge de l’animalerie sur une feuille de suivi post-opératoire suivant une échelle d'évaluation du bien-être adaptée au primate, basée sur des critères tels que la posture, l’activité motrice, les interactions sociales, la nutrition, l’hydratation, etc. Le suivi post-opératoire inclura également des antalgiques pour contrôler la douleur, des antibiotiques pour réduire le risque d’infection, et si nécessaire des corticoïdes afin de contrôler de possibles augmentations de pression intracrânienne. Les cicatrices seront inspectées quotidiennement et désinfectées à la bétadine. Les transports entre différents établissements s’effectueront dans une cage dédiée placée sur un chariot protégé des regards extérieurs par une housse, l’animal étant sédaté, maintenu au chaud sous une couverture, et bordé d’une bouillotte. Les éventuelles restrictions alimentaires ou hydriques seront introduites ou arrêtées de manière progressive, maintenues au niveau minimal efficace, et feront l’objet d’une surveillance et d’une réévaluation régulières. Ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité SBEA. Enfin, les procédures seront arrêtées en cas d'atteinte d'un des points limites.

Choix des espèces

Au niveau scientifique, ce projet vise à étudier l’impact de la neurostimulation sur un réseau cérébral à grande échelle constitué notamment de l’hippocampe, du cortex entorhinal et du cortex préfrontal. Il existe une grande homologie de ce réseau entre le macaque et l’humain, mais cette homologie est nettement réduite avec d’autres espèces de vertébrés tels que les rongeurs, chez lesquels la définition du cortex préfrontal fait même débat. De plus, l’entraînement à des tâches cognitives suffisamment élaborées pour avoir un équivalent chez l’humain requiert l’usage de primates. Au niveau technologique, ce projet vise à développer des technologies de neurostimulation qui pourrait par la suite être appliquées à l’humain, ce qui nécessite un modèle anatomique suffisamment proche. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte (i.e. de plus de 5 ans environ). Le premier groupe contiendra des animaux entre 5 et 15 ans environ (âge adule moyen). Le deuxième groupe utilisera des animaux plus âgés (15-30 ans) dans le but d’observer des déficits de mémoire liés au vieillissement cognitif et de les compenser par la neurostimulation.

8 macaques rhésus vont être utilisés, réutilisés ou placés en retraite à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux neurochirurgies de quatre à six heures avec pose d'implants crâniens, puis des séances d'enregistrement sur animal vigile maintenu en chaise de contention, sous contrôle hydrique. Le projet étudie les réseaux du cortex préfrontal impliqués dans l'adaptation comportementale. Le porteur indique un risque d'infection des implants, une sensation de soif entre les sessions et une possible brûlure superficielle liée aux ultrasons, et affirme que les primates non humains sont "le seul choix possible".

Objectifs

L’adaptation comportementale repose sur plusieurs processus importants: établir la valeur des stimuli de l’environnement, des buts à atteindre et des actions en fonction de l’état interne du sujet, sélectionner un comportement et évaluer ses conséquences. La nécessité d’agir dans un contexte sociale implique la prise en compte d’information relative aux valeurs et intentions d’autres agents biologiques. Notre objectif vise à mieux comprendre les interactions au sein de larges réseaux neuronaux dans la régulation flexible de nos comportements. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une region considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Pour cela, il est indispensable 1) d’identifier les relations anatomo-fonctionnelles entre les régions du lobe frontal et temporal, 2) d’étudier l’implémentation des mécanismes de l’adaptation comportementale au niveau neuronal et 3) de comprendre le rôle causal de ces différentes structures sur le fonctionnement intégré de ces réseaux. Ceci nécessite une combinaison d’approches d’imagerie et d’électrophysiogie, dont certaines invasives. Les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs, pour conduire le projet proposé. Ce projet sera réalisé dans 3 étab lissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Une caractéristique de notre survie dans le monde réel est notre capacité à faire preuve d'adaptation comportementale. Les primates en général et les humains en particulier sont très efficaces pour extraire rapidement les signaux informatifs de l'environnement social et non-social, et les intégrer aux conséquences de leurs actions, afin de maintenir ou de modifier si besoin leurs décisions. Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui vise à comprendre les mécanismes par lesquels les différentes régions du cortex frontal et temporal interagissent et comment elles contribuent aux comportements adaptifs en contexte social et non social. Le principal bénéfice attendu sera donc l’amélioration des connaissances scientifiques qui découleront de la réalisation des expériences de ce projet. 1. Le projet nous permettra de mieux d’identifier les circuits neuronaux et les mécanismes physiologiques qui supportent l’expression de comportements adaptatifs. 2. Le projet nous permettra de comprendre comment les perturbations de ces interactions préfronto-temporales conduisent à des altérations des processus cognitifs supportant les comportements adaptatifs Des bénéfices secondaires pourraient inclure des hypothèses en recherche clinique dans le domaine de la neuropsychiatrie. 3. Le projet nous permettra de mieux comprendre le couplage neuro-vasculaire Des bénéfices secondaires pourraient inclure une meilleure utilisation translationnelle des données d’électrophysiologie obtenues chez le singe aux données de neuroimagerie obtenues chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 actes chirurgicaux pour permettre la stimulation transcranienne par ultrasons et la collecte des données d'électrophysiologie et d'imagerie chez l'animal vigile. Les chirurgies seront réalisées après entrainement aux tâches comportementales. Une première chirurgie implantatoire permettra de réaliser les procédures de stimulation transcranienne et d'imagerie par résonance magnétique. Ce type de chirurgie dure en moyenne 4h. La seconde chirurgie sera réalisée à l’issue de la collecte des données d’imagerie fonctionnelle dans ces mêmes tâches. Elle est nécessaire pour la réalisation des procédures d'électrophysiologie et d'imagerie par ultrason. Ce type de chirurgie implantatoire nécessite la réalisation d’une craniotomie et sont plus longues (durée moyenne = 6h). Toutes les actes seront réalisés dans l'EU1, sauf la collecte de données CT préalable aux chirurgies qui sera réalisée dans l'EU3, et les chirurgies qui seront réalisées dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales pour les deux neurochirurgies et au moins un examen en neuroimagerie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d’une chambre d'enregistrement. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. Les marges des implants constituent des zones d’infection potentielle qui seront maitrisés par une surveillance régulière des implants et par l’administration de soins appropriés. Les singes travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis, ou en position dite du sphinx dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et plutôt bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les singes seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions. La stimulation ultrasonore peut induire une sensation de gêne lors de son application. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée. La stimulation ultrasonore peut induire une brûlure superficielle de la peau. Une modélisation au préalable des variations thermiques engendrées par la stimulation préviendra de cet effet négatif potentiel.

Devenir

La potentielle réutilisation des animaux en fin de protocole sera prise en accord avec la vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être utilisés, un placement en retraite sera considéré.

Remplacement

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une région cérébrale considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Sur la base de critères anatomiques et cognitifs, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal pour conduire le projet proposé. Il n'existe pas d’alternative qui permette d'obtenir des informations similaires à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, ou des modèles animaux non-primates.

Réduction

Contrairement à la neuroimagerie chez l’humain qui nécessite un grand nombre de sujet (n>20), les protocoles chez le primate non-humain bénéfient de la possibilité de répéter les sessions chez un même sujet. Chez le singe, 3 est également le nombre minimal d'animaux par étude sur lequel la communauté scientifique s'accorde. Dans le cadre du présent projet, il est important de prendre en compte le facteur social : dominants vs dominés. Nous travaillerons donc sur 2 groupes de 3 sujets. Cependant il arrive parfois que des animaux s’accommodent mal au travail en chaise de contention, ou ne tolèrent pas les implants. Nous envisageons le besoin de 8 animaux mais nous nous arrêterons à 6 si tous les animaux coopèrent, apprennent les tâches comportementales et tolèrent les implants.

Raffinement

Chaque animal reçoit un long pré-entrainement par renforcement positif pour l'habituer à la vie au laboratoire (nettoyage des volières, pesées régulières, etc.). Des protocoles d’enrichissement de l’environnement sont développés pour stimuler l’animal et lui permettre d’exprimer au mieux son répertoire comportemental en dehors des phases de collecte de données. L’utilisation de station de travail mobile permettra de réaliser certaines phases du conditionnement dans les volières des animaux. Un raffinement continu est également pratiqué pour développer des implants moins invasifs et moins sensibles aux infections. L’optimisation des techniques d’enregistrements électrophysiogiques permettra de réduire la phase de collecte des données. Tout sera mis en œuvre pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal grâce aux différentes mesures mises en place dans l’animalerie (hébergement en groupe social, enrichissement, etc.) et un suivi médical régulier de l’animal (perte de poids, alopécie), et des implants sera mis en œuvre (signes d’infections). Un suivi medical plus spécifique sera également mis en oeuvre post intervention chirugical.

Choix des espèces

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex préfrontal. Cette région est considérée comme une specificité de l’organisation cérébrale des primates. Les expériences présentees sont invasives. La combinaison des approches proposées permettront l’obtention d’informations fondamentales impossible à obtenir avec d'autres techniques, et impossible à réaliser chez l’humain. Notre recherche porte sur des animaux post-puberté (>4ans)

21 macaques rhésus vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce volet couvrant l'essentiel du protocole d'un projet mené sur deux établissements. Ils reçoivent un entraînement cognitif tête fixée sur une chaise de contention, jusqu'à cinquante injections d'un ligand, des neurochirurgies et un contrôle de leur accès à l'eau, pour enregistrer l'activité de leur cortex préfrontal. Le porteur reconnaît une soif possible entre les sessions et un inconfort à l'apprentissage de la contention, et prévoit la mise à mort de chaque singe pour valider l'expérience par l'histologie du cerveau. Il conclut que le remplacement des primates est impossible, les alternatives in vitro et in silico ne reproduisant pas ce réseau.

Objectifs

Le cortex préfrontal est une région cérébrale très développée chez les primates. Il gère des fonctions qui permettent la flexibilité comportementale. La perte de ces fonctions caractérise plusieurs maladies psychiatriques. Les mécanismes du cortex préfrontal dans ces fonctions et de ces maladies sont peu connus – il semble notamment important de comprendre comment le cortex préfrontal fonctionne en interaction avec d’autres régions du cerveau. Nous étudierons ces interactions dans ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs – EU1/2 pour la majorité du protocole, et EU2/2 pour l'imagerie cérébrale. Tout d'abord, nous étudierons le dynamique de ces interactions par enregistrement électrophysiologique des neurones du cortex pendant des comportements adaptatifs. Puis nous caractériserons l’impact de perturbations des interactions du cortex préfrontal sur l’activité neuronal et sur les comportements adaptatifs. Nous utiliserons la technique émergente de pharmacogénétique qui permet de modifier l’activité des neurones impliqués dans les interactions, tandis que nous enregistrons cette même activité pour comprendre ce qui change dans le cerveau. Ces techniques invasives nécessitent des sujets animaux, ici des macaques - contrairement à d’autres espèces modèles les macaques partagent plusieurs des zones préfrontales ciblées avec l’espèce humaine. Les connaissances fondamentales acquises par ce projet contribueront à notre compréhension du fonctionnement cérébral et, à long terme, à élucider les mécanismes pathologiques des dysfonctions exécutives.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu sera donc la connaissance scientifique qui résultera de ces études, comme le projet nous permettra de mieux décrire les mécanismes physiologiques du cortex préfrontal et les mécanismes dans le cerveau des comportements adaptifs. En plus le projet nous permettra de comprendre comment le perturbation des interactions du cortex préfrontal modifient son fonctionnement. Plus largement la compréhension de ces perturbations nous approche à des mécanismes spécifiques des maladies qui en sont liées. Le projet avancera notre compréhension des approches pharmacogénétiques chez les primates, étape essentielle au développement du pharmacogénétique comme traitement médicale chez l’humain.

Procédures

Tous les animaux recevront un entrainement cognitif avec renforcement positif, dans leur hébergement et dans une salle de test. Les sessions sont de 1–5 heures, 5 jours par semaine, pour la durée du protocole. Après chirurgie, les singes fourniront des enregistrements intracérébraux pendant ses sessions d’entrainement cognitif. Les singes passeront également l’imagerie cérébrale - des IRM, des TEP et des CT sous anesthésie. Chaque séance dur 1-3 heures. Tous les singes passeront une ou deux neurochirurgies - pour l'implantation de dispositifs d'enregistrement neurophysiologique et pour l'injection de vecteurs viraux pour la pharmacogénétique. Les singes recevront des injections intramusculaires d'un ligand pour la pharmacogénétique ou d'une substance de contrôle. Jusqu’à 50 injections par animal, pendant le session de travail. À la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera extrait pour analyse histologique.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales, dont au moins une pour une neurochirurgie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d'électrodes, de chambres d'enregistrement, et/ou à l'injection de vecteurs viraux. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. Les animaux du groupe 5 travailleront dans un environnement d'entraînement en accès libre. Ils seront brièvement maintenus en contention légère, de manière à équiper les implants de carte mémoire et à effectuer les inspections et les soins pour les implants. Les animaux des groupes 1-4 et 6 travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les animaux seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions.

Devenir

À la fin du protocole les animaux, ayant reçu des injections pour le pharmacogénétique, seront euthanasiés et leur cerveau sera extrait pour analyse histologique, afin d'analyser et de confirmer l'expression des récepteurs pharmacogénétique dans leur cerveau. La validation de l'expression de ces récepteurs dans le tissu post mortem est une étape critique dans la justification des résultats de l'expérience. Le travail histologique, et donc l'euthanasie des animaux, fait donc partie intégrante de l'expérience.

Remplacement

La nécessité scientifique de ce programme de recherche est décrite dans les objectifs de ce projet et est soutenue par les financements accordé. Le projet est spécifiquement axé sur la dynamique neuronale du cortex préfrontal et ses interactions. Cette spécificité rend les alternatives non animales impossibles à mettre en œuvre pour atteindre les objectifs du projet. Les modèles in silico du cortex préfrontal restent rudimentaires pour les questions de dynamique neuronale - en effet, un résultat de ce projet pourrait être l'amélioration de ces modèles. En outre, le projet se concentre sur les interactions du cortex préfrontal avec d'autres régions du cerveau. Non seulement les modèles in silico du cortex préfrontal sont rudimentaires pour l'étude de la dynamique neuronale, mais ils sont rarement connectés à des versions modélisées d'autres régions du cerveau, et jamais avec toute la complexité des connexions dans le cerveau parce que nous ne connaissons ni ne comprenons la forme et la nature de ces connexions. Les assemblages de cellules in vitro peuvent être utilisés pour étudier la dynamique neuronale de base, mais jamais avec les interactions cortico-corticales, cortico-sous-corticales et neuromodulatrices que nous examinerons ici - les préparations in vitro manquent de ces éléments, et l'objectif de ce projet est de rendre compte de l'ensemble des systèmes du cortex préfrontal, ce qui n'est pas possible in vitro. L'étude ex-vivo est impossible pour ce projet car la dynamique neuronale n'est produite que par un cerveau vivant. Pour atteindre les objectifs scientifiques décrits, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs. Seules les espèces de primates possèdent la région du cortex préfrontal latéral granulaire qui est la cible de notre étude. Parmi les animaux de laboratoire acceptés, seules certaines espèces de primates sont capables d'accomplir les tâches cognitives que nous étudions ici. En conséquence de ce qui précède, il n'y a aucune forme de progrès scientifique ou technique dans un avenir prévisible qui permette d'obtenir les informations que nous recherchons ici à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, et donc nous ne pouvons pas aborder la question du remplacement de ces expériences.

Réduction

La taille estimée de la cohorte pour cette étude a été définie en prenant en compte l'impératif éthique d'utiliser le moins d'animaux possible et l’impératif scientifique et éthique d’utiliser le nombre suffisant pour obtenir des données scientifiques robustes, des résultats significatifs et généralisables. Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et une reproductibilité des observations. En général, l'approche consiste à concevoir toutes les expériences pour les contrastes et les tests statistiques intra-individuel, puis à tester un deuxième animal pour confirmer les résultats du premier. Cela signifie qu’un singe sert comme son propre contrôle et que le "n" de l'expérience est constitué de sessions ou de neurones. C'est le minimum absolu pour une expérience scientifique correctement réalisée, et notre travail pour réaliser ces expériences de cette manière représente un effort maximal de réduction. Pour toutes les procédures, l’utilisation des interventions pharmacogénétique DREADD pour modifier l’activité des neurones relèvent du raffinement ce qui porte la réduction à son maximum. C’est une intervention réversible qui ne nécessitent pas de lésion et n’impliquent pas de perturbation à long terme. La procédure étant réversible, l'animal peut également agir comme son propre contrôle. Dans chaque groupe principal, deux animaux seront utilisés si les deux fournissent la puissance statistique requise pour l'étude. Un troisième animal a été noté, mais il ne sera inclus que si l'un des deux premiers n'est pas en mesure de fournir des données répondant à ces critères. Nous souhaitons souligner ici que le critère important est, une fois que nous commençons l'expérimentation sur des sujets macaques, de s'assurer que des résultats scientifiques solides et fiables découlent du projet.

Raffinement

Nos approches expérimentales font l'objet de raffinements constants. Nous appliquons depuis plusieurs années des protocoles de surveillance accrue de nos animaux, à la fois dans les protocoles et autour des procédures chirurgicales ; nous fournissons des soins péri-opératoires au niveau qui serait attendu en chirurgie humaine dans la mesure du possible ; nous suivons la douleur post-opératoire avec notation et points limites; et tous nos animaux sont entrainés avec un renforcement positif pour chaque élément du protocole. Chaque élément du protocole est suivi avec des points limites gradés adaptés à chaque animal et le protocole et les interventions sont effectués en fonction des discussions régulières avec les vétérinaires et le personnel chargé des soins aux animaux. Notamment, le contrôle hydrique est opéré ici avec un suivi renforcé et un ensemble gradué de points d'intervention et de points d'arrêt, comme décrit par les recommandations nationales du CNREEA. Les techniques et les matériaux d'implantation font l'objet de raffinements réguliers, tout comme le soin des implants et leur suivi à long terme. Les interventions pharmacogénétiques permettent une intervention neuronale directe plus ciblée que les approches précédentes et ne nécessite pas d'injection intra-cérébrale à chaque séance. À terme la validation des injections pharmacogénétiques par TEP et IRM devrait permettre de valider les expériences sans sacrifier les animaux pour une validation histologique. Le travail réalisé ici contribuera à cet objectif, mais une validation post mortem reste nécessaire pour le moment. Le travail des singes testés en "libre accès" représente un raffinement significatif pour l'acquisition de données neurophysiologiques et pour les conditions de travail pour l’animal. Plus précisément, il s'agit d’un raffinement majeur de l'hébergement conformément au protocole, car les animaux sont beaucoup moins fréquemment contraints ou retirés de leur hébergement pour les besoins de l'expérience. Le projet entre autres fournira une base de données pour indiquer dans quels cas ce raffinement spécifique est approprié dans l’avenir.

Choix des espèces

Les expériences chez les primates non-humains sont directement pertinentes pour la compréhension de la cognition humaine, en raison des capacités cognitives du macaque, et des similarités de cerveau. Nos questions scientifiques nécessitent des études chez le singe en raison des proximités anatomiques et biochimiques entre les espèces primates, et de la capacité unique des primates à réaliser des tâches cognitives complexes qui permettent de manipuler, comme chez l'Homme, les capacités comportementales complexes. Nos études sont centrées sur le cortex préfrontal, un cortex granulaire qui parmi les espèces modèles n’a été identifié que chez les primates. L'utilisation du modèle primate permet un transfert direct vers la compréhension du cerveau chez l'Homme. Ceci est renforcé par les connaissances que nous avons acquises, et par nos études comparatives Humain-Macaque. Les animaux sont adultes – les procédures d'implantation sont réalisées à 5-6 ans lorsque le développement crânien se stabilise pour éviter de fortes modifications morphologiques après implantation et des problèmes de localisation stéréotaxique.

21 macaques rhésus vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce volet couvrant l'imagerie cérébrale d'un projet mené sur deux établissements. Ils subissent une ou deux neurochirurgies pour implanter des électrodes et injecter des virus, des séances d'imagerie sous anesthésie et un contrôle de leur accès à l'eau qui peut provoquer la soif, pour étudier le cortex préfrontal. Le porteur décrit un entraînement par renforcement positif et un suivi de la douleur, tout en prévoyant la mise à mort de chaque singe pour analyser son cerveau. Il affirme que le primate est le "seul choix possible" et que les modèles informatiques restent "rudimentaires".

Objectifs

Le cortex préfrontal est une région cérébrale très développée chez les primates. Il gère des fonctions qui permettent la flexibilité comportementale. La perte de ces fonctions caractérise plusieurs maladies psychiatriques. Les mécanismes du cortex préfrontal dans ces fonctions et de ces maladies sont peu connus – il semble notamment important de comprendre comment le cortex préfrontal fonctionne en interaction avec d’autres régions du cerveau. Nous étudierons ces interactions dans ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs – EU1/2 pour la majorité du protocole, et EU2/2 pour l'imagerie cérébrale. Tout d'abord, nous étudierons le dynamique de ces interactions par enregistrement électrophysiologique des neurones du cortex pendant des comportements adaptatifs. Puis nous caractériserons l’impact de perturbations des interactions du cortex préfrontal sur l’activité neuronal et sur les comportements adaptatifs. Nous utiliserons la technique émergente de pharmacogénétique qui permet de modifier l’activité des neurones impliqués dans les interactions, tandis que nous enregistrons cette même activité pour comprendre ce qui change dans le cerveau. Ces techniques invasives nécessitent des sujets animaux, ici des macaques - contrairement à d’autres espèces modèles les macaques partagent plusieurs des zones préfrontales ciblées avec l’espèce humaine. Les connaissances fondamentales acquises par ce projet contribueront à notre compréhension du fonctionnement cérébral et, à long terme, à élucider les mécanismes pathologiques des dysfonctions exécutives.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu sera donc la connaissance scientifique qui résultera de ces études, comme le projet nous permettra de mieux décrire les mécanismes physiologiques du cortex préfrontal et les mécanismes dans le cerveau des comportements adaptifs. En plus le projet nous permettra de comprendre comment le perturbation des interactions du cortex préfrontal modifient son fonctionnement. Plus largement la compréhension de ces perturbations nous approche à des mécanismes spécifiques des maladies qui en sont liées. Le projet avancera notre compréhension des approches pharmacogénétiques chez les primates, étape essentielle au développement du pharmacogénétique comme traitement médicale chez l’humain.

Procédures

Tous les animaux recevront un entrainement cognitif avec renforcement positif, dans leur hébergement et dans une salle de test. Les sessions sont de 1–5 heures, 5 jours par semaine, pour la durée du protocole. Après chirurgie, les singes fourniront des enregistrements intracérébraux pendant ses sessions d’entrainement cognitif. Les singes passeront également l’imagerie cérébrale - des IRM, des TEP et des CT sous anesthésie. Chaque séance dur 1-3 heures. Tous les singes passeront une ou deux neurochirurgies - pour l'implantation de dispositifs d'enregistrement neurophysiologique et pour l'injection de vecteurs viraux pour la pharmacogénétique. Les singes recevront des injections intramusculaires d'un ligand pour la pharmacogénétique ou d'une substance de contrôle. Jusqu’à 50 injections par animal, pendant le session de travail. À la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera extrait pour analyse histologique.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales, dont au moins une pour une neurochirurgie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d'électrodes, de chambres d'enregistrement, et/ou à l'injection de vecteurs viraux. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. Les animaux du groupe 5 travailleront dans un environnement d'entraînement en accès libre. Ils seront brièvement maintenus en contention légère, de manière à équiper les implants de carte mémoire et à effectuer les inspections et les soins pour les implants. Les animaux des groupes 1-4 et 6 travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les animaux seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions.

Devenir

À la fin du protocole les animaux, ayant reçu des injections pour le pharmacogénétique, seront euthanasiés et leur cerveau sera extrait pour analyse histologique, afin d'analyser et de confirmer l'expression des récepteurs pharmacogénétique dans leur cerveau. La validation de l'expression de ces récepteurs dans le tissu post mortem est une étape critique dans la justification des résultats de l'expérience. Le travail histologique, et donc l'euthanasie des animaux, fait donc partie intégrante de l'expérience.

Remplacement

La nécessité scientifique de ce programme de recherche est décrite dans les objectifs de ce projet et est soutenue par les financements accordé. Le projet est spécifiquement axé sur la dynamique neuronale du cortex préfrontal et ses interactions. Cette spécificité rend les alternatives non animales impossibles à mettre en œuvre pour atteindre les objectifs du projet. Les modèles in silico du cortex préfrontal restent rudimentaires pour les questions de dynamique neuronale - en effet, un résultat de ce projet pourrait être l'amélioration de ces modèles. En outre, le projet se concentre sur les interactions du cortex préfrontal avec d'autres régions du cerveau. Non seulement les modèles in silico du cortex préfrontal sont rudimentaires pour l'étude de la dynamique neuronale, mais ils sont rarement connectés à des versions modélisées d'autres régions du cerveau, et jamais avec toute la complexité des connexions dans le cerveau parce que nous ne connaissons ni ne comprenons la forme et la nature de ces connexions. Les assemblages de cellules in vitro peuvent être utilisés pour étudier la dynamique neuronale de base, mais jamais avec les interactions cortico-corticales, cortico-sous-corticales et neuromodulatrices que nous examinerons ici - les préparations in vitro manquent de ces éléments, et l'objectif de ce projet est de rendre compte de l'ensemble des systèmes du cortex préfrontal, ce qui n'est pas possible in vitro. L'étude ex-vivo est impossible pour ce projet car la dynamique neuronale n'est produite que par un cerveau vivant. Pour atteindre les objectifs scientifiques décrits, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs. Seules les espèces de primates possèdent la région du cortex préfrontal latéral granulaire qui est la cible de notre étude. Parmi les animaux de laboratoire acceptés, seules certaines espèces de primates sont capables d'accomplir les tâches cognitives que nous étudions ici. En conséquence de ce qui précède, il n'y a aucune forme de progrès scientifique ou technique dans un avenir prévisible qui permette d'obtenir les informations que nous recherchons ici à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, et donc nous ne pouvons pas aborder la question du remplacement de ces expériences.

Réduction

La taille estimée de la cohorte pour cette étude a été définie en prenant en compte l'impératif éthique d'utiliser le moins d'animaux possible et l’impératif scientifique et éthique d’utiliser le nombre suffisant pour obtenir des données scientifiques robustes, des résultats significatifs et généralisables. Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et une reproductibilité des observations. En général, l'approche consiste à concevoir toutes les expériences pour les contrastes et les tests statistiques intra-individuel, puis à tester un deuxième animal pour confirmer les résultats du premier. Cela signifie qu’un singe sert comme son propre contrôle et que le "n" de l'expérience est constitué de sessions ou de neurones. C'est le minimum absolu pour une expérience scientifique correctement réalisée, et notre travail pour réaliser ces expériences de cette manière représente un effort maximal de réduction. Pour toutes les procédures, l’utilisation des interventions pharmacogénétique DREADD pour modifier l’activité des neurones relèvent du raffinement ce qui porte la réduction à son maximum. C’est une intervention réversible qui ne nécessitent pas de lésion et n’impliquent pas de perturbation à long terme. La procédure étant réversible, l'animal peut également agir comme son propre contrôle. Dans chaque groupe principal, deux animaux seront utilisés si les deux fournissent la puissance statistique requise pour l'étude. Un troisième animal a été noté, mais il ne sera inclus que si l'un des deux premiers n'est pas en mesure de fournir des données répondant à ces critères. Nous souhaitons souligner ici que le critère important est, une fois que nous commençons l'expérimentation sur des sujets macaques, de s'assurer que des résultats scientifiques solides et fiables découlent du projet.

Raffinement

Nos approches expérimentales font l'objet de raffinements constants. Nous appliquons depuis plusieurs années des protocoles de surveillance accrue de nos animaux, à la fois dans les protocoles et autour des procédures chirurgicales ; nous fournissons des soins péri-opératoires au niveau qui serait attendu en chirurgie humaine dans la mesure du possible ; nous suivons la douleur post-opératoire avec notation et points limites; et tous nos animaux sont entrainés avec un renforcement positif pour chaque élément du protocole. Chaque élément du protocole est suivi avec des points limites gradés adaptés à chaque animal et le protocole et les interventions sont effectués en fonction des discussions régulières avec les vétérinaires et le personnel chargé des soins aux animaux. Notamment, le contrôle hydrique est opéré ici avec un suivi renforcé et un ensemble gradué de points d'intervention et de points d'arrêt, comme décrit par les recommandations nationales du CNREEA. Les techniques et les matériaux d'implantation font l'objet de raffinements réguliers, tout comme le soin des implants et leur suivi à long terme. Les interventions pharmacogénétiques permettent une intervention neuronale directe plus ciblée que les approches précédentes et ne nécessite pas d'injection intra-cérébrale à chaque séance. À terme la validation des injections pharmacogénétiques par TEP et IRM devrait permettre de valider les expériences sans sacrifier les animaux pour une validation histologique. Le travail réalisé ici contribuera à cet objectif, mais une validation post mortem reste nécessaire pour le moment. Le travail des singes testés en "libre accès" représente un raffinement significatif pour l'acquisition de données neurophysiologiques et pour les conditions de travail pour l’animal. Plus précisément, il s'agit d’un raffinement majeur de l'hébergement conformément au protocole, car les animaux sont beaucoup moins fréquemment contraints ou retirés de leur hébergement pour les besoins de l'expérience. Le projet entre autres fournira une base de données pour indiquer dans quels cas ce raffinement spécifique est approprié dans l’avenir.

Choix des espèces

Les expériences chez les primates non-humains sont directement pertinentes pour la compréhension de la cognition humaine, en raison des capacités cognitives du macaque, et des similarités de cerveau. Nos questions scientifiques nécessitent des études chez le singe en raison des proximités anatomiques et biochimiques entre les espèces primates, et de la capacité unique des primates à réaliser des tâches cognitives complexes qui permettent de manipuler, comme chez l'Homme, les capacités comportementales complexes. Nos études sont centrées sur le cortex préfrontal, un cortex granulaire qui parmi les espèces modèles n’a été identifié que chez les primates. L'utilisation du modèle primate permet un transfert direct vers la compréhension du cerveau chez l'Homme. Ceci est renforcé par les connaissances que nous avons acquises, et par nos études comparatives Humain-Macaque. Les animaux sont adultes – les procédures d'implantation sont réalisées à 5-6 ans lorsque le développement crânien se stabilise pour éviter de fortes modifications morphologiques après implantation et des problèmes de localisation stéréotaxique.

170 rats et 6 macaques vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les uns et les autres reçoivent une injection de vecteurs de thérapie génique sous la rétine des deux yeux, puis subissent des séries d'imageries et de tests rétiniens sous anesthésie, répétés jusqu'à quinze fois chez les macaques, ainsi que des prélèvements sanguins. L'objectif déclaré est de tester l'efficacité d'un traitement de la maladie de Stargardt chez les rats et sa toxicité chez les macaques, que le porteur juge indétectable chez les rongeurs. Il présente la rétine comme non reconstituable in vitro et retient le macaque pour son œil proche de celui de l'humain.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie génétique liée à des mutations sur le gène ABCA4. Elle a une prévalence de 1 pour 8000 à 10000 personnes, et se traduit par une dégénérescence rétinienne avec une cécite diurne, qui impacte à la fois les hommes et les femmes à partir de l’adolescence. La protéine ABCA4 est un transporteur essentiel pour le métabolisme des photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. En absence d’ABCA4, on observe une accumulation de déchets métaboliques dans les photorécepteurs, qui finissent par dégénérer. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace pour cette maladie. La thérapie génique, qui consisterait à venir ramener une copie fonctionnelle du gène ABCA4 dans les cellules rétiennes, est une approche prometteuse. Mais une limite de cette approche est que le gène ABCA4 est trop grand pour être intégré dans les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV), vecteurs de choix pour transférer un gène dans la rétine. Une approche alternative consiste à délivrer deux vecteurs rAAVs, chacun porteur d’une moitié du gène ABCA4, associé à des structures spécifiques appelées ‘intéines’. Les deux moitiés de la protéine ABCA4 sont produites dans les cellules transduites, et une ligation s’effectue grâce aux intéines pour reconstruire une protéine ABCA4 entière. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité et la potentielle toxicité d’un traitement de thérapie génique basé sur l’utilisation de vecteurs recombinants «AAV-ABCA4-intéine» pour la maladie de Stargardt. L’évaluation de l’efficacité de ces vecteurs sera réalisée après injection sous-rétinienne chez le rat ABCA4-/-, modèle de la maladie de Stargardt dans lequel le gène ABCA4 est non fonctionnel. L’objectif sera de réduire le taux de déchets métaboliques dans la rétine, après expression de la protéine complète d’ABCA4, tout en vérifiant qu’une structure correcte de la rétine est maintenue. En parallèle de cette étude d’efficacité chez ce modèle de rat, nous évaluerons le risque de toxicité des «AAV-ABCA4-intéine» chez le macaque sain. En effet, les intéines étant des éléments protéiques exogènes, étrangers au système immunitaire, elles pourraient induire une toxicité immunitaire. Une telle toxicité ne pouvant pas être mise en évidence chez les rongeurs (connus pour tolérer un certain nombre de protéines exogènes, après transfert avec un vecteur AAV), il est donc nécessaire de passer au modèle macaque pour répondre à cette question.

Bénéfices attendus

Le but de cette étude est d’évaluer l’effet thérapeutique des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine» après injection sous rétinienne chez des rats pour lesquels le gène ABCA4 n’est pas fonctionnel et de valider l’absence de toxicité de cette approche thérapeutique chez le macaque. L’évaluation in vivo des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. De plus, si cette approche est validée pour le gène ABCA4, elle pourra potentiellement être transposée pour soigner d’autres maladies génétiques ayant un gène trop grand pour être inséré dans un seul vecteur AAV.

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » dans les 2 yeux : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 2h maximum pour les macaques. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 4 fois le premier mois puis maximum deux fois par mois, soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats et 1h pour les macaques. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 2 fois le premier mois puis maximum une fois par mois, soit un maximum de 8 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 1h30 pour les macaques. (iv) Injection intramusculaire d'un traitement immunosuppresseur: Geste réalisé sur animaux vigiles (sous contention dans leur cage), pour les macaques une fois avant l'injection du vecteur, puis une fois par semaine pendant les 5 semaines suivant l'injection du vecteur. (v) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois avant l’injection des vecteurs puis une fois par mois post-injection, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Pour les macaques lors des mêmes anesthésies que les imageries rétiniennes soit un maximum de 10 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée du geste 10 minutes maximum pour les deux espèces.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide après les chirurgies car les animaux seront sous anesthésie gazeuse.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. D’autre part, la pathologie de Stargardt est induite par une toxicité liée au métabolisme de la vitamine A présent dans l’œil à la naissance et supplémenté via la circulation choroidale. Cet effet systémique de la vitamine A ne peut pas être reproduit in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Ce nombre basé sur celui de nos précédentes études, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles, que ce soit avec le modèle de rat ABCA4-/- ou le macaque sain. Pour les rats ABCA4-/-, nous nous laissons la possibilité d’inclure entre 1 et 3 animaux supplémentaires par groupe, en cas d’échec des injections sous-rétiniennes. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses quantitatives et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes non injectés ou injectés avec un tampon, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes. Le suivi longitudinal non invasif par imagerie de la rétine permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour les analyses chez le macaque le nombre d'animaux utilisés est réduit à son strict minimum (n= 2 animaux par groupe, avec injections bilatérales). Malgré tout, nous savons que ce nombre permettra d'apporter les réponses aux questions posées dans cette étude. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression du gène ABCA4, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre ABCA4 et une analyse statistique sur les amplitudes des résultats d’électrorétinogrammes (analyse de la réponse électrique de la rétine). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats, et dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés pour les macaques. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts et un suivi des animaux à l’aide de grilles de score, d’un arbre décisionnel nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés voire de décider d'une mise à mort prématurés.

Choix des espèces

Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large pour permettre une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt. Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. Mais les études menées chez les rongeurs ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’œil comparable à celle de l’homme, comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système visuel, une dimension et une structure du globe oculaire mais également de la rétine, avec la présence d’une macula (absente chez les rongeurs) ainsi qu’un système immunitaire comparable à ceux de l’homme.

50 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un vecteur de thérapie génique, parfois par une chirurgie cérébrale de cinq heures, puis subit des séances répétées d'imagerie sous anesthésie avant l'euthanasie pour analyse des tissus. L'objectif est d'obtenir une "preuve de concept" avant un essai clinique contre la maladie de Parkinson. Le porteur justifie le recours au macaque par la taille de son cerveau et sa proximité immunitaire avec l'humain, et affirme que ni les cultures ni le rongeur ne sont "prédictifs".

Objectifs

La maladie de Parkinson, fait partie d’un groupe de maladies du cerveau dont la signature est l’accumulation anormale d’une protéine l’alpha-synucléine (α-syn). A l’état normal, α-syn régule le trafic et la libération des neurotransmetteurs qui sont essentiels pour la communication entre neurones. Son accumulation excessive et en forme insoluble, contribue à l’apparition d’agrégats multi-protéiques qui encombrent les neurones et empêchent leur bon fonctionnement. Une stratégie thérapeutique contre cette accumulation et agrégation d’α-syn est de réduire sa quantité dans les tissus ou des molécules intermédiaires (ARN messager, ou ARNm) nécessaires à sa production. Des essais cliniques sont déjà en cours sur des patients atteints de la maladie de Parkinson pour évaluer l’efficacité de cette stratégie. Cependant, ces approches laissent la protéine et/ou ARNm s’accumuler jusqu’à qu’ils rencontrent une molécule qui les élimine. Ce processus engorge à terme la machinerie cellulaire et il serait plus efficace de réduire l’expression du gène directement, c’est-à-dire d’agir en amont de la production d’ARNm et de protéines. Grâce à une technologie d’édition du génome qui est inductible et réversible, nous proposons de tester une nouvelle approche pour réduire partiellement la quantité d’α-syn produite de novo. Des résultats obtenus chez le rongeur montrent que l’approche est efficace et bien tolérée. Il s’agit maintenant d’étoffer ces données et de mettre à l’échelle le traitement dans une espèce plus proche de l’humain en termes de taille et organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau, et par rapport au système immunitaire. Les expériences proposées dans un modèle primate non-humain permettront ainsi d’établir si la réduction partielle de l’expression du gène est efficace et bien tolérée. Pour ceci, il faut réaliser la mise à l’échelle du traitement chez le gros animal et étudier différentes voies d’administration, en comparant l’effet de la thérapie génique après injection du vecteur thérapeutique directement dans le cerveau, dans le compartiment de liquide céphalorachidien, ou dans le compartiment sanguin. Toutes les voies d’administration citées sont utilisées chez l’humain et sont donc pertinentes pour le traitement des patients atteints de la maladie de Parkinson. Dans un souci de raffinement, la voie moins invasive donnant une efficacité satisfaisante chez le primate non humain sera privilégiée pour la translation de cette thérapie en clinique.

Bénéfices attendus

Les données déjà obtenues dans des modèles rongeurs de la maladie de Parkinson montrent bien que la réduction de la quantité de protéines ou d’ARNm de l’α-syn a un effet bénéfique. Ce projet vise à établir pour la première fois chez le primate non-humain l’effet d’une thérapie qui réduit partiellement l’expression du gène de l’α-syn en vue de son utilisation chez le patient atteint de la maladie de Parkinson. Notre approche devrait éviter d’encombrer et perturber la machinerie cellulaire, et limiter le risque d’engorgement empêchant l’élimination des produits accumulés et causant une inflammation chronique autour des neurones, où ils s’accumulent. Les données acquises pendant le projet permettront d’établir les meilleurs paramètres d’administration chez le patient, ce qui constitue une preuve de concept essentielle avant de démarrer un essai clinique.

Procédures

Le protocole expérimental comporte 4-5 séances de prélèvements sous anesthésie (~30 min) avant et après administration de la thérapie. L’imagerie IRM non-invasive, sera utilisée pour observer l’anatomie du cerveau et la présence d’inflammation (4-5 fois 1-2H). De même, 4-5 séances d’imagerie TEP (4H max) seront délivrées en respectant 3 semaines d’écart entre les examens. Une seule délivrance de thérapie est prévue par animal et sa durée sera de 1H à 6H selon la voie. L’euthanasie en fin de protocole sera nécessaire pour prélever les organes et tissus et les analyser, afin de comparer les résultats aux mesures fonctionnelles et anatomiques acquises par imagerie IRM et TEP, et ainsi valider les résultats d’innocuité et efficacité. Toutes ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale en prenant en compte l’inconfort, la douleur lors des chirurgies et le suivi de l’état général des animaux comme le poids, la mobilité et la sociabilité avec les congénères.

Impact sur les animaux

Les nuisances possibles suite à la délivrance du traitement par chirurgie sont une infection au niveau de l’incision de la peau (5-7 jours maximum avec prise en charge par un traitement antibiotique), une douleur au niveau de l’incision (2-3 jours post-incision avec prise en charge par un traitement analgésique), perte de poids (2 jours post-chirurgie avec prise en charge par un soutien alimentaire). Toute modification du comportement moteur ou social des animaux hébergés en groupe social sera noté et notifié au vétérinaire.

Devenir

Suite à des données prometteuses obtenues chez le rongeur, et dans l’optique d’obtenir une preuve de concept de l’efficacité et la sureté d’une stratégie de thérapie génique pour la maladie de Parkinson chez une espèce fonctionnellement et immunitairement proche de l’Homme, il est nécessaire d’analyser les tissus après euthanasie pour obtenir des mesures concrètes et reproductibles. En effet, le cadre règlementaire pour transposer une thérapie en clinique chez l’humain impose une vérification directe de la distribution dans l’organisme du vecteur viral et une évaluation de sa capacité à induire une réponse immunitaire. Ces données sont inaccessibles chez le patient humain et le recours à l’animal reste nécessaire. Ainsi, la présence du vecteur viral et de la protéine surexprimée seront mesurées et cartographiées dans le système nerveux central et les organes périphériques à l’aide de techniques biochimiques ou histopathologiques.

Remplacement

Le recours à l’animal est nécessaire, aucun milieu de culture, organoïde ou système synthétique, ne permettant aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale du cerveau au point de prédire la biodistribution d’un agent thérapeutique, ou de comparer cette distribution en fonction des voies d’administration utilisées. Le rongeur, vu la petite taille de son cerveau, n’est pas pertinent pour informer correctement le design clinique de l’administration de cette approche, c’est-à-dire le nombre d’injections et la concentration de l’agent thérapeutique à utiliser pour couvrir une région du cerveau. La taille et la structure du cerveau du primate non-humain – en rapport avec la résolution intrinsèque des équipements d’imagerie existants – permettent aussi des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées chez les patients et impossibles chez le rongeur par exemple. Par ailleurs, la réaction du système immunitaire suite à la surexpression d’une protéine exogène doit aussi être évaluée dans un modèle animal proche de l’Homme pour augmenter sa valeur prédictive. Il est possible de dépister ces effets grâce à des examens d’imagerie et de confirmer ces résultats par analyse immunohistochimique des marqueurs d’inflammation post-mortem. Le protocole expérimental pourra être révisé pour éviter une réaction immunitaire, en modulant des paramètres d’administration comme la concentration et le volume de l’agent thérapeutique, sa répartition par site d’injection et l’administration d’un traitement anti-inflammatoire. Tous ces éléments pourront être utilisés pour mettre au point les protocoles de délivrance et de suivi chez le patient.

Réduction

Une veille de la littérature démontre que ces expériences n’ont pas été déjà réalisées et que le nombre d’animaux choisi, en tenant compte de l’espèce, est pertinent puisqu’il a déjà permis de mettre en évidence des effets thérapeutiques dans d’autres études. De plus, le laboratoire dispose d’une solide expérience dans le design d’expériences d’évaluation thérapeutique chez le primate non-humain et du nombre d’individus nécessaires par groupe expérimental pour conclure sur des effets pertinents et prédictifs chez l’humain. Un suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives comme l’imagerie permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet thérapeutique significatif, en évitant l’euthanasie pour une confirmation histologique à différents temps.

Raffinement

Une seule séance par individu est prévue pour délivrer les vecteurs viraux. La durée et le caractère invasif de la procédure de délivrance seront variables entre les groupes expérimentaux, selon qu’il s’agira d’une simple injection (~1h) ou une chirurgie pour délivrance dans le cerveau (~5h). Un suivi d’observation journalière sera mis en place les deux premières semaines après administration pour vérifier l’absence de réaction aigue (réaction cutanée locale, gonflement, rougeur, infection). Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie locale et systémique le jour de l’intervention et, dans le cas de la chirurgie, dans les deux jours qui suivront. D’après l’expérience du laboratoire, grâce à ces protocoles, les chirurgies ne modifient pas le comportement de l’animal ni sa prise de nourriture, même dans les 48 heures post-intervention. De plus, un suivi du poids sera réalisé toutes les semaines durant toute la durée de l’expérience. Le comportement sera évalué une fois par semaine pendant toute la durée du protocole à l’aide d’une grille prenant en compte différents critères, dont la présence ou absence d’un penchement de la tête, la difficulté de déplacement à cause d’un membre inférieur ou supérieur, les rotations, la prostration, l’apparence du pelage, la prise de nourriture fournie par l’expérimentateur (motricité fine et apathie).

Choix des espèces

Des études préalables chez le rongeur montrent que la réduction de l’expression de la protéine aSyn est suffisante pour modifier ou empêcher le développement de la maladie de Parkinson. Notre projet vise à réduire partiellement l’α-syn au niveau de l’ADN. Le développement clinique de l’approche demande d’étudier la biodistribution et la sureté de cette thérapie dans un modèle bien connu et proche de l’homme en termes d’organisation anatomo-fonctionnel cérébrale et d’immunologie. Ni les modèles in vitro ni les modèles rongeurs ne sont prédictifs du fait de la petite taille du cerveau et des différences au niveau du système immunitaire, et c’est pourquoi nous avons fait appel au modèle macaque. En effet, des études comparatives entre rats, primates et humains montrent que le nombre de cellules dopaminergiques dans la substance noire est de 12.7x10e3, 203x10e3 et 382x10e3 respectivement ce qui illustre la pertinence de l’espèce de choix. Animaux adultes dans la perspective de l’application clinique chez des patients atteints de la maladie de Parkinson et dans le but de s'éloigner d'une plasticité trop importante observée chez l'enfant et le jeune adulte et qui pourrait entrainer la mise en jeu de mécanismes adaptatifs de compensation.