Rongeurs

Greffés d'un fragment de tumeur dans le cortex cérébral puis opérés une seconde fois pour la retirer, 300 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun peut recevoir une séance de radiothérapie à 10 Gy, jusqu'à cinq prélèvements sanguins et jusqu'à six IRM d'une heure sous anesthésie. Le porteur qualifie de modérées les douleurs opératoires tout en décrivant des convulsions possibles, une incapacité de boire ou manger, et une nécrose cérébrale que la dose de rayons pourrait induire. Il précise avoir choisi des rats adultes parce qu'ils supporteront mieux la chirurgie, les effets secondaires des composés testés et le développement de la tumeur.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Les gliomes de haut grade restent à ce jour un cancer pour lequel la prise en charge a peu évolué depuis 20 ans, avec une survie médiane après traitement à ce jour de 24 mois environ. Le développement de nouvelles thérapies est de ce fait critique afin d’améliorer la survie et la rémission des patients. L’objectif de ce projet est, dans un modèle de glioblastome orthotopique (dans l’organe dans lequel il se développe normalement, c’est-à-dire le cerveau dans ce cas) chez les rongeurs (rats) décrit dans la littérature, de reproduire la prise en charge clinique et d’y ajouter un traitement local de nouveau composé afin d’évaluer spécifiquement l’efficacité thérapeutique du composé d’intérêt dans le contexte de la présence de cellules cancéreuses résiduelles suite à une chirurgie de résection de glioblastome. En d’autres termes, les études couvertes par ce projet permettront, avant les essais cliniques chez l’homme, d’évaluer l’efficacité de composés destinés à traiter les tissus cancéreux résiduels de glioblastome chez l’homme. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs différents. Une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

L’animal représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettant d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, les modèles et site d’implantation choisis (dans l’organe dans lequel la tumeur se développe normalement, c’est-à-dire le cerveau) permettront de reproduire la prise en charge clinique actuelle chez l’homme et d’apprécier le bénéfice de nouvelle thérapies ajoutées en sus sur la survie des animaux.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : La greffe tumorale intra cérébrale, ainsi que sa résection seront des procédures chirurgicales d’une trentaine de minutes environ et seront réalisées sous anesthésie et analgésie pré-, per et post-opératoire. Les animaux vigiles pourront également recevoir un unique traitement de radiothérapie sous anesthésie dans un établissement spécialisé (trajet ne dépassant pas 40 min aller-retour et 15-30 min de traitement par animal). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. Il sera réalisé un maximum de 5 prélèvements sanguins par animal, répartis sur la durée totale de l’étude. Si un suivi par une technique d’imagerie est envisagé, il sera réalisé sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure. . Il sera réalisé un maximum de 6 IRM par animal.

Impact sur les animaux

Pour ces modèles, la greffe de la tumeur (implantation de fragment) et sa résection sont réalisées dans le cortex cérébral pariétal. Compte tenu de l’analgésie, les douleurs opératoires et post-opératoires seront de niveau modéré. L’évolution du volume tumoral, la résection et le traitement topique pourront entrainer des troubles tels que des troubles neurologiques (diminution de la mobilité, convulsions, incapacité de boire ou manger, apathie) ou une perte de poids qui constitueront un point limite. Les animaux recevront des traitements par radiothérapie ou voie orale. Ces actes entraineront un stress léger. La séance de radiotherapie à la dose 10Gy pourrait induire de la nécrose cérébrale et de l’ostéonécrose sur le site de radiation. Le jour du démarrage de l’étude, les animaux seront répartis en groupes homogènes (en poids et/ou du volume tumoral) et donc potentiellement mis en présence de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger pendant 1 à 2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Lors des prélèvements sanguins, la contention ou l’anesthésie entraineront un stress léger. Lors des acquisitions IRM, l’anesthésie entrainera un stress léger.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure. Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament nécessitent d’étudier leurs interactions dans un contexte global et anatomique et cela ne peut pas être transposé dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s), à savoir le poids et le volume tumoral. Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la survie entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques (ANOVA) soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes. Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 8 et 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Le nombre minimal d’animaux surnuméraires ne pourra pas excéder 20%. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.

Raffinement

La greffe et la résection du fragment de tumeur seront réalisées sous anesthésie générale et locale avec administration préalable d’un analgésique opiacé et d’un alpha 2 agoniste (type xylazine, médétomidine ou équivalent). En fin de chirurgie et les 2 jours suivant (total 72h), un anti-inflammatoire non stéroïdien (type meloxicam ou équivalent) ou un corticoïde sera administré. 4h, 6 à 8h et 24h après la chirurgie, les animaux recevront un analgésique opiacé. Un anesthésique local (type lidocaïne) sera également injecté en sous-cutané avant la chirurgie. La chirurgie de greffe sera réalisée stérilement avec un cadre de stéréotaxie. Les procédures seront réalisées sous maintien de la température corporelle et surveillance post-opératoire jusqu’au réveil puis toutes les 2h (6h au total). .Les administrations/prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les expérimentateurs sont formés pour effectuer ce type de chirurgie et évaluer spécifiquement l’état de souffrance et établir les points limites. Une grille de scoring est mise en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les scores cliniques les plus élevés et l’accumulation de scores intermédiaires constitueront un point limite. Une perte de poids de 15% ou prolongée (entre -10 et -15% sur 3 jours consécutifs) constituera un point limite. Les autres points limites concernent l’état général de l’animal. Pour raffiner, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et de l’imagerie faiblement invasive permettant d’atteindre l’objectif plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages.

Choix des espèces

Diverses souches de rats immunocompétents sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Les modèles choisis ainsi que le site d’implantation auront un développement similaire à ce qui est observé chez l’homme. De plus, les rats autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés après sevrage à l’âge de jeunes adultes (7 semaines minimum). Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter la greffe des fragments tumoraux. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets de la chirurgie, les effets secondaires des composés à tester et les effets du développement tumoral.

1 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant passer dix à quatorze séances d'imagerie sous anesthésie, deux par semaine pendant cinq à sept semaines. Elles reçoivent des cellules cancéreuses injectées dans l'estomac au cours d'une chirurgie, ou dans le cœur sous échographie, puis un gavage une à deux fois par jour pendant deux à quatre semaines et des injections dans le ventre. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Les combinaisons de traitement annoncées pour les patients atteints d'un cancer gastrique avancé restent au conditionnel, alors que la tumeur greffée provoque dès son installation douleur, gêne et perte de poids.

Objectifs

Le cancer gastrique est un cancer très agressif, comptant de nombreuses rechutes avec métastases, sans traitement curatif, menant à de très mauvais pronostic. Les objectifs de ce projet sont de prédire et identifier des mécanismes de résistance à de nouveaux traitements prometteurs pour développer des combinaisons de traitement efficaces à long terme dans les cancers gastrique très avancés et ainsi améliorer la prise en charge pour ces patients au pronostic très défavorable.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier et comprendre les mécanismes de résistance dans les cancers gastrique très avancés. Cela permettra le développement de combinaisons de traitement efficaces à long terme dans les cancers gastriques très avancés afin d'améliorer la prise en charge, l'efficacité thérapeutique et la survie chez ces patients au pronostic très défavorable.

Procédures

Chirurgie au niveau de l’estomac sur animal anesthésié : injection de cellules cancéreuses dans l’estomac, durée 10-15 minutes, geste réalisé 1 fois. Chirurgie au niveau de l’estomac sur animal anesthésié : résection de la tumeur primaire dans l’estomac, durée 10-15 minutes, geste réalisé 1 fois. Injection intracardiaque de cellules cancéreuses sur animal anesthésié : monitoré par échographie, durée 5 minutes, geste réalisé 1 fois. Réalisé sur des animaux différents de ceux ayant une chirurgie gastrique, pas de cumul des 2. Imagerie à bioluminescence sur animal anesthésié : durée 10-15 minutes, geste réalisé 2 fois par semaines pendant 5 à 7 semaines. Administration par voie orale sur animal vigile : durée 30 secondes, geste réalisé 1 à 2 fois par jour pendant 2 à 4 semaines. Injection dans le ventre sur souris vigile : durée 10 secondes, geste réalisé 2 à 3 fois par semaine pendant 4 à 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent provenir de : 1) Développement de la tumeur : douleur, gêne, impact sur l’appétit, perte de poids. 2) Le gavage répété : douleur liée au geste, impact sur l’appétit, perte de poids, stress. 3) Les injections intrapéritonéales : stress lié à la contention, douleur au site d’injection. 4) Les séances d’imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention, hypothermie. 5) Injection intracardiaque : une douleur au site d’injection. 6) Une douleur post opératoire peut se présenter et sera minorée par des antalgiques.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de récupérer des prélèvements post-mortem qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Nous souhaitons découvrir des mécanismes de résistance dans les cancers gastriques métastatiques et développer des stratégies thérapeutiques pour contrer cette résistance dans les métastases. Actuellement, il n’existe aucun modèle pour évaluer l’efficacité d’un médicament (Alpelisib) administré par voie orale sur le développement de métastases issues de la tumeur primaire, dans un organisme aussi complexe que le corps. L’utilisation des animaux est donc indispensable.

Réduction

Le 1er objectif de ce projet est une étude pilote qui permettra de déterminer et choisir les modèles les plus pertinents afin de réduire leur nombre pour la suite du projet. Nous travaillerons à la fois sur des mâles et des femelles. Le suivi de la croissance métastatique et donc la visualisation de la résistance au traitement se fera par imagerie non invasive permettant de faire un suivi dans le temps sur un même animal. Des tests in vitro seront réalisés au préalable afin de déterminer les meilleures combinaisons de traitement à valider in vivo. Un test statistique sera réalisé. Le nombre d'animaux a été déterminé en utilisant un logiciel dédié.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont maintenues dans des conditions d’hébergement qui les protègent de risques d’infection par des pathogènes. Les actes expérimentaux seront réalisés sous anesthésie quand cela est nécessaire et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Une analgésie est mise en place au moment de la chirurgie et aussi en suivi post-opération si des signes de souffrance sont visibles. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur tout au long du projet.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix en imagerie optique de par sa petite taille. De plus cette espèce permet d’obtenir des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées à partir d’un âge de 6-8 semaines correspondant à de jeunes adultes. A cet âge elles ont une taille raisonnable facilitant leur manipulation.

Pour tester si une molécule administrée par la bouche peut renforcer l'enzymothérapie de la maladie de Pompe, 64 souris porteuses du déficit enzymatique vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des organes et du sang. Chacune est contenue deux fois par jour pendant cinq jours pour s'habituer à l'administration orale, reçoit la molécule quatre jours de suite à la micropipette, puis deux injections dans la veine de la queue à quarante-huit heures d'intervalle sous anesthésie gazeuse. Le porteur décrit un raffinement inhabituellement détaillé, excipient sucré présenté au bord de la gueule plutôt que gavage, crème anesthésiante avant l'injection, transfert par tunnel. Il fixe l'âge d'utilisation à six mois, avant que la faiblesse musculaire du modèle ne devienne visible vers huit ou neuf mois, ce qui limite à la fois ce que les animaux subissent du fait de leur maladie et ce que l'expérience peut en montrer.

Objectifs

La maladie de Pompe est une maladie génétique héréditaire liée à un déficit en une enzyme spécifique qui entraîne une accumulation de glycogène dans les lysosomes, ce qui provoque des dommages cellulaires dans différents tissus, particulièrement dans le cœur, les muscles, le foie et le système nerveux. Chez le nourrisson atteint d’une forme grave, le muscle cardiaque est souvent touché ; c’est la cause principale de décès. Chez les patients atteints d’une forme tardive, le système respiratoire et la capacité de déplacement sont généralement les plus affectés par la maladie, nécessitant souvent le recours à un fauteuil roulant et à une assistance respiratoire et pouvant raccourcir l’espérance de vie. Un traitement de remplacement (substitution) de l’enzyme ou enzymothérapie de remplacement est disponible pour la maladie de Pompe, mais présente une efficacité limitée et une réaction immunitaire élevée surtout dans la forme infantile de la maladie. Les défenses de l’organisme neutralisent peu à peu cette molécule au fur et à mesure des administrations. En conséquence, cette approche ne parvient pas à corriger totalement l’accumulation de glycogène pathologique dans le tissu nerveux et les muscles squelettiques. Malgré les nouvelles générations d’enzyme de substitution, les problèmes de sélectivité et de réaction immunitaire persistent. Dans ce contexte, une première étude a été réalisée sur des souris pour identifier des molécules appelées chaperons pharmacologiques présentant une sélectivité élevée pour cettte enzyme déficiente.Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude précédente et permettra de mettre en avant un candidat médicament pour améliorer l’enzymothérapie, principal traitement actuel de la maladie de Pompe. En effet, la molécule chaperon d’intérêt a démontré sa capacité à améliorer l’activité mesurée dans les tissus de souris traitées par enzymothérapie avec cette molécule. En particulier, une augmentation significative de l’activité de l’enzyme spécifique mesurée dans le cœur, le quadriceps et le diaphragme encourage fortement à poursuivre les études pour confirmer l’efficacité de ce composé dans ces tissus mais aussi dans d’autres tissus affectés par les symptômes de la maladie de Pompe.

Bénéfices attendus

L’enzymothérapie se fait en injectant dans une veine (perfusion) une solution contenant l’enzyme de substitution. Cependant, la durée de vie de l’enzyme étant courte dans l’organisme, la perfusion, de doses importantes, doit être répétée toutes les deux semaines. Si le traitement est interrompu, la maladie progresse de nouveau. De plus, certains patients développent une réponse immunitaire c’est-à-dire qu’ils fabriquent des anticorps contre l’enzyme injectée comme si c’était un agresseur pour leur organisme. Les patients qui fabriquent beaucoup d’anticorps deviennent moins sensibles au traitement qui perd de son efficacité (environ 40% des patients). Différentes mutations sont présentes dans la maladie, et toutes ne génèrent pas une absence complète d’enzyme mais parfois la synthèse d’enzymes endogènes malconformées et non actives. Ces patients pourraient potentiellement se passer de perfusion de l’enzymothérapie si leur mutation répond à la molécule chaperon d’intérêt seule. Une évaluation in vitro sur 5 types différents de cellules musculaires de patients a été réalisée et 3 ont répondu à la la molécule d’intérêt. Dans ce contexte, notre étude a pour objectif d’améliorer la qualité de vie des patients atteints de la maladie de Pompe. Ce projet vise à confirmer les premiers résultats prometteurs montrant que la molécule chaperon d’intérêt est un candidat médicament d’intérêt pour le traitement de la maladie de Pompe par voie orale, en améliorant l’efficacité de l’enzymothérapie. La co-administration de cette molécule d’intérêt avec une enzymothérapie pourrait permettre une amélioration de son efficacité, une diminution des doses d’enzyme recombinante à administrer et un espacement des perfusions pour les patients atteints de la maladie de Pompe. Les bénéfices attendus sont une diminution du coût global du traitement, une amélioration de la tolérance au traitement et de la qualité de vie des patients, qui doivent être traités pendant toute leur vie.

Procédures

Lors de cette étude, les animaux seront soumis à des contentions (durée maximale par contention de 30 secondes) 2 fois/jour pendant 5 jours pour une période d’habituation à l’administration orale à la micropipette et 1 fois/jour pendant 4 jours pour l’administration de la substance d’intérêt par voie orale via la micropipette. Ces animaux seront également soumis à 2 injections en veine caudale (durée 20 secondes) à 48h d’intervalle. L’injection sera effectuée sous anesthésie gazeuse de manière à limiter le stress de l’animal.

Impact sur les animaux

Ces expériences étant réalisées sur seulement 5 jours, peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus sur les animaux. Les premières expériences réalisées ont montré que les souris se portaient bien pendant toute la durée du traitement et ne montraient aucun effet indésirable ni signe de toxicité de ce type de traitement. Les effets indésirables prévus sont un léger stress lié à la contention pour l’administration par la micropipette et une petite douleur transitoire pour l’injection dans la veine de la queue. Ces souris ayant une faiblesse musculaire débutant à partir de 6 mois, elles pourraient présenter des petites difficultés à se mouvoir. Nous ne nous attendons donc pas à observer ces signes car selon la littérature ces problèmes de locomotion sont cliniquement apparents qu’à l’âge de 8-9 mois.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du projet afin d’analyser différents organes, ainsi que le sang. Les mesures de différents paramètres (enzyme, glycogène notamment) permettront d’évaluer la dose de la molécule d'intérêt la plus intéressante et la plus efficace afin de poursuivre le développement de cette nouvelle molécule en association ou non avec l'enzyme dans le traitement de la Maladie de Pompe.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, des études préliminaires ont été menées in vitro sur des modèles cellulaires pertinents. Ces travaux ont permis d’identifier une molécule chaperon que nous allons étudier ici dans ce projet. Ces résultats encourageants constituent une base solide, mais ne permettent pas d’appréhender la complexité des interactions physiopathologiques impliquées dans la maladie de Pompe. En effet, cette pathologie implique des altérations multisystémiques, affectant notamment les muscles squelettiques et cardiaques. L’évaluation de l’efficacité thérapeutique nécessite donc d’analyser la réponse globale de l’organisme, incluant des interactions inter-organes, des mécanismes de distribution, de pharmacocinétique et de pharmacodynamie, qui ne peuvent pas être reproduits de manière fiable à ce jour par des modèles in vitro ou in silico. À ce stade du développement, le recours à un modèle animal est indispensable pour évaluer l’impact physiologique global de l’ajout de la molécule chaperon à l’enzymothérapie, et pour valider la pertinence de cette approche avant d’envisager une éventuelle transposition clinique.

Réduction

Le nombre de souris a été évalué au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée et du modèle animal mais aussi des résultats d’études précédentes. Le nombre de souris par lot a été évalué pour permettre de (i) détecter des signaux d’efficacité non négligeable dans les groupes traités avec une probabilité satisfaisante; (ii) documenter une relation dose–effet entre une dose faible proche de l’exposition clinique et une dose forte ; (iii) et disposer d’un contrôle contemporain, tout en limitant au strict minimum le nombre de souris, grâce au recours aux données de contrôles historiques pour compléter l’interprétation. Une réduction supplémentaire des effectifs des groupes traités risquerait de rendre l’étude ininterprétable et pourrait conduire à devoir la répéter, ce qui irait à l’encontre du principe de réduction. De plus, l’évaluation du nombre d’individus par cohorte s’est basée sur le fait qu’il n’a pas été décrit de mort prématuré jusqu’à l’âge de 6 mois. Nous ne nous attendons donc pas à une perte d’animaux lors de cette procédure. Nous procéderons également à l’administration de la molécule chaperon par micropipette, geste technique non invasif sans risque de perte contrairement au gavage. Et nous ne nous attendons pas non plus à un risque lors de l’anesthésie car celle-ci sera légère et de courte durée.

Raffinement

Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 mois, soit avant l’apparition des signes cliniques manifestes observés à partir de 8-9 mois. À ce stade, bien que des altérations musculaires débutantes puissent être présentes au niveau histologique, les animaux ne présentent pas encore de signes de souffrance clinique tels que la faiblesse musculaire marquée ou la réduction significative de la mobilité. Ce choix d’âge permet de minimiser l’impact sur le bien-être animal, tout en garantissant une représentativité suffisante du modèle pour les études biologiques envisagées. Afin de limiter l’apparition de possibles conflits, un apport supplémentaire d’enrichissement (hutte, bâtonnet à ronger, tubes) sera mis à disposition dans les cages. -La préhension des souris sera réalisée par transfert à l’aide d’un tunnel pour réduire le stress. De plus, les souris seront habituées à la contention en étant manipulées lors de la pesée hebdomadaire puis 2 fois/jour la semaine précédant les 5 jours de traitement. - L’administration de la molécule chaperon sera réalisée non pas par gavage oral mais par micropipette avec un excipient sucré présentée au bord de la gueule de l’animal. L’excipient sucré seul sera proposé 10 fois la semaine précédent le traitement à la souris afin d’habituer la souris à accepter le traitement. - Afin de limiter la douleur et de réduire le stress lors des injections en intraveineuse dans la veine caudale : une crème anesthésiante sera appliquée sur la zone d’injection de la queue, les souris seront sous anesthésie gazeuse et placées sur un tapis. Suite à l’injection, une surveillance des animaux sera réalisée pour détecter toute réaction anormale pendant les 30 minutes qui suivent l’injection et seront de nouveau contrôlées dans leur cage d’hébergement en fin de matinée et dans l’après-midi. Les animaux seront pesés toutes les semaines et seront observés pour détecter tout signe de mal-être, souffrance, lésions ou de détérioration de l’état de santé général avec la mise en place de points limites précoces. Des moyens de prévention/correction de la douleur seront apportés en fonction de l’état de l’animal.

Choix des espèces

Nos études sont réalisées afin d’améliorer le traitement de la maladie de Pompe. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec le modèle animal existant de cette maladie. Ces souris offrent un modèle génotype-→-phénotype fidèle, mesurable et modulable, parfait pour créer, comparer et optimiser les traitements de la maladie de Pompe avant le passage en toxicologie réglementaire et en l’essai clinique. Les animaux utilisés seront âgés de 6 mois, comme ceux utilisés lors des études préliminaires. L’âge de 6 mois correspond à l’âge à partir duquel des injections sont possibles au vu des très faibles quantités administrées, mais également à l’âge où la faiblesse musculaire est quantifiable par des marqueurs biologiques. A partir de 6 mois, leur état commence à évoluer, avec une faiblesse musculaire plus marquée lors de tests de comportement et une atrophie musculaire (notamment des membres postérieurs) qui elle sera très marquée vers 8-9 mois avec une marche dandinante. L’utilisation des animaux à l’âge de 6 mois permet ainsi de prévenir toute apparition de signes importants de la maladie sans intervention et d’éviter tout signe d’inconfort potentiels chez les animaux avant traitement.

Rendues obèses par un régime riche en graisses, 400 souris subissent des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements sanguins et tissulaires. L'objet est de mesurer l'anxiété, la dépression et les comportements compulsifs provoqués par ce régime, puis de tester une molécule qui stimule les récepteurs de la langue sensibles aux graisses sans apport calorique. Le porteur écrit avoir dimensionné son effectif avec un outil en ligne gratuit. Il annonce des tests comportementaux qu'il qualifie de non invasifs et conçus pour minimiser la souffrance, sans en nommer un seul, et décrit la mise à mort comme rapide et indolore.

Objectifs

L'obésité est une maladie complexe, souvent associée à des troubles comme la dépression ou l'anxiété. Parmi ses causes, on retrouve notamment une alimentation trop riche en graisses. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les mécanismes biologiques reliant l’obésité et ces troubles du comportement, en utilisant une molécule qui agit sur les récepteurs de la langue sensibles aux graisses, sans apport calorique. Pour cela, nous étudierons les effets de cette molécule sur les comportements liés à l’anxiété, la dépression et les troubles compulsifs, induits par un régime riche en graisses. Le projet permettra d’explorer les liens entre obésité et santé lentale, déjà observés chez l’humain et confirmés par des modèles animaux, mais encore mal compris au niveau des mécanismes cérébraux, notamment ceux liés à l’inflammation du système nreveux. Cette étude vise aussi à identifier des marqueurs biologiques spécifiques de l’obésité et évaluer le potentiel thérapeutique de cette nouvelle approche. Ce projet pourrait ouvrir la voie à des solutions innovantes pour traiter à la fois l’obésité et ses conséquences psychologiques.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet devraient permettre de (1) mieux comprendre les liens entre le système digestif, le cerveau et les troubles du comportement (comme l’anxiété ou la dépression) provoqués par une alimentation trop riche en graisses. Cela inclut l’étude de la communication entre la langue, l’intestin et le cerveau, un axe encore peu exploré ; et (2) d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement contre l’obésité et ses conséquences sur la prise de poids, la santé métabolique (comme la régulation de la glycémie) et le comportement (réduction de l’anxiété, de la dépression ou des troubles compulsifs). Ce traitement pourrait être utilisé à la fois en prévention (pour éviter l’obésité) et en cure (pour traiter ses effets).

Procédures

Pour étudier les effets de l’obésité et des traitements, le comportement des animaux sera évalué à l’aide de tests non invasifs, conçus pour minimiser toute souffrance. Ces tests, bien que pouvant causer un stress léger et temporaire, seront précédés d’une période d’habituation afin de familiariser les animaux avec leur environnement et les manipulations. Les animaux subiront également des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, qui incluent des prélèvements sanguins. Ces procédures seront réalisées sous analgésie pour garantir leur bien-être. Enfin, à la fin de l’étude, les animaux seront mis à mort de manière rapide et indolore (en moins d’une minute), sous anesthésie et analgésie, conformément aux normes éthiques strictes en vigueur.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux permettent d’étudier les aspects émotionnels, cognitifs et sociaux des animaux. Bien qu’ils puissent causer un stress léger (lié à une restriction alimentaire temporaire ou à un isolement ponctuel pendant les tests), toutes les précautions sont prises pour limiter cet impact : habituation progressive des animaux aux manipulations, environnement contrôlé (température, luminosité, bruit réduit). Les tests physiologiques (tolérance au glucose et à l’insuline), essentiels pour évaluer les effets de l’obésité (comme l’insulinorésistance chez les souris), peuvent entraîner une légère douleur ou fatigue. Pour y remédier, une analgésie est utilisée avant et pendant les tests, les prélèvements sanguins sont minimisés, et une surveillance continue est mise en place pour détecter tout signe de détresse. De plus, les animaux sous régime riche en graisses (pouvant entraîner un surpoids) bénéficieront d’un accès facilité à la nourriture et à l’eau pour limiter les inconforts, et l’ajout d’enrichissement dans les cages permettra d’améliorer leur qualité de vie. En fin de l’étude, les animaux seront mis à mort de manière indolore (en moins d’une minute), sous anesthésie et analgésie, conformément aux normes éthiques européennes.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Ce projet combine une approche en culture cellulaire (méthode in vitro sans recours aux animaux) pour étudier finement le mécanisme d’action de notre molécule thérapeutique au niveau cérébral et ses effets sur différents types cellulaires, ainsi qu’une approche sur modèle souris, indispensable pour analyser des processus physiologiques complexes impliquant plusieurs organes (cerveau, langue, intestin, tissu adipeux, foie et pancréas). Bien que la culture cellulaire permette de réduire l’utilisation d’animaux, le modèle souris reste nécessaire pour une approche intégrée, notamment pour évaluer les interactions entre ces organes et valider l’efficacité globale de la molécule.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au strict nécessaire, tout en permettant d’obtenir des résultats fiables et scientifiquement valables. Pour définir cet effectif, un outil en ligne gratuit a été utilisé afin d’aider à concevoir l’étude de manière rigoureuse. Par ailleurs, des travaux antérieurs ont montré qu’un groupe de 15 animaux permettait d’obtenir des résultats statistiquement pertinents. Les données seront analysées au fur et à mesure de l’étude, afin de pouvoir arrêter les expérimentations dès que le nombre d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables sera atteint, limitant ainsi l’utilisation d’animaux au minimum indispensable.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes afin de préserver les interactions sociales naturelles, dans des cages transparentes adaptées et enrichies pour favoriser leur bien-être. Leur état général sera contrôlé quotidiennement. Dans le respect de la règle des 3R et des principes éthiques de l’expérimentation animale, des méthodes non invasives et des tests comportementaux seront privilégiés chaque fois que possible. Lorsque des gestes susceptibles de provoquer une douleur sont nécessaires, ils seront réalisés avec une prise en charge adaptée de la douleur. Les animaux seront habitués progressivement à une manipulation douce afin de limiter le stress, et les contentions seront réduites au strict nécessaire. Lors des tests de tolérance au glucose ou à l’insuline, des techniques permettant une manipulation plus douce seront utilisées. Après ces procédures, une période de repos d’une semaine, sans manipulation autre que la pesée hebdomadaire, permettra aux animaux de récupérer du stress et de la fatigue éventuels. En cas de signes de détresse ou de dégradation de l’état général, les animaux seront immédiatement retirés de l’étude, replacés dans leur cage de vie avec un accès libre à l’eau et à la nourriture, et surveillés quotidiennement. Si leur état venait à se détériorer de manière irréversible et à atteindre un seuil limite prédéfini, ils seraient retirés définitivement des expérimentations et mis à mort afin d’éviter toute souffrance inutile. Toutes les interventions seront réalisées par un personnel formé et qualifié, en nombre limité, garantissant un suivi attentif et individualisé des animaux.

Choix des espèces

De nombreuses études portant sur la thématique du projet ont déjà été réalisées chez la souris, qui constitue un modèle de référence largement utilisé pour l’étude de l’obésité et des organes associés. Ce modèle permet de comparer les résultats obtenus avec ceux déjà disponibles dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, car les systèmes biologiques étudiés doivent être pleinement développés. Cet âge permet d’éviter à la fois la période de puberté et les altérations physiologiques liées au vieillissement. Ce choix est adapté aux objectifs du projet, qui s’inscrivent dans une approche à la fois préventive et curative de l’obésité.

Deux chirurgies rénales à une semaine d'intervalle pour 80 souris, un régime enrichi en adénine pendant sept semaines pour 48 autres, et pour 32 d'entre elles une ration quotidienne calquée sur ce que mange le groupe témoin pendant quatre semaines. 160 souris sont utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale après anesthésie. S'y ajoutent une perforation de l'oreille, quatre injections hebdomadaires, un jeûne de six heures et le port d'un capteur pendant une heure sur animal vigile. L'anticorps testé a été développé par un laboratoire pharmaceutique contre la dénutrition dans un autre domaine, et le porteur justifie le passage par l'animal en invoquant la réglementation, qui "impose de disposer de résultats précliniques solides avant d'autoriser un essai chez l'Homme".

Objectifs

La maladie rénale chronique (MRC) est un problème de santé publique. Elle touche environ 10 % de la population mondiale et près de 6 millions de personnes en France. Elle correspond à une perte progressive et irréversible du fonctionnement des reins et s’accompagne de nombreuses complications cardiovasculaires, métaboliques et nutritionnelles (perte de poids et notamment de muscles). Des analyses récentes ont montré que plus la MRC est sévère, plus le taux dans le sang d’une certaine protéine (appelée ici X) est élevé. Dans un autre domaine de recherche que la MRC, un laboratoire pharmaceutique a développé un anticorps contre cette protéine pour lutter contre la dénutrition et la perte de muscles. Grâce à une collaboration avec ce laboratoire, nous souhaitons tester si cet anticorps peut aussi prévenir la dénutrition et la perte de muscles dans deux modèles de MRC chez la souris : • Le modèle adénine où un régime alimentaire spécifique entraîne la formation de cristaux dans les reins provoquant des lésions. • Le modèle chirurgical où une partie du rein est retirée. La partie restante doit alors travailler beaucoup plus ce qui finit par l’abîmer. Nous testerons deux façons d’utiliser l’anticorps : 1. Traitement précoce : l’anticorps est donné en même temps que l’induction de la MRC. 2. Traitement curatif : l’anticorps est donné après que la MRC a commencé à se développer, avec ou sans un régime pauvre en protéines. Ce type de régime est souvent utilisé pour ralentir la progression de la maladie, mais il peut augmenter le risque de dénutrition. Nous vérifierons donc si l’association anticorps + régime pauvre en protéines apporte un bénéfice supplémentaire par rapport à chaque stratégie prise séparément. Comme l’anticorps pourrait aussi augmenter naturellement l’appétit, nous utiliserons une méthode appelée pair-feeding. Cela signifie qu’un groupe de souris traitées recevra exactement la même quantité de nourriture qu’un groupe non traité. Cela permettra de savoir si les effets observés viennent vraiment de l’anticorps et non simplement d’une augmentation des apports alimentaires. Objectif principal : déterminer si l’anticorps peut améliorer les problèmes majeurs liés à la MRC — baisse de la fonction rénale, dénutrition et perte de muscles —, qui sont également des complications importantes chez les patients humains.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet servira à vérifier si un traitement avec l’anticorps anti-X, donné dans à stade précoce de la maladie ou pour soigner quand la maladie est déjà installée, peut améliorer le fonctionnement des reins et réduire les complications de la maladie rénale chronique (perte de poids et de muscles). Pour l’instant, on ne sait pas encore quels sont les effets de cet anticorps dans cette situation. Si les résultats sont bons, ils représenteront une étape importante vers la préparation d’une étude clinique chez l’Homme. À plus long terme, ces recherches pourraient permettre de développer une nouvelle façon de traiter la maladie rénale chronique, afin d’améliorer le fonctionnement des reins, l’état nutritionnel et la qualité de vie des patients.

Procédures

Les 160 animaux seront identifiés une fois par une perforation de l’oreille (≈1 mm, 20 sec avec contention). Induction de la maladie rénale : – 1ère étude (modèle adénine) : 48 souris recevront une alimentation enrichie en adénine, quotidiennement (sauf week-ends) pendant 7 semaines. – 2nde étude (modèle chirurgical) : 96 souris recevront 4 injections anesthésiantes (1 anesthésie générale + 1 locale à chaque chirurgie,

Impact sur les animaux

L’identification des animaux par une petite perforation de l’oreille peut provoquer une douleur légère et de très courte durée. Le régime alimentaire riche en adénine, utilisé pour provoquer la maladie rénale, réduit l’appétit et ralentit la prise de poids des animaux. Cela peut entraîner un inconfort. La méthode qui consiste à donner une quantité précise de nourriture à un groupe pour qu’il mange autant que le groupe contrôle peut créer une frustration, de la fatigue ou du stress, car les animaux ne peuvent pas manger autant qu’ils le souhaitent. De même, un régime pauvre en protéines peut entraîner une perte de poids. Les pesées régulières représentent un petit stress momentané. Les injections, que ce soit pour administrer l’anticorps, un placebo ou des produits d’anesthésie/analgésie, provoquent un stress court et une douleur légère. Aucune nuisance n'est attendue suite à l'injection de l'anticorps anti-X. Les deux opérations nécessaires dans le modèle chirurgical peuvent entraîner une douleur après l’intervention, du stress temporaire et un risque classique de complications liées à la chirurgie ou à l’anesthésie. Dans nos expériences précédentes, la mortalité associée à cette procédure était inférieure à 5 %, et survenait surtout dans les 24 à 48 h suivant la seconde chirurgie. Les mesures de composition corporelle nécessitent de placer brièvement la souris dans un petit tube pendant moins de deux minutes ; cela peut provoquer un stress léger. L’évaluation de la fonction du rein implique une courte anesthésie gazeuse pour l’injection du produit et la pose du capteur, puis le port du capteur pendant environ une heure. Cela peut entraîner un inconfort temporaire. La période de jeûne de six heures, indispensable pour étudier le métabolisme du glucose, peut générer un inconfort modéré. La petite prise de sang au niveau de la queue provoque une gêne brève et légère. Aucun comportement anormal n’a été observé lors de protocoles similaires dans notre laboratoire. Toutes les procédures sont réalisées par un personnel formé, avec une surveillance adaptée, afin de réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.

Devenir

Les 160 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Le traitement par l’anticorps anti-X doit d’abord être testé chez l’animal avant d’être donné à l’être humain. Cette étape est nécessaire pour vérifier s’il est efficace et pour repérer d’éventuels effets indésirables. La réglementation impose de disposer de résultats précliniques solides avant d’autoriser un essai chez l’Homme. Les tests chez l’animal sont donc indispensables pour justifier l’utilisation de ce traitement chez les patients atteints de maladie rénale chronique.

Réduction

Le traitement par l’anticorps anti-X n’a encore jamais été testé dans la maladie rénale. En revanche, il a déjà été utilisé chez la souris pour d’autres maladies, ce qui nous laisse penser qu’il pourrait avoir un effet et limite le risque d’utiliser des animaux sans raison valable. Le nombre de souris nécessaires dans chaque groupe a été déterminé grâce à un calcul statistique. Ce calcul s’appuie sur nos résultats obtenus dans des études précédentes chez des souris avec une maladie rénale. Selon ce calcul, 16 animaux par groupe sont nécessaires pour détecter une différence réelle. Nous avons également choisi des méthodes non invasives (analyse de la composition corporelle et mesure de la fonction rénale) qui peuvent être faites deux fois sur les mêmes animaux : avant et après le traitement. Cela permet de réduire le nombre total d’animaux. Enfin, un maximum de tissus sera collecté au moment de la mise à mort et conservé. Ces échantillons permettront de répondre à d’autres questions scientifiques ou d’être utilisés dans des collaborations, évitant ainsi de refaire des expériences et de réutiliser des animaux inutilement.

Raffinement

Toutes les manipulations seront réalisées par trois expérimentateurs expérimentés afin de garantir des gestes rapides et précis. Les animaux seront manipulés avec douceur, dans un environnement calme, et observés cinq fois par semaine. La prise alimentaire et hydrique sera mesurée deux fois par semaine par cage, et le poids individuel suivi deux fois par semaine. Pour la composition corporelle, les animaux seront préalablement habitués au tube de mesure (un entraînement à l’entrée dans le tube une semaine avant la mesure), ce qui réduira le stress durant la séance. Dans le cadre de la restriction alimentaire, plusieurs mesures limiteront le stress : rations ajustées tous les deux jours selon la consommation du groupe contrôle, distribution à horaire fixe, nourriture répartie en plusieurs points, et enrichissement supplémentaire des cages. L’alimentation enrichie en adénine sera interrompue chaque week-end pour limiter la perte de poids sans compromettre l’induction de la maladie. Les croquettes seront préparées avec du cacao pour maintenir une bonne appétence. Les volumes d’injection (anticorps, placebo, anesthésiques, analgésiques) seront réduits au minimum nécessaire. Pour la mesure de la fonction rénale, une anesthésie gazeuse légère et brève facilitera l’injection du produit et la pose du capteur ; un collyre anesthésique sera appliqué. Pendant l’enregistrement (≈60 min), les animaux resteront vigiles, dans leur cage, sous surveillance rapprochée. Les chirurgies rénales seront réalisées par du personnel expérimenté. L’anesthésie générale sera adaptée au poids et surveillée en continu, complétée par une anesthésie locale. Des analgésiques seront administrés avant et après l’intervention. Au réveil, les animaux seront placés au chaud et surveillés jusqu’à récupération complète, puis feront l’objet d’un suivi post-opératoire renforcé. La planification en deux étapes réduit la sévérité de chaque chirurgie et permet une induction progressive de la maladie. En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour un prélèvement de sang, puis mis à mort par dislocation cervicale. Des points limites précis permettront une détection précoce de toute souffrance ou dégradation de l’état général.

Choix des espèces

La souris est un modèle adapté pour étudier la maladie rénale chronique. Les deux méthodes utilisées pour induire la maladie entraînent une forme modérée qui reproduit les principales atteintes observées chez l’Homme. Ces modèles sont bien connus et largement utilisés. Le choix de cette espèce permet aussi de comparer nos résultats avec nos travaux précédents menés chez la souris avec un régime pauvre en protéines. Par ailleurs, l’anticorps anti-X a déjà montré une efficacité dans d’autres modèles murins, ce qui renforce la probabilité d’obtenir un effet dans les modèles utilisés ici. Des souris âgées de 10 semaines seront utilisées. À cet âge, elles ont terminé leur croissance, ce qui assure des réponses plus homogènes. Le régime enrichi en adénine est bien toléré et les deux chirurgies sont correctement supportées. La maladie rénale induite à cet âge est bien caractérisée et reproductible.

192 souris vont être utilisées, chacune privée de ses congénères pendant seize jours pour qu'elles ne grattent pas les greffons des autres, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur retire un morceau de peau du dos sous anesthésie et on y greffe une peau humaine reconstituée en laboratoire, opération de quinze à vingt minutes qui peut entraîner une douleur modérée et une déshydratation pendant quatre jours. Toutes sont tuées pour que le greffon soit analysé. Le porteur revendique un milieu de culture sans sérum animal, mis au point pour répondre aux exigences réglementaires du médicament, et annonce des bio-pansements pour les grands brûlés, 3 500 cas graves par an en France, comme retombée à venir.

Objectifs

En raison de sa fonction protectrice, la peau est un organe indispensable à la survie de l’organisme. Lors d’agressions importantes, telles qu’une brûlure du troisième degré, la peau n’est plus capable de cicatriser spontanément. L’étendue de la brûlure et le risque élevé d’infection associé peut engager le pronostic vital de l’individu. La prise en charge des victimes de brûlures sévères se base sur l’utilisation de substituts de peau préparés avec les cellules du patient. Cependant, la longueur du procédé de fabrication peut mettre en jeu la vie du patient. La présence et le maintien de cellules souches épidermiques sont nécessaires à la bonne prise de greffe et à l’efficacité de recouvrement à long terme. Pour cela, nous avons développé et optimisé un milieu de culture sans sérum animal, permettant le maintien du potentiel de croissance in vitro de ces cellules à long terme et de leur capacité à former une peau reconstituée. L’objectif du projet est de valider l’efficacité in vivo et sur le long terme d’un substitut de peau humain préparé in vitro dans ces conditions optimisées correspondant aux exigences réglementaires d’un médicament et donc susceptible de servir de bio-pansements lors de greffe de peau.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d’évaluer le devenir et le maintien à long terme de cellules souches dans un greffon cutané humain pour favoriser une bonne prise de greffe, la maturation de la peau et son auto-renouvèlement tout au long de la vie d’un patient. Cette étape permettrait une avancée significative vers la conception de nouveaux substituts cutanés pouvant servir de bio-pansements lors de greffes de peaux chez l’Homme (ex : grands brulés avec 3500 cas graves par an en France).

Procédures

Les animaux seront hébergés individuellement 2 jours avant la chirurgie et pendant toute la durée de l’expérience (14 jours). Les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à une greffe de peau reconstituée sur le dos pour une durée moyenne de chirurgie de 15 à 20 minutes par souris.

Impact sur les animaux

L’anesthésie par injection peut provoquer chez les animaux une légère apathie au réveil pendant une ½ journée. Le retrait d’un morceau de peau et la greffe peuvent entrainer chez les animaux une douleur modérée et une légère déshydratation pendant 4 jours. Un stress peut être induit par la nécessité de placer les animaux en hébergement individuel le temps de la procédure (14 jours) pour éviter que les souris endommagent les greffons de leurs congénères, notamment par grattage. Il y a un risque d’infection de la plaie qui conduit à la sortie de l’animal de l’étude.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux inclus dans l’étude est nécessaire pour analyser au niveau histologique, cellulaire et moléculaire les substituts de peau greffés. Ces analyses viendront compléter les observations visuelles de la plaie et permettre de conclure à l’efficacité du substitut cutané.

Remplacement

Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée impliquant des cultures de cellules et des reconstructions de substituts de peau humaine en 3 dimensions, les mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d’une greffe et des processus de cicatrisation ne peuvent être reproduits en laboratoire. Par exemple, les modèles de cicatrisation ex vivo qui reproduisent plus fidèlement la peau humaine sont limités par exemple par l’absence de mécanismes de coagulation ou d’inflammation. Le remplacement par des modèles in vitro ou ex vivo n’est ainsi pas possible ici car seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire à long terme à la suite d’une xénogreffe, permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, des premières études in vitro de culture cellulaire en 3 dimensions ont été effectuées pour valider la non toxicité et la fonctionnalité biologique de la peau greffée préparée dans des milieux de culture de composition compatible avec les critères d’exigence d’une future utilisation en clinique. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera assuré par l’utilisation de moyens d’enrichissement du milieu de vie des animaux par une visite quotidienne et la mise en place d’une anesthésie et analgésie avant, pendant et après la chirurgie. Pour pallier l’éventuelle perte de poids des animaux, une alimentation riche sous forme gélifiée sera placée au fond de chaque cage. En cas de déshydratation, des injections sous cutanées de liquide physiologique seront réalisées. En cas d’absence d’amélioration de leur état général, les animaux seront euthanasiés. Afin de réduire la souffrance animale. Une grille de suivi des animaux est mise en place et des points limites sont définis pour guider la mise en place de traitements adaptés ou la décision d’euthanasier les animaux.

Choix des espèces

Les souris seront utilisées au stade du jeune adulte (8 semaines). Ce choix résulte d’un compromis pour utiliser des souris à un stade de développement suffisamment avancé pour s’affranchir du cycle de croissance des souris (pouvant entrer en jeu dans les processus de greffe et de cicatrisation) mais suffisamment jeune pour s’affranchir des processus de vieillissement de la souris. Dans un premier temps, nous avons choisi l’espèce de souris sans thymus car c’est un modèle largement décrit dans la littérature pour évaluer la greffe et la cicatrisation de la peau humaine. De plus, ce choix vise à standardiser ce modèle de greffe de peau entre plusieurs laboratoires impliqués dans un projet de recherche commun. Le choix d’une deuxième lignée de souris pour rechercher une possible amélioration de notre modèle de greffe est basé sur des publications montrant le succès de greffes de substituts cutanés dans cet autre modèle.