Autres rongeurs

Le rat des sables, rongeur diurne dont la rétine compte 40 % de cônes contre 3 % chez la souris, est retenu pour reproduire une maladie de l'œil humaine. 208 individus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une injection sous la rétine pratiquée sur des nouveau-nés de dix à vingt jours, puis trois électrorétinogrammes, trois tomographies et trois fonds d'œil sous anesthésie. Le porteur indique que l'injection n'engendre "en général" aucune lésion, sans écarter une infection, une inflammation ou une douleur transitoire, et signale un stress aigu lié aux transports entre les deux établissements. Tous sont mis à mort pour analyse moléculaire et cellulaire de leur rétine.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte l’œil, et constitue la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche souvent des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, nommément la macula qui est riche en cônes. Les mécanismes pathogènes ont été largement analysés dans une souche de souris modifiée qui n‘exprime pas le gène responsable. Néanmoins, ces souris ne présentent pas les déficits observés chez les patients. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne appelé Rat des Sables (Psammomys obesus) présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa rétine riche en cônes ressemble fortement à celle de l’homme. L’objectif du projet qui est un projet multisite se déroulant dans deux établissements utilisateurs est de développer un nouveau modèle animal dans lequel le gène responsable sera invalidé spécifiquement dans la rétine. Les conséquences de la mutation induite seront étudiées par des méthodes non-invasives permettant de suivre la dégénérescence lente de la rétine grâce à l’évaluation longitudinale de la fonction de la rétine et à l'obtention d'images de l’œil. Des analyses cellulaires et moléculaires viendront compléter l’étude. Ainsi, ce modèle permettra d’éclaircir les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie de Stargardt. Si le modèle récapitule les caractéristiques principales de la maladie il sera utilisé dans une deuxième phase pour tester une thérapie génique, potentiellement capable de contrecarrer la dégénérescence et maintenir la fonction des photorécepteurs. Une modification a été déposé afin d'inclure une cararctérisation électrorétinographique plus fine, sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

L’utilisation du modèle rongeur Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme chez l’homme, va permettre d’étudier les mécanismes de la maladie de Stargardt et de tester une potentielle thérapie génique. Il est évident que si des effets bénéfiques suite à l’administration de la thérapie géniques ont constatés, cela ouvre des perspectives importantes pour les patients atteints de la maladie de Stargardt, qui est actuellement sans traitement.

Procédures

Les procédures décrites dans ce projet comprennent une injection sous-rétinienne (EU1/2) réalisée sur animal anesthésié ainsi que des analyses structurales et fonctionnelles de la vision réalisées avec des méthodes non invasives, également sur animal anesthésié. Il s'agit de l'électrorétinogramme (EU1/2), de la tomographie par cohérence optique (EU2/2) et du fond d'oeil (EU2/2). Ces 3 analyses seront réalisées chacune à 3 reprises.

Impact sur les animaux

L’injection sous-rétinienne chez les nouveaux nés de Psammomys obesus, n’engendre, en général, aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. Toutefois nous ne pouvons exclure l’apparition d’une infection, d’une inflammation ou de dommages à l’œil injecté lors de son développement ou d’une douleur transitoire. L’ERG et l’imagerie sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière mais une inflammation de l’œil n’est pas à exclure suite à l’ERG, même si son occurrence est minimisée à travers l’utilisation de gel ophtalmique. Le transport entre les deux EU pourra induire un stress aigu transitoire chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses ultérieures moléculaires et cellulaires de la rétine.

Remplacement

A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles (ce qui nous concerne ici). Toutefois, la technique de modification du gène responsable de la maladie de Stargardt a été validée par analyse génomique et par nos observations expérimentales précédentes.

Réduction

Pour la majorité des expériences chaque animal est son propre contrôle. A savoir un œil est injecté avec une construction contrôle et l’autre avec une construction qui permet d'obtenir l’inactivation du gène impliqué dans la maladie de Stargardt. Le nombre d'animaux a été évalué au maximum en prenant en compte le risque potentiellement engendré par l’injection, ainsi que la variabilité interindividuelle pour aboutir à des résultats significatifs lors de la comparaison entre l’œil contrôle et l’œil traité. Il s'agit également d'une étude où le même animal est suivi à plusieurs temps après injection (étude longitudinale) ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux utilisés. Dans cet avenant le nombre total d’animaux de la procédure 1 a été réduit car les données obtenues ont permis de déterminer que la dégénérescence débute précocement et que les temps de mise à mort tardifs initialement prévus ne sont pas nécessaires.

Raffinement

Afin de respecter / stimuler les interactions sociales, les animaux sont hébergés avec leur mère et leur fratrie jusqu’au sevrage, puis ensuite par groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe. L’environnement est enrichi (matériel de nidification, bâton à ronger, tunnel) afin de stimuler leur activité motrice. . Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum, qui est adaptée selon l’état physiologique des animaux (mère allaitante, animaux sevrés, adultes). Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux au stade de développement P10-20 sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale, à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’œil. Après l’intervention, l’application d’un gel ophtalmique permet d’éviter un desséchement de la cornée. Lors de l’ERG, de l'OCT et du fond d'œil, les animaux sont placés sous anesthésie, complétée d’une analgésie locale pour l’ERG. L’application de gel ophtalmique permet ici aussi d’éviter tout desséchement de l’oeil. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être : deux fois par jour le jour d’une intervention (injection, FO + OCT, ERG), puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté. En cas d’infection ou de douleur manifeste, les animaux seront mis à mort immédiatement selon une méthode adaptée à l’âge de l’animal. Les deux sites expérimentaux sont distants de moins de 10 km. Les animaux sont transportés entre sites expérimentaux, en présence de la personne habituée à les manipuler, dans des boites de transport pour animaux de laboratoire contenant litière et enrichissements type bâton et frisure, nourriture et eau gélifiée. Lors du précédent projet, les animaux n'ont montré aucun signe de stress à leur arrivée dans chacun des sites.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne Psammomys obesus. Par comparaison avec la souris, la rétine de Psammomys obesus est de plus grande taille et est enrichie en cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) de type cônes (40% versus souris 3%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’injection sous rétinienne et l’étude des cônes, qui sont impliqués dans la maladie de Stargardt. Nous utiliserons des animaux aux stades postnataux P10-20 (jours après la mise bas), car ce stade correspond à la période où la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans), et la protéine ciblée n’est encore que peu exprimée dans les photorécepteurs.

Le rat roussard, un rongeur diurne, vit en cage individuelle dès le sevrage, les mâles de cette espèce étant agressifs entre eux. 64 rats roussards et 64 souris, soit 128 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comparer l'effet de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme d'une espèce diurne et d'une espèce nocturne. Chacun subit une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie générale pour l'implantation d'un capteur de télémétrie, puis jusqu'à quatre semaines en cage individuelle, ce que le porteur décrit comme un "stress d'isolement social". Tous sont tués pour des analyses post-mortem, après un prélèvement de sang terminal que le porteur situe "après arrêt respiratoire de l'animal".

Objectifs

La lumière joue un rôle majeur sur la physiologie et la santé. Ce projet de recherche vise à étudier les effets de la lumière ambiante sur la prise alimentaire et le métabolisme au cours des 24 h. Les expériences seront menées en parallèle chez un modèle animal nocturne, la souris et chez un modèle animal diurne, le rat roussard. Dans ce projet de recherche, nous proposons de tester l’hypothèse selon laquelle l'exposition à la lumière optimise les comportements de prise alimentaire chez les espèces diurnes et nocturnes, par deux processus temporellement cohérents qui sont 1) les effets dépendants des horloges circadiennes et 2) les effets directs de la lumière sur le comportement. Nous proposons que les effets directs de la lumière favorisent la prise alimentaire de jour chez les espèces diurnes et inhibent la prise alimentaire de nuit chez les animaux nocturnes.

Bénéfices attendus

L’identification des effets directs de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme pourrait permettre de participer à la prévention et le traitement des troubles liés à la prise de nourriture et des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, par des approches de photothérapie ciblée et par des recommandations sur des horaires d’exposition à la lumière qui seraient à éviter.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 1h30 réalisée sous anesthésie générale et à un prélèvement sanguin terminal réalisé également sous anesthésie générale et après arrêt respiratoire de l'animal. Pour toutes les procédures les animaux devront être placés en cage inviduelle pour une durée maximal de 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement social d'une durée maximale de 4 semaines. La chirurgie d'implantation du capteur de télémétrie pourrait induire de l'inflammation, une perte de poids transitoire, une infection au site des sutures.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour analyse post-mortem.

Remplacement

La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme et la détection de la lumière impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, rétine, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles) et des relais nerveux et hormonaux, l’investigation des interactions entre horloges circadiennes et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro ou de modéliser in silico la réponse de ce circuit multi-organes.

Réduction

Pour les tests in vivo circadiens et métaboliques, le nombre d’animaux proposé (n=12 par condition) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales recueillies dans des études antérieures. Pour l'étude des réponses hormonales et neuronales à la lumière (post-mortem), le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire et par condition lumineuse) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures . Notre suivi systématiquement longitudinal des animaux réduit significativement le nombre d’individus utilisés.

Raffinement

Les souris issues d'un fournisseur agréé seront soumies à deux semaines d'acclimatation aux nouvelles conditions d'animalerie avant le début des procédures. Le rongeur diurne est quant à lui hébergé dès le sevrage en cage individuel car les mâles de cette espèce sont très territoriaux et donc agressifs entre eux. Les souris seront ensuite placées en cages individuelles pour la durée des procédures ce qui genèrera un stress d'isolement social que nous limiterons par ajout de frisure en plus de l'enrichissement classique des cages à savoir bâton à ronger et coton pour faire un nid. La frisure permettra de soutenir la thermorégulation de la souris individualisée notamment tout en apportant un enrihcissement supplémentaire pour la construction du nid. La procédure invasive de chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie adaptée et la température corporelle des animaux est maintenues grâce à un tapis thermostaté relié à une sonde rectale durant toute la procédure. Dès l'anestéhsie et ensuite jusqu'au réveil les animaux sont maintenus sous lampe chauffante. L'état de santé des animaux est évalué une fois par semaine avant la procédure de chirurgie puis au minimum quotidiennement à l'aide d'une grille de score adapatée après. Des points limites spécifiques ont été établis pour limiter la souffrance animal en arrêtant la procédure dès que nécessaire. En post-chirurgie pour aider la récupération de l'animal de la nourriture gélifiée sera ajoutée au fond de la cage pour faciliter la prise de nourriture et hydrique.

Choix des espèces

Pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, notre projet repose sur l’analyse comparative des réponses comportementales, physiologiques et neuronales entre un modèle animal nocturne et un modèle animal diurne. La souris est une espèce nocturne devenue un modèle classique en nutrition et en chronobiologie. C’est aussi un modèle incontournable en recherche animale par l’existence de nombreuses lignées transgéniques (y compris celles porteuses de mutations, celles avec gènes invalidés, ou avec gènes-rapporteurs). Une fois ce projet achevé, nous envisageons de rechercher les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris transgéniques exposées aux mêmes procédures expérimentales. Le modèle rongeurs diurnes sont des modèles expérimentaux appropriés pour la recherche biomédicale. Leur utilisation dans le projet présent est pertinente pour comprendre les différences de réponses entre espèces nocturnes et diurnes. C’est pourquoi les mêmes expériences seront faites en parallèle chez un rat diurne, et la souris nocturne. Jeunes adultes (2-4 mois) pour étudier un système circadien et un métabolisme matures et non-sénescents.

Frottis vaginaux quotidiens, micro-incisions de la queue pour quatre prises de sang étalées sur huit heures, cathétérisation artérielle permanente, pose d'un capteur de glycémie sous la peau, ablation des ovaires avec implant hormonal : 328 Arvicanthis ansorgei, un rongeur diurne, subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées pour analyse des gènes, des hormones et des organes. Le porteur retient cette espèce parce que son système circadien ressemble à celui des humains, contrairement aux rats et aux souris nocturnes, et n'utilise que des femelles. Il annonce une perte de poids possible de 15 %, une inflammation des plaies, un risque d'hémorragie lié à la cathétérisation et un hébergement individuel pendant toute l'expérimentation pour une partie des animaux. Le régime de lumière nocturne qui donne son objet au projet n'est décrit nulle part, et l'effectif de 328 animaux repose sur des moyennes d'études antérieures sans calcul exposé.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à déterminer les mécanismes biologiques, à ce jour très mal connus, impliqués dans les effets néfastes de la pollution lumineuse et de la désynchronisation circadienne (= désynchronisation des rythmes biologiques proche de 24 heures). Les résultats permettront de répondre aux enjeux de santé publique visant à améliorer la santé du personnel exposé aux conditions de travail posté et des populations exposées à la lumière nocturne (professionnels navigants sur plusieurs fuseaux-horaires, travaillant très tôt ou très tard, enfants et adolescents s’exposant à la lumière d’écrans la nuit). Les mécanismes impliqués dans les effets sanitaires néfastes de la pollution lumineuse et des horaires décalés sont difficiles à établir chez les sujets humains, et nécessitent l'utilisation d’un modèle animal proche de l’homme. Les modèles classiques (rats, souris) ont un phénotype nocturne (vivent la nuit) qui est inadapté aux applications biomédicales. Nombre de leurs rythmes journaliers (cycles veille-sommeil, prise alimentaire-jeune) sont inversés par rapport à l’Homme (phénotype diurne, de jour). La majorité des études expérimentales sont réalisées chez des individus mâles, ignorant l’effet sexe de ces analyses. Les études ne distinguent pas l’impact direct de la pollution lumineuse nocturne de l’effet indirect de la désynchronisation circadienne sur la physiologie. Nous proposons une approche originale pour mieux comprendre les effets de la pollution lumineuse et des décalages horaires sur le métabolisme et la fertilité féminine. L’objectif de ce projet est de fournir de nouvelles connaissances pour mieux comprendre les effets délétères de la pollution lumineuse sur l'homéostasie métabolique et la fertilité. Le choix d’un modèle diurne, le rongeur Arvicanthis Ansorgei, permettra la production de résultats rapidement exploitables dans le domaine de la santé humaine. La majorité des études dans cette thématique étant menées chez les individus masculins, notre choix de sujets féminins permettra d’évaluer les points critiques et, de gérer les risques sanitaires de la pollution lumineuse sur l'ensemble de la population générale. La réalisation de ce projet aidera à développer des approches préventives. Le projet initial nécessite l'ajout de 16 animaux pour modification de la voie de cathétérisation.

Bénéfices attendus

Ce projet va aider à mieux comprendre les mécanismes néfastes de la pollution lumineuse nocturne sur la santé métabolique et la fertilité. Les résultats obtenus chez un modèle animal diurne ( = vivant de jour) féminin permettront de mieux appréhender les risques sanitaires de la pollution lumineuse pour le personnel exposé aux conditions de travail en horaires décalés ainsi que pour toutes les autres catégories populationnelles exposées à de la lumière nocturne (par exemple, personnel navigant sur plusieurs fuseaux-horaires, personnes de toutes classes d’âge s’exposant à la lumière d’écrans pendant la nuit). La réalisation de ce projet conduira ensuite à développer des approches préventives sous forme de mesures interventionnelles ou de recommandations de bonnes pratiques et de gestion des risques professionnels.

Procédures

Pour analyser l'effet de la pollution lumineuse sur le métabolisme: un groupe de 108 animaux vigiles seront soumis à une injection d’une solution sucrée puis à 5 microprélèvements sanguins sur une période de 3H. Ce test sera effectué avant le début de l'expérience, puis à la fin de chaque mois, l’expérimentation durant entre 1 et 3 mois selon les résultats obtenus.16 animaux maximum seront soumis à une chirurgie permettant la pause d’un capteur donnant la glycémie 24/24h (durée 2H). Cette opération s’effectuera sous anesthésie générale. 16 animaux seront soumis à une cathétérisation permanente (durée de la chirurgie 1H) pour réaliser des prélèvements sanguins séquentiels un ou plusieurs jours. Cette chirurgie s’effectuera sous anesthésie générale. Pour analyser le cylce sexuel, 108 autres individus seront soumis à des frottis vaginaux quotidiens (décrit précédemment) et des micro-prélèvements sanguins réguliers (jour déterminé par frottis). Les micro-volumes de sang seront prélevés à 4 reprises sur une durée totale de 8h par une micro-incision de la queue. Un groupe de 48 animaux sera soumis à une ablation des ovaires et à la pose d'un implant sous cutané d'hormone sous anesthésie générale. Ces animaux seront soumis à un unique frottis vaginal. Les frottis seront réalisés sur animaux vigiles maintenus à l’aide d’un tissu englobant le corps (pour réduire le stress) pendant une durée d’environ une minute.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale est jugée douloureuse (douleur modérée) et inflammatoire. Les procédures chirurgicales peuvent entraîner une perte de poids de 15%, une inflammation des plaies et l'hémorragie comme complication de la canulation cathétérisation artérielle ne peut être totalement exclue. Bien que les rongeurs soient des espèces « dit » social, il faudra garder certains individus en cage individuelle après intervention chirurgicale pour éviter que ses congénères ouvrent la plaie et empêchent la cicatrisation. De plus, certaines analyses s’effectueront dans des cages particulières n’étant pas prévu pour l’analyse de 2 individus simultanément. Une partie des animaux sera donc placés en cages individuelles pendant toute l’expérimentation. La contention douce nécessaire aux injections peut entrainer un stress léger de courte durée.

Devenir

L’euthanasie des animaux est nécessaire puisqu'elle permettra d’étudier les gènes, hormones et organes afin de comprendre le mécansime biologique d’action de la lumière sur le métabolisme et la reproduction.

Remplacement

En termes de remplacement, la régulation du métabolisme et des cycles reproducteurs impliquant plusieurs organes (notamment, cerveau, foie, pancréas, muscles, hypophyse, ovaires), l’investigation des interactions nécessite l’utilisation d’organismes entiers, et non pas d’organes ou de cellules isolées.

Réduction

En termes de Réduction, le nombre d’animaux propose est basé sur un nombre minimal qui prend en compte les moyennes des données comportementales recueillies dans des études précédentes. Ici nous privilégions l’utilisation des mêmes animaux pour les expérimentations calorimétrie, tolérance au glucose, actimétrie.

Raffinement

En termes de Raffinement, les cages seront systématiquement enrichies d’un morceau de bois à ronger. L’ajout de matériel de nidification n’est pas utile chez les Arvicanthis en stabulation car ni les mâles, ni les femelles hors reproduction ne construisent de nid avec ce matériau. Par ailleurs, bien que ce projet nécessite des procédures invasives, le maximum sera fait pour réduire la douleur et le stress des animaux tout au long de l’expérience (environnement enrichi, anesthésie et analgésie profondes, suivi du score de douleur). De plus, l’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement. Des points limites prédictifs ont été établis permettant d’interrompre les procédures et soustraire ainsi l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le rongeur diurne Arvicanthis ansorgei a été choisi car son système circadien fonctionne d’une manière similaire à celui des Hommes, contrairement aux rongeurs classiques de laboratoire (rats et souris qui ont une activité nocturne). Le modèle Arvicanthis présente donc des atouts novateurs indéniables pour les applications biomédicales visant à étudier les effets de la pollution lumineuse sur la santé humaine. Nous avons choisi d’étudier l’effet de la pollution lumineuse sur un modèle de rongeur de sexe féminin pour trois raisons majeures : 1) le genre féminin est rarement étudié dans les investigations scientifiques à ce jour, 2) il existe des différences spécifiques liées a la reproduction féminine qui implique les rythmes biologique de 24 h dans la création des cycles reproducteurs ; 3) un nombre croissant de femmes travaille en horaires décalés alors que leurs systèmes reproducteur et métabolique sont particulièrement sensibles à la pollution lumineuse. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier des fonctions matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier les fonctions physiologiques matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature et non-sénescentes.

Tués pour prélèvement de tissus, sans autre précision donnée, 286 Arvicanthis ansorgei vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces rongeurs diurnes sont hébergés individuellement, soumis à un protocole de stress chronique destiné à provoquer chez eux un état dépressif, puis évalués par sept tests comportementaux en trois semaines, niveau d'activité, intérêt pour l'eau sucrée, construction du nid, réaction à la nouveauté. Ils reçoivent en parallèle vingt et une injections quotidiennes d'antidépresseur, pour vérifier si le traitement atténue les comportements induits. Le porteur affirme que le stress chronique et la réponse aux antidépresseurs ne peuvent pas être reproduits de façon fiable in vitro ou par informatique, et présente le rythme diurne de l'espèce comme un gain de transposabilité réduisant la "nécessité d'expérimentations supplémentaires".

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre et à évaluer les signes de dépression et d’anxiété chez un modèle animal qui vit le jour, un rongeur nommé Arvicanthis ansorgei. Contrairement aux modèles habituels de souris ou de rats, qui sont actifs la nuit, ce rongeur est actif le jour, comme les humains, ce qui pourrait rendre ses réactions plus comparables aux nôtres. Pour cela, nous utilisons un protocole de stress léger et prolongé pour induire des comportements ressemblant à la dépression, puis nous administrons un antidépresseur afin d’observer s’il peut atténuer ces comportements. Cela nous permet de vérifier si notre approche pour évaluer les signes de dépression est fiable et de valider l’utilisation du modèle diurne mais également des tests comportementaux sur ce modèle, dans la recherche sur la santé mentale et les comportements anxieux-depressifs.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait améliorer notre capacité à étudier les troubles de l’humeur, comme la dépression, en utilisant un modèle animal actif le jour, ce qui ressemble davantage au rythme de vie humain. En validant ce modèle, nous pourrions mieux comprendre comment les comportements dépressifs se développent et comment les traitements agissent pour les réduire. À terme, cela pourrait aider à concevoir des méthodes de recherche plus précises et mieux adaptées pour tester de nouveaux traitements contre la dépression, contribuant ainsi à des avancées potentielles dans la santé mentale.

Procédures

Les animaux seront exposés à plusieurs sources de stress légers et variés, comme des modifications de leur environnement, dans le cadre d’un protocole visant à induire progressivement un état de stress chronique, avec pour objectif d'étudier des comportements liés à l’anxiété et à la dépression. Afin d’évaluer leurs réponses, ils passeront des tests visant à observer leur niveau d’activité, leur intérêt pour des récompenses et leur réactivité face à des situations nouvelles. Ces tests permettent d’analyser des comportements comparables à ceux observés dans les états dépressifs ou anxieux. 7 tests seront réalisés sur une période de 3 semaines, avec 2 jours d'intervalle entre chaque test. Les tests durent entre 10min et plusieurs jours pour certains (évaluation d'un score de construction du nid, ou de consommation d'eau sucrée toutes les 24h). De plus, les animaux recevront des injections quotidiennes d’un traitement antidépresseur pendant 3 semaines (soit 21 injections), afin de mesurer les effets potentiels du traitement sur leur comportement. Cette injection a une durée d'environ 2min maximum par animal. Ces interventions seront réalisées sur une période de plusieurs semaines, avec des tests courts et espacés pour limiter le stress supplémentaire

Impact sur les animaux

Les interventions prévues peuvent entraîner des effets de stress modéré chez les animaux, tels que des changements temporaires dans leur niveau d’activité ou dans leurs comportements d’exploration et d’interaction avec leur environnement. Le protocole de stress chronique, bien que conçu pour être léger, peut induire des signes de comportement dépressif ou anxieux. Les injections quotidiennes peuvent aussi entraîner un léger inconfort momentané au point d’injection.

Devenir

mise à mort pour prélèvement de tissus

Remplacement

Les comportements complexes liés aux états d’anxiété et de dépression, ainsi que la réponse physiologique aux antidépresseurs, ne peuvent pas être reproduits de manière fiable avec des modèles in vitro ou informatiques. L'utilisation d'un modèle animal est donc nécessaire pour obtenir des informations précises et pertinentes sur les interactions entre le stress chronique, les comportements associés aux troubles de l’humeur, et les effets des traitements. Nous utilisons comme modèle animal le rongeur Arvicanthis ansorgei, pour son cycle d’activité diurne, qui est plus proche de celui des humains par rapport aux modèles nocturnes plus couramment utilisés. Cette similitude rend les résultats plus transposables aux études sur l’humain, réduisant ainsi la nécessité d’expérimentations supplémentaires.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé pour garantir des résultats fiables tout en respectant les règles en vigueur pour limiter leur utilisation. Certains animaux ne stabilisent pas leur consommation de sucre ou sont résistants à la dépression, donc nous en incluons un peu plus au départ pour former des groupes adaptés. Cela tient compte de notre expérience, des techniques utilisées et des études existantes.

Raffinement

Tout sera mis en œuvre pour limiter la souffrance et l’inconfort des animaux tout au long de l’étude. Les animaux seront hébergés individuellement mais pourront maintenir un contact visuel et olfactif avec leurs congénères grâce à leur placement dans la même pièce. Un enrichissement (nid, tunnel, bâton à ronger) est également prévu pourtous les animaux en procédure. Un suivi hebdomadaire rigoureux, incluant l’évaluation de l’état général et la pesée, permettra d’assurer leur bien-être. Des points limites ont été établis pour soustraire immédiatement un animal à la souffrance.

Choix des espèces

Dans notre étude, nous avons choisi d'utiliser le rongeur Arvicanthis ansorgei car il c'est un rongeur diurne plus proche du rythme de vie humain que les modèles nocturnes habituels, ce qui permet d'obtenir des résultats plus pertinents et transposables à la condition humaine. Concernant les stades de développement, nous nous concentrons sur des animaux adultes (3mois), car c'est à ce moment que les comportements liés à l'anxiété et à la dépression sont plus stables et plus susceptibles d'être influencés par des stress chroniques. En exposant ces animaux adultes à des stress légers de manière contrôlée, nous pouvons observer comment ces expériences affectent leur comportement et leur réponse aux traitements, tels que les antidépresseurs.

Des injections dans l'œil détruisent les cellules à mélanopsine de la rétine, une chirurgie cérébrale de trente à quarante-cinq minutes vient ensuite moduler une structure du cerveau. 546 Arvicanthis ansorgei, un rongeur diurne, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever rétine et cerveau. Dès l'âge de vingt jours et jusqu'à la fin des procédures, chaque animal est isolé dans une cage individuelle pour mesurer son activité locomotrice, puis placé quinze à vingt jours en obscurité constante, afin d'évaluer les effets d'une exposition à la lumière bleue nocturne pendant l'adolescence. Le porteur annonce sept tests comportementaux "validés" sans préciser lesquels, et qualifie l'obscurité constante de procédure standard n'induisant "aucune nuisance".

Objectifs

Le cycle lumière/obscurité de 24 h synchronise l'horloge biologique du cerveau. La lumière a des effets positifs et négatifs selon ses caractéristiques (moment, durée, intensité, spectre, etc.). La littérature montre qu'une exposition aberrante à la lumière, notamment bleue la nuit, altère les rythmes, la cognition et induit des états dépressifs chez l'animal et l'Homme. Les cellules à mélanopsine de la rétine jouent un rôle clé dans la médiation de ces effets. La lumière pénètre dans l'organisme par la rétine, captée par par des cellules particulières, sensibles à la lumière bleue, convertissant le signal lumineux en un signal biochimique transmis aux structures cérébrales régulant les rythmes biologiques, l'humeur et la cognition. Les adolescents, plus sensibles à la lumière, présentent un risque particulier d'exposition nocturne à la lumière bleue, car les troubles mentaux surviennent souvent avant 25 ans. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l'adolescence contribue au développement de troubles circadiens (par exemple un décalage du cycle veille sommeil ou un retard chronique à l'endormissement), affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Cette étude sera réalisée sur le modèle diurne Arvicanthis ansorgei, plus pertinent que les rongeurs nocturnes comme les rats ou souris. Les objectifs sont : 1) Étudier l'impact de la lumière bleue nocturne sur le système circadien, l'humeur et la cognition via des tests comportementaux validés. 2) Analyser les conséquences sur la rétine, son fonctionnement et ses projections cérébrales. 3) Caractériser les effets dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine régulant ces systèmes. Cette analyse, de la cellule au comportement, aura des résultats déterminants pour la recherche fondamentale et clinique. Avenant : Nos résultats montrent que les animaux exposés à la lumière nocturne ont un retard de rythme biologique, indiquant une perturbation de leur horloge interne. Une procédure étudiera le rôle de la sérotonine dans cette perturbation. Une autre teste si cet impact affecte leur capacité à se réajuster après un changement d'heure. Enfin, une troisième examine si la lumière bleue nocturne les rend plus sensibles au stress.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l’adolescence sur le développement des troubles circadiens, affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Les données obtenues permettront d’élaborer de nouvelles stratégies pour limiter les effets délétères d’une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents.

Procédures

Pour définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte 4 interventions. La première, l'électrorétinographie (ERG), évalue la fonction visuelle. Le test est similaire à celui chez l'homme, mais l'animal est endormi pendant l'enregistrement. Chaque test dure 45-60 min, avec deux passages : un avant et un après l'exposition à la lumière pour évaluer son impact. Ensuite, les animaux passeront 7 tests comportementaux validés pour étudier l'impact de la lumière sur leur système circadien, l'humeur et la cognition. La durée d'un test varie, mais chaque animal est testé environ 5 min. Pour étudier le rôle des cellules à mélanopsine rétiniennes, les animaux recevront des injections oculaires : une avec un "traceur" pour marquer les projections rétiniennes vers le cerveau, et une seconde avec des molécules pour cibler spécifiquement les cellules à mélanopsine et les détruire. Ces injections se font sous anesthésie et analgésie. Enfin, pour vérifier l'implication d'une structure cérébrale régulant l'humeur et la cognition, une chirurgie sera réalisée sous anesthésie. Des molécules pharmacologiques seront injectées pour moduler l'activité de cette structure. La procédure dure entre 30 et 45 min. Après récupération, un activateur de ces molécules sera injecté dans la cavité abdominale pour inhiber certains neurones. Avenant : suite aux premiers résultats, les animaux recevront une injection (moins d'une minute par animal) sur animal vigile pour bloquer un messager chimique spécifique. Ils subiront ensuite des changements de cycle lumineux. D’autres animaux seront soumis à des cycles lumineux simulant des décalages horaires ou à du stress par immobilisation (quotidiennement, pendant 2h maximum, et sur 3 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances: 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien, visuel, de l’humeur et de la cognition (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs. 3) Afin d’évaluer les paramètres de leur horloge biologique, les animaux seront placés pendant 15-20 jours à l’obscurité constante. Le placement de l’animal en obscurité constante est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien, ce qui n‘induira aucune nuisance. 4) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur et la cognition, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 5) Les animaux seront soumis à différents types d'injections, toutes réalisées sous anesthésie. 6) Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…). 7) Les animaux seront soumis à une exposition à des cycles lumineux perturbants, et à une immonilisation pouvant provoquer du stress, des perturbations physiologiques, un incofort temporaire et une altération du comportement. avenant : l’administration de molécule dans l'abdomen peut causer une légère douleur et un inconfort temporaire à l’endroit de l’injection. Le décalage horaire simulé (jet lag) peut créer du stress, perturber leur activité et nuire à leur sommeil. Ces effets peuvent durer entre 10 et 15 jours, selon la rapidité avec laquelle l’animal se réajuste. Enfin, l’immobilisation peut provoquer une douleur, du stress, des comportements inhabituels, comme des bruits ou de l’agitation, une réduction de l’activité, une perte de poids ou un manque d'appétit. Ces effets varient en fonction de l'animal et de la durée et de l'intensité de l'immobilisation.

Devenir

Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière durant l’adolescence sur le système circadien, visuel, la cognition et l’humeur. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) et longitudinales (ERG) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification et baton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le choix de notre modèle animal s'est porté sur l'espèce de rongeur Arvicanthis ansorgei. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères d'une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents (P20), afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'homme. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (P20) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur le système circadien, l’humeur et la cognition au stade adulte (P40).

208 rats des sables, un rongeur diurne dont la rétine ressemble à celle de l'humain, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour analyse de la rétine. L'injection se fait sous la rétine d'animaux âgés de dix à vingt jours, encore avec leur mère, pour inactiver dans un œil le gène responsable de la maladie de Stargardt, l'autre œil servant de témoin. Chaque animal subit ensuite trois électrorétinogrammes, trois tomographies et trois examens du fond de l'œil, tous sous anesthésie, ainsi qu'un transport entre deux établissements. Le porteur qualifie ces examens de non invasifs et affirme que l'injection sous-rétinienne chez le nouveau-né n'engendre "en général, aucune lésion", tout en indiquant qu'une inflammation de l'œil n'est pas à exclure et que les animaux montrant une douleur manifeste sont tués immédiatement.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte l’œil, et constitue la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche souvent des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, nommément la macula qui est riche en cônes. Les mécanismes pathogènes ont été largement analysés dans une souche de souris modifiée qui n‘exprime pas le gène responsable. Néanmoins, ces souris ne présentent pas les déficits observés chez les patients. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne appelé Rat des Sables (Psammomys obesus) présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa rétine riche en cônes ressemble fortement à celle de l’homme. L’objectif du projet qui est un projet multisite qui se déroule dans deux établissements utilisateurs est de développer un nouveau modèle animal dans lequel le gène responsable sera invalidé spécifiquement dans la rétine. Les conséquences de la mutation induite seront étudiées par des méthodes non-invasives permettant de suivre la dégénérescence lente de la rétine grâce à l’évaluation longitudinale de la fonction de la rétine et à l'obtention d'images de l’œil. Des analyses cellulaires et moléculaires viendront compléter l’étude. Ainsi, ce modèle permettra d’éclaircir les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie de Stargardt. Si le modèle récapitule les caractéristiques principales de la maladie il sera utilisé dans une deuxième phase pour tester une thérapie génique, potentiellement capable de contrecarrer la dégénérescence et maintenir la fonction des photorécepteurs.

Bénéfices attendus

L’utilisation du modèle rongeur Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme chez l’homme, va permettre d’étudier les mécanismes de la maladie de Stargardt et de tester une potentielle thérapie génique. Il est évident que si des effets bénéfiques suite à l’administration de la thérapie géniques ont constatés, cela ouvre des perspectives importantes pour les patients atteints de la maladie de Stargardt, qui est actuellement sans traitement.

Procédures

Les procédures décrites dans ce projet comprennent une injection sous-rétinienne (EU1/2) réalisée sur animal anesthésié ainsi que des analyses structurales et fonctionnelles de la vision réalisées avec des méthodes non invasives, également sur animal anesthésié. Il s'agit de l'électrorétinogramme (EU1/2), de la tomographie par cohérence optique (EU2/2) et du fond d'oeil (EU2/2). Ces 3 analyses seront réalisées chacune à 3 reprises.

Impact sur les animaux

L’injection sous-rétinienne chez les nouveaux nés de Psammomys obesus, n’engendre, en général, aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. L’ERG et l’imagerie sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière mais une inflammation de l’oeil n’est pas à exclure suite à l’ERG, même si son occurrence est minimisée à travers l’utilisation de gel ophtalmique. Le transport entre les deux EU pourra induire un stress aigu transitoire chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses ultérieures moléculaires et cellulaires de la rétine.

Remplacement

A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles (ce qui nous concerne ici). Toutefois, la technique de modification du gène responsable de la maladie de Stargardt a été validée par analyse génomique et par nos observations expérimentales précédentes.

Réduction

Pour la majorité des expériences chaque animal est son propre contrôle. A savoir un œil est injecté avec une construction contrôle et l’autre avec une construction qui permet d'obtenir l’inactivation du gène impliqué dans la maladie de Stargardt. Le nombre d'animaux a été évalué au maximum en prenant en compte le risque potentiellement engendré par l’injection, ainsi que la variabilité interindividuelle pour aboutir à des résultats significatifs lors de la comparaison entre l’œil contrôle et l’œil traité. Il s'agit également d'une étude où le même animal est suivi à plusieurs temps après injection (étude longitudinale) ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux utilisés. Dans cet avenant le nombre total d’animaux de la procédure 1 a été réduit car les données obtenues ont permis de déterminer que la dégénérescence débute précocement et que les temps de mise à mort tardifs initialement prévus ne sont pas nécessaires.

Raffinement

Les animaux au stade de développement P10-20 sont hébergés avec leur mère et leur fratrie, afin de respecter les interactions sociales et dans un environnement enrichi (matériel de nidification et bâton à ronger), afin de stimuler leur activité motrice. Après le sevrage les animaux sont hébergés en groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe, afin de respecter les interactions sociales et dans un environnement enrichi (bâton à ronger, tunnel), afin de stimuler leur activité motrice. Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum, qui est adaptée selon l’état physiologique des animaux (mère allaitante, animaux sevrés, adultes). Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux au stade de développement P10-20 sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale, à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’œil. Après l’intervention, l’application d’un gel ophtalmique permet d’éviter un desséchement de la cornée. Lors de l’ERG, de l'OCT et du fond d'œil, les animaux sont placés sous anesthésie, complétée d’une analgésie locale pour l’ERG. L’application de gel ophtalmique permet ici aussi d’éviter tout desséchement de l’oeil. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être : deux fois par jour le jour d’une intervention (injection, FO + OCT, ERG), puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté. En cas d’infection ou de douleur manifeste, les animaux seront mis à mort immédiatement selon une méthode adaptée à l’âge de l’animal. Les deux sites expérimentaux sont distants de moins de 10 km. Les animaux sont transportés entre sites expérimentaux, en présence de la personne habituée à les manipuler, dans des boites de transport pour animaux de laboratoire contenant litière et enrichissements type bâton et frisure, nourriture et eau gélifiée. Lors du précédent projet, les animaux n'ont montré aucun signe de stress à leur arrivée dans chacun des sites.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne Psammomys obesus. Par comparaison avec la souris, la rétine de Psammomys obesus est de plus grande taille et est enrichie en cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) de type cônes (40% versus souris 3%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’injection sous rétinienne et l’étude des cônes, qui sont impliqués dans la maladie de Stargardt. Nous utiliserons des animaux aux stades postnataux P10-20 (jours après la mise bas), car ce stade correspond à la période où la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans), et la protéine ciblée n’est encore que peu exprimée dans les photorécepteurs.

208 rats des sables, des rongeurs diurnes de l'espèce Psammomys obesus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous seront tués pour des analyses de leur rétine. Sous anesthésie générale et locale, ces jeunes rats âgés de 10 à 20 jours reçoivent une injection sous la rétine destinée à inactiver, dans un œil, le gène en cause dans la maladie de Stargardt, puis ils sont transportés entre deux établissements pour des examens de la vision. Électrorétinogramme, tomographie et fond d'œil se font tous sous anesthésie, pour obtenir leur immobilité, alors que chez l'humain le premier se pratique sous anesthésie locale et les deux autres sans anesthésie, selon le porteur. "Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l'injection sous rétinienne et l'étude des cônes", conclut-il, en invoquant une rétine plus grande que celle de la souris et riche en cônes, 40 % contre 3 %.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte l’œil, et constitue la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche souvent des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, nommément la macula qui est riche en cônes. Les mécanismes pathogènes ont été largement analysés dans une souche de souris modifiée qui n‘exprime pas le gène responsable. Néanmoins, ces souris ne présentent pas les déficits observés chez les patients. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne appelé Rat des Sables (Psammomys obesus) présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa rétine riche en cônes ressemble fortement à celle de l’homme. L’objectif du projet qui est un projet multisite se déroulant dans deux établissements utilisateurs est de développer un nouveau modèle animal dans lequel le gène responsable sera invalidé spécifiquement dans la rétine. Les conséquences de la mutation induite seront étudiées par des méthodes non-invasives permettant de suivre la dégénérescence lente de la rétine grâce à l’évaluation longitudinale de la fonction de la rétine et à l'obtention d'images de l’œil. Des analyses cellulaires et moléculaires viendront compléter l’étude. Ainsi, ce modèle permettra d’éclaircir les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie de Stargardt. Si le modèle récapitule les caractéristiques principales de la maladie il sera utilisé dans une deuxième phase pour tester une thérapie génique, potentiellement capable de contrecarrer la dégénérescence et maintenir la fonction des photorécepteurs.

Bénéfices attendus

L’utilisation du modèle rongeur Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme chez l’homme, va permettre d’étudier les mécanismes de la maladie de Stargardt et de tester une potentielle thérapie génique. Il est évident que si des effets bénéfiques suite à l’administration de la thérapie géniques ont constatés, cela ouvre des perspectives importantes pour les patients atteints de la maladie de Stargardt, qui est actuellement sans traitement.

Procédures

Les procédures décrites dans ce projet comprennent une injection sous-rétinienne (EU1/2) et une analyse fonctionnelle de la vision à l'aide de méthodes non invasives, nommément électrorétinogramme (ERG, EU1/2), tomographie par cohérence optique (OCT, EU2/2) et fond d'œil (EU2/2). L'injection sous-rétinienne s’effectue sous anesthésie gazeuse suivie d’une anesthésie locale et de l’application d’un gel limitant le dessèchement de l’œil. Sa durée est d'environ 10 minutes pour chaque animal. ERG (< 60 minutes), OCT et fond d'œil (< 15 minutes) sont des méthodes non invasives, réalisées sous anesthésie car elles nécessitent l’immobilité de l’animal. Chez l’homme, elles sont réalisées sous anesthésie locale (ERG) ou sans anesthésie (OCT et fond d’œil).

Impact sur les animaux

L’injection sous-rétinienne chez les nouveaux nés de Psammomys obesus, n’engendre, en général, aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. Toutefois nous ne pouvons exclure l’apparition d’une infection, d’une inflammation ou de dommages à l’œil injecté lors de son développement ou d’une douleur transitoire. L’ERG et l’imagerie sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière mais une inflammation de l’œil n’est pas à exclure suite à l’ERG, même si son occurrence est minimisée à travers l’utilisation de gel ophtalmique. Le transport entre les deux EU pourra induire un stress aigu transitoire chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses ultérieures moléculaires et cellulaires de la rétine.

Remplacement

A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles (ce qui nous concerne ici). Toutefois, la technique de modification du gène responsable de la maladie de Stargardt a été validée par analyse génomique et par nos observations expérimentales précédentes.

Réduction

Pour la majorité des expériences chaque animal est son propre contrôle. A savoir un œil est injecté avec une construction contrôle et l’autre avec une construction qui permet d'obtenir l’inactivation du gène impliqué dans la maladie de Stargardt. Le nombre d'animaux a été évalué au maximum en prenant en compte le risque potentiellement engendré par l’injection, ainsi que la variabilité interindividuelle pour aboutir à des résultats significatifs lors de la comparaison entre l’œil contrôle et l’œil traité. Il s'agit également d'une étude où le même animal est suivi à plusieurs temps après injection (étude longitudinale) ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux utilisés. Dans cet avenant le nombre total d’animaux de la procédure 1 a été réduit car les données obtenues ont permis de déterminer que la dégénérescence débute précocement et que les temps de mise à mort tardifs initialement prévus ne sont pas nécessaires.

Raffinement

Afin de respecter / stimuler les interactions sociales, les animaux sont hébergés avec leur mère et leur fratrie jusqu’au sevrage, puis ensuite par groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe. L’environnement est enrichi (matériel de nidification, bâton à ronger, tunnel) afin de stimuler leur activité motrice. . Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum, qui est adaptée selon l’état physiologique des animaux (mère allaitante, animaux sevrés, adultes). Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux au stade de développement P10-20 sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale, à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’œil. Après l’intervention, l’application d’un gel ophtalmique permet d’éviter un desséchement de la cornée. Lors de l’ERG, de l'OCT et du fond d'œil, les animaux sont placés sous anesthésie, complétée d’une analgésie locale pour l’ERG. L’application de gel ophtalmique permet ici aussi d’éviter tout desséchement de l’oeil. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être : deux fois par jour le jour d’une intervention (injection, FO + OCT, ERG), puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté. En cas d’infection ou de douleur manifeste, les animaux seront mis à mort immédiatement selon une méthode adaptée à l’âge de l’animal. Les deux sites expérimentaux sont distants de moins de 10 km. Les animaux sont transportés entre sites expérimentaux, en présence de la personne habituée à les manipuler, dans des boites de transport pour animaux de laboratoire contenant litière et enrichissements type bâton et frisure, nourriture et eau gélifiée. Lors du précédent projet, les animaux n'ont montré aucun signe de stress à leur arrivée dans chacun des sites.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne Psammomys obesus. Par comparaison avec la souris, la rétine de Psammomys obesus est de plus grande taille et est enrichie en cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) de type cônes (40% versus souris 3%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’injection sous rétinienne et l’étude des cônes, qui sont impliqués dans la maladie de Stargardt. Nous utiliserons des animaux aux stades postnataux P10-20 (jours après la mise bas), car ce stade correspond à la période où la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans), et la protéine ciblée n’est encore que peu exprimée dans les photorécepteurs.

208 rats des sables, des rongeurs diurnes de l'espèce Psammomys obesus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous seront tués pour analyser leur rétine. Âgés de 10 à 20 jours et encore avec leur mère, ils reçoivent sous anesthésie une injection d'une dizaine de minutes sous la rétine. Dans la plupart des expériences, un œil reçoit ainsi une construction qui inactive le gène en cause dans la maladie de Stargardt, l'autre une construction témoin. Suivent des électrorétinogrammes de moins d'une heure, des examens d'imagerie et de fond d'œil, tous sous anesthésie, et des transports entre deux établissements. La thérapie génique évoquée ne viendrait qu'ensuite : "Si le modèle récapitule les caractéristiques principales de la maladie il sera utilisé dans une deuxième phase", écrit le porteur.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte l’œil, et constitue la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche souvent des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, nommément la macula qui est riche en cônes. Les mécanismes pathogènes ont été largement analysés dans une souche de souris modifiée qui n‘exprime pas le gène responsable. Néanmoins, ces souris ne présentent pas les déficits observés chez les patients. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne appelé Rat des Sables (Psammomys obesus) présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa rétine riche en cônes ressemble fortement à celle de l’homme. L’objectif du projet qui est un projet multisite qui se déroule dans deux établissements utilisateurs est de développer un nouveau modèle animal dans lequel le gène responsable sera invalidé spécifiquement dans la rétine. Les conséquences de la mutation induite seront étudiées par des méthodes non-invasives permettant de suivre la dégénérescence lente de la rétine grâce à l’évaluation longitudinale de la fonction de la rétine et à l'obtention d'images de l’œil. Des analyses cellulaires et moléculaires viendront compléter l’étude. Ainsi, ce modèle permettra d’éclaircir les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie de Stargardt. Si le modèle récapitule les caractéristiques principales de la maladie il sera utilisé dans une deuxième phase pour tester une thérapie génique, potentiellement capable de contrecarrer la dégénérescence et maintenir la fonction des photorécepteurs.

Bénéfices attendus

L’utilisation du modèle rongeur Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme chez l’homme, va permettre d’étudier les mécanismes de la maladie de Stargardt et de tester une potentielle thérapie génique. Il est évident que si des effets bénéfiques suite à l’administration de la thérapie géniques ont constatés, cela ouvre des perspectives importantes pour les patients atteints de la maladie de Stargardt, qui est actuellement sans traitement.

Procédures

Les procédures décrites dans ce projet comprennent une injection sous-rétinienne (EU1/2) et une analyse fonctionnelle de la vision à l'aide de méthodes non invasives, nommément électrorétinogramme (ERG, EU1/2), tomographie par cohérence optique (OCT, EU2/2) et fond d'œil (EU2/2). L'injection sous-rétinienne s’effectue sous anesthésie gazeuse suivie d’une anesthésie locale et de l’application d’un gel limitant le dessèchement de l’œil. Sa durée est d'environ 10 minutes pour chaque animal. ERG (< 60 minutes), OCT et fond d'œil (< 15 minutes) sont des méthodes non invasives, réalisées sous anesthésie car elles nécessitent l’immobilité de l’animal.

Impact sur les animaux

L’injection sous-rétinienne chez les nouveaux nés de Psammomys obesus, n’engendre, en général, aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. Toutefois nous ne pouvons exclure l’apparition d’une infection, d’une inflammation ou de dommages à l’œil injecté lors de son développement ou d’une douleur transitoire. L’ERG et l’imagerie sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière mais une inflammation de l’œil n’est pas à exclure suite à l’ERG, même si son occurrence est minimisée à travers l’utilisation de gel ophtalmique. Le transport entre les deux EU pourra induire un stress aigu transitoire chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses ultérieures moléculaires et cellulaires de la rétine.

Remplacement

A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles (ce qui nous concerne ici). Toutefois, la technique de modification du gène responsable de la maladie de Stargardt a été validée par analyse génomique et par nos observations expérimentales précédentes.

Réduction

Pour la majorité des expériences chaque animal est son propre contrôle. A savoir un œil est injecté avec une construction contrôle et l’autre avec une construction qui permet d'obtenir l’inactivation du gène impliqué dans la maladie de Stargardt. Le nombre d'animaux a été évalué au maximum en prenant en compte le risque potentiellement engendré par l’injection, ainsi que la variabilité interindividuelle pour aboutir à des résultats significatifs lors de la comparaison entre l’œil contrôle et l’œil traité. Il s'agit également d'une étude où le même animal est suivi à plusieurs temps après injection (étude longitudinale) ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux utilisés. Dans cet avenant le nombre total d’animaux de la procédure 1 a été réduit car les données obtenues ont permis de déterminer que la dégénérescence débute précocement et que les temps de mise à mort tardifs initialement prévus ne sont pas nécessaires.

Raffinement

Les animaux au stade de développement P10-20 sont hébergés avec leur mère et leur fratrie, afin de respecter les interactions sociales et dans un environnement enrichi (matériel de nidification et bâton à ronger), afin de stimuler leur activité motrice. Après le sevrage les animaux sont hébergés en groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe, afin de respecter les interactions sociales et dans un environnement enrichi (bâton à ronger, tunnel), afin de stimuler leur activité motrice. Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum, qui est adaptée selon l’état physiologique des animaux (mère allaitante, animaux sevrés, adultes). Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux au stade de développement P10-20 sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale, à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’œil. Après l’intervention, l’application d’un gel ophtalmique permet d’éviter un desséchement de la cornée. Lors de l’ERG, de l'OCT et du fond d'œil, les animaux sont placés sous anesthésie, complétée d’une analgésie locale pour l’ERG. L’application de gel ophtalmique permet ici aussi d’éviter tout desséchement de l’oeil. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être : deux fois par jour le jour d’une intervention (injection, FO + OCT, ERG), puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté. En cas d’infection ou de douleur manifeste, les animaux seront mis à mort immédiatement selon une méthode adaptée à l’âge de l’animal. Les deux sites expérimentaux sont distants de moins de 10 km. Les animaux sont transportés entre sites expérimentaux, en présence de la personne habituée à les manipuler, dans des boites de transport pour animaux de laboratoire contenant litière et enrichissements type bâton et frisure, nourriture et eau gélifiée. Lors du précédent projet, les animaux n'ont montré aucun signe de stress à leur arrivée dans chacun des sites.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne Psammomys obesus. Par comparaison avec la souris, la rétine de Psammomys obesus est de plus grande taille et est enrichie en cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) de type cônes (40% versus souris 3%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’injection sous rétinienne et l’étude des cônes, qui sont impliqués dans la maladie de Stargardt. Nous utiliserons des animaux aux stades postnataux P10-20 (jours après la mise bas), car ce stade correspond à la période où la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans), et la protéine ciblée n’est encore que peu exprimée dans les photorécepteurs.