Rongeurs

192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. Un cathéter intraveineux leur est implanté à demeure sous anesthésie, puis ils enchaînent cinquante séances quotidiennes d'auto-administration de cocaïne de trois heures chacune, et dix séances de mesure de choix où des impulsions électriques servent de punition. Le but déclaré est de comprendre comment une consommation répétée devient incontrôlable, pour mieux prévenir et traiter l'addiction chez l'être humain. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun test in vitro ou in silico ne permet cette recherche et qu'il n'est donc "pas envisageable d'utiliser des méthodes de substitution à l'animal entier".

Objectifs

L’addiction aux drogues est une maladie qui se traduit par une perte de contrôle : la personne continue de consommer malgré les conséquences négatives sur sa santé, sa vie sociale ou professionnelle. Cette perte de contrôle n’apparaît pas chez tout le monde, mais peut survenir chez certaines personnes après une consommation prolongée. Elle est due à des interactions complexes entre la drogue et le fonctionnement du cerveau. Pour mieux prévenir et traiter l’addiction, il est essentiel de comprendre ce qui rend certaines personnes plus vulnérables que d’autres. Des recherches suggèrent que la prise répétée de drogue pourrait conduire à des habitudes de consommation qui peuvent devenir pathologiques, si bien qu'une personne continue de consommer même si elle sait que cela lui fait du mal. Cependant, on ne sait pas encore précisément comment ces habitudes peuvent évoluer vers une consommation compulsive, c’est-à-dire incontrôlable. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre comment la répétition de certains comportements peut conduire à une perte de contrôle. Plus spécifiquement, l’objectif est de vérifier si certains individus sont plus enclins que d’autres à former des habitudes de consommation qui peuvent ensuite devenir compulsives. L’objectif final est de mieux comprendre les mécanismes cognitifs de l’addiction pour pouvoir, à terme, améliorer la prévention et les traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche pourrait permettre de mieux comprendre pourquoi certaines personnes deviennent dépendantes à la drogue et n’arrivent plus à s’arrêter, même si elles en souffrent. En identifiant les mécanismes cognitifs qui transforment une consommation volontaire en une habitude incontrôlable, nous espérons trouver de nouvelles façons de prévenir l’addiction avant qu’elle ne s’installe, et de développer des traitements plus efficaces pour aider les personnes déjà dépendantes.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter (durée : 15minutes par animal,) pour permettre l’auto-administration. Sur animaux vigiles : - 50 sessions d’auto-administration de cocaine (1 session / jour, 3 heures par session,). - 10 sessions de mesure de choix (1 session / jour, 5 minutes par session).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : Chirurgies : inconfort transitoire au réveil ; implantation d’un cathéter intraveineux à demeure : risques d’infection ou démangeaisons ; Impulsions électriques légères lors des tests de punition. Stress généré lors des différentes manipulations.

Devenir

Tous les animaux, à l’issue des procédures seront mis à mort afin de prélever le cerveau pour étudier les mécanismes neurobiologiques impliqués dans la compulsion à consommer de la drogue.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement habituel, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, nous utiliserons un maximum de 192 animaux sur 5 ans pour répondre à nos objectifs.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés et compétents. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 3 fois par semaine. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et en cycle inversé avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger ; balle de jeu) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues/récompenses naturelles qui sont similaires à celles de l’Homme et ils peuvent apprendre à s’auto-administrer toutes les drogues abusées par l’Homme, de façon spontanée. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.

Neuf tests comportementaux répartis sur deux semaines, deux gavages de glucose, une injection d'insuline, dix-neuf prélèvements de sang et un jeûne pouvant aller jusqu'à seize heures sont infligés à 96 souris génétiquement modifiées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, pancréas, foie, intestin et contenu du cæcum. L'étude cherche à établir si le fond génétique modifie la réponse des souris au fructose, étape que le porteur présente comme préalable à une future étude sur les mécanismes d'action. Les neuf tests censés mesurer l'anxiété, l'humeur dépressive et la mémoire ne sont pas nommés.

Objectifs

La consommation de fructose a fortement augmenté au cours des dernières décennies, notamment par le biais des produits alimentaires ultratransformés et par les boissons sucrées. Plusieurs études ont montré l’impact négatif de cette surconsommation sur la santé (obésité, diabète de type 2, etc.), troubles de l’humeur (anxiété, dépression). On ne sait pas comment le fructose provoque ces effets néfastes. Dans l’intestin grêle, il est peu absorbé par rapport au glucose. Son excès provoque sa présence en quantités anormales dans le gros intestin et y altère la flore bactérienne. Ce phénomène est amplifié chez près de la moitié de la population qui présente des problèmes d’absorption intestinale du fructose, pathologie encore mal diagnostiquée. Des travaux préliminaires sur la souris montrent que les cellules immunitaires du cerveau sont activées par l’excès de fructose indiquant un état inflammatoire néfaste à long terme. De plus, des tests de comportement révèlent un état dépressif de ces animaux. Mais on ne sait pas si le fructose agit directement sur le cerveau ou/et si ses effets sont la conséquence d’un dysfonctionnement intestinal ou sanguin. Cette étude va nous permettre de déterminer si les différences génétiques ont un impact sur les effets du fructose chez la souris.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer dans quelle mesure le fond génétique des souris et leurs conditions d’hébergement influencent leur réponse au fructose, tant sur le plan comportemental que physiologique. Ces données sont cruciales pour mettre en place une étude sur les mécanismes d’action du fructose.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des tests de comportement durant 5 à 20 minutes pour permettre d’analyser des comportements émotionnels et de mémoire : 4 tests différents répartis sur 4 jours une semaine (jour de repos le mercredi) et 5 tests différents répartis sur 5 jours une autre semaine. Trois semaines sépareront les 2 semaines de tests. Au cours du protocole expérimental, les animaux vigiles seront soumis à 2 reprises à un test de tolérance au glucose et une fois à un test de résistance à l’insuline. Ils recevront au total 2 gavages de glucose et 1 injection d’insuline pour un suivi de la glycémie pendant 2 heures (glycémie mesurée à 7 et 5 temps différents par prélèvement d’une goutte de sang d’une durée inférieure à 10 secondes, soit un total de 19 prélèvements). Les gavages et injections ne durent qu’une dizaine de secondes, maximum 20 secondes. Les animaux seront mis à jeun 16 heures maximum une fois, et 6h deux fois, une fois 4h, puis 2h en fin de protocole. Un prélèvement sanguin sera effectué une fois, d’une durée d’environ 20 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages et des prélèvements (moins de 20 secondes). Les animaux seront soumis à un stress durant les tests de comportement (10 minutes maximum). Les animaux seront soumis à une légère douleur lors des prélèvements sanguins. Les souris seront soumises à des périodes de jeûne (16 heures, 6 heures et 4 heures) ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever et analyser certains tissus (cerveau, pancréas, foie, intestin et contenu de caecum).

Remplacement

L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives ne peut être faite que sur des animaux vivants, tout comme l’étude des effets physiologiques d’un changement de consommation alimentaire. Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant les remplacer. Enfin, les analyses tissulaires doivent être réalisées sur des organes entiers qui tiennent compte de l’anatomie réelle qui existe chez les individus, en particulier le cerveau constitué d’un réseau de voies nerveuses encore impossible à reproduire.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. D’après de précédentes études, 12 animaux par groupe expérimental semblent nécessaires pour obtenir des résultats rigoureux suite aux tests comportementaux.

Raffinement

Pour réduire au maximum le stress des animaux, une semaine avant le début du protocole, ils seront habitués à être pris de leur cage au moyen d’un tunnel en plastique et à être manipulés pour les gestes de contention. Un suivi visuel quotidien des animaux sera opéré et leur poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués pour limiter au mieux la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris, qui est un mammifère comme l’Homme. Les tests de glycémie et de comportement sont bien connus chez ces rongeurs et nous pourrons comparer nos résultats à ceux d’études antérieures. Elles seront étudiées à l’âge adulte (10 semaines) pour reproduire la malabsorption intestinale du fructose observée chez l’Homme lorsque la flore intestinale est mature et évaluer leur santé mentale. Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés qui seront nécessaires pour la poursuite de notre projet, où le transporteur au fructose sera invalidé spécifiquement dans le cerveau ou l’intestin afin de déterminer si l’effet du fructose est du à son action directe au niveau du cerveau ou à sa malabsorption au niveau intestinal.

1 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une ou deux injections provoquant la présence de bactéries dans le sang, puis cinq prélèvements sanguins étalés sur quatre à dix jours selon la procédure, avant récupération de leurs organes. Le bénéfice annoncé, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques face à la résistance aux antibiotiques, reste au conditionnel, quand les atteintes décrites sont l'inconfort des injections et des prélèvements répétés et une perte de poids liée aux infections. L'effectif de 1 530 animaux tient en une phrase, justifié par des "calculs statistiques" dont le détail n'est pas donné.

Objectifs

Les maladies infectieuses sont responsables d’un grand nombre de décès dans le monde et représentent la troisième cause de mortalité en France, avec un impact sanitaire et économique majeur. Les bactéries dites « pathogènes » sont à l’origine de la majorité de ces maladies, soit par leur simple présence dans les tissus infectés, soit par la production de molécules qui déclencheront une réponse immunitaire. L’inflammation est un mécanisme naturel qui permet à l’organisme de se défendre contre les infections. Mais lorsqu’elle est mal contrôlée ou excessive, elle peut contribuer à des déficits immunitaires et des cancers. Une bonne connaissance des phénomènes de contrôle de cette inflammation est donc indispensable pour la protection de l’hôte contre les microbes. L’objectif de ce projet est d’identifier les systèmes impliqués dans la défense de l’organsime contre l’infection. Une étude de la littérature, ainsi que des résultats préliminaires obtenus in vitro sur cellules, ont mis en évidence le rôle de certaines protéines dans la réponse immunitaire contre les bactéries. Nous souhaitons donc confirmer le niveau d’implication de ces protéines dans la bactériémie (présence de bactéries dans le sang) induite chez la souris.

Bénéfices attendus

Du fait de l’étendue actuelle et à venir de la résistance aux antibiotiques, le développement de nouveaux médicaments dans le traitement des maladies infectieuses est crucial. Une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu dans ces échanges entre l’hôte et le pathogène devrait permettre d’identifier de nouvelles cibles pour de nouvelles applications thérapeutiques dans la prise en charge des patients atteints d’infections bactériennes.

Procédures

Les animaux subiront des injections : selon les procédures 1 injection, ou 2 injections espacées de 15 jours. Ils subiront également des prélèvements sanguins à différents temps post injection : 5 prélèvements étalés sur 4 jours ou 5 prélévements étalés sur 10 jours en fonction de la procédure. La durée de chaque intervention n’excède pas une dizaine de secondes. A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : un léger inconfort produit par les injections intra-veineuses et les prélèvements de sang répétés, et une perte de poids possible liée aux infections.

Devenir

Les animaux utilisés dans cette demande seront infectés, et leurs organes récupérés après leur mise à mort. Ils ne pouront donc pas être réutilisés.

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro afin d’identifier au préalables les acteurs du dialogue entre la bactérie et l’hôte. Ces résultats doivent maintenant être confirmés in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est basé sur des calculs statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour avoir des résultats robustes et fiables.

Raffinement

Après infection et/ou toute intervention, ils seront surveillés quotidiennement par les responsables du projet afin de détecter toute apparition de signes de souffrance durables non reliés à l’infection. Le cas échéant les animaux seraient plus particulièrement surveillés et si les symptômes se prolongeaient au-delà de 24 heures, les animaux concernés seraient mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle d'étude pertinent de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la drosophile aux mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines.

Huit passages au scanner sous anesthésie et huit sessions de suivi de la démarche par animal, sur les huit semaines qui suivent l'opération : 36 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Un défaut osseux de 2 mm est percé dans un fémur après ouverture des tissus musculaires et cutanés, pour évaluer la combinaison de deux biopansements déjà testés séparément lors d'un projet précédent. Le porteur indique que la douleur postopératoire peut s'accompagner d'une perte de poids, d'une baisse de mobilité et d'une agressivité accrue envers les congénères pendant la première semaine. Il présente cette étude comme un moyen de réduire ensuite le nombre de rats soumis à un modèle de fracture fémorale complète, qu'il décrit lui-même comme plus invasif et plus douloureux.

Objectifs

Le projet vise à évaluer le potentiel de biopansements actifs (scaffolds) et de différents enrichissements sur l'étude de la cicatrisation osseuse. À la suite d’une lésion osseuse, un processus complexe de régénération se met en place. Dans ce contexte lésionnel, une solution innovante permet d'améliorer la régénration osseuse : les scaffolds. Ces biomatériaux offrent une matrice dont les propriétés physico-chimiques guident et stimulent la croissance cellulaire, favorisant ainsi la reconstruction progressive du tissu osseux. Leur potentiel peut encore être renforcé grâce à l’ajout de molécules bioactives, capables d’accélérer et d’amplifier le processus de cicatrisation. Dans ce volet, le projet souhaite étudier le pouvoir cicatrisant de deux biopansements combinés sur le tissu osseux. Ceux-ci ont déjà été testés et validés par le passé lors d'un précédent projet, de façon indépendante et sans enrichissement. Nous souhaitons aujourd’hui tester leur pouvoir cicatrisant en les combinant sur un modèle plus représentatif des contraintes mécaniques que peut subir le tissu osseux.

Bénéfices attendus

Ce projet ambitionne de valider la combinaison de deux biopansements innovants capables de stimuler fortement la cicatrisation osseuse, y compris dans des contextes lésionnels sévères. Ainsi, deux pansements testés lors d'un précédent projet et qui se sont révélés efficaces sur la régénération du tissu osseux indépendamment, ont été retenus afin d’être combinés sur ce projet pour leur propriétés respectives. Le bénéfice final attendu de ce projet sera la mise au point d'un biopansement combiné capable d'accélérer la réparation de défauts sévères.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1- Procédure chirurgicale osseuse (30 min) sous anesthésie volatile (30 min) avec deux injections sous-cutanées pour l'analgésie et l'antibiothérapie (10 secondes chacune) ; Tonte et aseptie (5 min), ouverture des volets cutanés et musculaires (5 min) avec exposition du fémur (5min). Un défaut osseux sera réalisé dans l'un des deux fémurs (5 min). Les volets musuclaires puis cutanés seront refermés à l'aide de fils chirurgicaux (10 min). Les animaux seront mis dans une chambre de réveil pour faciliter le retour à l'état vigile (30 min). Sur les jours suivants la chirurgie, l'antibiothérapie sera poursuivie sur deux jours (2 injections sous-cutanées) et de nouvelles injections d'analgésique seraient réalisées en cas d'apparition de signes de douleur (10 sec). 2- Suivi de la locomotion par un appareil de suivi de la démarche rongeurs toutes les semaines pendant 8 semaines (8*15 min par animal) sans qu'aucune contrainte ne leur soit réalisée. 3- Suivi de la régénération osseuse par imagerie Scanner sous anesthésie volatile (isoflurane) toutes les semaines pendant 8 semaines (8*15 min par animal). 4- Mise à mort terminale avec récupération des tissus en fin d'étude (30 min).

Impact sur les animaux

L'induction des défauts osseux circuclaires de 2mm au niveau des fémurs de rats vont premièrement nécessiter une anesthésie (volatile) et des injections sous-cutanées d'analgésiques. L'anesthésie peut entrainer une hypothermie qui sera à surveiller. Par la suite, ces défauts osseux qui seront induits sont susceptibles d’entraîner des niveaux de douleur modérés. Les nuisances cliniques attendues comprennent notamment une perte de poids et/ou déshydration, une diminution de la prise alimentaire, une diminution de la mobilité, une augmentation du stress (notamment visible par les aspects corporels) ainsi qu’une potentielle agressivité accrue envers les congénères. Des signes d’infection et/ou d’inflammation pourraient également survenir (membre chaud, rouge, glonflé,…) et seront surveillés. Ces manifestations apparaitront principalement au cours de la première semaine suivant la chirurgie et vont tendre à s’atténuer progressivement au fil des semaines.

Devenir

Une mise à mort des animaux est prévue en fin de procédure pour la récupération des fémurs afin de réaliser leur analyse en histologie.

Remplacement

Les biopansements ici testés ont déjà fait l’objet de tests in vitro et in vivo par le biais d'un précédent projet sur le calvarium de rats. Afin de vérifier le potentiel cicatrisant de la combinaison de ces deux pansements sur un modèle plus sévère, et répondre à cette hypothèse scientifique, un nouveau modèle in vitro serait insuffisant. Ainsi, un modèle animal est ici nécessaire afin d’étudier le processus de cicatrisation osseuse dans son ensemble, avec les contraintes que ce tissu peut subir au sein d’un organisme vivant (inflammation locale, vascularisation, remodelage, …). Ceci permettra de garantir la validité, la robustesse et la transposabilité des résultats, condition essentielle pour le développement d’outils thérapeutiques réellement applicables en médecine humaine.

Réduction

Cette étude sera dédiée à la caractérisation de la cicatrisation osseuse dans un modèle de fracture légère. Les données obtenues permettront de valider l'intérêt de ce nouveau biopansement combiné, d’optimiser les paramètres expérimentaux et, surtout, de réduire significativement le nombre de rats utilisés sur le modèle de fracture fémorale complète plus invasive et douloureuse qui viendra compléter cette étude. Ainsi, cette approche progressive contribue directement à limiter l’exposition des animaux aux procédures les plus contraignantes, conformément au principe de Réduction des 3R. Un nombre de 36 rats est prévu sur la procédure, incluant 18 mâles et 18 femelles. Ce nombre a été réduit au maximum afin d’apporter à minima 3 données sur chacun des temps de l’étude tout en gardant une significativité des résultats.

Raffinement

Raffinement de la technique chirurgicale : Des cadavres de rats issus de précédents projets ont été utilisés par le personnel de l’animalerie pour des sessions d’entraînement afin d’affiner et de sécuriser les gestes chirurgicaux de cette procédure. Raffinement des soins pré-per-post opératoires : Tous les rats seront induits en chambre d’induction puis maintenus sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane sur un plateau chauffant. Ils recevront également une injection sous-cutanée d'analgésique afin d’assurer une prise en charge optimale de la douleur et seront également mis sous antibiothérapie .Après la chirurgie osseuse, l’animal sera placé dans une chambre de réveil offrant des conditions optimales afin de faciliter un retour à l’état vigile dans un environnement sécurisé et confortable. Au cours des premières heures et jours post-opératoires, la surveillance des rats sera renforcée afin de permettre une prise en charge rapide et adaptée dès l’apparition des premiers signes de souffrance. En cas de détection de signes de souffrance, une administration d'analgésique sera effectuée afin de soulager efficacement la douleur des rats. De plus, de l’hydrogel sera ajouté dans chacune des cages afin de faciliter l’hydratation des rats et de contribuer à réduire leur inconfort post-opératoire. Par la suite, les animaux subiront une surveillance quotidienne, permettant d’intervenir le plus rapidement en cas d’apparition de signes de douleur / stress.

Choix des espèces

Le rat est largement utilisé dans la recherche preclinique, notamment sur les modèles chirurgicaux orthopédiques. La souche de rat choisie est réputée robuste et facilement manipulable, ce qui nous permettra un suivi clinique facilité. D’autre part, les structures anatomiques osseuses sont suffisamment proches de celles de l'homme et assez grandes pour être opérées et pour réaliser une perforation de 2mm dans l'un des deux fémurs. Une revue en cours de publication sur le critical-size defect ainsi que les entraînements ex vivo ont permis de déterminer que des rats âgés de 15 semaines constituent le modèle le plus adapté afin d’étudier la régénération osseuse. En effet, à ce stade de développement, la croissance osseuse est fortement réduite (stade adulte) ce qui réduit les interactions avec l’étude. De plus, les fémurs à 15 semaines, que ce soit chez les mâles ou les femelles, présentent la taille suffisante pour les modèles chirurgicaux réalisés.

Pour construire un atlas vasculaire cérébral et automatiser le recalage entre imagerie par résonance magnétique et imagerie ultrasonore, 66 rats de six à huit semaines vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun passe une heure d'IRM sous anesthésie avec pose d'un cathéter veineux, puis, vingt-quatre à soixante-douze heures plus tard, une chirurgie d'amincissement du crâne suivie sans réveil de l'imagerie ultrasonore, jusqu'à trois heures en tout. Une partie des rats reçoit en plus une injection de lipopolysaccharide dans le cerveau, pour provoquer une inflammation locale. La méthode sera mise à disposition des utilisateurs de la plateforme d'imagerie, et le porteur indique que des animaux de réforme pourront servir à la mise au point des protocoles.

Objectifs

L’imagerie ultrasonore ultrarapide est une technique récente d’imagerie qui permet d’étudier l’activité cérébrale, grâce à la mesure des changements de volume sanguin dans les vaisseaux qui irriguent le cerveau. En combinaison avec un agent de contraste ultrasonore (sous forme de microbulles injectées dans la circulation, la technique permet de créer des images haute résolution de la microcirculation. Cependant ces images offrent un contraste uniquement vasculaire, sans autre repère anatomique que les vaisseaux intra-cérébraux dans le champ de vue de la sonde ultrasonore. L’acquisition comme l’analyse de ces images requiert de pouvoir repérer les régions anatomiques cérébrales depuis un référentiel, qui ne contient en général aucune information vasculaire. Actuellement la méthodologie d’analyse des données ultrasonores reste très insatisfaisante car l'alignement des images vasculaires avec les images anatomiques (obtenues en IRM) est réalisé manuellement, avec un contrôle visuel de leur adéquation. C'est une source d'imprécision majeure dans la quantification des données. L’objectif est donc de développer une méthodologie robuste, reproductible et automatique de recalage des modalités d’imagerie ultrasonore et IRM.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un développement méthodologique qui permettra d’exploiter de manière plus fiable les données d’imagerie cérébrale ultrasonore acquise chez le rat. Plus généralement, l’intégration de cette modalité, qui permet l'enregistrement de l'activité cérébrale chez des animaux anesthésiés mais aussi vigiles, dans des projets exploitant l’imagerie médicale, sera facilitée. La méthodologie de recalage des modalités d’imagerie du cerveau par résonance magnétique (IRM) et ultrasonore (fUS/ULM) sera mise à disposition de tous les utilisateurs de la plateforme, et pourra, le cas échéant, être adaptée à la souris. Enfin une nouvelle classe d’agents de contraste ciblés sera évaluée, ouvrant la voie à une imagerie ultrasonore moléculaire, ce qui constituerait une nouveauté scientifique. A terme, cette technique d’imagerie pourra être utilisée pour l’évaluation de nouveaux agents de contraste ou médicaments à visée humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à une session d’imagerie par résonance magnétique (1 heure au maximum), sous anesthésie générale, avec pose d’un cathéter veineux. Entre 24h et 72h après, ils subiront une chirurgie consistant en un amincissement du crâne, nécessaire pour l’imagerie ultrasonore, qui sera réalisée dans la foulée (3 heures au maximum, pour l’ensemble, sans réveil de l’animal), avec pose d’un cathéter veineux. En outre certains animaux, auront préalablement subi une intervention chirurgicale consistant en une injection intracérébrale, réalisée 24 à 72h avant la première session d’imagerie. Le délai minimal entre chaque session (imagerie ou chirurgie) est de 24h, le délai maximal est porté à 72h pour tenir compte du week-end.

Impact sur les animaux

L'injection intracérébrale peut entraîner une douleur locale ainsi qu’une gêne transitoire susceptible d’affecter temporairement la prise alimentaire. L’induction de l’anesthésie par voie gazeuse peut être source de stress pour les animaux. Il sera nécessaire de poser un cathéter veineux caudal afin d’administrer des produits de contraste, ce qui constitue une source supplémentaire d’inconfort ponctuel. Préalablement à l’acquisition des images en ultrasons, les animaux subiront une chirurgie consistant en un amincissement du crâne, susceptible d’entraîner des douleurs.

Devenir

Mise à mort

Remplacement

Les développements méthodologiques en imagerie cérébrale doivent être réalisés sur des animaux vivants. En effet, seule l’expérimentation in vivo permet de tester et de valider ces approches dans des conditions physiologiques réelles, où interviennent des paramètres tels que la circulation sanguine, la respiration, l’activité cérébrale et les réactions biologiques de l’organisme.

Réduction

Des animaux de réforme pourront être utilisés pour la mise au point des protocoles d’imagerie. Des animaux de même âge et poids seront utilisés pour la construction de l'atlas vasculaire cérébral, et chaque animal sera mis à profit de manière optimale en subissant à la fois un examen d’imagerie IRM et ultrasonore. Ceci limite considérablement la variabilité et donc le nombre total d’animaux nécessaire. Pour l'évaluation de nouveaux agents de contraste "intelligents" ( car ciblant des protéines particulières), des groupes expérimentaux réduits au minimum (3-4 animaux) seront utilisés pour mener une comparaison exploratoire entre les deux modalités d’imagerie.

Raffinement

L’imagerie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Lors de l’induction de l’anesthesie, une lampe infrarouge est utilisée pour réchauffer la boite et limiter la perte de température corporelle. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse, avec supplémentation en oxygène, un traitement anti-douleur adapté, une thermorégulation continue, une hydratation sous-cutanée, et un monitoring respiratoire. Les groupes sociaux sont conservés (pas d'isolement en dehors de la période d'anesthésie). Le modèle animal d’inflammation cérébrale locale provoquée par l’injection intracérébrale de lipopolysaccharide (LPS) est utilisé car il est moins invalidant pour les animaux que d’autres modèles inflammatoires aigus (comme ceux mimant un accident vasculaire cérébral ou une sclérose en plaques). De plus les méthodes d’imagerie ciblées apportent une grande sensibilité de détection, ce qui permet de limiter à la fois la quantité de LPS injecté et la durée de suivi longitudinal.

Choix des espèces

Les développements méthodologiques visés utilisent des appareils d’imagerie dédiés aux rongeurs. Le projet est mis en oeuvre chez le rat, pour bénéficier d’une imagerie cérébrale mieux résolue en raison de la plus grosse taille de cerveau en comparaison avec la souris. La méthodologie sera entièrement adaptable chez la souris, si besoin. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (jeunes adultes) : la maturité cérébrale sera atteinte, l’os crânien suffisamment développé et robuste, et le poids suffisant (250-300g) pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste.

Plus petites, dotées d'un cerveau plus petit, les souris double mutantes de ce projet peinent à se déplacer et à communiquer avec le reste de la portée, et leur mortalité augmente vers trois semaines de vie. 942 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau, à des stades allant de l'embryon à vingt jours de vie. Le porteur écrit pourtant qu'elles "ne subiront aucune procédure expérimentale". Tout animal délaissé par sa mère ou sans poche à lait visible pendant vingt-quatre heures est tué, et les collectes s'arrêtent à vingt jours pour devancer la mortalité.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Des mutations dans de nombreux gènes ont été identifiées chez des patients avec des troubles du neurodéveloppement. Notre objectif est de comprendre le rôle de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques associés à ces maladies. Plusieurs patients avec des troubles du neurodéveloppement présentent une mutation dans le gène d’intérêt. La protéine issue de ce gène (gène 1) forme un complexe avec une autre protéine (encodée par le gène 2). Ce complexe est indispensable au décodage de certains gènes. Notre collaboration avec des généticiens et d’autres équipes de recherche a permis de mettre en avant l’importance du gène d’étude dans le développement du cerveau. La technique utilisée lors de ces précedentes études nous a permis de moduler l’expression dans une partie des cellules de cortex (environ 1%) et de visualiser un défaut de migration. Nous souhaitons à présent moduler cette expression dans toutes les cellules du cortex pour comprendre les mécanismes impliqués dans les troubles du neurodeveloppement. Afin d’avoir toute la population de cellules du cortex à analyser (et non 1% comme les expériences précédentes), nous avons étudié des souris cKO (Knock-Out conditionnel, c’est-à-dire que le gène d’intérêt est absent uniquement dans le cortex des souris) soit pour le gène 1 soit pour le gène 2. Ces souris ne présentent aucune anomalie au niveau du cerveau. Nous souhaitons à présent étudier les souris cKO pour les deux gènes du complexe (perte de l’expression des gènes 1 et 2 simultanément), ici encore en limitant l’excision des gènes au cortex cérébral des souris. Cette étude permettra de comprendre par quels mécanismes moléculaires le complexe influe sur le développement du cortex.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction du complexe étudié dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels sa déplétion conduit à des troubles du neurodéveloppement, plus précisément au niveau moléculaire.

Procédures

Ils ne subiront aucune procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

Les animaux mutants sont plus petits et ont un cerveau plus petit. Ils pourront avoir du mal à se déplacer et à communiquer avec le reste de la portée, notamment dans le cas des études post-natales. Vers 3 semaines après la naissance, les animaux présentent une mortalité qui semble augmentée d’après nos premières données préliminaires. Dans ce projet, nous n’étudions pas les animaux agès de plus de 3 semaines.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet afin de prélever les cerveaux et de réaliser les analyses sur ceux-ci.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral en développement qui ne peut pas totalement être recréé par des approches in vitro. Nous incluons d’ailleurs dans cette étude des méthodes de culture cellulaire, mais qui nécessitent tout de même des embryons « donneurs ». Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.

Réduction

Notre projet est composé de trois études dont la première a pour but de déterminer les stades clés pour les études suivantes, afin de limiter le nombre de stades étudiés en détail et de limiter le nombre d’animaux générés. De plus, nous allons combiner les analyses de protéines et d’ARN sur une même portée (1 hémisphère pour chaque étude au lieu du cerveau entier). Nous utilisons les test statistique adaptés afin d’évaluer différents paramètres chez les animaux portant la mutation par rapport aux contrôles (embryons non porteurs de la mutation de la même portée). Nous avons aussi adapté le nombre de portées à analyser en fonction des expériences à réaliser.

Raffinement

Nous prenons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal, notamment avec l’ajout de nid et de tunnel dans les cages d’hébergement. La mise à mort est faite par du personnel qualifié. Pour les animaux à 3 semaines de vie (21-22 jours après la naissance), bien qu’ils soient plus petits et aient un cerveau plus petit, nous n’avons jusqu’à présent pas détecté de signe de détresse ou de souffrance. Aucun point limite (maigreur, absence de lait maternel dans l’estomac) n’a été constaté dans les premières portées. Nous faisons toutefois nos collectes les plus tardives à 20 jours de vie, avant l’apparition de la mortalité. Nous effectuons le prélèvement pour le génotypage en post-mortem pour éviter une douleur inutile. En post-natal, pour les animaux étudiés le jour de la naissance ou à 6 jours de vie : nous comptons les nouveaux nés à la naissance et nous nous assurons qu’ils sont bien en groupe dans le nid, attestant que la mère s’occupe de tous ses petits. Tout animal délaissé sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie. 3 fois par semaine, nous apportons une attention particulière aux points limites suivants : i) l’absence de prise alimentaire par observation de la poche à lait : tout animal sans poche à lait visible pendant 24h est euthanasié ; ii) cyanose: les animaux étant glabres jusqu’à 6 jours de vie, nous observons la couleur de la peau : tout animal cyanosé est euthanasié. Entre 6 et 20 jours de vie: Nous surveillons l’attitude de la mère et tout animal délaissé sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie. L’apparence du pelage des petits est également un bon indice du soin apporté par la mère. Nous avons noté une taille des nouveaux nés double mutants plus petite (mais de corpulence normale, c’est-à-dire qu’ils ne sont pas anomalement maigres), des cerveaux plus petits et des animaux moins vifs. Le point limite étant une perte anormale de poids, les animaux sont pesés 3 fois par semaine. Si une perte de poids ou un état de maigreur est observé, l’animal est euthanasié. Les animaux ne réagissant pas à une stimulation lors de l’ouverture du nid sont euthanasiés.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour étudier les gènes impliqués chez des patients souffrant de troubles neurodéveloppementaux. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris, ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neurodéveloppementales chez l’homme. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par portée est couramment modifié génétiquement, ce qui nous permet de mimer les mutations observées chez l’homme. De plus la culture de cellules souches neurales et la culture primaire de neurones à partir de cortex murins sont des techniques bien établies au laboratoire. Selon nos études préliminaires, les très jeunes embryons mutants (avant 2/3 de gestation) ne présentent aucune différence avec les embryons sauvages. A la naissance, nous notons une taille légèrement inférieure et juste avant le sevrage, cette taille ainsi que la taille du cerveau, sont très inférieures chez les double cKO. A deux semaines de vie, on observe également une diminution de la taille (corps et tête) chez les animaux avec une seule copie d’un des deux gènes. Nous souhaitons dans un premier temps étudier tous les stades du développement du cerveau afin de déterminer précisement la dynamique d’apparition des phénotypes et d’identifier le timing précis auquel réaliser la caractérisation moléculaire qui permettra de comprendre les mécanismes qui mènent à l’apparition des phénotypes : stades embryonnaires 14.5 jours, 15.5 jours, 16.5 jours et 18.5 jours post-fécondation et stades postnataux jour de la naissance et 6, 14 et 20 jours de vie. Dans les études suivantes, nous étudierons plus en détail uniquement les stades clé.

Une perte de 10 à 15 % du poids en quarante-huit heures, une masse tumorale qui gêne les déplacements, la prostration ou le décubitus déclenchent la mise à mort. 812 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau. Un glioblastome leur est induit par injection de lentivirus dans un ventricule cérébral au cours d'une chirurgie de trente à quarante minutes, suivie de cinq jours d'injections quotidiennes, de jusqu'à cinq cycles de traitement, de quatre injections d'anticorps par cycle et d'un suivi par bioluminescence deux fois par semaine sous anesthésie. Le porteur décrit un projet collaboratif d'organoïdes de glioblastome incluant microglie et monocytes, et écrit qu'il pourra remplacer une partie des expériences in vivo selon les résultats obtenus ici.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'effet de drogues dites sénolytiques (drogues qui éliminent les cellules sénescentes) seules ou en combinaison avec d'autres traitements, dans un nouveau modèle immunocompétent de tumeur cérébrale de type glial appelée glioblastome. Le modèle de glioblastome de type mésenchymateux proposé dans le projet récapitule au mieux les altérations moléculaires identifées chez les patients notamment la perte des suppresseurs de tumeur PTEN, p53 et NF1 en utilisant la technologie d'invalidation de l'expression de gènes Crispr-Cas9. Ce projet est multisite car un équipement spécifique se trouve dans un autre établissement utilisateur et c'est la raison de ce dossier. Ce projet est la suite d'un autre projet autorisé qui ne nécessite pas d’augmentation du nombre d’animaux.

Bénéfices attendus

Le glioblastome est la tumeur cérébrale adulte primaire la plus fréquente et agressive dont les patients ne survivent pas plus de 15 mois en moyenne à ce jour. Ce projet devrait générer un modèle préclinique immunocompétent de glioblastome de type mésenchymateux qui récapitule au plus près les altérations moléculaires des glioblastomes de patient. En effet, afin de traduire de façon efficace nos résultats de recherche fondamentale à la clinique il est indispensable de s'approcher au plus près de la pathologie humaine. Nos résultats devraient permettre de proposer des nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge des patients avec un glioblastome.

Procédures

La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 7 actes techniques incluant une injection intra-crâniale de lentivirus nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par utilisation d’imagerie par bioluminescence, une mesure du flux sanguin cérébral par examen Doppler, des traitements, des prélèvements sanguins puis finalement une euthanasie. La chirurgie prendra environ 30-40min sur animal anesthésié et analgésié en pré et post-opératoire (établissement 1). Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs sur animal vigil (établissement 1). La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines sur animal anesthésié. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min (établissements 1 ou 2). Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés sur souris vigiles pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. Les animaux recevront au maximum 5 cycles de traitement (établissement 1). L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines sur souris vigile (établissement 1). Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigil (durée de quelques secondes, 4 fois par animal) (établissement 1). L'examen Doppler d'une durée d'1h30, sera réalisé tous les 5 jours sur des animaux anesthésiés (établissement 2).

Impact sur les animaux

Ce projet comporte deux étapes où des effets indésirables sont attendus sur les animaux, la procédure chirurgicale et la charge tumorale. La procédure chirurgicale est invasive, il s'agit d'une injection stéréotaxique de lentivirus dans le ventricule latéral effectué sous anesthésie/analgésie mais qui entraîne des nuisances (risques anesthésiques, douleur post-opératoire, risque infectieux). Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées). Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et les animaux seront pesés quotidiennement pendant les 5 jours suivant la chirurgie et deux fois par semaine par la suite. De la douleur légère de courte durée pourrait être ressentie lors des prélèvements sanguins. Dans de très rares cas un hématome ou une perte de sang hémorragique pourrait être observée. L’imagerie Doppler mesure la perfusion sanguine cérébrale et tumorale de manière non invasive et nécessite une anesthésie qui peut engendrer une hypothermie et des difficultés respiratoires.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris et d'analyser la tumeur cérébrale induite pendant la procédure, au niveau moléculaire et histologique.

Remplacement

En parallèle de ce projet in vivo, nous caractériserons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patient collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare car la survie des patients après diagnostic est inférieure à 15 mois. Cette étude fondamentale demeurera néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans un modèle animal préclinique. Dans un souci de remplacement et réduction, nous projetons de générer des organoides à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle d'organoides conservant le microenvironnement global (notamment, la microglie, les monocytes et les cellules T infiltrants, les cellules endothéliales et les péricytes). Notre équipe de recherche participe activement à un projet collaboratif visant à générer des organoides de glioblastome incluant de la microglie et des monocytes infiltrants. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.

Réduction

Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, nous utiliserons dans ce projet 812 souris. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 18 animaux. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, ganglions, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescence sera localisée dans le cerveau disséqué à la loupe binoculaire et nous réaliserons plusieurs types d'analyses sur chaque tumeur. Immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques. Pour les animaux du lot 2, de l'imagerie permettra de quantifier les flux sanguins cérébral et intratumoral au cours de la croissance tumorale permettant d’accumuler un grand nombre de résultats pertinents par animal.

Raffinement

Pour réduire le stress post-opératoire, les animaux seront logées par groupes de 5 souris par cage pendant une période d'acclimatation de 7 jours minimum avant la procédure chirurgicale. Tous les animaux auront un enrichissement: carré de coton et bâton à ronger. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Pendant la chirurgie et l'examen Doppler, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l'hypothermie, un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter leur déshydratation. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée pour détecter toute anomalie potentielle de la procédure anesthésique. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. Ceux-ci comprennent une variation relative du poids corporel comprise entre 10 et 15% en 48h, une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l’animal et une dégradation de l’état général de l’animal comprenant des signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées. Nous avons établi dans l’équipe une grille de suivi post-opératoire (annexe) pour les animaux pouvant développer des tumeurs cérébrales. Cette grille sera consultée et une fiche de suivi de l’animal sera remplie à chaque examen, présente au dos de l'étiquette de cage. Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et le poids des animaux deux fois par semaine. En fin de processus d’expérimentation, si une souris est isolée nous regrouperons cet animal avec des animaux sujets au même traitement et lorsque cela ne sera pas possible nous apporterons de l’enrichissement supplémentaire dans la cage sous forme de maisonnette. Lors des prélèvements sanguins, si le saignement ne stoppe pas rapidement, une compression plus longue avec un papier essuie tout propre sera directement effectuée sur le point de prélèvement. En cas d'apparition de prostration et de difficulté à récupérer (anomalie cardiorespiratoire), l'animal sera pris en main pour effectuer des frictions afin de le stimuler. De la nourriture hydratée sera déposée à côté de lui dans la cage. Si cet état perdure plus de quelques minutes, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour induire de novo des glioblastomes. En effet ce type de tumeur est diagnostiqué chez des sujets adultes d'âge médian de 59 ans, cette tumeur se développe donc à l'âge adulte. Notre projet, qui vise à évaluer l'effet de drogues sénolytiques dans un nouveau modèle immunocompétent de glioblastome, utilisera uniquement des souris femelles. En effet, les modèles de glioblastomes murins se développent de façon similaire chez les mâles et les femelles. De façon plus importante dans une étude récente, nous avons montré que l’enrichissement de la signature murine de sénescence chez les patients avec un glioblastome est un facteur de mauvais pronostique quel que soit le sexe. Ces résultats montrent donc que l’étude de la sénescence dans le contexte des glioblastomes peut être réalisée sur un seul sexe. Nous avons choisi pour ce projet de travailler sur des femelles.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous anesthésie générale, puis cinq ou neuf injections sous anesthésie locale, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse ou suivie par imagerie tous les trois jours. La croissance des tumeurs sous la peau provoque des douleurs locales modérées, et les traitements une perte d'appétit et de poids. Le porteur retient la souris parce que sa génétique est la mieux connue, que l'oncologie en fournit déjà beaucoup de données, et que son équipe a "acquis une pratique expérimentale sur cette espèce".

Objectifs

Les inhibiteurs de la tyrosine kinase ont été approuvés pour le traitement de routine des patients atteints de cancer. Ils agissent de façon autonome uniquement sur la croissance de cellules cancéreuses génétiquement modifiées. Cependant, cette fonction a récemment été remise en question par des découvertes montrant des effets immunostimulateurs directs de ces molécules. Il a été montré que certaines sont dotées de la capacité d'induire la mort cellulaire immunogène dans les cellules cancéreuses, stimulant ainsi les cellules cancéreuses à émettre des signaux qui les rendent détectables par le système immunitaire. De plus, il existe des preuves précliniques solides selon lesquelles ces molécules peuvent être avantageusement combinés avec une chimiothérapie et une immunothérapie standard, pour traiter le cancer du poumon non à petites cellules. Plus globalement, nous disposons donc de preuves solides selon lesquelles certaines ont la capacité d'agir comme inducteurs de la mort cellulaire immunogène sur les cancers, agissant ainsi, aussi, comme des activateurs de la mort cellulaire. Dans un précédent projet, un de ces produits, a été testé seul ou en combinaison avec une chimiothérapie et/ou une immunothérapie standard dans des modèles précliniques immunocompétents ou immunodéficients. Les résultats étant prometteurs, nous souhaitons aller plus loin en déterminant quelles cellules immunitaires sont importantes pour permettre la traduction des présents résultats en applications cliniques.

Bénéfices attendus

Si ce projet confirme nos résultats in vitro et in vivo précédents, ces inhibiteurs de tyrosine kinase permettront de proposer de nouvelles combinaisons de traitements anti-tumoraux beaucoup plus performantes pour les patients.

Procédures

Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis cinq injections sous anesthésie locale (vigile,

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et des greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse ou d’imagerie tous les trois jours. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal et les croissances tumorales en sous- cutanées peuvent entraîner des douleurs locales , transitoires et modérées. Une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée peut apparaître chez la souris suite aux traitements médicamenteux.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse des tumeurs et des cellules immunitaires après traitement, post-mortem.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du système immunitaire dans l'organisme entier et son effet sur la croissance tumorale.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Les résultats seront analysés avec des outils statistiques.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (examen clinique quotidien, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout changement.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Par ailleurs, il s’agit d’un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé, correspondant à la population de patients.

Dix-huit vaccins croisés avec et sans adjuvant et selon six voies d'administration : 3 612 souris reçoivent deux à trois injections aux semaines 0, 3 et 5, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les injections passent par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale, et sept prélèvements sanguins échelonnés complètent le suivi de chaque animal. Toutes les souris sont tuées pour analyser la moelle osseuse, la rate, les ganglions et les muqueuses par lesquelles entrent les pathogènes. L'effectif découle du criblage lui-même, sept souris par groupe multipliées par le nombre de combinaisons, et le porteur affirme que "la réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l'animal".

Objectifs

Les objectifs du projet sont de tester la capacité de vaccins à activer des réponses immunitaires dans les infections comme l’infection à SARS-CoV-2 (nouveaux variants), à Nipah virus (un virus léthal qui émerge contre lequel il n'existe pas de vaccin), HBV (le virus de l'hépatite B contre lequel il n'existe pas de vaccin), Chlamydiae trachomatis (CT, une bactérie sexuellement transmissible contre laquelle il n'existe pas de vaccin), Bordetella pertussis (responsable de la coqueluche dont les cas sont en nette augmentation du fait d'une diminution de la protection induite par le vaccin acellulaire) ou encore Tuberculosis mycobacterium (afin de traiter les formes latentes de la tuberculose) et d’identifier pour chaque vaccin la meilleure voie d’administration et le meilleur adjuvant afin d’obtenir des réponses immunitaires optimales et adaptées à chaque pathogène. Les vaccins que nous évaluons dans ce projet ont démontré leur innocuité dans une précédente étude. Ce qui change ici ce sont les antigènes (petits morceaux de microbes qui ne donnent pas la maladie) véhiculés par ces vaccins. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des souris génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Le projet vise également à déterminer la persistance de la réponse immunitaire induite par les vaccins après avoir choisi les plus efficaces et l’adjuvant le plus efficace pour chaque vaccin.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont le développement de nouveaux vaccins dans des maladies infectieuses avec un impact sur la santé humaine.

Procédures

Les interventions effectuées seront des injections de vaccins (durée: 30 secondes) par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale selon les procédures ( à semaine 0, 3 et 5) et un prélèvement périodique de sang (durée 30 secondes) pratiqué sur les souris (Semaine (S)-1, S0+1 jour, S2, S3+1jour, S4, S5+1 jour, et le jour de la mise à mort) après la vaccination.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront 2 à 3 injections de vaccin et seront soumis à des prélèvements sanguins réguliers. La réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l’animal tout le long de la cinétique expérimentale. Les effets indésirables pourraient être une infection après l'utilisation d'aiguilles au moment de l'injection des vaccins ou des prélèvements de sang. Les aiguilles sont changées entre chaque animal pour limiter cet effet indésirable.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'évaluer les réponses immunitaires induites par les vaccins dans les organes lymphoïdes primaires (moelle osseuse) et secondaires (rate et ganglions lymphatiques) et dans les tissus périphériques portent d'entrée des pathogènes.

Remplacement

Les vaccins utilisés dans ce projet ont déjà été évalués dans un précédent projet. Ce qui change ici se sont les antigènes (petits fragments de microbes qui ne provoquent pas la maladie) véhiculés par nos vaccins. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Les nouvelles versions de vaccins que nous allons tester dans ces modèles animaux ont été présélectionnés sur la base de plusieurs tests in vitro sur des cellules en culture. Ainsi seuls les vaccins candidats qui auront donné les meilleurs résultats seront ensuite utilisés chez l’animal. Nous nous proposons ici de tester l’efficacité de ces vaccins pré-sélectionnés dans des modèles de souris (induction de réponses immunitaires systémiques, muqueuses et de longue durée). Les réponses immunitaires sont des processus complexes dont la mise en place est conditionnée par des interactions dynamiques impliquant de nombreux partenaires cellulaires présents dans différents compartiments de l’organismes (site d’entrée du pathogène/antigène, ganglion drainant, site effecteur). A l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires dans le cadre d’une infection naturelle ou après une vaccination. C’est pourquoi nous avons besoin de travailler avec ces modèles animaux.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris (n=7 par groupe) nécessaires pour que les résultats soient significatifs et selon nos précédents travaux. Il s'agit ici de tester 18 vaccins avec et sans adjuvant et injectés selon différentes voies afin de trouver les meilleures conditions d'utilisation de ces vaccins c'est-à-dire l'adjuvant et la voie d'administration qui induiront les réponses immunitaires optimales. Ce nombre est estimé à 3612 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans l'expérimentation animale afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux par procédure.

Raffinement

Les souris sont élevées avec soin et respect, en présence d’éléments d’enrichissement (bandelette de coton et neslets pour faire un nid et un tunnel en carton pour se réfugier et jouer) afin de réduire au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Nous avons ainsi établi une grille de bien-être des animaux qui comprend l'évaluation de 10 signes cliniques et prend en compte des points limites. Les animaux sont toujours manipulés par une personne expérimentée.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler chez la souris car notre projet nécessite d’étudier les réponses immunitaires chez des animaux génétiquement modifiés afin de d'exprimer un gène humain dans un type cellulaire donné. En effet, certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des animaux génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Ces modifications génétiques sont possibles chez la souris. D’autre part, les modèles murins de vaccination ont déjà été mis au point et sont largement décrits dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (après 8 semaines afin de minimiser l’impact des perturbations endocriniennes observées avant cette tranche d’âges).