Rongeurs

Jusqu'à soixante-trois jours seules en cage, cinquante-six administrations orales quotidiennes, deux mises à jeun de douze heures et quatre prélèvements de sang à la queue : 80 souris subissent ces procédures, dont soixante âgées de 22 mois. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour prélever foie, tissu adipeux, muscle, cœur et cerveau. L'étude compare un composé en développement à un composé de référence sur l'inflammation intestinale liée à l'âge, pour le compte d'un client dont le porteur espère qu'il obtiendra une mise sur le marché. Ni l'un ni l'autre composé n'est nommé, et l'effectif est justifié par l'expérience du laboratoire "sur le modèle de souris obèse", quand les animaux utilisés ici sont des souris âgées.

Objectifs

Le vieillissement se caractérise par un état d'inflammation chronique de bas grade, contribuant au développement de troubles métaboliques, gastro-intestinaux et systémiques. Les stratégies visant à restaurer l'intégrité de la barrière intestinale et à réduire les déclencheurs pro-inflammatoires d'origine intestinale sont de plus en plus reconnues comme des approches prometteuses pour atténuer l'inflammation et favoriser un vieillissement en bonne santé. L'objectif du projet est de caractériser l'inflammation intestinale et systémique chez des souris âgées comparées à des souris jeunes, et évaluer l'efficacité d'un traitement chronique pendant 7 semaines d'un composé en développement versus un composé de référence afin d'atténuer l'inflammation intestinale liée à l'âge et restaurer l'intégrité de la barrière intestinale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à répondre à un enjeu de santé majeur lié au vieillissement : la présence d’une inflammation chronique de bas grade, qui contribue à la progression de nombreuses pathologies métaboliques, gastro-intestinales et systémiques. L’identification de stratégies nutritionnelles ou thérapeutiques capables de moduler l’inflammation intestinale représente une approche prometteuse pour favoriser un vieillissement en meilleure santé. Ce projet s'incrit dans le cadre du développement d'un composé en développement visant à atténuer l'inflammation intestinale chez l'Homme et ainsi de promouvoir un vieillisement sain. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de l'inflammation intestinale.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Hébergement individuel (max. 63 jours / état vigil) ; 2) Administration quotidienne de traitements ou véhicule (max. 56; durée : env. 1 minute / état vigil) ; 3) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (max. 17 mesures; durée : env. 1 minute / état vigil) ; 4) Mise à jeun en présence d'eau (2 fois, durée : 12h / état vigil) ; 5) Administration d'un marqueur fluorescent (2 fois, durée : env. 1minute / état vigil); 6) Prélèvements sanguin à la queue (max. 4 prélèvements, durée du prélèvement : 2 minutes / état vigil).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations et le placement en boîte de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de stress. La mise à jeun de 12h pourra induire une sensation de faim.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure afin de collecter des organes (foie, tissu adipeux, muscle gastrocnémien, coeur et cerveau) pour analyses biochimiques et histologiques ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre d'inflammation intestinal. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que nous n'attendons pas d'effet sexe-dépendant du candidat médicament, l'étude sera menée sur les deux sexes.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cage individuelle pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts visuels, auditifs et olfactifs entre eux. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue avant les prélèvements sanguins. Une alimentation sous forme de gelée sera ajoutée dans chaque cages afin de prevenir les difficultées d'alimentation en raison de l'âge avancé de certaines souris. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé est l’un des plus couramment employés et les mieux caractérisés dans le cadre d’études précliniques portant sur l’inflammation intestinale. Le présent projet nécessitera l'utilisation de 20 souris âgées de 2 mois correspondant au stade de développement "jeune adulte", afin de constituer un groupe de référence. Il impliquera également 60 souris âgées de 22 mois représentant un stade "adulte avancé" chez la souris. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par le composé à tester, à savoir une population âgée.

Privées de défenses immunitaires par sélection génétique pour que les greffons humains prennent, 384 souris reçoivent par chirurgie des fragments de tumeurs de poumon et de vessie prélevées sur des patients. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et la tumeur peut gêner la locomotion, ulcérer voire nécroser la peau qui la recouvre. Pendant jusqu'à 180 jours, chaque animal est pesé deux fois par semaine et sa tumeur mesurée au pied à coulisse, avec une sensibilité que le porteur reconnaît au moment de la mesure. Toutes sont tuées, celles chez qui aucune tumeur n'a poussé au bout de six mois comme les autres, et le porteur écrit qu'il n'a pas été possible de justifier statistiquement l'effectif de 384.

Objectifs

Le cancer reste l’une des principales causes de mortalité dans le monde. En particulier, les cancers de la vessie et les cancers du poumon représentent un lourd fardeau pour les patients et les systèmes de santé. Malgré les progrès de l’immunothérapie, les taux de réponse restent faibles (20–30 %) et les coûts de traitement très élevés (30 000 à 200 000 € par patient). Une des principales limitations à l’efficacité de ces traitements est liée aux systèmes de délivrance peu efficaces de l’agent thérapeutique. Il est donc urgent de développer de nouveaux outils de délivrance ciblée permettant d’optimiser l’efficacité tout en limitant les effets indésirables. Les objectifs du projet sont de développer des modèles de tumeurs dérivées de patients de cancers de la vessie et du poumon, représentatifs de l’hétérogénéité des tumeurs humaines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra de développer de nouveaux modèles pertinents afin d'obtenir par la suite des informations sur l’efficacité d’un potentiel nouveau traitement anticancéreux plus efficace chez des patients atteints de cancer du poumon et de la vessie, étant peu ou non répondeurs aux traitements de référence.

Procédures

Implantation de morceaux de tumeurs par chirurgie (5 minutes). Mesures tumorales au pied à coulisse 1 à 2x/sem et pesées 2x/semaine (quelques secondes) jusqu’à 180 jours après implantation. Administration d’analgésique pendant quelques secondes pouvant être réalisée jusqu’à 4 fois.

Impact sur les animaux

Pousse tumorale : nuisance possible si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite, gêne. Une perte de poids peut être envisagée suite à la pousse tumorale. Les animaux vont subir une intervention chirurgicale sous anesthésie afin d’implanter les fragments de PDX en sous-cutané qui peut entrainer un stress. La tumeur peut à un certain volume gêner à la locomotion, et la peau au niveau de la tumeur peut potentiellement ulcérer voire nécroser. Aucune métastase n’est attendue dans ces modèles chez la souris avant atteinte d’un volume tumoral constitutif d’un point limite, mais les animaux seront surveillés de manière adéquate. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress pendant plusieurs semaines lors de la contention et éventuellement une gêne, sensibilité au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tumeurs pour les analyser et caractériser les modèles ou au bout de 180 jours si aucune tumeur n’a pris.

Remplacement

Plusieurs études préliminaires ont été menées in vitro pour s’assurer de l’efficacité prometteuse du traitement sur des lignées cancéreuses en culture ainsi que plusieurs étapes de vérification de caractéristiques valides pour un candidat médicament, cependant les interactions entre le métabolisme, les cellules du système immunitaire et le microenvironnement tumoral sont complexes et impactées par différents organes, ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Même si nous cherchons à développer nos modèles en impression 3D, tout ceci n’étant encore qu’à un stade très précoce et ne représentant pas le microenvironnement tumoral et sa complexité, l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur ne peut, pour le moment, se faire que sur organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de mener le but de la procédure à bien. Il n’a pas été possible de justifier statistiquement les effectifs au vu de la portée exploratoire de ce développement, cependant nous nous sommes appuyés sur une revue extensive de la littérature et notre expérience pour déterminer que nous aurions besoin de ce nombre d’animaux pour mener le projet à bien.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet qui les pèseront plusieurs fois afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements appropriés à la souche de souris (coton de nidation, tunnels pour jeux, maisonnette).

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec la souris car c’est une espèce sur laquelle de nombreux modèles de cancer ont été développés, et qui permet de manipuler facilement le système immunitaire : ici une déficience pour une meilleure prise de nos PDX. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Deux injections trois fois par semaine pendant quatre mois : c'est le traitement imposé à 280 des 1 058 souris de ce projet, toutes utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime riche en graisses et en sucres jusqu'à devenir obèses et résistantes à l'insuline, puis des prises de sang mensuelles, des tests de tolérance à l'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie et des mesures hebdomadaires de composition corporelle. L'objet est de savoir si une hormone greffée sur des vésicules prolonge l'effet d'un antidiabétique du marché après son arrêt, les essais chez l'humain restant conditionnés aux résultats. Chaque souris finit anesthésiée à l'isoflurane, saignée au niveau du sinus rétro-orbital, puis tuée par dislocation cervicale.

Objectifs

Le Diabète de Type 2 est une maladie chronique qui touche 463 millions d'adultes dans le monde, représentant 90% des cas de diabète. Ce chiffre pourrait atteindre 700 millions d'ici 2045. Le diabète cause environ 1,5 millions de décès par an. Un des facteurs de risque majeur est l’obésité. Les médicaments utilisés dans le traitement de l’obésité et dans le diabète de type 2, présentent des limites. Ils ne sont pas efficaces chez tous les patients, et entraînent souvent un regain de poids après arrêt du traitement, ce qui représente un traitement à vie. Il y a donc nécessité de développer de nouvelles solutions pour surmonter les insuffisances et problèmes associés à l'utilisation de cette classe de médicaments. Une hormone abondante dans le sang, a des effets anti-inflammatoires et bénéfiques sur nos organes. Chez les personnes atteintes de diabète de type 2 ou obèses, son taux est fortement diminué. Il faudrait donc donner à ces personnes un médicament constitué de cette hormone. Or, à ce jour, personne n’a réussi à la fabriquer. Ce défi a été relevé en greffant l'hormone sur des vésicules, sortes de transporteurs présents dans le corps et qui assurent la communication entre les organes. Notre projet vise à étudier les effets thérapeutiques de ces transporteurs d’hormone chez des souris sous régime gras et d’évaluer leur impact thérapeutique après arrêt du médicament du marché. Ainsi, nous saurons si la perte de poids induite par le médicament du marché est maintenue grâce à l'hormone. Nous évaluerons aussi l’effet thérapeutique de l’hormone, combinée ou pas au médicament du marché lorsqu’elle est administrée sous forme de virus thérapeutiques. Nous comparerons également l'efficacité du traitement entre les femelles et les mâles.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet nous permettra de mieux comprendre comment utiliser un nouveau traitement qu’il soit à base de virus thérapeutique ou à base de vésicule transportant l'hormone pour prolonger les effets bénéfiques d’un médicament anti-diabétique existant, même après son arrêt. Cela pourrait permettre à l’avenir de réduire les effets secondaires liés à un traitement à vie, notamment chez les jeunes patients. Nous étudierons aussi si les femelles et les mâles réagissent différemment au traitement, ce qui pourrait aider à adapter les futurs traitements selon le sexe des patients. À moyen terme, les résultats obtenus contribueront à valider notre traitement expérimental avant son test chez l’humain. Si les résultats sont positifs, ce traitement innovant pourra entrer dans une première phase d’essai clinique. À long terme, ce nouveau type de traitement, basé sur des vésicules naturelles transportant un médicament, pourrait offrir une alternative plus efficace et mieux tolérée que les médicaments actuels, avec des applications dans d’autres maladies comme les maladies du foie, les problèmes cardiovasculaires, certaines atteintes de la rétine ou encore des maladies inflammatoires.

Procédures

Les animaux vigiles seront pesés 1 fois avant le début des traitements puis 1 fois par semaine pendant la durée du protocole. Le traitement consiste à 2 injections 3 fois par semaine pendant 4 mois et concerne 280 souris. 2 prélèvements de sang (sur 15 jours d’acclimatation) avant la période de traitement seront faits sur animaux vigiles puis 1 fois par mois pour mesurer les transaminases. L’analyse corporelle est une approche non invasive, qui se fait sur animaux éveillés en moins de 2 minutes. Elle sera faite 1 fois par semaine ou 1 fois par mois, selon la procédure. Les tests de glycémie (sous insuline ou non) seront faits 1 fois par mois à 5 jours d’intervalle. Différentes combinaisons de traitements seront injectées (quelques secondes) à 674 souris vigiles par voie sous-cutané ou par voie intra-veineuse pendant 1 mois. 360 souris recevront 1 injection sous-cutanée d’un traitement 3 fois par semaine pendant 1 mois et 1 seule injection en intra-veineuse. 72 souris recevront 1 injection sous-cutanée d’un traitement trois fois par semaine pendant 1 mois. 242 souris recevront 1 seule injection en intra-veineuse pendant 1 mois. 648 souris seront pesées et subiront des tests d’analyse de la composition corporelle avant le début du traitement et 1 fois par semaine, au cours du traitement pendant 1 mois. Elles subiront également un test d’analyse du métabolisme de base avant le début des injections et en fin d’étude. 26 animaux seront prélevés (30 µL de sang), moins d’une minute, avant le début des injections et une fois par semaine pendant 1 mois. Enfin, tous les animaux (1058) seront anesthésiés à la fin de l’étude et du sang sera prélevé (quelques secondes) une fois l’animal endormi. Les animaux seront euthanasiées et des organes seront récoltés.

Impact sur les animaux

Les animaux sous régime gras présentent des caractéristiques comparables aux personnes souffrant d’obésité (diabète, résistance à l’insuline). Les manipulations répétées pour les injections du traitement et les prélèvements de gouttes de sang peuvent entrainer un stress transitoire. Nous prévoyons d’alterner le site d’injection pour limiter la douleur induite lors des injections hebdomadaires. L’injection d’insuline peut entrainer une hypoglycémie.

Devenir

Toutes les souris sont mises à mort afin de prélever du sang et différents organes permettant de répondre aux questions sur les effets métaboliques des vésicules, car ces organes seront analysés par la suite par des techniques de biochimie et d’histologie.

Remplacement

Des méthodes alternatives ont déjà été utilisées, notamment sur des cellules en culture in vitro au laboratoire. La procédure expérimentale a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude métabolique globale dans un contexte d’obésité, dépendant du métabolisme et de la communication entre différents organes ne peut se faire que sur animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint à son minimum, sans compromettre les objectifs du projet et l’interprétation statistique des résultats expérimentaux. Le nombre de souris par lot a été déterminé par un logiciel d’analyse statistique en tenant compte de la taille d’effet basé sur des données pilotes. Nous prévoyons d’utiliser un total de 1058 souris sur une durée de 5 ans, dans 6 procédures.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront réparties dans les cages en fonction de leur poids et de certains critères métaboliques afin d’avoir des groupes équilibrés. Elles resteront 10 jours sans manipulation pour s’habituer à leur nouvel environnement. Elles recevront une alimentation riche en graisses et en sucres, changée deux fois par semaine pour garantir sa fraîcheur. Les litières seront changées plus souvent que la normale, car les souris sont diabétiques. Les souris seront pesées une fois par semaine et surveillées quotidiennement pour détecter rapidement tout signe de douleur ou de stress lié aux injections. Plusieurs signes seront observés : poids, apparence, comportement, réactions aux stimuli. Des scores seront attribués selon une grille définie afin de determiner le besoin d'un suivi renforcé, un traitement antidouleur ou une euthanasie. Les sites d’injection seront changés régulièrement pour limiter la douleur. Lors du test de tolérance à l’insuline, une solution de sucre (dextrose) sera préparée à l’avance afin d’intervenir rapidement en cas de signes d’hypoglycémie. Le jour de la mise à mort, une anesthésie sera réalisée sous isoflurane afin de récupérer le sang au niveau du sinus rétro-orbital (après dépôt d’une goutte d’analgésique local). Chaque animal sera ensuite euthanasié par dislocation cervicale afin de confirmer la mort de l’animal.

Choix des espèces

Afin de tester l’effet métabolique des vésicules transportant l'hormone, combinées ou pas avec l'anti-diabétique du marché, nous travaillerons avec des modèles murins d’obésité pertinents à savoir des souris sous régime gras qui développent des insulino-résistances sévères et présentent des phénotypes métaboliques basaux différents pour mimer l’obésité. Dans ce projet, des mâles et des femelles obèses âgés de 5 mois seront utilisés, car c’est à stade que se mettent en place des altérations métaboliques conduisant au développement de complications métaboliques qui pourraient donc être prévenues par l’injection de l'hormone. Pour étudier le devenir après injections (stabilité dans le temps et dans les organes) des traitements à base de virus transportant l'hormone, nous utiliserons des souris plus jeunes (10 semaines) qui auront un régime alimentaire standard.

18 000 souris, 2 000 rats et 2 050 hamsters dorés vont recevoir pendant jusqu'à soixante semaines une nourriture riche en graisses et en sucres, et une eau sucrée, afin de développer obésité, diabète, dyslipidémie et stéatose hépatique. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à 240 piqûres de la veine caudale par animal pour mesurer la glycémie, et le porteur reconnaît que la maladie induite peut aller jusqu'à la fibrose, la cirrhose ou un cancer du foie. La majorité de ces 22 050 rongeurs part ensuite vers le laboratoire d'un client qui les utilisera dans son propre projet, les cinquante hamsters servant à entraîner le personnel au prélèvement sanguin étant, eux, tués. Rendre malades des rongeurs par lots pour les livrer comme modèles d'évaluation de médicaments : le porteur compte ce travail parmi les bénéfices pour l'animal, au titre de "l'amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée".

Objectifs

A l’échelle mondiale, les maladies liées au surpoids représentent une part non négligeable des décès estimé à plus de 1,2 million par an. En 2016, 650 millions d’adultes étaient obèses, soit 3 fois plus qu’en 1975. En 2021, le diabète affecte plus de 537 millions de personnes. La dyslipidémie et la NASH (stéatose hépatique non- alcoolique) sont provoqués par le diabète et l’obésité. La dyslipidémie touche quelques milliers de patients chaque année en France et la société nationale française de gastro-entérologie considère qu’un quart de la population française est touché par la NASH. Par l'alimentation de rongeurs avec un régime riche en lipides et glucides, il est possible d'induire ces phénotypes spécifiques : obésité, dyslipidémie, diabète et NASH. Ces rongeurs avec syndromes métaboliques seront utilisés chez nos clients pour évaluer les effets de médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des bénéfices pour l’homme. Ce projet pourra amener à long terme des solutions thérapeutiques pour traiter les syndromes métaboliques du surpoids et du diabète. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les animaux auront à disposition un aliment standard et/ou un aliment riche en gras et/ou en sucre et une eau standard et/ou une eau additionnée de sucre, pendant 60 semaines maximum. Des prélèvements sanguins pour mesurer la glycémie pourront être faits, et consisteront en un prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale, avec ou sans mise à jeun (mise à jeun de 4 à 6 heures maximum), sur les animaux en aigue (maximum 2 mesures par jour par animal, avec 3 jours de récupération entre 2 séries de mesures, ce qui fait 240 prélèvements sur toute la durée du protocole) ou en chronique (une mesure par animal par semaine, ce qui fait 60 prélèvements sur toute la durée du protocole). La durée du prélèvement ne dépassera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

Au fil de la prise alimentaire riche en gras et/ou sucres et d’un abreuvement standard ou riche en sucre, les animaux pourront exprimés des signes cliniques plus ou moins modérés. Les animaux vont développer une obésité et des syndromes métaboliques tels diabète, dyslipidémie, insulino-résistance, NASH pouvant aller jusqu’à une fibrose, une cirrhose ou un cancer du foie à long terme (après la phase préparatoire). Le prélèvement sanguin peut induire un léger stress transitoire et une légère douleur.

Devenir

La majorité des animaux sont expédiés à un laboratoire de recherche pour une utilisation dans son projet de recherche. Les animaux qui auront servi à l’entrainement au prélèvement sanguin seront mis à mort, ne pouvant être utilisés dans une autre procédure.

Remplacement

L’induction de modification métabolique chez l’animal fait intervenir plusieurs types cellulaires produisant des facteurs tendant à moduler ou amplifier la réponse. Toute cette cascade d’événement faisant intervenir des facteurs autocrines, paracrines ou exocrines aussi variés que complexes ne permet pas une étude significative et déterminante in vitro. Par ailleurs, l'objet de cette étude est d'évaluer l'impact sur une fonction vitale de l'organisme, ce qui ne peut être fait que sur un organisme vivant.

Réduction

Nous réalisons ce protocole alimentaire pour proposer un modèle animal pertinent avec un nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre l'objectif scientifique. Le nombre d’animaux pour chaque espèce est estimé selon un prévisionnel de demandes basé sur les années précédentes. Les animaux dédiés à l’entraînement ne concernent que les hamsters, car la maîtrise du prélèvement sur la veine saphène nécessite une phase d’apprentissage préalable avant toute manipulation sur les animaux du protocole.Un nombre de 5 hamsters pourra être utilisé pour l’entrainement des personnes au prélèvement à la veine saphène avant chaque lot. Avec 2 lots par an, il sera utilisé 50 hamsters sur les 5 ans.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long de cette phase préparatoire. En cas d'anomalie clinique observée sur un animal, une grille de scoring général sera utilisée afin de déterminer l'atteinte de points limites et de décider du devenir de l'animal. Enfin, les contentions et prélèvements seront réalisés par un personnel formé et expérimenté.

Choix des espèces

Les souris, rats et hamsters sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur les maladies métaboliques liés au surpoids car elles développent naturellement ce type de pathologie ayant une affinité à la nourriture grasse et sucrée similaire à l’Homme. Pour les hamsters syriens dorés, ils ont un métabolisme des lipoprotéines imitant la dyslipidémie humaine car il exprime la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP). Les animaux pourront commencer le régime alimentaire à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). À cet âge, le métabolisme est encore en développement, ce qui permet une meilleure induction de l’obésité par le régime enrichi en graisses et/ou en sucre. De plus, une mise en place précoce du régime permet une meilleure standardisation entre les individus et augmente la robustesse du modèle.

Maintenus autour de 90 % de leur poids de forme pour rester motivés par la récompense alimentaire, 114 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour analyse de leur cerveau. Ils apprennent une tâche une heure par jour, au moins cinq jours sur sept pendant deux à trois mois, avant une opération d'une heure trente pour implanter des électrodes dans deux régions cérébrales, puis un à deux mois d'enregistrement. Le porteur qualifie cette restriction de temporaire et affirme qu'elle "impacte très peu" leur bien-être, tout en ajustant la ration dès que le poids passe deux jours de suite sous le seuil. L'objectif premier reste fondamental, comprendre quand le cerveau décide d'agir, les indications sur les troubles cognitifs humains venant en second et sans échéance.

Objectifs

Le comportement est adapté s'il est géré correctement et de façon flexible dans le temps, et décider quand agir est un processus fondamental dont la base neurobiologique reste largement inconnue. Le projet vise à analyser l'organisation fonctionnelle de deux zones du cerveau, et leur modulation, dans le contrôle flexible de l'action dans le temps. Sur la base de données récentes, nous faisons l'hypothèse que la coordination d'un comportement adapté dans le temps nécessite une interaction précise au sein des circuits neuronaux. L’objectif général de ce projet est d’évaluer l’implication de ces réseaux grâce à l’enregistrement de neurones de deux régions du cerveau afin de caractériser la signature neuronale et l’interaction entre les deux zones cérébrales lors de l’adaptation comportementale à différentes règles spatiotemporelles. Cette étude nous apportera des informations importantes et nouvelles sur le rôle de ces circuits dans la flexibilité temporelle.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une information précieuse sur les réseaux neuronaux impliqués dans la flexibilité comportementale. Outre son intérêt en recherche fondamentale (objectif premier de l’étude), ce projet devrait fournir des indications précieuses en recherche translationnelle dans la mesure où des dysfonctionnements préfrontaux avec des altérations des fonctions exécutives (dont les flexibilités cognitives) ont été décrits dans plusieurs maladies du cerveau (ex : Schizophrénie, addictions).

Procédures

Dans ce projet, tous les rats seront entraînés à réaliser une tâche comportementale qui nécessite une légère restriction alimentaire initiale (~1 semaine) suivie d'un apport de nourriture contrôlé quotidien (2-3 mois). L'apprentissage est réalisé à raison d’une séance d’une heure par jour au moins 5 jours sur 7, puis subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (durée environ 1h30) pour implanter des électrodes dans deux régions d’intérêt. Les animaux sont isolés d'un à trois jours maximum après la chirurgie pour permettre une bonne cicatrisation, puis remis en cages collectives. Après une semaine de récupération post-chirurgie, ils seront ré-entrainés à la même tâche comportementale (2 semaines) puis enregistrés pendant la réalisation de cette dernière (un à deux mois).

Impact sur les animaux

La tâche comportementale n’est pas stressante en soi, mais nécessite que l’animal ait une certaine motivation pour explorer l’environnement et chercher le renforcement positif (récompense alimentaire). Pour être au plus près du comportement naturel et favoriser la motivation, nous procéderons à une alimentation contrôlée, en donnant la nourriture immédiatement après la séance comportementale en quantité suffisante (90-95% de la ration normale), de façon à ce qu’il n’y ait pas de reste de nourriture le lendemain, mais que l’animal ait une légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire. Cependant, pour amorcer leur motivation à effectuer la tâche, les animaux seront restreints dans les premiers jours de la tâche comportementales de façon à les maintenir autour de 90% de leur poids. Le poids de l’animal est vérifié quotidiennement juste avant la tâche (donc au moment le plus éloigné de la dernière ration) et la quantité de nourriture est ajustée si le poids descend en dessous de 90% deux jours consécutifs, critère basé sur nos expériences précédentes. La nourriture sera ensuite progressivement augmentée de manière à ce que les rats réatteignent leur poids de forme théorique. Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale et impacte très peu leur bien-être. Un autre point de vigilance concerne la chirurgie. La chirurgie d’implantation des électrodes est faite sous antalgique et anesthésie générale, mais présente un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure (pour analyse des cerveaux).

Remplacement

Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences comportementales. En effet, l’évaluation comportementale et neurobiologique en réponse à un changement de règle spatiotemporelle nécessite l’utilisation d’organismes entiers et vivants. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas déterminer les codes neuronaux sous-tendant le comportement sans faire appel à l’implantation d’électrodes qui ne peut se faire chez des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les oiseaux. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal. Nous avons calculé le nombre de rats minimal par groupe pour obtenir des résultats significatifs et exploitables, en tenant compte de la perte de certains animaux (comportement temporel instable, perte à la chirurgie, mauvaise localisation des électrodes, mauvais signal d’enregistrement).

Raffinement

Après quelques jours d’acclimatation à leur arrivée dans l’animalerie, les rats sont manipulés et pesés quotidiennement au moins une semaine avant le début de l’entraînement à la tâche comportementale, afin de les habituer à l’expérimentateur et de laisser les rats s’habituer à la quantité contrôlée de nourriture. Pour la procédure chirurgicale, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement par l’expérimentateur ou les zootechniciens pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites associés à des actions sont identifiés pour le cas où les mesures de prises en charge de la douleur et de l’inconfort pouvant résulter de l’étape chirurgicale ne seraient pas suffisantes. Nous avons aussi optimisé les équipements comportementaux pour permettre aux animaux porteurs d’implants cérébraux de se mouvoir avec le maximum de confort (mangeoire de haute taille, écran tactile à toucher avec le nez au lieu d’un trou où mettre son nez ce qui donne le risque de cogner l’implant). De plus, nous utilisons un cache des implants permettant de loger les animaux à deux par cage et nous avons dessiné et imprimé à l’imprimante 3D des supports d’implants cérébraux améliorant là aussi le confort des animaux en réduisant les possibilités d’accroches dans l’environnement de test. L’enrichissement des rats implantés est aussi modifié (maison en carton à la place des tunnels de plastique) pour empêcher les rats de se faire mal en se coinçant l’implant. Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les conseils vétérinaires.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude des circuits neuronaux des processus cognitifs, largement conservés le long du phylum. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rongeur des aptitudes cognitives complexes. Les rats ont été sélectionnés pour ce projet car la littérature sur l’apprentissage temporel, dont nos propres publications, est majoritairement basée sur des études chez le rat, fournissant une base de connaissances solide. Les analyses anatomiques et fonctionnelles dans ces expériences s'appuient sur une richesse de connaissances sur la structure anatomique et la neurochimie du rat. Par ailleurs, le rat est généralement considéré comme ayant des capacités cognitives plus évoluées que la souris et la taille supérieure du rat nous permet de réaliser des interventions plus spécifiques au niveau central. Ce modèle animal est donc le plus approprié à la fois pour les études comportementales et neurobiologiques. Nous utilisons pour ce projet de jeunes adultes âgés de trois mois environ au début des expériences, pour s’assurer que le cortex préfrontal et sa connectivité soient matures dès le début de l’apprentissage de la tâche comportementale.

Tuées quatre heures après une injection de lipopolysaccharide qui les laisse fébriles, confuses et apathiques, 54 souris mâles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les quatre jours précédents, chacune reçoit par gavage un extrait de la plante Satureja nepeta, sous contention d'une à deux minutes, et se retrouve isolée une demi-heure pour que ses fèces soient recueillies. Le projet cherche à savoir si l'infusion, la décoction, le macérat ou l'huile essentielle de cette plante limitent l'inflammation du tissu adipeux, présentée comme une "alternative naturelle" aux traitements conventionnels. Sur la prise en charge de la douleur, le RNT est explicite : aucune analgésie n'est prévue pour ce protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier les effets préventifs de divers extraits de la plante médicinale aromatique Satureja nepeta (Infusion, décoction, macération hydroéthanolique à 60% et huile essentielle), dans un modèle murin d’inflammation aiguë induite par le lipopolysaccharide (LPS).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier les extraits de Satureja nepeta les plus efficaces pour prévenir l’inflammation aiguë induite par le lipopolysaccharide (LPS) dans le tissu adipeux, tout en explorant les modifications du microbiote intestinal. Il permettra ainsi de mieux comprendre les mécanismes d’action anti-inflammatoires de cette plante médicinale et de valoriser son potentiel en tant qu’alternative naturelle aux traitements conventionnels.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention quotidienne de gavage oral pendant 4 jours consécutifs, correspondant à l’administration des différents extraits de Satureja nepeta. Chaque gavage nécessitera une mise en contention de l’animal pendant environ 1 à 2 minutes. Une injection de LPS sera réalisée le 5ᵉ jour, également sous contention d’environ 1 à 2 minutes. Par ailleurs, des collectes de fèces seront effectuées avant et après induction de l’inflammation, nécessitant un isolement temporaire de l’animal (environ 30 minutes) pour permettre le recueil dans des conditions standardisées.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors du recueil de fèces (environ 30 minutes). Stress lié aux gavages (5 minutes). Douleurs possibles lors de l’administration des extraits et lors des injections du LPS (2 minutes). Suite à l'injection de LPS, les animaux seront fébriles (augmentation de la température corporelle), ils peuvent montrer des signes de confusions et d’apathie (durant 4 heures, jusqu'à la mise à mort). Jeune de 3 heures. Prise de température au niveau rectal (1 minute).

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet qui seront ensuite étudiés et de démontrer les effets anti-inflammatoires des différents extraits de la plantes Satureja nepeta

Remplacement

L’étude de l’effet des différents extraits de la plante médicinale Satureja nepeta sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test statistique, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arret. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle largement utilisé et reconnu pour les études portant sur l’inflammation et le métabolisme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

Nourries pendant quatre mois d'un régime riche en sucres et en graisses jusqu'à devenir obèses, une partie des 664 souris de ce projet passe ensuite sur la table d'opération pour un arrêt puis une reprise de la circulation sanguine dans le foie, sous anesthésie, pendant quatre-vingt-dix minutes. Toutes subissent trois à quatre prélèvements sanguins, certaines reçoivent deux administrations de molécules agissant sur les lipides, et les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. L'enjeu déclaré est de rendre greffables des foies stéatosiques aujourd'hui écartés, et le projet sert aussi à la formation professionnelle. Toutes les souris sont tuées, le porteur précisant que les prélèvements d'organes prévus sont "incompatibles avec le maintien en vie des animaux".

Objectifs

La transplantation est aujourd’hui une solution reconnue pour soigner des patients lorsqu'un organe ne fonctionne plus. Mais il y a un manque d'organes de qualité à greffer. Les médecins doivent donc parfois utiliser des organes dits "marginaux", provenant de personnes âgées ou ayant eu certains problèmes de santé comme l’obésité ou le diabète. Ces organes sont plus fragiles et réagissent mal à un phénomène appelé ischémie-reperfusion, inévitable en transplantation. Il correspond à l’arrêt temporaire de la circulation du sang dans l’organe, puis à son retour. Cela provoque des lésions qui abîment fortement l’organe et peuvent compromettre la réussite de la greffe. Les organes dits marginaux, comme les foies avec stéatose, sont encore plus sensibles à ces lésions d’ischémie reperfusion, d’où la nécessité d’évaluer des molécules pour les protéger et pouvoir les utiliser en transplantation. Des recherches récentes ont montré une altération précoce du métabolisme des lipides après une ischémie dans le foie avec apparition de lipides toxiques. Le but de notre projet est de déterminer si l'ischémie du foie sain ou avec stéatose conduit aussi à l'apparition de lipides dits toxiques et s'il est possible de limiter les lésions du foie après ischémie reperfusion en utilisant des molécules qui agissent sur les lipides toxiques.

Bénéfices attendus

A court terme, cette étude permettra de mieux comprendre les modulations précoces du métabolisme lipidique après ischémie sur foies sains et stéatosiques et leurs implications dans la genèse des lésions hépatiques. A long terme, ce projet vise à réhabiliter des greffons stéatosiques aujourd’hui récusés pour la transplantation en mettant au point des stratégies thérapeutiques limitant la production d’espèces lipotoxiques, dont le nombre va croitre massivement dans les années à venir en raison de la pandémie d’obésité, et ainsi répondre à la pénurie de greffons que subit aujourd’hui la France.

Procédures

Certains animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 4 mois pour provoquer une stéatose hépatique. Tous les animaux subiront 3 à 4 prélèvements de sang (durée de moins de 5 minutes) faits sous anesthésie pour mesurer différents paramètres biologiques et une chirurgie pour réaliser l'ischémie-reperfusion du foie (durée de 90 minutes) sous anesthésie également. Les prélèvements de sang seront espacés d'un minimum de 20 heures. Parmi la totalité des souris, une partie n’aura aucune administration de molécules et d’autres souris auront 2 administrations de molécules agissant sur le métabolisme lipidique (durée de moins de 5 minutes). Les 2 administrations seront espacées au moins de 90 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 4 mois. Ce régime conduira à la prise de poids progressive des animaux tout au long du régime jusqu’à atteindre une obésité. Les prélèvements sanguin (acte

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements d’organes, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

A ce jour, il existe des modèles de foie in silico ou in vitro, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la complexité cellulaire du foie, le métabolisme des lipides et les lésions d’ischémie reperfusion. De plus, les modèles de perfusion de foies ex vivo ne nous permettent pas non plus d’étudier le remodelage du lipidome hépatique et plasmatique.

Réduction

Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). La répartition sera de 3 à 5 souris par cage. Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape de la procédure en pré-, per- et post- opératoire. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie, sous anesthésie générale, avec un maintien de la température corporelle.

Choix des espèces

Le choix porté sur la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) Le modèle de régime obésogène chez la souris, qui mime une obésité environnementale chez l’homme, est validé et adapté pour répondre aux objectifs du projet. 3) La disponibilité chez cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques déjà présents au laboratoire. 4) La souche de souris sélectionnée offre moins de variabilité dans la réponse au régime occidental que d'autres souches de souris et développe moins de shunt porto-systémique comme mis en évidence dans notre précédente saisine

Fournir des anticorps monoclonaux pour des tests de diagnostic rapide suppose ici d'immuniser 200 souris, toutes tuées pour prélever leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois à quatre injections d'antigènes, à raison d'une par mois, et subit trois prises de sang. Les effets annoncés vont de l'infection au point d'injection à l'abcès, avec fièvre, perte de poids et douleur modérée liée à l'inflammation. Le porteur indique avoir sorti l'animal de la production d'anticorps à grande échelle, et affirme que l'immunisation in vitro ne donne pas des affinités suffisantes, ce qui rend selon lui le recours à la souris "toujours nécessaire".

Objectifs

Les tests « rapides » de détection et de diagnostic de microorganismes pathogènes ou de toxines responsables de maladies infectieuses sont d’un intérêt croissant non seulement dans le domaine de la maitrise et de la détection des risques biologiques mais plus largement en santé publique. Ce type de tests est particulièrement adapté à un suivi précoce de l’émergence ou de la ré-émergence de certaines maladies infectieuses responsables de pandémies mondiales pouvant avoir des conséquences extrêmement graves en santé humaine ou d’un point de vue économique (ex : Ebola, ZIKA, Covid-19, Variole du singe, etc.). Ils sont basés sur l’utilisation d’anticorps monoclonaux, des protéines du vivant capables de reconnaitre de manière très spécifique des pathogènes ou toxines. Notre projet vise au développement d’anticorps monoclonaux dirigés contre différentes cibles notamment des antigènes de microorganismes pathogènes ou de toxines dans le cadre de multiples programmes de recherche, visant à suivre les émergences des maladies infectieuses responsables de différentes pathologies humaines ou animales. Le développement de nouveaux tests antigéniques nécessite donc la génération de nouvelles lignées cellulaires sécrétrices d’anticorps monoclonaux spécifiques pour répondre à ces besoins importants pour la santé publique. Bien que l’animal ne soit plus du tout utilisé dans notre laboratoire pour la production d’anticorps à grande échelle, il reste néanmoins encore indispensable pour la partie immunisation permettant in fine l’obtention des anticorps d’intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de générer des anticorps monoclonaux sur le territoire national pour garantir la souveraineté et la sécurité des approvisionnements dont nous avons pu mesurer l’importance lors de la pandémie de COVID19. Cela permettra la mise au point, la validation et la fourniture de moyens diagnostiques appropriés, performants et répondant aux préconisations des autorités de santé.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 ou 4 injections (durée totale de chaque injection d’environ 10 secondes) d’antigènes pour les immuniser à la fréquence d’une injection par mois : Trois prises de sang seront réalisées par animal (durée de l’intervention environ 30 à 40 secondes) à la fréquence maximale d’un prélèvement par mois.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévisibles sont : - une infection au point d’injection, abcédation, risque de fièvre - une perte de poids - une douleur modérée transitoire due à l’inflammation

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. L’obtention d’anticorps monoclonaux nécessite en effet de prélever la rate des animaux immunisés.

Remplacement

L’obtention d’anticorps monoclonaux à des fins diagnostiques ou de détection nécessite d’atteindre un niveau d’immunisation très élevé. Bien que la production d’anticorps monoclonaux ait connu de grands progrès depuis quelques années, démarche dans laquelle notre laboratoire est pleinement engagé (avec une forte réduction du nombre d’animaux à plusieurs étapes et notamment celle de la production), les technologies actuelles de remplacement pour l’étape d’immunisation ne sont pas complétement satisfaisantes notamment en termes d’affinité et de spécificité des anticorps obtenus. Ces méthodes d’immunisation in vitro ne permettent pas, en l’état actuel des connaissances, d’obtenir des réponses immunitaires suffisantes pour garantir la performance de tests de diagnostic et actuellement, le recours à l’immunisation d’animaux afin d’obtenir des anticorps monoclonaux spécifiques est toujours nécessaire.

Réduction

Les immunisations sont réalisées par lots de 4 souris, un lot correspondant à une condition d'immunisation. Il est communément admis de tester 2 conditions d’immunisation par antigène (concentration ou type de solution véhicule) soit 8 animaux. La réponse immunitaire est évaluée et les animaux ayant les meilleures réponses sont sélectionnés pour réaliser les fusions lymphocytaires. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous ne testerons qu’une condition à la fois (4 animaux) ; si cette dernière ne donne pas les résultats escomptés lors des tests d’affinité, nous en testerons une deuxième. Il est à noter que dans la plupart des cas, la première condition est suffisante. Il est prévu 200 souris maximum pour les immunisations pour l’ensemble de la saisine sur 5 ans. Ce chiffre est un maximum et le nombre de lots est étroitement corrélé au nombre de sujets de recherche que nous aurons à traiter et du niveau de réponse immunitaire des animaux vis-à-vis de chaque antigène. Tous les efforts seront faits pour diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les études statistiques ne sont pas adaptables. Les résultats sont évalués en nombre d’hybridomes développés.

Raffinement

Une analgésie continue sera pratiquée avant tout acte potentiellement douloureux. Les animaux seront observés quotidiennement et un ensemble d’indicateurs prédictifs de douleurs ou stress éventuels a été mis place. En cas d’atteinte d’un point limite établi (prostration, dépilation, refus de s’alimenter…), une évaluation précise de l’état général de l’animal, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Le choix de la souris est rendu inévitable pour l’obtention des hybridomes sécréteurs d’anticorps monoclonaux spécifiques. En effet, l’hybridome étant le résultat de la fusion cellulaire entre des lymphocytes issus des souris immunisées et des cellules de myélome de souris (lignée cellulaire établie et approvisionnée auprès de collections internationales de cellules), il est de ce fait techniquement impossible de réussir cette étape si les lymphocytes et le myélome ne sont pas issus de la même espèce (souris en l’occurrence). Toutes les souris que nous utiliserons seront de jeunes adultes (6 à 8 semaines). A cet âge, les animaux ont la maturité immunologique nécessaire pour obtenir de bonnes réponses immunitaires.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées pour collecter et analyser leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent neuf jours seules en cage, une nuit sans nourriture, et subissent une injection sous anesthésie générale ainsi que trois contentions dans un tube d'analyse de la composition corporelle. Le porteur indique avoir déjà reproduit l'état nourri et l'état à jeun sur des cellules de foie en culture, et retient malgré cela l'animal entier pour ses échanges entre organes. Le bénéfice annoncé tient en une phrase et reste suspendu au long terme, ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour les maladies du foie ou le diabète.

Objectifs

Le but de ce projet de comprendre le rôle d'une famille de protéine dans la fonction des cellules du foie. En effet, des résultats du laboratoire montrent que la quantité de ces protéines varient entre l’état de jeûne et l’état nourri et que diminuer leur expression modifie l'adaptation de l'organisme pour répondre à la modification d'apport nutrionel. D'autre part, nous avons montré que la quantité de ces protéines étaient modifiées dans le cas de pathologie du foie ou de diabète.

Bénéfices attendus

Comprendre le rôle de ces protéines permettrait à long terme d'ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour les pathologies du foie ou du diabète..

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une injection sous anesthésie générale (4 min maximum) - 9 jours d'hebergement individuel (1 fois) - 1 nuit sans accès à la nourriture mais accès à la boisson - 3 pesées sur animal vigile (

Impact sur les animaux

L’analyse du métabolisme énergétique recquiert que les animaux soient hébergés individuellement pour une durée maximum de 9 jours, la privation de congénères peut générer un stress modéré. Pour la détermination de la composition corporelle des animaux, les animaux sont placés pour une très courte durée (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour pouvoir collecter et analyser les tissus.

Remplacement

Dans notre laboratoire, nous avons mis au point des conditions de culture permettant de mimer l'état nourri / à jeun avec des cellules de foie. Cependant, afin de mieux comprendre le fonctionnement de ces cellules, nous avons besoin d'étudier des animaux entiers avec leur physiologie et les échanges inter-organes. Seules les protéines ayant montré un impact sur le métabolisme des cellules du foie en culture seront étudiés chez l'animal.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires. Nous optimiserons également la collecte de tissus post- mortem à l’issue de chaque procédure afin de créer une « bibliothèque d’échantillons » pouvant être utilisés pour de futures analyses.

Raffinement

Le stress subit par les animaux par l'hébergement individuel est atténué par le fait qu’ils conservent un contact visuel et olfactif et sonore avec leurs congénères. Ces cages d'analyse présentent une grande surface au sol et sont équipées (litière, mangeoire, biberon et maisonnette suspendus) de manière à offrir des occasions accrues d'interaction avec l'environnement, qui compensent les effets de l’hébergement individuel. Pour l’injection, les souris seront anesthésiées quelques minutes afin de réaliser le geste sans stress pour l'animal. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil complet et qu’ils redeviennent mobiles. Puis un suivi sera réalisé les jours suivant l’injection pour vérifier qu’aucune lésion n’est apparue. Nous avons mis en place des points limites adaptés avec une surveillance des animaux (comportement, poids, site d'injection) permettant de déceler tous signe de mal-être ou de souffrance de façon précoce.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence dans les études métaboliques, nous pouvons donc bénéficier d’un grand nombre de ressources et de données préliminaires existantes. Par ailleurs, ce sont des mammifères dont l'utilisation du sucre et du gras est proche de celui de l'Homme. Nous espérons ainsi pouvoir extrapoler les conclusions de notre étude à l’Homme. Les animaux utilisés auront entre 10 et 25 semaines. A cet âge, les souris auront un foie mature.

480 rats et 288 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois injections par semaine pendant sept semaines leur administrent une molécule qui abîme le foie, avec une absence de prise de poids, une déshydratation et, dans les formes avancées, une dégradation de l'état général que le porteur ne peut pas exclure. Chaque animal passe ensuite une à deux séances d'IRM par semaine sous anesthésie générale, avec injection d'un agent de contraste, pour caler des marqueurs d'imagerie de la fibrose hépatique transposables au diagnostic humain. Le porteur présente l'imagerie du petit animal vivant comme un "maillon indispensable" et affirme que ces marqueurs permettraient de remplacer les "nombreux sacrifices d'animaux" des études à venir.

Objectifs

Le syndrome métabolique est un ensemble de désordres incluant le diabète, l'obésité ou la stéatose hépatique, qui constituent un problème de santé majeur dans les pays occidentaux. Sa prévalence est estimée entre 25% et 30% de la population et pour les patient atteints du diabète du type 2, elle monte à 70%. Ce syndrome est un facteur de risque pour les maladies cardio-vasculaires, la cirrhose et le cancer. Ce syndrome se caractérise par un foie gras, inflammé avec présence de fibrose. La présence de fibrose est un marqueur de la gravité de la maladie et sert à la stratification des patients. La présence de surcharge en fer est un facteur aggravant de la maladie. Afin de limiter la progression de ces désordres métaboliques, l’industrie pharmaceutique tente de développer des molécules pour restaurer la fonction des tissus endommagés (pancréas, foie, tissus adipeux...). Des études histologiques ont déjà été réalisées pour valider les modèles ani-maux. Cependant, plusieurs problèmes persistent, notamment le nombre très important d’animaux utilisés (pour évaluer l’évolution de la pathologie à différents temps, pour évaluer la sévérité de la pathologie, évaluer l’efficacité d’un traitement, etc..). L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique incontournable pour le diagnostic médical, grâce à sa bonne résolution spatiale, son caractère non-traumatique et sa grande variété de contrastes. L’IRM devrait permettre de définir des bio-marqueurs IRM pour détecter la pathologie et la sévérité de la fibrose pour ensuite évaluer l’impact de médicaments sur la pathologie, sans avoir recours à une biopsie. Ces marqueurs ont pour objectifs d’être, à terme, utilisés en routine clinique chez l’homme. Ce projet est donc basé sur le développement de séquences IRM sur le petit animal pour obtenir des informations précises et fiables, en 3D et en des temps d’acquisition rapides.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer des méthodes IRM produisant des marqueurs fiables de désordres hépatiques. Ainsi, il n’y aura plus besoin d’utiliser un grand nombre d’animaux pour les futures études, développant des traitements contre les désordres métaboliques. De plus, ces méthodes IRM seront transférables à l’homme, et limiteront ainsi le recours à des biopsies régulières sur les patients.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à trois injections intrapéritonéales par semaine de sérum physiologique ou d’une molécule induisant un désordre hépatique, pendant 7 semaines. Ensuite, les animaux seront imagés par IRM sous anesthésie générale une à deux fois par semaine. Une fois par semaine (lors d’une session IRM), un agent de contraste sera injecté par voie intraveineuse. Suite à la session d’imagerie, les animaux recevront une injection intra-péritonéale d’un mélange d’antalgique et d’analgésique avant d’être euthanasiés.

Impact sur les animaux

Une absence de prise de poids et une deshydratation sont attendues dans ces modèles. De plus, dans les formes les plus avancées de la pathologie, une dégradation de l’état général n'est pas à exclure.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de corréler les biomarqueurs IRM aux analyses histologiques.

Remplacement

Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant le diagnostic et l’évaluation de la sévérité de désordres hépatiques chez l’homme. L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus. En effet, nous souhaitons détecter l’apparition d’une maladie (diagnostic précoce) et ensuite suivre son évolution (pronostic). Ceci permettrait de remplacer les nombreux sacrifices d’animaux en fournissant des biomarqueurs fiables et robustes grâce à l’obtention d’images avec des résolutions spatiales élevées, et des informations quantitatives. Tout cela, dans le but de suivre plus tard l’application de traitements contre les désordres métaboliques.

Réduction

Du fait de la non-invasivité de l’IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum d’une semaine entre chaque examen. Ainsi chaque animal sera son propre contrôle. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire. De plus, sur la base de publications scientifiques, il était estimé un écart-type standard d’environ 25% sur la plupart des expérimentations réalisées. Nous utiliserons les tests statistiques pour comparer les biomarqueurs entre des animaux pathologiques et des animaux sains, ainsi qu’entre animaux à différents stades de la pathologie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages collectives, avec de l’enrichissement (bâtonnets de bois à ronger, matériaux de construction de nid, maisonnette pour le souris, tubes en carton pour les rats, litière) et de la nourriture et de l’eau à volonté. L'utilisation d'anesthésies gazeuses générales lors des procédures, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Il est à rappeler que l’expérience d’IRM en elle-même ne génère aucun signe de souffrance visible. Une surveillance régulière de la santé et du bien-être des animaux sera réalisée, comprenant des signes au niveau du comportement, de la mobilité, de la perte de poids, et de l’apparition de symptômes cliniques. Si des signes de mal-être apparaissent, les animaux seront pris en charge par un analgésique. Des points limites ont aussi été instaurés, induisant une euthanasie immédiate. L’état de santé des animaux sera suivie quotidiennement.

Choix des espèces

Les animaux sélectionnés sont largement utilisés et caractérisés par la communauté scientifique afin d'étudier la progression du diabète, de l’obésité et des désordres hépatiques. Ils ont une progression pathologique similaire à celles observés chez l'Homme. En particulier, les rats sont très bien caractérisés au niveau métabolique. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Ceci permet d'une part de reproduire ces modèles couramment utilisés par la communauté scientifique et d'autre part d'éviter de considérer les effets due à l'immaturité du tube digestif des animaux non-adultes qui pourront altérer nos conclusions.