Gerbilles de Mongolie
Étude in vivo de la pharmacocinétique de la dexaméthasone administrée localement par un implant d’oreille moyenne dit « Turbo Ear Cube » chez la gerbille de Mongolie.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Pour tester un implant d'oreille moyenne censé délivrer un corticoïde dans l'oreille interne, 75 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque animal est opéré des deux oreilles au cours d'une chirurgie de 45 à 60 minutes sous anesthésie générale, subit trois à huit séances de mesure de l'audition de 20 à 30 minutes chacune, puis un prélèvement de liquide au sommet de la cochlée de 40 à 50 minutes. Le porteur ne retient qu'un seul effet néfaste, la perte auditive liée à l'implantation du dispositif. Il énumère par ailleurs les signes qui déclencheraient un traitement à la buprénorphine, poil hérissé, voussure dorsale, vocalises, perte de poids de plus de 10 %, avant d'écrire que cette situation est "peu probable" au motif d'une chirurgie "peu invasive et peu douloureuse", alors que le projet est classé sévère.
Objectifs
Selon l'OMS, 360 millions de personnes souffrent de déficience auditive handicapante (5 millions en France). Les traitements médicaux destinées a l’oreille interne par voie systémique sont limitées par l’existence de la barriere hémato-cochléaire qui empeche le principe actif d’atteindre sa cible. L’objectif de l’étude est le développement d’outils de délivrance de principes actifs via la fenêtre ronde.
Bénéfices attendus
Nous espérons que le prélèvement de liquide périlymphatique à l’apex cochléaire permettra une analyse précise et fiable de la pharmacocinétique du médicament. Nous nous attendons à mettre en évidence des concentrations plus élevées en dexaméthasone avec l’implant d’oreille moyenne, sans gradient de concentration baso apical et avec une concordance de gradient histo-biochimique. Nous espérons mettre en évidence une durée prolongée de délivrance de la dexaméthasone dans le groupe « long terme ».
Procédures
- Potentiels évoqués auditifs (PEA) réalisés sous anesthésie générale pour une durée totale de 20 à 30 minutes maximum. Toutes les gerbilles avant la chirurgie puis à 1 semaine et 1 mois post opératoire et à 2 mois, 3 mois, 4 mois, 5 mois et 6 mois pour le groupe "long terme". Cela correspond à 3 interventions dans le groupe "court terme" et 8 interventions dans le groupe "long terme". - Chirurgie d'implantation du dispositif d'oreille moyenne sous anesthésie générale pour une durée totale de 45 à 60 minutes selon la courbe d'apprentissage : toutes les gerbilles avec le dispositif chargé en dexaméthasone dans une oreille, la moitié des gerbilles bénéficiera du dispositif non chargé en dexaméthasone dans l'oreille controlatérale et l'autre moitié bénéficiera d'une injection transtympanique de dexaméthasone dans l'oreille controlatérale. Ainsi, chaque gerbille bénéficiera d'une seule intervention au cours de laquelle les 2 oreilles seront opérées. - Prélévement péri lymphatique à l'apex cochléaire sous anesthésie générale de chaque oreille soit une durée totale de 40 à 50 minutes : à 1 mois pour le groupe "court terme" et à 6 mois pour le groupe "long terme". Chaque gerbille bénéficiera d'une seule intervention au cours de laquelle le prélèvement sera réalisé sur les 2 oreilles.
Impact sur les animaux
Perte auditive lié à l'implantation du dispositif d'oreille moyenne.
Devenir
L'ensemble des 75 animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de réaliser le prélévement puis l'analyse en immunofluorescence et en histologie des cochlées.
Remplacement
Il s'agit d'une étude de délivrance d'un produit au sein de l'oreille interne, il n'existe pas d'alternative non animale pour la réalisation de ce type d'étude. Seul un modèle animale vivant peut nous permettre d'étudier la pharmacocinétique du dispositif au sein de l'oreille interne.
Réduction
Un nombre d'animaux suffisant (30 par groupe) a été choisi pour pouvoir réaliser des tests statistiques paramétriques, qui sont plus robustes (Tests t de Student et ANOVA). Les deux oreilles de chaque animale sera utilisé : l'une bénéficiera du principe actif l'autre bénéficiera de la technique de référence ou sera utilisé comme controle négatif.
Raffinement
En cas de signe(s) de souffrance (hyperactivité ou isolement, indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire, fuite ou défense à la manipulation, poil hérissé par absence de toilettage, voussure dorsale, vocalises, perte de poids supérieure à 10 %) un traitement analgésique sera mise en place précocément par injection intrapéritonéale de Buprénorphine (Vétergésic® ou Buprécare®) à raison de 0,03 mg/kg toutes les 6 à 8 heures. Cette situation est peu probable car il s'agit d'une chirurgie peu invasive et peu douloureuse.
Choix des espèces
La gerbille de Mongolie est un excellent modèle animal en audiologie et otologie pour 4 raisons : - spectre auditif étendu aux basses fréquences, ce qui en fait le rongeur (avec le Chinchilla) qui présente le spectre auditif le plus proche de l'Homme, - bulle auditive (zone qui contient les oreille moyennes et internes) naturellement hypertrophiée, ce qui en fait un bon modèle chirurgical pour ces régions, - rareté des épisodes d'otites moyennes aiguës, ce qui en fait un bon modèle pour l'évaluation non infectieuse des chirurgies otologiques, - ancienneté d'utilisation du modèle depuis de nombreuses années par notre équipe nous permettant d'acquérir une certaine expertise le concernant. Les gerbilles de Mongolie auront environ 10 mois, ce qui constitue le meilleur compromis entre un âge adulte donnant des animaux de taille suffisante pour faciliter la microchirurgie et un âge suffisamment jeune permettant de s’affranchir des problèmes de presbyacousie. En effet, la gerbille de Mongolie est un excellent modèle animal de presbyacousie. Son audition est adulte à partir de 18 jours et la presbyacousie débute vers 18 mois, avec une élévation du seuil de 10 dB SPL vers 22-24 mois et une franche perte auditive (20 à 30 dB SPL) à 36 mois de vie.
Etude de la virulence de la bactérie Leptospira interrogans chez la gerbille
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Inoculées d'un millilitre de leptospires dans l'abdomen, sept gerbilles de Mongolie développent une infection qui tue l'animal en cinq jours environ, et sept autres subiront la même chose si la première série échoue. Ces quatorze gerbilles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue, dès l'apparition des signes que le porteur décrit comme prédictifs de la mort, perte de plus de cinq grammes en deux jours, apathie, poil piqué, yeux mi-clos. Aucun groupe témoin n'est prévu. Le porteur indique devoir revalider le modèle gerbille après un déménagement d'animalerie pour que la fabrication du vaccin humain contre la leptospirose ne prenne pas de retard, ce projet revalidant un test de contrôle qualité dans de nouveaux locaux.
Objectifs
Dans le cadre d'un démenagement d'animalerie et de locaux en mars 2024, l'objectfif est de valider le modèle gerbille infecté par l'inoculum Leptospira interrogans serogroup icterohaemorrhagiae serovar copenhageni. En effet, dans le cadre du test d'un vaccin contre la Leptospirose, un test in vivo avec des animaux infectés par la leptospirose est nécessaire. Le vaccins étant le seul vaccin humain existant, il est soumis à une certaine contrainte d'approvisionnement et ne peut donc pas prendre de retard dans sa fabrication. Ainsi, il est nécessaire de mener une étude dans nos nouveaux locaux afin de valider le modèle gerbille et pouvoir continuer de réaliser les prochaines études de libération de lot dans les temps.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de valider le modèle gerbille inoculé par la souche Leptospira interrogans serogroup icterohaemorrhagiae serovar copenhageni dans notre nouvelle animalerie. Ce modèle sera ensuite utilisé pour réaliser des tests de lots ou de stabilité vaccinal.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu'à l'incoluation par la Leptospirose, par une injection intraperitonéale d'1mL. Les animaux seront vigiles, la contention ne dure pas plus d'une minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront maintenu environ une minute pour réaliser l'inoculation par injection intrapéritonéale par la leptorspirose. Les animaux seront inoculés par la souche Leptospira interrogans serogroup icterohaemorrhagiae serovar copenhageni qui provoque habituellement la mort de l’animal en environ 5 jours. Des euthanasies anticipées seront réalisées pour éviter toute souffrance de l’animal. Les signes cliniques et points limites attendus sont : une perte de poids de plus de 5g en 48h , un animal apathique et/ou recroquevillé sur lui-même avec un poil piqué et / ou des yeux mi-clos.
Devenir
Le but d'un test de virulence est d'observer la mortalité et la morbitié des animaux. Aussi, pour des raisons de biosécurité, les animaux infecté par la leptospire ne pourront pas être réutilisé ou replacer. Ils devront être euthanasiés en fin de procédure. Un premier groupe de 7 animaux sera utilisé afin de tester la virulence. Si cette première procédure fonctionne, les 7 autres animaux prévus à ce projet ne seront pas commandés à notre fournisseur et ne seront donc pas utilisés. Sinon, un nouveau test de virulence devra être reconduit après avoir pris toutes les dispositions possibles pour que celui-ci fonctionne, avec 7 nouveaux animaux.
Remplacement
Afin de valider les tests in vivo décrit dans l'Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) du vaccin contre la leptospirose, nous devons valider le modèle gerbille qui sera utilisé pour ces même tests. Nous ne pouvons donc pas encore remplacer l’animal sur ce projet.
Réduction
Un maximum de 14 animaux sera utilisé. Un premier projet comportera un lot de 7 animaux, correspondant au nombre d’animaux utilisés pour tester un lot vaccinal. Si ce premier projet n’est pas validé, de nouveaux tests seront réalisés après avoir analysé les causes de l’échec et mis en place les changements nécessaires pour que le test fonctionne. Nous n’utiliserons pas de groupe témoin lors de ce projet
Raffinement
Avant l’arrivée des animaux, une analyse 5M sera réalisée afin d’analyser tous les changements qui auront lieu avec le changement de locaux. Cela permettra d’identifier les points critiques et mettre en place les nouvelles procédures pour que tout se déroule au mieux. Ceci permettra de minimiser les risques de devoir réaliser une deuxième étude en cas d’échec. Aussi, des points limites bien défini permettrons de mettre à mort les animaux le plus rapidement possible dès les premiers signes cliniques. Les animaux seront hébergés en groupe dans une cage avec litière. Du matériel de nidification et du matériel à ronger sera mis à leur disposition quotidiennement. Des points limites prédictifs de la mort de l'animal sont mis en place : une perte de poids de plus de 5g en 48h , un animal apathique et/ou recroquevillé sur lui-même avec un poil piqué et / ou des yeux mi-clos. Les animaux seront euthanasié en cas d'atteinte d'un ou plusieurs points limites. Avant toute euthanasie, les animaux seront anesthesiés.
Choix des espèces
La gerbille est une des espèces rongeuses sensible à la bactérie Leptospirosa interrogans au point de reproduire les signes cliniques aboutissant à la mort comme cela est parfois observé chez l’homme. De plus, le vaccin contre cette bactérie est immunogène dans cette espèce. Les animaux seront agées entre 11 et 15 semaines, correspondant à l'âge ou les animaux sont inoculés lors des tests d'efficacités vaccinal. Ce seront donc des animaux adultes.
Evaluation précoce de la toxicité de produits futurs candidats médicaments
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 1500
Cochons d'Inde : 100
Hamsters dorés : 110
Gerbilles de Mongolie : 110
Trier des candidats médicaments avant les études réglementaires : 6 000 souris, 1 500 rats, 110 hamsters dorés, 110 gerbilles de Mongolie et 100 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent jusqu'à quatre administrations par jour pendant vingt-huit jours, à doses toxiques ou maximales tolérées, avec chirurgie pour certaines voies, perfusions de plus d'une heure et prélèvements de sang répétés. Les effets annoncés vont des diarrhées aux signes neurologiques, avec une perte de poids pouvant atteindre 20 %. Le porteur présente ce tri précoce comme un moyen d'éviter des études réglementaires "coûteuses d'un point de vue éthique et économique", et prévoit environ 75 études par an sur cinq ans.
Objectifs
Le projet a pour objectif : • d’étudier les putatifs mécanismes de toxicité liée à l’administration de la molécule d’intérêt. La détection précoce de toxicité permet d’arrêter le développement d’une molécule avant des études de toxicologie règlementaires couteuses d’un point de vue éthique et économique. Ces effets toxiques pourront être reliés à la concentration circulante du candidat médicament administré grâce à des données de toxicocinétique générées en parallèle. • de déterminer dans le cas de toxicité des biomarqueurs pertinents qui pourront être par la suite étudiés chez l’homme. •de caractériser éventuellement des populations répondeuses ou non à la molécule d’intérêt en associant des méthodes d’analyses ex vivo de génomique, protéomique ou métabolomique
Bénéfices attendus
Le projet vise à détecter très tôt dans le développement les effets de toxicité d'un composés test ce qui obligatoirement implique l'arrêt du développement d’une molécule avant même les études de toxicologie règlementaires coûteuses d’un point de vue éthique, en animaux, et économique. Le projet permet d'apporter des informations aux agences de réglementations pour prendre la décision de commercialiser un médicament chez l'homme ou l'animal. Le projet contribue à mettre sur le marché des médicaments sûrs et sécurisés chez l'homme et chez l'animal pour des maladies dont les besoins thérapeutiques sont non satisfaits à ce jour (domaine du cancer, infectieux et système nerveux). Le projet contribue à comprendre les mécanismes de toxicité d'une famille de composés et sélectionner ainsi des composés d'intérêt et des doses adminsitrées beaucoup plus sûrs.
Procédures
Les animaux subissent des adminsitrations uniques voire répétées sur 28 jours maximum de composé d'intérêt à des doses élévées afin d'identifier des effets secondaires susceptibles d'être observés chez l'homme. Pour les voies d'administration contraignantes, les animaux sont anesthésiés pour éviter tout inconfort ou souffrance inutile. Des prélèvements de sang sur animaux vigiles ou anesthésié sont également effectués pour mesurer les concentrations du composés d'intérêt dans le sang ou les tissus pour évaluer l'exposition des animaux au composé ou suivre un biomarqueur qui réflète l'évolution de lésions. Le maximum d'administrations quotidienne est de 4 et ceux pendant 28 jours maximum. La durée de ces administrations vont de quelques secondes pour une voie orale à moins d'une heure pour les perfusions longue durée sur animal contraint et à plus d'une heure pour des animaux libre de leurs mouvements. Le maximum de prélèvements de sang est limité au volume totale de sang prélevé sur une semaine qui doit être infèrieur à 10% du volume de sang total. La durée de ces prélèvements n'excèdent pas 2 minutes.
Impact sur les animaux
La manipulations des animaux peuvent entrainer des nuisances : - Pesée : stress de la manipulation, limité par de méthodes de préhension douces des animaux (léger) ; - Administrations de produits: stress de la manipulation et éventuelle douleur au point d’injection (léger). Certaines voies d’administrations lentes nécessitent une contention un peu plus longue. Certaines voies d’administration nécessitent une intervention chirurgicale (modéré) : effet de l’anesthésie, douleur per et post-opératoire, fortement limitée par l’anesthésie et l’analgésie adaptées. - Des prélèvements de sang peuvent être effectués : stress de la manipulation et éventuelle douleur au point de prélèvement(léger). - Hébergement individuel temporaire, soit pour recueil d’urine/fécès, soit en post-opératoire (léger). L'exposition des animaux à des doses toxiques ou de doses maximales tolérées de composés à tester peuvent provoquer des effest indésirables. Ces effets seront très limités dans le temps par la mise en place de critères d'arrêt anticipés et de suivi très rigoureux des animaux. Les animaux peuvent manifester des signes légers ou modérés d’inconfort, de stress :changements de comportements, baisse de la prise alimentaire ou hydrique, dégradation de l’état général , modifications de la fréquence respiratoire, manifestation de signes d’origine neurologique, selles diarrhéiques ou perte de poidsl (
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort en fin d'étude. Pour les besoins de l’évaluation de la tolérance des composés testés, les organes doivent être observés et des analyses tissulaires réalisées qui nécessitent la mise à mort des animaux en fin d'étude.
Remplacement
De nombreux test in vitro de toxicité remplacent déjà les animaux. Il s'agit de tests orientés sur un organes. Il n'existe pas de tests englobant l'ensemble des systèmes biologiques
Réduction
Le nombre d’animaux est déterminé pour répondre à la question scientifique de l’étude. Le nombre d’animaux s’appuie sur des recommandations internationales dans le domaine de la toxicologie et des publications scientifiques. Le nombre minimal par cohorte est réduit à 3 pour répondre scientifiquement à l’objectif de l’étude. Les recommandations de l’EMA demandent également à réduire autant que possible le nombre d’animaux, notamment en évitant d’ajouter des groupes contrôles ou véhicule quand cela est possible, notamment lorsqu’il existe des données déjà publiées ou historiques. Le nombre d’études sur les 5 prochaines années pour ce projet a été déterminé à partir des données historiques. Concernant les Hamsters, Cobaye et Gerbille environ 4 études par an peuvent être envisagées. Ces études comportent 4 groupes d’au maximum 4 animaux soit 16 animaux par études. Concernant les souris et rats, les études par composé comportent 4 groupes de 5 animaux en moyenne (minimum n=3, maximum n=8) soit 20 animaux pour un composé. Nous considérons 1 étude par composé et nous envisageons de tester environ 75 composés par an soit 75 études par an, avec un 80% d’études souris et 20% d’études rats. Les données expérimentales sont analysées avec des tests statistiques adaptés. Dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux, lors d’administration de fortes doses, un ou deux animaux de lacohorte est traité afin d’évaluer la tolérance au produit à fortes doses. En cas de signes cliniques majeurs sur cesanimaux, le reste de la cohorte ne sera pas traité aux fortes doses. Par ailleurs, les fortes doses seront administrées lorsque la certitude d’absence d’effets secondaires sera observée sur les doses inférieures autant que possible.
Raffinement
L'ensemble des procédures contraignantes jugées douloureuses pour les animaux sont faites sous anesthésie générale par inhalation ou par injection de composés à propriétés anesthésiantes. Les étapes de contention sont limitées (
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est défini par les lignes directrices internationales (ex. ICH, CHMP, OECD, WHO, FDA, MHLW) et sur des bases scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le(s) véhicule(s) envisagé(s) et les données disponibles de pharmacocinétique, de métabolisme et de toxicologie in vitro. Le stade adulte est celui utilisé afin de disposer d’animaux dont les systèmes biologiques sont matures. Exceptionnellement, des animaux juvéniles pourraient être utilisés si un impact sur le développement de l’animal doit être évalué.
DEVOFIL -Développement des filaires et de leurs symbiontes associés chez les rongeurs
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 015 mérions vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun recevant dans l'abdomen 80 filaires parasites dont une trentaine survit et douze femelles seront analysées. Un groupe reçoit un antibiotique deux fois par jour pendant quatorze jours à partir du quarantième jour d'infection, un autre un antihelminthique deux fois par jour pendant cinq jours, et tous subissent un prélèvement de sang sous anesthésie locale à 70 puis à 90 jours. La mise à mort sert à récupérer les filaires logées dans les espaces péritonéal et pleural. L'effectif est calculé à l'envers, à partir des 12 180 filaires femelles voulues, ce qui donne le nombre de mérions à infester.
Objectifs
Les parasitoses comme les filarioses affectent des millions de personnes dans les zones tropicales. Les filaires sont des nématodes parasites de l’homme et de nombreux vertébrés terrestres et sont toujours transmis par des arthropodes hématophages, comme des acariens. Le développement de résistance aux traitements actuels et l’absence de vaccin justifient la demande pour de nouvelles études en particulier sur des modèles animaux de références pour analyser le développement parasitaire, les réponses immunitaires, et les pathologies. Nous utilisons un modèle de filariose chez les rongeurs avec la filaire Litomosoides sigmodontis, laquelle présente de nombreuses caractéristiques proches de celles des filaires de l’homme. Les bactéries Wolbachia vivent dans une interaction mutuellement bénéfique dans certains compartiments spécifiques des filaires. Elles sont essentielles pour la survie et la fertilité des filaires et l’élimination de la bactérie par des traitements antibiotiques conduit à des retards de développement, une réduction de la longévité des filaires adultes et à la stérilité des femelles. Pour se déplacer dans les filaires, les bactéries utilisent un réseau composé de microtubules, des assemblages de protéines tubulines. De ce fait tout traitement déstabilisant le réseau de microtubules aura un effet sur les Wolbachia et donc sur la santé des filaires. Le projet a pour objectifs : 1/ d’étudier le réseau de microtubules dans les filaires au cours du développement chez le rongeur ; 2/ d’analyser la localisation et la quantité de Wolbachia dans les filaires au cours du développement de la filaire chez le vertébré ; 3/ d’estimer l’impact sur le développement bactérien et filarien de traitements antibiotiques ou antihelminthiques visant le réseau de microtubules.
Bénéfices attendus
Une meilleure connaissance du développement filarien et de la répartition de ses bactéries endosymbiotiques Wolbachia devrait permettre de mieux connaitre le mode d'action de traitements anti-filarien et anti-Wolbachia.
Procédures
Tous les animaux auront une injection intrapéritonéale de parasites (filaires) au temps 0. Un groupe recevra un traitement antibiotique par voie orale qui débute au 40ème jour de l'infection et qui est administré deux fois par jour pendant 14 jours, un autre groupe recevra un traitement antihelminthique( visant donc les nématodes donc les filaires) benzimidazole par voie orale qui débute au 35ème jour de l'infection et qui est administré deux fois par jour pendant 5 jours. Un troisième groupe contrôle n’est pas traité. Un prélèvement sanguin de 10µl sous anesthésie locale (lidocaine) pour établir la microfilarémie (nombre de stades sanguins des filaires) des mérions à 70 jours et 90 jours post infection sera effectué.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont liées à l'infection filarienne. Elle est peu symptomatique et on n’observe pas de mortalité augmentée due à l’infection. Une surveillance journalière est opérée pour identifier d'éventuels effets indésirables, comme une perte de poids, une modification de l’aspect physique ou du comportement sur les animaux
Devenir
Euthanasie pour accéder aux filaires qui résident dans l'espace péritonéal et l'espace pleural du mérion
Remplacement
Le recours aux animaux se justifie dans la mesure où il n'existe actuellement aucun modèle alternatif permettant d’étudier les filarioses à tous les stades de développement de la filaire. Le cycle de vie est complexe et les filaires muent difficilement en culture et ne se reproduisent pas dans ces conditions.
Réduction
Le nombre de mérions est estimé au plus près des nombres de filaires femelles attendus et nécessaires pour réaliser toutes les analyses. Pour éviter les problèmes de compétitions en parasitologie (trop de parasites) qui ont un impact négatif sur le développement du parasite, les mérions sont infestés avec 80 filaires; cependant comme pour toutes les filarioses seules une partie des filaires survivent à la réponse immunitaire de l'hôte vertébré; dans le couple mérion-filaire Litomosoides sigmodontis, 30% des filaires inoculées survivent soit 24 filaires par mérion; le sex-ratio est de 50/50 et les études impliquant une caractérisation de l'embryogénèse/l'ovogénèse, seules les filaires femelles seront analysées ce qui représente 12 femelles par mérion. La totalité des analyses nécessite 4860 filaires femelles issues de 405 mérions non traités, 4860 filaires femelles issues de 405 mérions traités par un benzimidazole, 2460 filaires femelles issues de 205 mérions traités par antibiotique. Ces nombres de filaires sont déterminés de façon à avoir suffisamment de matériel en protéine ou en acides nucléiques et une puissance statistique suffisante pour valider le résultat observé
Raffinement
Les mérions sont dans un environnement adapté à leurs besoins (dimensions de la cage, nourriture, enrichissement, température et cycle jour/nuit). Entre autre, ils seront hébergés dans un environnement enrichi, avec un substrat pour faire leur nid et des objets à ronger. Une surveillance journalière des animaux est réalisée par un personnel compétent qui connait bien cette espèce.
Choix des espèces
Le mérion est l'animal le plus proche de l'hôte naturel de la filaire Litomosoides sigmodontis (même durée de l'infection filarienne, charge microfilarienne comparable...) ce qui permet d'étudier le développement de la filaire dans les conditions les plus proches de son environnement vertébré normal. Les animaux sont utilisés au stade adulte.
Formation du personnel à des gestes techniques
- Formation professionnelle
Rats : 100
Cochons d'Inde : 100
Hamsters dorés : 100
Gerbilles de Mongolie : 100
Lapins : 25
1 675 animaux non-humains de six espèces, souris, rats, cobayes, hamsters, gerbilles et lapins, vont être utilisés pour entraîner le personnel à des gestes techniques, une partie étant réutilisée ou adoptée et le reste tué. Selon le geste appris, ils subissent contentions, administrations et prélèvements, certains terminaux comme la ponction de liquide céphalo-rachidien ou la biopsie de peau sous anesthésie, jusqu'à l'euthanasie par dislocation cervicale ou décapitation. Le porteur décrit un stress lié à la contention et une douleur aux points d'injection, et indique privilégier d'abord la formation sans animaux, sur mannequins ou cadavres. Le projet ne produit pas de connaissances, les animaux étant utilisés pour l'entraînement à des gestes prévus dans d'autres protocoles.
Objectifs
Ce projet est un support à la formation du personnel de l’établissement utilisateur à la mise en œuvre des procédures expérimentales des projets de recherche autorisés.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de consolider et valider la formation du personnel afin que les personnes impliquées dans la réalisation des procédures expérimentales des projets de recherche répondent au mieux aux exigences règlementaires en terme de respect du bien-être de l’animal.
Procédures
Les gestes techniques considérés dans cette procédure peuvent être : Préhension, contention Administration : per os, sous cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, intradermique sur animal vigil ou anesthésié Prélèvement de sang sur animal vigil ou anesthésié Prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien Biopsie de peau sur animal anesthésié(exsanguination) Prélèvements terminaux de sang et tissus sur animal anesthésié.Préparation à la chirurgie : intubation, dispositif supra-glottique sur animal anesthésié. Euthanasie : dislocation cervicale, décapitation selon l’espèce Le nombre et la durée seront définis en fonction du niveau de formation des personnes aux gestes techniques. La durée des interventions par animal n’excèdera pas une heure.
Impact sur les animaux
Stress et inconfort lié à la contention. Douleur au point d’administration ou de prélèvement. Risque lié à l’anesthésie.
Devenir
Préhension, contention : Réutilisation ou adoption possible selon espèce Administration : Réutilisation ou adoption possible selon espèce Prélèvement de sang sur animal vigil ou anesthésié : Réutilisation ou adoption possible selon espèce, euthanasie en cas de réaction exagérée Prélèvement de liquide céphalo-rachidien : Euthanasie Biopsie de peau sur animal anesthésié : Euthanasie Prélèvements terminaux de sang et tissus sur animal anesthésié : Euthanasie Préparation à la chirurgie : intubation, dispositif supra-glottique sur animal anesthésié : Réutilisation ou adoption possible selon espèce Euthanasie : Pas de réutilisation ou autre
Remplacement
Chaque fois que cela est possible, les formations sont réalisées dans un premier temps sans avoir recours à l’animal (e-learning, animaux morts, mannequins ou matériaux synthétiques).
Réduction
Lorsque le type de technique apprise le permet, les animaux seront gardés en vie à la fin de chaque session de formation, observés attentivement puis feront l’objet d’un examen vétérinaire afin de pouvoir à nouveau être utilisés.
Raffinement
En fonction du geste technique considéré (ex : administration, prélèvement, mise à mort, préparation à la chirurgie), la formation se fera dans un premier temps sur animal anesthésié. Un protocole analgésique sera également mis en place chaque fois que cela est nécessaire.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est fonction des besoins de formation en prévision d’études réalisées dans le cadre d’autres projets autorisés. Pour le personnel amené à réaliser des procédures expérimentales sur animaux, il est indispensable d’acquérir et de maîtriser les gestes spécifiquement pour les espèces concernées afin de garantir la meilleure technicité au moment de leur réalisation. Animaux adultes ou animaux juvéniles sevrés (rongeurs, lagomorphes). Les stades de développement des animaux utilisés sont fonction des besoins des chercheurs.
Traitement du cholestéatome par un outil intelligent robotisé.
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
50 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit d'abord un cholestéatome, une otite chronique destructrice, par cautérisation des trompes d'Eustache sous anesthésie, puis teste un outil chirurgical robotisé couplé à un laser pour détecter et détruire la lésion. Il indique que la formation du cholestéatome peut entraîner une baisse d'audition et des infections de l'oreille et que les deux interventions durent une quinzaine de minutes chacune. Il revendique la gerbille comme seule espèce non humaine sujette au cholestéatome spontané et juge le recours à l'animal "incontournable" pour reproduire des conditions chirurgicales réalistes.
Objectifs
Le cholestéatome est une forme grave d'otite chronique caractérisée par une croissance anormale et proliférative de la peau dans la cavité épitympanique, à l’origine d’infections répétées . C’est une lésion bénigne, mais son extension locale peut être destructrice : extension à l'oreille moyenne, remplissant la cavité tympanique autour des osselets, puis autour de l’oreille interne, du nerf facial, ou des méninges. Les patients souffrant de cholestéatome ont généralement des otorrhées purulentes chroniques, des pertes auditives, des vertiges, et plus rarement une paralysie faciale. Des complications graves liées à la propagation du cholestéatome vers le crâne peuvent se produire, entraînant des abcès cérébraux, méningite ou empyème. La chirurgie est le seul traitement connu pour enlever le cholestéatome. Elle doit préserver autant que possible les fonctions normales de l'oreille moyenne et interne. En raison de la structure délicate des structures de l’oreille moyenne telles que le tympan, la chaine des osselets, le nerf facial ou celles de l’oreille interne telles que la cochlée ou le vestibule, une telle microchirurgie est réalisée sous microscope et sous anesthésie générale. L’objectif du projet est de tester un outil chirurgical intelligent visant à détecter puis éradiquer ce type de lésion histologique dans un modèle animal de cholestéatome connu. Un outil robotisé intelligent visant à améliorer la détection et le traitement du cholestéatome sur le site opératoire dans l’oreille moyenne a été préalablement développé. La détection sera améliorée à l’aide d’un système d’imagerie multimodale associant imagerie par fluorescence et tomographie par cohérence optique (ou Optical Coherence Tomography, OCT). Il sera couplé à cette détection un laser de traitement dans le but de détruire les lésions de cholestéatome. Le système a déjà été validée sur des pièces anatomiques humaines et sur des tissus biologiques humains inertes cholestéatomateux ou non (contrôle) obtenus au cours d’intervention chirurgicale. Il nécessite une évaluation sur modèle animal afin de reproduire des conditions chirurgicales réalistes (saignement) et la possibilité d’un cholestéatome résiduel en cas d’ablation incomplète de la lésion primitive.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette étude sont une validation d’un outil de détection et de traitement du cholestéatome. Après la mise au point et validation du prototype sur des modèles cadavériques humains, la validation sur modèle animal est l’étape suivante en vue d’une translation clinique chez l’homme. La mise au point d’un outil clinique pour cette pathologie pourrait diminuer le nombre d’intervention chirurgicale chez l’homme. En raison de la complexité de l'anatomie de l'oreille moyenne, de la taille millimétrique de ses structures et la difficulté de reconnaissance des limites du cholestéatome. Il en résulte souvent l'impossibilité de réséquer complètement le cholestéatome, ce qui entraîne une maladie résiduelle et des opérations de révision chirurgicales. L’utilisation d’un microscope opératoire ou d’endoscopes réduisent mais n'éliminent pas complètement le taux de récidive, en raison des résidus microscopiques potentiels qui ne peuvent pas être facilement distingués des tissus sains. L'incidence élevée des cholestéatomes résiduels chez l’enfant est encore plus élevée et varie de 20 à 25% par rapport à 15% environ chez les adultes. Cela nécessite une ou plusieurs interventions systématiques. Éradiquer le cholestéatome en une chirurgie réduirait les coût des interventions, de l’hospitalisation, et la médication itérative sur les otorrhées à répétition. .
Procédures
Tous les animaux subiront deux interventions sous anesthésie générale, d’une durée d’environ 15 minutes. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité́ lors de ce type de chirurgie, avec des douleurs contrôlées et des animaux se ré alimentant rapidement après la chirurgie. Les animaux auront ensuite un examen de l’oreille sous anesthésie gazeuse. L’examen durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
La cautérisation des trompes d’eustache a été largement décrite et utilisée dans la littérature sur de gerbilles. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité. Les douleurs engendrées par ce geste chirurgical sont contrôlées par les antalgiques habituels et les animaux récupèrent en quelques jours. La formation de cholestéatome peut entrainer une hypoacousie chez les Gerbilles. Parfois, le cholestéatome peut entrainer une infection de l’oreille. Dans ce cas, ces animaux suivent un traitement antibiotique adapté.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés, puisque nous souhaitons faire de l’histologie et des coupes de l’oreille après l’intervention pour vérifier l’absence de cholestéatome.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative que ce soit des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. L’oreille est un organe complexe et il n'existe pas, à ce jour, de modèle permettant de reproduire un cholestéatome. Le seul moyen permettant d’évaluer la détection et la destruction d’un cholestéatome reste l’utilisation d’un modèle animal vivant pour simuler les conditions chirurgicales réelles et notamment la présence de saignement sur le cholestéatome. Ainsi, le recours à l’animal est incontournable pour évaluer notre outil robotisé.
Réduction
Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Nous utilisons classiquement des tests statistiques pour tester la significativité́ de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment (la pathologie touche indifféremment l’homme et la femme), et nous nous concentrerons sur le nombre limité d’animaux en fonction de la capacité des dispositifs expérimentaux et de l’application des mesures sur le même animal le cas échéant. La mise au point (étape 1) permettra de valider le modèle de cholestéatome car la formation d’un cholestéatome n’est pas systématique. Dans la littérature, le taux de succès varie entre 60 et 75%. Dans cette étude, nous visons un taux de réussite de l’ordre de 60% : chaque animal ayant 2 oreilles, pour 50 animaux, nous espérons obtenir 60 oreilles (/100) avec cholestéatome à 12 semaines de suivi. La seconde étape permet d’évaluer l’outil robotique intelligent. Nous jugerons de deux critères de jugement principaux : (i) détection du cholestéatome et (ii) destruction du cholestéatome. En cas de cholestéatome bilatéral chez un même animal, les deux oreilles seront utilisées.
Raffinement
La semaine précédant l’expérimentation, les gerbilles seront manipulées plusieurs fois afin de les habituer au contact de l’expérimentateur et ainsi minimiser le stress le jour de la procédure expérimentale. Les méthodes sélectionnées pour cette étude sont les moins invasives et les moins douloureuses actuellement. Deux chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale par un chirurgien ORL expert et dureront 15 minutes environ : cautérisation des trompes d’eustache (étape 1, mise au point) et test de l’outil robotique intelligent (étape 2). Les animaux du projet seront ensuite suivis quotidiennement. La surveillance otoscopique sera courte et réalisée sous anesthésie gazeuse par un chirurgien ORL expert, elle durera 5 minutes environ. D’après la littérature, la cautérisation des trompes d’eustache n’entrainait pas de surmortalité. Les douleurs étaient contrôlées par des antalgiques habituels. Les points limites seront déterminés, selon une grille, pour évaluer une éventuelle souffrance, détresse ou inconfort. Des mesures de gestion de la douleur seront mises en place en fonction du score avec un protocole antalgique adapté. Les gerbilles seront hébergées en groupe dans un environnement enrichi pour favoriser un comportement naturel.
Choix des espèces
La gerbille est le modèle d'étude le plus approprié, car c'est la seule espèce, en dehors de l'homme, qui est sujette à des cholestéatomes spontanés. Les cholestéatomes des gerbilles présentent plusieurs caractéristiques similaires à celles des humains, tant au niveau macroscopique que microscopique. Il a déjà été démontré dans la littérature que l'oblitération expérimentale du conduit auditif externe ou de la trompe d'Eustache permettait d'induire des cholestéatomes chez ces animaux, avec des caractéristiques très similaires à celles qui se produisent spontanément. Le taux d’occurrence spontanée de cholestéatome serait équivalent à 45%, et après cautérisation de la trompe d’eustache il serait de 60–75% et après 12 semaines de suivi. Par ailleurs, la trompe d'Eustache de la gerbille est plus facile d’accès, courte (1,8 mm) et orientée très verticalement (81° contre 15° chez le rat). Le modèle de gerbille est utilisé par d’autres équipes de recherche, et nous pourrons bénéficier de leur expérience. Le projet impliquera exclusivement des animaux adultes. Les études menées jusqu’à présent dans le laboratoire ont utilisé des animaux de cet âge. Les données obtenues dans l’étude présente pourront être comparées à celles déjà obtenues avec des protocoles voisins.
Formation du personnel
- Formation professionnelle
Rats : 140
Cochons d'Inde : 180
Hamsters dorés : 200
Gerbilles de Mongolie : 80
Chats : 225
Chiens : 210
Furets : 130
1 765 animaux non-humains vont être utilisés pour former le personnel, dont des souris, rats, cobayes, hamsters, gerbilles, chats, chiens et furets, une partie tuée, une partie réutilisée ou adoptée. Ils servent à s'exercer à la manipulation, la contention, l'administration de substances et les prélèvements, mais aussi à l'anesthésie et à l'euthanasie. Le porteur indique que les gestes mal assurés peuvent causer inconfort et stress, et que les rongeurs sans réutilisation possible sont tués à l'issue. Il justifie l'ensemble par la qualité des gestes, présentée comme garante du "bien-être" des animaux non-humains, et décrit la formation comme un prérequis "obligatoire".
Objectifs
Toute personne entrant dans un établissement utilisateur doit suivre un programme de formation pour travailler sur les animaux puis doit faire l’objet d’une formation continue. Elle doit également être formée et qualifiée avant de mettre en pratique toute nouvelle technique sur animaux. De plus, pour certaines nouvelles procédures ou après une période longue sans pratique de la technique, une formation est nécessaire. Ce pré-requis est obligatoire pour garantir la qualité des gestes réalisés et donc le bien-être animal.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont en lien avec les 3R : - Raffinement : diminution du stress, de l’inconfort et de la durée des manipulations. - Réduction : Bien faire du premier coup pour ne pas refaire d’étude et donc réduire le nombre d’animaux utilisés. Ils seront matérialisés par la qualification du personnel en charge des gestes techniques sur animaux et assureront des résultats fiables et répétables dans les études.
Procédures
Dans le cadre de la formation du personnel, les animaux seront utilisés pour l'apprentissage, la manipulation, la contention, l'administrations de substances par différentes voies (sous-cutanée, orale...), et les prélèvements (sanguins, urinaires, écouvillons). Le personnel se formera également à l'anesthésie et à l'euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n’est attendu lors des formations. Cependant, lors de l’apprentissage, un geste technique mal assuré peut entraîner de l’inconfort chez l’animal qui pourrait alors exprimer un stress ou un comportement anormal. Dans ce cas, le formateur pourra à tout moment interrompre la séance s’il le juge nécessaire.
Devenir
Mise à mort: - lorsqu’il y a des risques de dommages persistants chez l’animal. - rongeurs : lorsqu’il n’y a pas de réutilisation possible des animaux après les séances de formation. Réutilisation: Une fois le prélèvement effectué, les animaux réveillés sont replacés dans leurs locaux usuels d’hébergement. Placement: dans tous les autres cas lorsque le placement répond aux conditions décrites dans le décret
Remplacement
La formation commencera toujours par la prise de connaissance des documents internes en vigueur (instructions) permettant de réaliser le geste technique à apprendre. Ensuite des formations théoriques, plus spécifiques relatives à l’anatomie, la physiologie, aux points limites avec reconnaissance des signes de douleur et de stress, à l’observation quotidienne des animaux et à la maîtrise de l’environnement sont réalisées. Enfin une observation sur le terrain d’une personne qualifiée sera mise en place avant toute pratique sur animaux.
Réduction
Les animaux peuvent être réceptionnés spécifiquement pour la formation des personnes, mais la préférence sera toujours à la réutilisation des animaux chaque fois que cela est possible. Les formations seront mutualisées pour limiter le nombre d’animaux utilisés. Seul le strict minimum d’animaux sera utilisé pour la formation.
Raffinement
Tous les animaux utilisés sont hébergés dans un environnement enrichi afin de leur permettre d'exprimer un maximum de leurs comportements naturels. Des points limites spécifiques et précis sont mis en place afin d'arrêter toute procédure qui engendrerait une souffrance inutile dans l'atteinte des objectifs de formation. Dans tous les cas, si le geste technique peut provoquer de la douleur chez l’animal, il sera réalisé sous anesthésie. Chez les carnivores domestiques, le renforcement positif est systématiquement appliqué après une manipulation, une récompense est distribuée et des gestes d’affection sont réalisés (ex: caresses, prise dans les bras…). Afin de limiter le stress des animaux, une période d'habituation à la contention et aux gestes techniques est mise en place (si nécessaire) avant le début de la formation. Dans le cas de formation à une technique d’administration de produit, l’apprentissage du geste technique sera réalisé avec un produit neutre type sérum physiologique. Lors de la formation, d’autres produits pourront être utilisés, par exemple injection d’un anesthésique puis vérification de l’endormissement de l’animal.
Choix des espèces
Il s'agit de toutes les espèces notées dans l'agrément et utilisées au sein de l'unité animale Animaux sevrés et adultes peuvent être utilisés car représentés dans les études. Il est utile de se former sur de jeunes animaux sevrés, car les techniques de prélèvement, notamment, peuvent être plus difficiles à réaliser du fait du petit format des animaux
Babesia microti: infection expérimentale et production de matériel parasitaire
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
150 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par le parasite Babesia microti, subissent des prélèvements de sang à la queue tous les trois jours, puis sont tuées par exsanguination une fois la parasitémie cible atteinte, jusqu'à 50 % des globules rouges parasités. L'objet du projet est de produire du sang parasité servant de contrôle positif pour un test de diagnostic. Le porteur affirme que le parasite n'est pas cultivable in vitro et que l'infection expérimentale reste le "seul moyen" d'en produire.
Objectifs
Afin d'obtenir des molécules parasitaire (protéines, antigènes, ADN...) il est nécessaire de recourir à l'infection expérimentale d'animaux tels que la gerbille de Mongolie, le parasite B. microti n'étant pas cultivable in vitro. L'objectif est d'obtenir la quantité nécessaire et suffisante de matériel, essentiellement sous forme de sang parasité pour extraction d'ADN, pour disposer d'un contrôle positif utilisable sur 1 année complète.
Bénéfices attendus
Le diagnostic des babésioses, humaines ou vétérinaire, repose sur la technique de la PCR (amplification spécifique de l'ADN). Un contrôle positif est nécessaire à la validation des résultats, ce contrôle positif consiste à l'utilisation de sang de gerbille parasité par B. microti.
Procédures
Deux injections intra péritonéales (200 µl) seront réalisées (inoculation du parasite à partir de sang parasité à J1), et surdose d'anesthésique lorsque la parasitémie atteint sa valeur cible. Environ 5 prélèvements de sang (1 goutte, soit 50 µl) au niveau de l'extrémité de la queue seront réalisés pour la réalisation d'un frottis sanguin et une mesure d'hématocrite (1 prélèvement tous les 3j). Un prélèvement de sang à la queue, réalisé sans contention particulière, dure environ 20 s, est quasiment indolore et ne provoque pas de stress ni de réactions particulières.
Impact sur les animaux
Les animaux reçoivent deux injections intrapéritonéales au cours de la procédure: une première injection pour l'inoculation des parasites, la deuxième lors de l'euthanasie. Ces deux injections peuvent entraîner une légère inflammation au point d'injection. Les prélèvements réalisés à la queue peuvent également causer une irritation modérée, leurs réalisations ne nécessitent pas la mise en place d'une contention particulière. Le saignement à la queue est stoppé très rapidement et l'application d'un désinfectant au niveau de la queue limite l'inflammation potentielle. Le développement du parasite dans le sang, au moins jusqu'à une parasitémie de 50%, n'induit pas d'effets notables sur le comportement des animaux.
Devenir
Le prélèvement de sang parasité par exsanguination implique l'euthanasie des animaux à la fin de la procèdure.
Remplacement
Il n'y a actuellement pas de méthodes alternatives à l'infection expérimentale pour propager les parasites B. microti. De plus, l'infection expérimentale reste une méthode de réference pour l'isolement de souches parasitaires issues de prélèvement cliniques. Contrairement à d'autres espèces de Babesia telles que B. divergens (cultivable en hématies humaines venant de l'EFS) ou de B. canis (cultivable en hématies canines venant d'une société d'élevage privée), B. microti ne peut pas être cultivées à long terme sur hématies in vitro (quelle que soit l'espèce de mammifère considérée). La production de matériel biologique ne peut être réalisée par des molécules de synthèse ni simulation informatique, ce qui contraint à l'infection expérimentale.
Réduction
Le nombre d'animaux est déterminé par le volume de sang parasité nécessaire pour l'utilisation du matériel mais aussi pour assurer le renouvellement des stocks congelés, permettant un maintien à long terme de nos capacités de production. Ainsi, nous avons besoin de 30 ml de sang parasité/an. A raison de 2 ml de sang total prélevable par animal, nous avons besoin de 30 gerbilles/an (soit 150 animaux sur 5 ans). L'objectif étant la production de sang parasité, l'approche statistique est sans objet.
Raffinement
Le prélèvement rétro-orbital, utilisé pour la mesure d'hématocrite (sur tube capillaire hépariné) est désormais remplacé par l'utilisation d'un lecteur d'hématocrite avec bandelettes. Ce lecteur utilise 2 µl de sang, qui sera prélevé à la queue dans le même prélèvement que celui nécessaire à la détermination de la parasitémie. Ceci permet donc d'éliminer totalement le prélèvement rétro-orbital de la procédure, ce qui permet de réduire fortement la perte sanguine des animaux, la douleur éventuellement générée et les risques d'infection. A noter que le parasite ne peut survivre ou se développer en dehors de la circulation sanguine de l'animal, et ne peut etre transmis que lors d'une injection expérimentale ou une morsure de tique infectée, ce qui empêche toute contamination de la zone d'hébergement. L'extrémité de la queue, à la suite du prélèvemnet, est désinfectée et le saignement stoppé par une légère pression avec un papier absorbant, ce qui empêche l'écoulement de sang parasité en dehors de la zone d'expérimentation et contribue à la non-contamination de la zone d'hébergement. Le point limite principal est l'hématocrite, et la mise en évidence de signes de souffrances. Lorsque l'hématocrite mesuré est inférieur ou égal à 20% (ou lorsque l'animal présente des signes de souffrance tels que déterminés sur la grille d'évaluation), l'euthanasie de l'animal est décidée et le sang parasité récupéré.
Choix des espèces
Babesia microti est un parasite transmis lors du repas sanguin de tiques infectées sur un hôte sensible. Les gerbilles de Mongolie sont sensible à l'infection par B. microti, et en l'absence de système de culture in vitro du parasite, l'infection expérimentale reste le seul moyen de produire du matériel parasitaire (ADN, protéines...).
Impact de la diversité morphologique du complexe cranio-mandibulaire des rongeurs sur les mouvements masticatoires.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Rats : 3
Cochons d'Inde : 3
Hamsters de Chine : 3
Gerbilles de Mongolie : 3
Autres rongeurs : 48
63 rongeurs de six espèces (souris, rats, cochons d'Inde, hamsters, gerbilles et autres rongeurs) vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Chaque animal subit sous anesthésie l'implantation de billes métalliques contre le crâne et la mandibule, puis des séances d'exposition aux rayons X pour filmer les mouvements de mastication, avant d'être tué et disséqué. Le porteur présente une recherche fondamentale sur la diversité morphologique des rongeurs et son lien avec des espèces fossiles. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de capturer ces mouvements chez l'animal vivant.
Objectifs
Le projet a pour but de documenter et de comparer la diversité morphologique cranio-mandibulaire des rongeurs afin de comprendre comment cette dernière influence les mouvements de la mâchoire durant la mastication. Nous cherchons à mettre en évidence des patrons de covariations entre des caractères anatomiques (ostéologiques, musculaires et dentaires) et fonctionnels afin de comprendre comment l’anatomie contraint ou favorise les mouvements de la mâchoire dans l’espace et dans le temps.
Bénéfices attendus
L'étude intégrative de la covariation morphologique des complexes ostéologiques, musculaires et dentaires et son impact fonctionnel sur les mouvements masticateurs en utilisant des données issues de mêmes individus est un concept original non-exploité dans la littérature. Les résultats attendus par ce projet nous permettront d'améliorer notre compréhension des dynamiques évolutives de la diversification des rongeurs et de mettre en évidence si l'évolution de ces structures (conjointes ou isolées) ont joué un rôle clé dans le succès évolutif de ce groupe. Enfin, ces données serviront a posteriori à la réalisation de modèles biomécaniques permettant de reconstruire les mouvements masticateurs possibles à partir des crânes d'espèces fossiles morphologiquement et phylogénétiquement proches de celles proposées dans ce projet.
Procédures
Tous les animaux (n = 63) subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie globale afin d'implanter des marqueurs radio-opaques (billes métalliques d'un diamètre < 1mm et d'un poids de 0.00026g) contre le crâne et la mandibule des animaux à l'aide d'une aiguille. La durée de la chirurgie est estimée entre 30 et 45 min. De plus, les animaux seront exposés aux rayons X lors de la procédure de capture des mouvements masticatoires via cinéradiographie. Ces mouvements ne sont pas impactés par la chirurgie dû au faible taille et poids des marqueurs. Cette intervention se déroulera lors de sessions de 2h maximum durant lesquelles l'animal sera exposé aux rayons X par intervalles de 6 secondes, pour une durée cumulée totale de 90 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux sont mis à jeun la veille de l’analyse. Une anesthésie chirurgicale de courte durée (moins de 30 min) est réalisée pour insérer les billes. Un antalgique post implantation des marqueurs est administré comme suggéré par le vétérinaire référent et re-administré si nécessaire (douleur prolongé). Une légère perte de poids potentielle suite à l’anesthésie peut être observée. - 10 examens d’imagerie (acquisition en cinéradiographie) pour une durée cumulée totale de 90 secondes en vigile et sans contention pendant qu’ils mangent leurs aliments habituels. Les animaux peuvent subir un stress suite à leur acquisition et à la modification de leur lieu de vie. L’anesthésie réalisée pour insérer les marqueurs risque de causer des légères troubles d'alimentation (et donc une légère perte de poids éventuelle le lendemain de l’implantation) ainsi que des douleurs faibles mais contré par l’analgésique. Ceci n’impacte en aucun moment les mouvements normales des mâchoires et donc les données scientifiques. Après leur rétablissement les animaux seront de nouveaux sujets à un stress lors de leur manipulation pour les acquisitions de données de cinéradiographie (environnement inhabituel, bruit du générateur à rayon X). Les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation pour être CT-scanné ce qui est essentiel pour pouvoir lier anatomie et mouvement au niveau individuel.
Devenir
A l'issue de la procédure "Acquisition des données des mouvements masticateurs", tous les animaux seront euthanasiés afin de procéder à la dissection de leur complexe masticateur puis de scanner le crâne et la mandibule pour reconstruire les mouvements masticatoires individuels en 3D.
Remplacement
Aucune méthode alternative de modélisation biomécanique ne permet de substituer l'utilisation d'animaux vivants pour capturer les mouvements masticateurs effectifs en lien avec la morpho-anatomie crânienne et musculaire.
Réduction
La large gamme d'espèces sélectionnées pour ce projet a été déterminée afin de considérer un spectre morphologique, taxonomique et écologique suffisant pour répondre aux questions macro-évolutives de notre projet. Le nombre d'animaux (n = 63) a été réduit au maximum en utilisant 3 individus par espèce afin de capturer un aperçu de la variation morpho-fonctionnelle de notre structure d'intérêt au sein d’une espèce mais en permettant de comparer a l’échelle interspécifique (moyennes par espèce sont utilisées pour les analyses comparatives).
Raffinement
Les animaux se trouveront dans un environnement adapté à leurs besoins (dimensions de la cage, récréation, nourriture, température et cycle jour/nuit) en fonction de l'espèce considérée et pendant toute la durée de l'acquisition des données expérimentales. Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi, avec un substrat pour faire leur nid et des objets à ronger. Les cages seront individuelles hormis pour les espèces sociales. Les animaux recevront une dose d’anti-inflammatoire pour prévenir la douleur des insertions sous cutanées des billes. Au cours de la chirurgie d’implantation des marqueurs, les animaux seront sous anesthésie générale et placés sur un tapis chauffant thermo-régulé pour éviter la perte de chaleur. Ils seront ensuite placés en chambre de réveil thermostatée et surveillés attentivement. Au moins deux à trois jours de récupération sont prévus suite à cette manipulation avant de débuter la cinéradiographie. Si les animaux montrent des signes de douleur l’analgésie sera prolongé (jamais observé sur plus de 3 ans d’expérience avec ce type d’implantation). Les boîtiers dans lesquels ils seront placés pendant cette procédure seront adaptés à la taille de l'animal et offriront des zones d'abri pour diminuer leur stress durant l'expérimentation. Une surveillance accrue des animaux par un personnel compétent est prévue afin d'adapter les temps de rétablissement post-chirurgie pendant toute la durée du projet et diminuer la souffrance animale. Les animaux seront euthanasiés immédiatement après l’acquisition des examens rayons X. Les points limites définis dans le projet seront strictement suivi limitant ainsi toute souffrance animale possible.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies permettent de capturer un maximum de variation morphologique et de régime alimentaire sur un large spectre systématique au sein des rongeurs ; donc de permettre de répondre aux questionnements macro-évolutifs et morpho-fonctionnels de ce projet. Des animaux adultes seront utilisés pour minimiser la variation en lien avec les changements morphologiques et fonctionnels qui ont lieu au cours du développement de l’animal jusqu’à sa maturité. Ce choix permet d'optimiser la détection de la variation entre espèces et est un des principes clé pour réaliser des analyses comparatives en biologie évolutive.
Effets de composés chimiques ou biologiques sur des maladies dermatologiques induites chez les rongeurs (acné, psoriasis, prurit, dermatite atopique)
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rats : 1500
Gerbilles de Mongolie : 1000
12 500 souris, rats et gerbilles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Le porteur induit acné, psoriasis, eczéma et prurit par applications répétées d'irritants ou injections de cytokines, avec démangeaisons, lésions cutanées, port de collerette, hébergement isolé et pertes de poids pouvant atteindre 20 à 25 %, avant mise à mort pour prélever peau et sang. Les tests décrits incluent la mesure du grattage sous caméra après isolement sans eau ni nourriture. Sur le remplacement, il indique que les données in vitro sont "souvent insuffisantes" pour prédire l'efficacité et conclut à la nécessité de vérifier les molécules chez le rongeur.
Objectifs
L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans un modèle de maladies dermatologiques chez le rat, la souris ou la gerbille : acné, psoriasis, dermatite atopique. Les différentes procédures de ce projet permettront d’évaluer l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques qui auront été présélectionnés in vitro sur des critères de puissance et d’efficacité En fonction de leurs propriétés pharmacocinétiques, ils pourront être testés en mode préventif ou thérapeutique .
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur plusieurs maladies dermatologiques : psoriasis, eczéma, acné, et sur un de leurs symptômes, le prurit. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies pour laquelle les options sont pour le moment limitées et imparfaites.
Procédures
Le psoriasis sera induit chez des rats/souris par application quotidienne (5 minutes) d’Imiquimod, ou par injections intradermiques quotidiennes de cytokines (sous anesthésie générale avec analgésie, 1 heure), pendant au maximum 15 jours. La dermatite atopique (eczéma) sera induite chez les rats/souris par applications topiques répétées de DNFB pendant 2 semaines ou d’OVA pendant 7 semaines (actes quotidiens de 5 minutes). Un score clinique sera établi deux fois par semaine par observation de la peau, et la quantification du nombre et de la durée des grattements sera déterminée à l’aide d’une caméra haute vitesse. Cette étape nécessitera l’isolement des animaux pendant 2,5 heures sans accès à la nourriture et à la boisson, une seule fois pendant l’étude. Les animaux seront pesés deux fois par semaine (5 minutes). Des démangeaisons pourront être déclenchées par administration intradermique à des souris/rats/gerbilles de substances pruritogènes sous anesthésie générale avec analgésie (1 heure). Ils seront pesés 2 fois dans la semaine d’étude (5 minutes). Pour les modèles d’atrophie des glandes sébacées, des composés seront administrés aux souris/rats pendant 4 à 24 semaines à une fréquence et par des voies variables. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine (5 minutes). Les applications topiques et intradermiques seront précédées par une tonte et une dépilation de la peau (acte d’environ 15 minutes). Les animaux porteront des collerettes et seront hébergés individuellement. Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par voie: intranasale et intratrachéale (anesthésie, 1h), intramusculaire et intradermique (anesthésie, avec analgésie, 1h), orale sur animaux vigiles (1 minute), sous cutanée (avec ou sans anesthésie et pansement occlusif, 5-30 minutes) et intrapéritonéale (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute), ou par mini pompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (anesthésié 1 heure). Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie). Des biopsies de peau pourront éventuellement être réalisées, sous anesthésie générale avec analgésie (1h30). Les études de psoriasis dureront au maximum 4 semaines, celles d’eczéma 6 semaines maximum, celles de prurit 1 semaine maximum, celles d’acné 24 semaines maximum et celles de pharmacocinétique uniquement 48h maximum.
Impact sur les animaux
Dans ces modèles de maladies dermatologiques, des lésions dermatologiques sont attendues. Dans le cas du modèle d’atrophie des glandes sébacées, les seules lésions et pertes de poids qui pourraient survenir proviendraient d’une toxicité des produits administrés. Dans le cas du modèle de psoriasis à l’Imiquimod, des lésions de type psoriasis sont attendues c’est-à-dire des plaques d’érythème. Une perte de poids de 15-25% du poids initiale est attendue dans les 72h suivant la première administration d’Imiquimod. Cette perte de stabilisation ensuite sans retour au poids initial. Dans le cas du modèle de psoriasis induit par injection de cytokines, les lésions de type psoriasis seront plus limitées et les animaux perdront peu de poids (
Devenir
Après les 4 procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de la peau et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionné dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
En cas de mesures simples de pharmacocinétique, il a été démontré que 3 animaux par groupe étaient suffisants. Dans le cas du modèle de prurit à la Substance P, nous avons démontré par le passé que 12 animaux par groupes sont nécessaires pour obtenir des différences significatives sur les paramètres d’intérêts. Dans les modèles d’eczéma induit par des allergènes, le nombre nécessaire a été évalué par le passé et dépend des paramètres évalués : il faut 12 animaux par groupe pour la mesure du nombre de grattements, 8 animaux par groupe pour comparer l’épaississement de l’épiderme et du derme, 10 pour la mesure d’infiltration de cellules inflammatoires par analyse histologique, 10 animaux par groupe pour comparer la mesure de l’expression de différents gènes dans la peau. Dans le cas de l’eczéma induit par S. aureus, il a été estimé sur la base de la littérature que 10 animaux par groupes seraient nécessaires. Ce nombre sera réévalué à l’issue des études pilotes. Dans le cas du modèle de psoriasis, il a été mis en évidence lors des études passées que 10 animaux par groupe sont nécessaires pour observer des différences statistiquement significatives.
Raffinement
Un scoring adapté au modèle sera réalisé au moins deux fois par semaine, sauf dans le cas du modèle de prurit (pas de lésions) et lors de l’induction du modèle d’eczéma à S aureus (pas de mesures lorsque le pansement est en place). La fréquence de retrait du pansement pourra être augmentée, afin de mieux comprendre la cinétique de la maladie, et la fréquence de retrait pourra être adaptée. Au préalable, des tests de réactions aux pansements et à leur retrait fréquent seront effectués (sous anesthésie). Les animaux seront pesés au moins 2 fois par semaine : 10-15% de perte de poids : pesée quotidienne, réhydratation sous cutanée (SC) une fois par jour. 15-25% : pesée quotidienne, réhydratation SC deux fois par jour. Le poids constituant un point limite sera adapté au modèle (voir procédures). Un gel nutritif ou de l’eau gélifiée dès 10% de perte de poids sur certains animaux. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Les actes douloureux (injection IM ou ID, pose de mini pompe, biopsie) seront réalisés avec analgésie. Les actes peu stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (administrations IV, IP et topiques) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Lors d’administrations topique, le port d’une collerette avec hébergement individuel pourra être nécessaire. Une période d’acclimatation à son port sera réalisée et un enrichissement supplémentaire sera fourni. Un nettoyage quotidien des yeux avec une compresse imbibée de sérum physiologique stérile palliera au manque de toilettage imposé par le port de la collerette. Pour évaluer l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte (cf. procédures). Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les différents modèles dermatologiques d’intérêt sont bien décrits chez la souris et le rat. La gerbille est aussi bien décrite dans le cas des modèles de prurit. L’espèce la plus pertinente pour les études, en particulier sur la base des paramètres pharmacologiques de la substance à tester, sera choisie si le modèle est décrit chez plusieurs espèces. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles dermatologiques d’intérêt sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.
Evaluation chez le rongeur, de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques par des méthodes froides ou radioactives
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 12500
Hamsters dorés : 300
Gerbilles de Mongolie : 200
Une perte de poids de plus de 15 %, ou de plus de 10 % pendant plus de trois jours, constitue un point limite pour les 25 500 rongeurs de ce projet : 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les composés testés, froids ou radiomarqués, leur sont administrés par la bouche, le nez, la trachée, le muscle, la peau, l'abdomen, la veine porte, le cerveau ou la vessie, cette dernière voie après jusqu'à quatre heures de privation d'eau, ou par minipompe implantée par chirurgie. La phase in vivo peut durer jusqu'à 12 mois, avec des jeûnes jusqu'à 16 heures et un hébergement individuel sans enrichissement pour recueillir urines et fèces, afin de mesurer la distribution et l'élimination de composés que le résumé ne nomme pas. Le porteur déclare 10 220 rongeurs réutilisés, et réserve ce maintien en vie à ceux qui n'ont reçu qu'une administration unique de composé non radioactif et sont restés moins d'une semaine en procédure, les autres étant mis à mort pour prélever leurs organes et de grands volumes de sang.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. Ce projet permettra d’une part de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. Une seconde partie du projet aura recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, ou des paramètres métaboliques (insulinémie, glycémie) et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Dans le cas de l’insulinémie et de la glycémie ou d’autres paramètres métaboliques, une injection de glucose en IP ou SC ou une administration PO pourront être réalisées au préalable des prélèvements sanguins.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.
Procédures
Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie: intranasale, intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire, intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte d’1min environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ 1h); injection intraportale ou minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ 1h). Les implants pourront être retirés au plus tôt une semaine plus tard (chirurgie d’environ 15min, anesthésie d’environ 1h). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’1h) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h,Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vis sur avis du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité (diarrhée, perte de poids, douleur, signes neurologiques), ce qui sera surveillée. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit. Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.
Devenir
Les animaux seront la plupart du temps mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé non radioactif et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront réalisées sur les paramètres mesurés.
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales, intravésicales, intraportales, les prélèvements de liquide cérébrospinal et les poses et retraits de mini-pompes osmotiques ou d’un implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (buprénorphine au moins 30 minutes avant). Pour les pompes et implants, les animaux seront hébergés individuellement et suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie suturée (en général 3-4 jours) et des soins locaux seront apportés si nécessaire. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique (buprénorphine).
Choix des espèces
Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Etude des conséquences pressionnelles et homéostatiques des liquides labyrinthiques de l’animal soumis à un désordre pressionnel extrinsèque
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
50 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Chacune subit une chirurgie de deux à trois heures ouvrant l'oreille moyenne et cathétérisant les espaces sous-arachnoïdiens, avec une élévation de la pression intracrânienne. Le porteur indique que cette hyperpression sur le cerveau n'est "pas compatible avec le réveil de l'animal", d'où la mise à mort. L'objectif est de comprendre les mécanismes de la maladie de Ménière, le porteur justifiant le choix de la gerbille par la facilité d'accès à son oreille interne et une anatomie proche de celle de l'humain.
Objectifs
L'intitulé du projet est l'evaluation du profil evolutif pressionnel et homéostatique des compartiments de l'oreille interne d'un animal soumis à un deséquilibre pressionnel extrinséque, le but étant de comprendre les mécanismes sous-jacents responsables des symptomes d'une crise de maladie de Meniere qui sont essentiellement représentés par une surdité, des acouphènes et un vertige. les mécanismes étiopathogéniques restent à ce jours inconnus, il y'a plusieurs théories qui expliquent les mécanismes physiopathologiques responsables de l'eclosion des symptomes de cette maladie. La plus communement admise à l'heure actuelle est l'hydrops endolymphatique qui signifie l'augmentation du volume du compartiement périlymphatique de l'oreille interne, cela fut constaté la première fois par Hallpike et Cairns (Hallpike and Cairns, 1938) sur des dissections de patients porteurs de la maladie. Par la suite Kimura a provoqué un état similaire d’hydrops sur l’animal en empêchant la résorption de la périlymphe en bloquant l’aqueduc vestibulaire (Kimura, 1967) Les constatations électrophysiologiques de ce type de modèle étaient très variables, avec des atteintes minimes contrastant avec l’importance de l’hydrops (Salt, n.d.). De plus les mesures pressionnelles lors de ces manipulations montraient également des résultats discordants entre les auteurs qui mettaient en évidence un différentiel pressionnel entre les deux compartiments (Böhmer et al., n.d.)(Andrews et al., 1991)(Böhmer and Andrews, 1989)(Böhmer and Dillier, 1990)(Ito et al., 1987), et les auteurs qui retrouvaient une pression similaire(Klis and Smoorenburg, 1994; Tonndorf, 1983; Warmerdam et al., 2003). La question de la physiopathologie de cette maladie reste toujours d’actualité à savoir, est-ce l’hydrops (dilatation de la membrane limitante de Reissner) ? Ou l’excès pressionnel au dépend du compartiment endolymphatique (avec action prépondérante sur la membrane basilaire) qui est responsable des symptômes ?
Bénéfices attendus
comprehension des mecanismes sous-jacents responsables des symptomes de la maladie de Méniere, ce qui permettra ulterieurement d'adapter la thérapeutique
Procédures
Procedure chirurgicale (abord de l'oreille moyenne - catheterisation des espaces sub-arachnoidiens) et d'elevation de pression intracanienne : une procédure par animal (durée entre 2 et 3 heures)
Impact sur les animaux
Aucun, car animal anesthésié profondement puis sacrifié à la fin de l'intervention
Devenir
le sacrifice animal est necessaire du fait de l'effet de l'hyperpression intracranienne sur le parenchyme cerebral pendant la procedure qui n'est pas compatbile avec le reveil de l'animal
Remplacement
L’expérimentation sur la gerbille de Mongolie -qui est fréquemment utilisée au sein du laboratoire de biophysique neurosensorielle- a dans la majeure partie des cas été réalisée sans écueil particulier du fait de la facilité d’accès aux structures de l’oreille interne. L’animal doit être vivant, cela permet d’étudier les phénomènes osmotiques, biomécaniques et régulateurs actifs des pressions de l’oreille interne, phénomènes qui ne peuvent être observés chez l’animal mort. Enfin, il demeure impossible d’étudier ces phénomènes chez l’être humain, ce qui imposerait de cathétériser l’oreille interne avec risque accru de surdité sévère et vertiges invalident, le cathétérisme des espaces sous arachnoïdiens est également un acte invasif qui ne se justifie pas en conditions normales.
Réduction
Les etudes précedantes réalisées (voire le chapitre dédié) nous permettent de reduire l'effectif d'animaux necessaires au minimum
Raffinement
le bien-être animal sera amélioré grâce l’hébergement des animaux en groupe dans des cages enrichies. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré, per-opératoire
Choix des espèces
Le système cochleo-vestibulaire de la gerbille de Mongolie est sensiblement identique à son homologue humain. Lors des précédentes études, le cochon d’inde avait été utilisé, mais le fait qu’il présente des épisodes fréquents d’otite séreuse rend difficile l’expérimentation sur son oreille moyenne et interne. L’expérimentation sur la gerbille de Mongolie -qui est fréquemment réalisée au sein du laboratoire de biophysique neurosensorielle- a dans la majeure partie des cas été réalisé sans écueil particulier du fait de la facilité d’accès aux structures de l’oreille interne. L'appareil vestibulaire de la Gerbille est mature à partir de la première semaine post-natale tandis que l'appareil auditif l'est à 21 jours, lorsqu'elles ont atteints leur taille adulte. C'est donc à cet âge que nous commencerons les tests pressionnels