Rongeurs

Les souris retenues sont sensibles au SARS-CoV-2 et développeront des symptômes généralisés après inoculation. 192 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une puce télémétrique leur est implantée, elles sont infectées puis suivies quinze jours avec des prélèvements sanguins à la lancette, une perte de poids et une chute de température étant attendues, et leurs cerveaux, poumons, intestins, rate et sang sont prélevés après la mise à mort. Le porteur écrit que 200 souris correspondent au "nombre minimal nécessaire", alors que le tableau des gravités n'en déclare que 192.

Objectifs

Les conjugués peptide-porphyrine sont des médicaments antiviraux à très large spectre capables de pénétrer dans le cerveau et le placenta, et donc de protéger le système nerveux central et les fœtus contre l'action des virus. Ils doivent leur large spectre d'activité à la cible particulière qu'ils visent dans la structure virale : l'enveloppe lipidique. Cette classe de composés compromet l'intégrité des enveloppes et les virus sont incapables de réparer les dommages, ce qui entraîne une perte de fonctionnalité. La preuve de concept a été établie in vitro avec les virus SARS-CoV-2 et Zika et in vivo avec le virus Zika. Il est nécessaire de valider l'activité antivirale des conjugués contre le SARS-CoV-2. Dans ce cadre, les trois conjugués préalablement validés pour leur efficacité contre plusieurs souches de SARS-CoV-2 sont des candidats prometteurs pour une visée thérapeutique. Il est nécessaire de renforcer ces résultats obtenus in vitro par des essais in vivo. Ces antiviraux injectés à plusieurs temps à des souris préalablement infectées par le SARS-CoV-2 devraient initier une protection chez l’animal face à l’infection, diminuant voire empêchant l’apparition de signes cliniques.

Bénéfices attendus

La validation des antiviraux testés dans le cadre de cette étude servira de base pour amorcer leur développement clinique dont l’utilisation finale sera d’améliorer la prise en charge des patients atteints de formes sévères de la COVID-19.

Procédures

Tous les animaux, soit 192 souris. Des prises de sang seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une lancette (5 minutes par animal, 3 fois soit une fois par semaine). Administration des anti-viraux ou placebo sur animaux en contention. L’objectif est de mesurer l’efficacité thérapeutique antivirale (5 minutes par animal, 8 fois). Challenge infectieux sous anesthésie générale. L’objectif est d’induire une infection pulmonaire. (10 min par animal, 1 fois).

Impact sur les animaux

Le protocole développé dans cette étude consiste à infecter des lots de souris avec du virus SARS-CoV-2. Les souris utilisées sont sensibles à ce virus et vont développer des symptômes généralisés mais avec une faible mortalité au vu des doses inoculées. Une perte de poids temporaire ainsi qu’une perte de température est attendue suivi d’une survie de 15 jours. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon les observations biquotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie sous-cutanée pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantation de la puce télémétrique. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal. La prise de sang peut aussi engendrer un stress et une douleur légère au point de prélèvement lors de l’utilisation de la lancette.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (cerveaux, poumons, intestin, rate, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le suivi des antiviraux dans les tissus, pour le recrutement cellulaire et la réponse immunitaire induite.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie thérapeutique et pour mimer une clinique proche de l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. Cette taille d’échantillon de 12 souris permet de détecter un effet modéré. Au total, 200 souris sont prévues pour ce projet, ce qui correspond au nombre minimal nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques (efficacité antivirale) tout en respectant le principe de réduction des 3R.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe social, dans des cages respectant les surfaces réglementaires et dans un environnement enrichi par différents types comme de la cellulose ou du sizzle, des bâtonnets de bois et des tunnels ou maisonnette/dôme… Les animaux sont transportés via un transporteur agréé dans un véhicule adapté et respectant au mieux les conditions et paramètres environnementales jusqu’à leur acheminement dans leur lieu d’hébergement définitif où ils sont ainsi manipulés pour les déplacer de la boite de transport vers la cage d’hébergement. Lors de cette manipulation, il est implanté la puce télémétrique. Ensuite vient la phase d’acclimatation où les animaux vont s’habituer progressivement à leur nouvel environnement et à la visite quotidienne des techniciens animaliers. Dès leur arrivée et pendant l’acclimatation, une récompense alimentaire sera distribuée aux animaux de type, graine à décortiquer, popcorn... Puis durant la procédure après chaque manipulation sur l’animal, afin de récompenser et favoriser l’acceptation des gestes. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites via un suivi clinique. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Les injections pour les anesthésies et les traitements seront réalisés par voie sous-cutanée, moins nocive que la voie intrapéritonéale, tout en maintenant une efficacité comparable. L’euthanasie au pentobarbital pouvant provoquer des douleurs, les animaux seront anesthésiés avant l’injection létale. Les prélèvements de sang seront espacés de plus d’une semaine.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par l’inoculation d’anticorps post-infection dans l’étude du COVID. Le modèle de souris humanisée est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux COVID. Adulte et immunocompétent (6 semaines). Le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents en vue de passer à une étude clinique.

910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour que leurs foies soient collectés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie, des injections répétées et le développement de tumeurs du foie, par groupes de dix. Une nouvelle piste thérapeutique pour les patients atteints de carcinome hépatocellulaire est annoncée au conditionnel et à terme, quand l'objectif immédiat est de caractériser une protéine et de tester des anticorps qui la bloquent. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne répond de façon fiable à ces questions et minimise l'atteinte en décrivant le foie comme un tissu "peu sensible (peu innervé)".

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire est la principale forme de cancer du foie. Il est particulièrement agressif et cause chaque année environ 800 000 décès dans le monde. Lorsque la chirurgie n’est plus possible, les traitements actuels restent souvent insuffisants : même si l’immunothérapie a marqué un progrès, seul un patient sur trois y répond durablement. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles approches. Notre projet s’intéresse à une protéine présente à la surface des cellules et impliquée dans la croissance des tumeurs du foie. Des anomalies génétiques augmentant l’activité de cette protéine sont retrouvées chez 10–15 % des patients et sont associées à un moins bon pronostic. Cette protéine est encore peu étudiée, mais nos partenaires académiques ont mis au point des anticorps capables de la bloquer. L’objectif est double : (1) comprendre le rôle précis de cette protéine dans l’apparition et l’évolution du cancer du foie à l’aide de modèles pertinents ; (2) évaluer des anticorps ciblant cette protéine comme candidats médicaments, afin de vérifier s’ils freinent la croissance tumorale. À terme, ces travaux pourraient ouvrir une nouvelle piste thérapeutique pour des patients aujourd’hui sans alternative efficace.

Bénéfices attendus

Nous attendons des résultats qui éclaireront comment certaines cellules du foie deviennent cancéreuses, avec des enseignements possiblement utiles à d’autres cancers. Le projet devrait préciser le rôle de la protéine étudiée et valider dans nos modèles un anticorps contre cette protéine comme agent thérapeutique capable de ralentir la croissance tumorale. En parallèle, nous viserons l’identification d’un marqueur sanguin simple permettant de repérer les patients les plus susceptibles de répondre, pour aller vers une médecine plus personnalisée. À court terme, les retombées incluent des publications et des outils biologiques partagés ; à moyen terme, ces données pourraient ouvrir la voie à une évaluation clinique précoce et à de nouvelles options thérapeutiques pour des patients aujourd’hui sans alternative efficace.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection des cellules dans le foie, nécessitant un acte chirurgical sous anesthésie (15 minutes par souris), ou bien à une injection de solution saline contenant de l’ADN (30 secondes par souris). Des produits permettant l’imagerie des tumeurs seront injectés avant acquisition des images, et pour certaines souris du sang sera prélevé de manière hebdomadaire.

Impact sur les animaux

Les effets sont le développement de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elles sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte pas le fonctionnement de l’organe. Il existe également un stress induit par la contention de l’animal,l’injection des produits, et une gêne possible liée à la cicatrice. Les animaux sont évalués quotidiennement pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies pour les analyses liées au projet.

Remplacement

Notre objectif est de caractériser in vivo les effets cancereux de la protéine PZR et d’évaluer des anticorps dirigés contre ce récepteur. Nous avons réalisé le plus d’expériences possible sur cellules en culture, ce qui nous a permis d’obtenir des résultats importants tout en limitant l’usage d’animaux (principe de remplacement). Cependant, pour tester efficacement ces anticorps comme nouvelle option thérapeutique et vérifier leur impact réel sur la formation et la croissance des tumeurs, nous devons maintenant passer à des expériences chez la souris : l’environnement du foie, les interactions avec d’autres organes et la réponse globale de l’organisme ne peuvent pas être entièrement reproduits en culture. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de répondre de manière fiable à ces questions. Cette étape in vivo est donc nécessaire ; dès que les informations clés auront été obtenues dans ce modèle, nous reviendrons aux lignées cellulaires pour affiner et prolonger nos analyses

Réduction

Nous avons tout mis en œuvre pour utiliser le moins d’animaux possible dans ce projet. En collaboration avec notre service de statistiques, nous avons soigneusement calculé le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Il en ressort qu’il nous faut 10 animaux par groupe expérimental pour pouvoir répondre de manière rigoureuse à notre question scientifique. Par ailleurs, nous avons restreint nos expériences au strict nécessaire, en limitant à la fois le nombre de cellules testées et le nombre de moments d’analyse, afin de réduire au maximum l’impact sur les animaux tout en conservant la validité des résultats.

Raffinement

Nous avons soigneusement planifié et optimisé notre protocole expérimental, en suivant les recommandations européennes, afin de réduire au maximum les contraintes pour les animaux. Concrètement, nous avons choisi une anesthésie plus légère, réduit la durée de la chirurgie et utiliserons un tapis chauffant pour stabiliser la température corporelle, ainsi que l’application d’une crème réparatrice pour favoriser la cicatrisation. Les solutions injectées sont préchauffées. Ensuite, grâce à une grille de surveillance, nous suivrons les animaux quotidiennement pour intervenir si nécessaire et éviter qu’ils ne développent un inconfort lié à la tumeur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie et de la physiologie hépatique. Le modèle proposé est le plus proche de la maladie humaine, permettant d’analyser les premières étapes du développement de tumeurs. La souris est également un modèle d’étude classique pour tester de nouveaux médicaments dans les cancers. Ces approches sont soutenues par de nombreuses publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (cancer de l'adulte).

Une chambre dorsale est implantée chirurgicalement dans le dos de chaque souris, qui reçoit ensuite des injections de cellules tumorales et un agent de contraste avant des séances de microscopie confocale sous anesthésie générale. 10 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue parce qu'elles portent ce dispositif, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le port de la chambre impose un hébergement individuel dont le porteur reconnaît qu'il peut induire de l'apathie. Ces implantations forment un à trois personnels déjà qualifiés en chirurgie et en imagerie, et le porteur écarte toute nuisance liée aux cellules tumorales au motif de la durée de maintien des animaux, sans jamais indiquer cette durée.

Objectifs

L'imagerie optique des tissus sur animal vivant, autrement appelée "imagerie intravitale", est actuellement la seule méthode pour étudier les aspects dynamiques des processus physiologiques ou pathologiques à l'échelle cellulaire. Cette méthodologie passe par l'implantation chirurgicale de chambres dorsales, crâniennes ou abdominales au travers desquelles les tissus à observer sont physiquement exposés de manière stérile. Introduite depuis plusieurs années, elle a été développée essentiellement en cancérologie pour : 1- analyser les mouvements et interactions cellulaires ; 2- observer les modifications anatomiques et fonctionnelles des réseaux vasculaires ; 3-comprendre et optimiser les mécanismes d'action de molécules thérapeutiques. Ces chambres ont été développées par des laboratoires académiques et restent confinées à leurs propres fins de recherche. Dans le laboratoire, nous avons développé et validé un modèle de chambre dorsale multimodal toléré sur plusieurs mois par la souris. L'expérience acquise à ce jour avec ce dispositif nous a permis de définir une procédure chirurgicale optimisée en terme de gestes opératoires tant dans leur réalisation que dans leur enchainement réduisant ainsi la durée de la chirurgie à son minima et améliorant la survie de l'animal. De la même manière, les procédures en imagerie optique suivent désormais des protocoles précis à la fois dans la prise en charge des animaux et leur maintien en conditions les plus favorables possibles, que dans les protocoles d'acquisition d'images proprement dits. Nous souhaitons former 1 à 3 personnels préalablement qualifié en chirurgie et en imagerie photonique.

Bénéfices attendus

A l'issue de la formation, le stagiaire aura connaissance de l'ensemble des étapes pour l'implantation et le suivi en imagerie d'une chambre dorsale sur animal greffé. Toutes les informations éthiques et scientifiques lui auront été communiquées (documents papier et échanges oraux). Le format tutorat de la formation permet une prise en charge quasi individuelle du stagiaire conduisant à une meilleure interaction entre les différents intervenants. Un support technique post-tutorat pourra garantir la bonne mise en application des procédures apprises au moment de la formation. Une fois l'ensemble de la procédure acquis, les stagiaires pourront la mettre à profit pour leur propre projet de recherche et former d'autres personnels s'ils le jugent opportun.

Procédures

Implantation de la chambre dorsale sous anesthésie générale : 45min entre le début de l'anesthésie et le réveil de l'animal : la procédure en elle-même dure 30 min. L'intervention inclut l'injection d'agents analgésiques lors de la chirurgie sous anesthésie générale (2 injections par animal, durée 20 secondes par injection), Fixation de la chambre dorsale par suture (durée 10 minutes maximum), Incision de la peau (durée quelques secondes), Injection intradermique de cellules tumorales sous anesthésie générale (1 par animal - 30sec). 2. Phase d'imagerie: Injection de l'agent de contraste sous anesthésie générale (1 par animal - 2min), Acquisition d'images en microscopie (1 par animal- 30min).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale entrainera une contrainte légère et transitoire (anesthésie générale). La présence de la chambre entrainera une contrainte modérée en termes de mobilité et de douleur. L'injection d'agent de contraste lors de la procédure d'imagerie entrainera une contrainte légère et transitoire (anesthésie générale). Les injections de cellules tumorales et les injections entraineront un stress physique et transitoire (préhension) et une douleur et une contrainte légère et transitoire (injections sous anesthésie locale ou générale). L'examen en microscopie confocale sous anesthésie générale entrainera une contrainte légère et transitoire. Aucune nuisance spécifique n'est attendue suite à l'injection des cellules tumorales par voie sous-cutanée vu la durée de maintien des animaux en procédure. Les animaux en hébergement individuel pourront souffrir de la diminution de leurs interactions sociales avec d'autres individus, ce qui peut induire de l'apathie.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés car porteurs de chambres dorsales.

Remplacement

La formation s'adresse à des personnes autorisées et qualifiées en chirurgie et imagerie. Il s'agit de transmettre les gestes opératoires spécifiques à la greffe de chambre dorsale dont la maitrise dépend de l'élasticité cutanée, du réseau vasculaire et du derme à préserver au mieux afin de garantir une greffe qui sera exploitable pour l'imagerie. Ces paramètres ne peuvent être correctement reproduits sur des fantômes plastiques de souris. De plus, les acquisitions en imagerie peuvent être biaisées par une mauvaise prise en charge de l'animal et de son monitoring. Par ailleurs, les protocoles en imagerie sont réalisés après injection intraveineuse d'un biomarqueur pour réhausser le signal des microvaisseaux. Or ce type d'expérience n'est absolument pas réalisable sur fantômes. Pour toutes ces raisons, le recours à l'animal est incontournable et indispensable dans ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, l'équipe formatrice implantera un seul animal afin de garantir la qualité de la séance d'imagerie en cas d'échec de l'implantation par le stagiaire (risque d'inflammation, mauvaise fixation de la chambre). Pour le stagiaire, 2 animaux seront nécessaires pour qu'il acquiert les 2 postes du binôme formateur (chirurgie/assistant chirurgie).

Raffinement

Toutes les interventions sur l'animal, de l'implantation de la chambre dorsale à l'imagerie intravitale, seront réalisées sous anesthésie générale. Concernant la procédure chirurgicale, une anesthésie locale sera réalisée avant l'incision de la peau et un anti-douleur sera administré avant le réveil de l'animal. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement l'apparition de signes cliniques. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront pesés au moins 2 fois par semaine afin de prévenir une éventuelle détérioration de l'état général. Si des signes de douleurs sont détectés un analgésique sera administré après analgésie locale. Avant l'implantation chirurgicale, les animaux seront stabulés en groupe, aliment et eau ad libitum, un enrichissement adapté sera présent dans toutes les cages. Compte tenu de la présence de la chambre dorsale, les animaux devront être hébergés individuellement après la procédure chirurgicale. Cependant une augmentation de l'enrichissement permettra de réduire l'impact de l'isolement et l'animal restera en contact visuel avec ses congénères. Afin de favoriser la récupération post-chirurgicale, un aliment préhensile et energétique sera ajouté dans toutes les cages.

Choix des espèces

Le développement du modèle de chambre dorsale a été conduit chez la souris, animal de référence pour les études en cancérologie. La souris de la souche sélectionnée est préférée du fait de son élasticité cutanée et de l'absence de poils qui facilitera la greffe chirurgicale en particulier pour des novices à ce type de chirurgie. Les animaux seront adultes (minimum 8 semaines). Compte-tenu de l'encombrement de la chambre dorsale sur le dos de l'animal et de la procédure chirurgicale, la physionomie de l'animal doit être suffisamment robuste pour limiter la mortalité lors de la chirurgie. Des études préliminaires ont montré une mortalité opératoire plus importante quand l'animal avait moins de 8 semaines.

425 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles reçoivent un traitement de superovulation, subissent une anesthésie de trois minutes avec un risque d'hypothermie, puis sont tuées pour que leurs ovules soient récoltés. L'objectif déclaré est de comprendre le rôle d'un gène de la méthylation de l'ADN dans le développement embryonnaire précoce, dont l'absence réduit le réservoir ovarien et rend les femelles stériles. Le porteur affirme qu'aucun protocole ne permet d'étudier ce développement in vitro à partir d'ovules fécondés.

Objectifs

La méthylation de l'ADN est une modification chimique pouvant réguler l’expression des gènes sans modifier la séquence d’ADN. Ces modifications chimiques sont des groupements « méthyles » qui peuvent être ajoutés sur l’ADN et qui peuvent modifier la manière dont est perçu l’information génétique. Nous pourrions comparer la méthylation de l’ADN à la ponctuation d’une phrase. Prenez par exemple la phrase : « On va manger, mami ! ». Si vous enlevez la virgule et remplacer le « ! » par une « . » la phrase n’a plus du tout la même signification (On va manger mami.). Chez les mammifères, la méthylation de l’ADN peut induire une répression stable des gènes de façon réversible. En effet, il est important d’exprimer les gènes embryonnaires au bon stade du développement et pas à l’âge adulte. Ainsi, cette modification a des fonctions régulatrices importantes au cours du développement embryonnaire et gamétique et est transmise à travers les générations. Une altération de ces profils de méthylation est observée dans les cadres de cancers et autres maladies. L’objectifs de ce projet est de mieux comprendre le rôle d’un nouvel acteur de la méthylation de l'ADN sur le développement embryonnaire précoce. En effet, des résultats préliminaires démontrent que son l’absence de ce gène conduit à une hypofertilité chez les femelles avec une réduction du réservoir ovarien ainsi qu’une stérilité (pas de naissance). Les données obtenues au cours de ce projet pourront avoir des retombées pour mieux comprendre l’infertilité humaine puisque ce gène est conservé chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre le rôle d'un gène dans le développement des ovocytes et de mettre en évidence de nouveaux mécanismes moléculaires qui régulent la fertilité et le développement embryonnaire chez la souris. L’objectif final de ce projet est de transposer nos résultats à l’homme dont les problèmes d'infertilité sont en constante augmentation et constituent un enjeu de santé publique majeur. En effet, ce gène étant conservé chez l’être humain, il serait envisageable d’utiliser ce dernier soit comme outils de diagnostic, soit comme nouvelle cible thérapeutique dans le cadre de la procréation médicalement assistée pour des maladies tel que l’IOP (Insuffisance ovarienne prématurée, prévalence de 1/10 000 chez les femmes de moins de 20 ans, 1/1 000 chez les femmes de moins de 30 ans et 1% chez les femmes de moins de 40 ans).

Procédures

Les animaux recevront deux injections espacées de 48h sous anesthésie. L'injection dure environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Il y a un risque d’hypothermie des animaux bien que l’anesthésie soit de courte durée (~3min).

Devenir

Les animaux seront mis à mort dans le but de récolter les ovules.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de protocole pour étudier le développement embryonnaire in vitro à partir d’ovules fécondés. C’est pourquoi nous effectuerons nos expériences sur des échantillons primaires isolés de souris.

Réduction

Le protocole de superovulation permet de stimuler la production d'ovocytes et donc de réduire le nombre de femelles utilisées. L’utilisation du protocole de culture in vitro d’embryons à la suite du protocole de superovulation permet d'étudier tous les stades de développement embryonnaire précoce et tardif simultanément pour un nombre significatif d’embryons. Ceci limite fortement le nombre de femelles utilisées par rapport à une approche in vivo qui nécessiterait de sacrifier des femelles à chaque stade de développement embryonnaire.

Raffinement

Les souris seront élevées en groupe dans des cages aux normes européennes et enrichies (maison, tube en carton, bâton en bois, frisures en carton pour la nidification…). Les enrichissements permettront : -de réduire le stress des animaux au cours de l’élevage en répondant à leur besoin de nidification et de cachette (maison, tube, frisures en carton) -de combler leur besoin de ronger/user leur dent afin de palier à la croissance continue de leurs incisives (bâton en bois) L’environnement et le bien-être des animaux seront vérifiés quotidiennement. Nous avons également établi des points limites afin d’atténuer la souffrance ou/et le stress des animaux. Dès lors que nous observerons un point limite, en fonction du degré de sévérité et de sa durée, soit nous soignerons l’animale, soit nous le mettrons à mort.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est justifié par les éléments suivants : (i) La méthylation de l’ADN est absente chez les modèles invertébrés tels que la levure, la drosophile (mouche du vinaigre) et le nématode (ver), (ii) les fonctions biologiques sont très conservées entre la souris et l’homme. (iii) la souris offre de nombreux modèles génétiques déjà existant, ce qui justifie son utilisation comme modèle d’étude. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris femelles âgées de 4 semaines pour la récolte d’ovules car il s’agit de l’âge auquel les femelles répondent le mieux à la stimulation hormonale.

Pour cribler jusqu'à douze candidats médicaments par cible et sur trois cibles au maximum, 6 000 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par injection dans la veine de la queue sur animal vigile, un poinçonnement auriculaire sans anesthésie, puis des prélèvements sanguins une à deux fois par semaine et un prélèvement de moelle osseuse deux fois par mois. Le porteur fixe la mise à mort à 80 % de cellules humaines détectées dans le sang ou à 20 % de perte de poids. Le criblage doit aboutir à un candidat principal mené en développement réglementaire et à une estimation de la dose pour la première injection chez l'être humain.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données d’efficacité antitumorale lors d’administration par voie intraveineuse de candidats médicaments de thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC), dans des souris immunodéficientes porteuses de xénogreffes de lignées cellulaires leucémiques humaines. Ces composés étant majoritairement cross-réactifs humains/souris avec le même profil d’expression dans les deux espèces), les résultats chez la souris permettront de modéliser l’efficacité chez l’humain. Ces données d’efficacité en escalade de dose permettront d’effectuer une étude de criblage de candidats médicaments en fonction de leur cible, de leur niveau d’expression et des indications thérapeutiques pertinentes. Ces données permettront de sélectionner un candidat principal à mener en développement réglementaire et de contribuer à l’évaluation les doses minimales efficaces antitumorales (MED) pour la première injection chez l’homme. Ce projet est divisé en 2 procédures consécutives et interdépendantes pour chaque cible (répétables jusqu’à 3 cibles) : # Procédure-1 : Consiste en une Tumorogénèse sur différents modèles de xénogreffe tumorale issue de lignée cellulaire cancéreuse humaine (CDX – jusqu’à 10 modèles). Différents protocoles de la littérature seront testés en termes d’expression de la cible, de dispersion des courbes de croissance et d’homogénéité de croissance tumorale. # Procédure-2 : A l’issue des procédures de mise au point et de sélection des modèles CDX en termes de croissance tumorale, cette deuxième procédure (cœur du projet), consiste à cribler différents candidats médicaments (jusqu’à 12 par cible), en face de contrôles positifs et négatifs, à différentes doses et fréquences, sur 1 à 5 modèles CDX validés et sélectionnés précédemment.

Bénéfices attendus

Ce projet dans son ensemble vise à développer de nouvelle thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques (poumon, tète et cou, colorectal, utérus, ovaire, pancréas, leucémies…), tout en minimisant les effets secondaires et représente l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Cette étude permettra ainsi d’évaluer la dose minimale efficace antitumorale (MED), qui, en comparaison avec la dose maximum tolérée (MTD - étude séparée), définiront les bornes de la fenêtre thérapeutique. Ces études permettront ainsi de cribler les molécules sur leur fenêtre thérapeutique la plus grande et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser dans les modèles pré-cliniques et cliniques. La première procédure permettra de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux. La deuxième procédure permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés dans la procédure précédente.

Procédures

# Après une semaine d'adaptation à l'environnement, les souris seront identifiées : - Soit par poinçonnage auriculaire sur souris vigiles (2-3 minutes si moins de 100 souris). - Soit par puçage électronique (injection sous-cutanée sous capsulaire du transpondeur), sous anesthésie gazeuse (4-6 minutes). # Traitement des animaux par les différents médicaments par voie intraveineuse sur souris vigiles (2-3 minutes). # Des échantillons de sang périphérique seront prélevés 1 ou 2 fois par semaine. Chaque prélèvement de sang cumulé ou non retirera en fonction du poids de la souris un volume qui n’excédera pas la limite de 7.5% du volume sanguin total par semaine glissante (2-3 minutes). Ces échantillons de sang pourront être analysés NFS et/ou en cytométrie de flux pour évaluer l’évolution de l’infiltration blastique. De manière plus précise, prélèvements sanguins, de préférence par micro-échantillonnage ou par échantillonnage classique (veine caudale, sinus submandibulaire ou SRO). Des prélèvements de moelle osseuse en intra-fémoral seront également réalisés, sous anesthésie générale gazeuse en alternant les sites de prélèvements entre patte arrière gauche et droite, à un intervalle de deux semaines et à une fréquence d’un prélèvement par patte (J Vis Exp. 2014 Jul 5;(89):51660. doi: 10.3791/51660). Une dose préventive de buprénorphine avant la procédure, à raison de 0,05–0,1 mg/kg par voie sous‑cutanée toutes les 6 à 12 heures, peut être utilisée pour prévenir la douleur associée à la procédure, en complément du carprofène à 5 mg/kg par voie sous‑cutanée pourra être utilisé. Les souris prélevées en intra fémoral sont ensuite anesthésiées (induction de l’anesthésie dans la boîte à 3% d’isoflurane et 3% d’oxygène puis entretien de l’anesthésie au masque à 2-2,5% d’isoflurane et 2% d’oxygène) (6-8 minutes). # Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mis à mort. Une nécropsie ainsi qu’un prélèvement d’organes / tumeur pourront être réalisés post-mortem sur les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que sur les animaux arrivant en fin d’expérience. En cumule toutes ces manipulations ne dureront pas plus de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésie (s'il y a lieu - puçage électronique). Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la numérotation sur animal vigile par poinçonnement auriculaire, (2) de la greffe tumorale sur animal vigile par injection intraveineuse dans la veine caudale ainsi que lors (3) de l’injection par intraveineuse dans la veine caudale sur souris vigiles des candidats médicaments et (4) lors du prélèvement sanguin sur animal vigile et de moelle osseuse sous anesthésie. De façon plus particulière à cette étude (basée sur des modèles de souris dépourvues de système immunitaire et greffées en injection intraveineuse avec des cellules tumorales humaines - CDX), ces animaux seront suivis pour la croissance tumorale 1 à 2 fois par semaine par prélèvement sanguin et 2 fois par mois par prélèvement de la moelle osseuse, pour mesurer et analyser la tumeur et l'état général des animaux. Cette surveillance sera renforcée à l'approche des points limites. Les souris ayant un % de hCD45 de plus de 80% seront mises à mort par dislocation cervicale ou par augmentation progressive de la concentration en gaz carbonique (CO2).

Devenir

Pour chacune des deux procédures: - Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés.

Remplacement

Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de ces candidats médicaments anticancéreux (efficacité, stabilité dans les sérums, internalisation/vectorisation dans cellules tumorales), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique physiologique complexe est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique « first in human » dans les conditions d'injection par voie intraveineuse afin d’appréhender la dose minimale efficace anticancéreuse (MED) normalisées sur les données d’exposition pharmacocinétiques (PK). S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant majoritairement cross-réactif entre la souris et l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle murin. Également, l’implantation des cellules tumorales par voie intraveineuse est primordiale à évaluer. En effet, ces cellules sont nichées dans une matrice extracellulaire riche en molécules allant de différents métabolites et d’espèces réactives d’oxygène jusqu’à plusieurs facteurs inflammatoires, comme c’est notamment le cas de la niche ostéo-médullaire chez les patients atteints de leucémie. L’ensemble de ces acteurs cellulaires et moléculaires sont soumis à des contraintes mécaniques et à des niveaux d’oxygénation différents d’une localisation à une autre au sein de la même niche. Ainsi, l’étude d’efficacité de médicaments ciblant des cellules notamment leucémiques exige le maintien des interactions qu’il peut y avoir entre ces cellules et leur environnement, et ceci ne peut être assuré in vitro.

Réduction

La procédure-1 permettra de mettre au point les modèles et de les caractériser au mieux grâce à une tumorogénèse couplée à une étude d'efficacité, toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). Seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors de ces procédures de mise au point (tumorogénèse et étude pilote) seront utilisés par la suite. La procédure-2 s’effectue également sur un nombre limité d’animaux (qui sera adapté à la baisse en concertation avec notre structure bienêtre animal, en fonction des résultats obtenus lors de la procédure 1).Egalement, le fait de tester une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus au fil de l’eau (Q7D x1, x2 ou x3), permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés en testant jusqu’à deux doses pour la même molécule, au plus près des résultats biologiques. L'analyse statistique des résultats obtenus par les différentes expériences se fera au moyen de tests de Student et de Mann-Whitney (comparaison de deux groupes) ou d'analyses des variances (comparaison de plusieurs groupes), et de Kaplan-Meier (analyse de survie). L'analyse du nombre minimum d'animaux à utiliser pour répondre à chaque objectif avec une puissance statistique suffisante a été implémentée grâce au logiciel G*Power (critères de calcul : effectifs d'animaux équivalents entre chaque groupe, two-tailed, alpha = 0.05). Ce nombre sera de 10 souris par groupe, et a été estimé afin de générer des résultats significatifs en restant en accord avec la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4/5 dans des cages transparentes, aux dimensions adaptées, avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels…). Les conditions sanitaires permettent que leur phénotype ne soit pas dommageable (SPF). Une période de stabulation d’au moins 7 jours avant le début du protocole permettra leur acclimatation afin de réduire le stress des animaux. L’identification des souris sera effectuée sous anesthésie gazeuse si besoin pour le puçage électronique ou par poinçonnage auriculaire. Une surveillance comportementale/physiologique poussée des animaux et la définition d’une grille de score adaptée suffisamment prédictive, permettront de prévenir toute souffrance animale. Concernant les souris ayant reçu les cellules tumorales via injection intraveineuse, l’utilisation d’une technique d'imagerie non invasive ou des prélèvements de sang 1 à 2 fois par semaine sans anesthésie sera effectué pour suivre la croissance tumorale. Les prélèvements resteront dans la limite de 7,5% du volume sanguin total par semaine glissante. Aussi, 2 fois par mois, un prélèvement de moelle osseuse sous anesthésie sera effectué pour suivre le développement leucémique et la charge tumorale. Les animaux auront reçu une dose préventive de buprénorphine avant la procédure (à raison de 0,05–0,1 mg/kg par voie sous‑cutanée pouvant être répétées toutes les 6 à 12 heures). En plus, pour prévenir la douleur associée à la procédure e plus du carprofène à 5 mg/kg par voie sous‑cutanée, pourra être utilisé. Cela permet de déterminer le plus précocement possible le début du traitement et de la réponse. Le pourcentage limite de 80% de détection de hCD45 dans le sang et perte de poids de 20% constitueront des points limites. Un système de surveillance 7/7 est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux. Les animaux inclus dans la grille de score n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés dès que nécessaire (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience sont mis à mort par dislocation cervicale si besoin sous anesthésie gazeuse ou par augmentation progressive de la concentration en gaz carbonique. Afin de s’assurer de la mort effective des animaux, une vérification de la mort (prise de pouls …) sera effectuée.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Afin d’étudier les effets de candidats médicaments sur des xénogreffes de tumeurs humaines (CDX), dans un contexte physiologique, des animaux immunodéprimés sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données allométriques permettant de transposer ces données chez l’Homme). Enfin, les candidats médicaments étudiés dans ce projet pouvant être cross-réactif entre la souris et l’humain, aucune alternative ne peux se substituer à un modèle murin. Les animaux immunodéprimés (portant la mutation Nude ou SCID et de fond génétique choisi en cohérence avec le modèle tumorale décrit dans la littérature), seront livrés à partir de 7 semaines de développement et inclus en expérience après 7 jours d’acclimatation dans l’EU. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant une allométrie pertinente par rapport aux thérapies médiées par des anticorps. Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos conditions d’hébergement et d’expérimentation (animalerie SPF et expérimentation sous PSM).