Rongeurs
Rôle de la délétion vasculaire spécifique de CXCR4 dans le développement de l’arthrose post-traumatique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
3 612 souris vont être utilisées, toutes tuées, chacune subissant après sa mort un prélèvement de sang, de colonne vertébrale, des quatre pattes, de la trachée, des poumons et de l'aorte. À dix semaines de vie, elles subissent une chirurgie du genou droit qui déstabilise un ménisque pour provoquer une arthrose, puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant cinq jours. Le porteur décrit une prostration possible pendant trois jours, un isolement du groupe, l'arrêt du toilettage social, un risque d'infection des sutures et de péritonite. Les bénéfices annoncés se chiffrent en centaines de milliards d'euros d'économies européennes, quand le projet cherche d'abord à documenter, pour la première fois, le rôle d'une interaction moléculaire dans l'invasion vasculaire du cartilage.
Objectifs
L’arthrose, la plus répandue des maladies rhumatismales, impacte plus de 500 millions de personnes dans le monde. A ce jour, il n’existe pas de traitements qui permettent de soigner ou ralentir la maladie, les traitements disponibles sont uniquement palliatifs. Notre projet s’intéresse particulièrement aux mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la dégradation du cartilage articulaire lors de l’arthrose. L’une des étapes clé de cette dégradation correspond à une augmentation anormale du volume (i.e. hypertrophie) des cellules du cartilage (chondrocytes). A un stade plus avancé de la maladie, une invasion pathologique du cartilage articulaire par des vaisseaux sanguins nouvellement formés se met en place, via un mécanisme nommé « angiogenèse ». Cette invasion vasculaire accélère fortement la dégradation du cartilage. Nous proposons l’hypothèse que les chondrocytes hypertrophiques, joueraient un rôle fondamental dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Nos premiers résultats indiquent qu’une protéine ligand est spécifiquement produite par les chondrocytes hypertrophiques et que l’interaction avec son récepteur, présent à la surface des cellules endothéliales vasculaire, favorise l’angiogenèse. C’est dans ce contexte, que notre projet, se propose, pour la toute première fois, de documenter le rôle de l’interaction entre cette protéine ligand et son récepteur dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Pour ce faire, nous utiliser une lignée de souris génétiquement modifiées, permettant à la fois d’induire une invalidation du gène codant pour le récepteur spécifiquement au niveau des cellules endothéliales vasculaires mais aussi de visualiser cette population cellulaire grâce à une protéine fluorescente. Une arthrose sera induite chirurgicalement chez ces souris et l’invasion vasculaire du cartilage articulaire sera suivie au cours du temps. Par la suite, ces expérimentations nous permettrons de définir le moment idéal pour mettre en place des stratégies thérapeutiques anti-arthrose qui ciblent spécifiquement l’interaction entre la protéine d’intérêt et son récepteur.
Bénéfices attendus
Notre projet comporte plusieurs bénéfices attendus. Dans un premier temps, notre projet va permettre d’approfondir, de manière générale, les connaissances de la communauté scientifique sur les mécanismes cellulaires/moléculaires impliqués dans l’apparition de l’arthrose et plus précisément, sur le rôle de l’invasion vasculaire du cartilage dans le développement de cette maladie. Dans un second temps, les résultats obtenus, nous permettront d’évaluer l’intérêt de cibler l’étape d’invasion vasculaire du cartilage pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l’arthrose. Enfin, il faut prendre en compte que l’arthrose est une maladie chronique douloureuse et extrêmement répandue au sein de la population (40% des personnes de plus de 70 ans développe de l’arthrose), qui, de fait, exerce une pression importante sur le milieu médical. De manière connexe, l’arthrose de la hanche et du genou représente des poids financiers conséquents pour les pays européens, en effet, ils sont estimés entre 408-817 milliards d’euros et 350-700 milliards d'euros/an respectivement. Ainsi, au travers de l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques, notre projet s’inscrit dans une démarche visant à améliorer la qualité de vie des patients (amélioration de la mobilité et de l’autonomie des patients, diminution des douleurs chroniques et de comorbidités associées) et à réduire les coûts socio-économiques (limitation de dépenses liées aux arrêts de travail prolongé et aux intervention) exercées par l’arthrose sur notre société.
Procédures
A l’âge de 10 semaines de vie post-natale, les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d’un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs de l’articulation) du genou droit. Les animaux âgés de 12 semaines recevront des injections intrapéritonéales du composé d’intérêt quotidienne de quelques secondes sur une période de 5 jours. Un site différent sera choisi pour chaque injection afin de limiter les risques d’irritation pour l’animal.
Impact sur les animaux
Dans les trois premiers jours suivant la chirurgie, si des douleurs sont ressenties par l’animal, celui-ci peut entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux de la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Cette douleur pourrait notamment être causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait survenir au niveau des sutures post-chirurgicales. Les injections intrapéritonéales, bien que ne durant que quelques secondes, peuvent entraîner une irritation au niveau du site d’injection. De même, les injections de tamoxifène et plus généralement la technique d’injection intrapéritonéale en elle-même peuvent entrainer des nuisances chez l’animal : stress/anxiété, perte d’appétit, inflammation du péritoine (péritonite), injection mal placée conduisant à l’accumulation du produit au niveau d’un site non ciblé (i.e. organes présents dans le péritoine) avec conséquences potentielles multiples
Devenir
L’ensemble des animaux de ce projet seront utilisés afin de réaliser des prélèvements multi-organes post-mortem. Ces prélèvements sont indispensables pour la validation de notre modèle murin génétiquement modifié et pour mener à bien notre étude visant à déterminer l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques contre le développement de l’arthrose.
Remplacement
Des modèles in vitro/ex vivo permettent d’étudier la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et sont utilisés en amont de la présente étude pour remplacer au maximum le recours aux expérimentations animales. Ces modèles impliquent l’utilisation de cellules endothéliales d’origine humaine pour des tests de formation de tubes ou de migration cellulaires. Lors de ces tests il est possible de faire varier plusieurs paramètres et d’évaluer l’effet de communication cellulaires d’intérêt. Cependant l’utilisation de ces modèles reste limitée par le fait que les cellules endothéliales nécessitent un milieu de culture spécifique, peu compatible avec de nombreux autres types cellulaires. Or, dans le cadre de l’arthrose, l’environnement articulaire se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial trop complexes à prendre en compte dans la mise en place de modèles in vitro ou informatiques, ni même dans un modèle d’animal invertébré. D’autre part, l’arthrose est une pathologie aux causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système in vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet d’évaluer les processus impliqués dans le développement de l’arthrose ni l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.
Réduction
Dans le cadre du respect des 3Rs en éthique animale, le nombre d’animaux utilisés dans les procédures a été réduit au strict minimum. Pour ce projet scientfique, les nombre de 9 et 35 animaux de chaque sexe par groupe a été calculé par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative. Pour l’analyse des résultats, le test statistique le plus adapté sera utilisé pour pouvoir comparer toutes les conditions. Il est également important de souligner que chaque souris fera l’objet de prélèvement multi-organes (prélèvement de sang, colonne vertébrale, pattes avant et arrières, trachée et poumons, artère aorte). Cette approche présente l’avantage de rassembler une collection d’échantillons suffisante sur un nombre restreint d’animaux. Enfin, notre projet comprend l’utilisation de techniques d’analyses très haut débit qui permettent de générer un grand nombre de données pertinentes scientifiques à partir d’un faible nombre d’échantillons.
Raffinement
Pour le protocole d’induction de l’arthrose, une analgésie est assurée en avant et après l’opération. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’écarter tout risque d’hypothermie. Les souris seront ensuite transférées dans une cage de réveil également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer. Après 6h et 24h post-chirurgie, un traitement antalgique est administré aux animaux dans un souci de raffiner la prise en charge de la douleur ressentie par ces derniers. Les animaux sont observés quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Des grilles de points limites ont été définies pour chacune des procédures et permettront une gestion de la douleur adaptée selon le nombre et la sévérité des signes cliniques observés.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle animal dans ce projet est fondé sur plusieurs critères. La souris est tout d’abord un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Notre projet est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui permettent des études précises et pertinentes dans les tissus squelettiques d’intérêt pour la recherche thérapeutique sur l’arthrose. Ces lignées de souris génétiquement modifiées sont déjà développées et disponibles. Le modèle de souris d’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médian est le plus décrit dans la littérature et fait ainsi office de référence pour l’étude de cette pathologie. Le choix de l’espèce souris s’explique également par la nécessité de travailler sur des animaux arrivés à maturité squelettique. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 10 à 22 semaines. La procédure chirurgicale sera réalisée à 10 semaines de vie, il s’agit du stade de développement consensus dans la littérature pour l’induction de l’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médial
Mise au point d’un protocole de décolonisation gastro-intestinale chez la souris.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Tuées à l'issue de l'expérience, trois souris Swiss femelles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux antibiotiques dans leur eau de boisson pendant trois jours, sans autre acte invasif, l'effet redouté étant une intolérance digestive. Le but est de vider leur tube digestif de sa flore, première étape avant de le coloniser par des souches d'Enterococcus faecalis dans un projet ultérieur, l'âge des souris étant fixé "à la demande du client". Le porteur affirme qu'aucune alternative in vitro ou ex vivo ne reproduit la complexité d'une infection gastro-intestinale, pour une étape qui consiste à faire boire un antibiotique.
Objectifs
Les entérocoques sont des bactéries ubiquitaires, naturellement présents dans le microbiote intestinal humain. Parmi eux, Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium sont les deux espèces les plus fréquemment isolées chez l’Homme. Enterococcus faecalis est l'espèce majoritairement responsable des infections humaines. Historiquement considérés comme des bactéries opportunistes, les entérocoques suscitent aujourd’hui une inquiétude croissante en raison de leur capacité à développer une résistance aux antibiotiques, notamment aux glycopeptides, et à persister dans des environnements hospitaliers hostiles. E. faecalis est impliqué dans diverses pathologies, telles que les endocardites, les infections urinaires, les bactériémies, et dans les infections gastro-intestinales. La rechute fréquente de certaines infections, comme l’endocardite, laisse supposer une tolérance ou une persistance bactérienne qui échappe aux traitements classiques. Dans ce contexte, le projet global vise à développer un modèle d’infection gastro-intestinale permettant d’évaluer le comportement infectieux de deux souches mutées issues d’une souche parentale de E. faecalis. L’objectif de cette étude sera dans un premier temps de mettre en place un protocole de décolonisation du tube digestif de la souris qui permettra dans un second temps la colonisation de ce tube digestif par les différentes souches d’entérocoques.
Bénéfices attendus
La mise en place d’un modèle murin standardisé permet de reproduire les conditions d'une colonisation intestinale par Enterococcus faecalis et d'étudier son comportement in vivo, dans un environnement contrôlé et reproductible.
Procédures
Les animaux ne seront soumis à aucun acte invasif hormis une administration d’antibiotiques par eau de boisson pendant 3 jours.
Impact sur les animaux
L’étude consistera à administrer par eau de boisson deux antibiotiques. La nuisance principale sera liée possiblement à des effets secondaires de type intolérance digestive/diarrhée. Cependant des expériences de décontamination digestive menées par le passé et utilisant un cocktail de plusieurs antibiotiques (incluant la streptomycine) n’ont pas montré d’effets secondaires de type intolérance digestive/diarrhée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de l’expérience
Remplacement
Le recours à un modèle animal, en l’occurrence la souris, se justifie par l’absence d’alternative in vitro ou ex vivo permettant de reproduire de manière réaliste la complexité d’une infection gastro-intestinale impliquant l’interaction dynamique entre le microbiote, la barrière intestinale, le système immunitaire et la bactérie.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au maximum au nombre de 3 permettant d’avoir une information solide sur la décolonisation du tube digestif des souris.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 3 dans un environnement enrichi (igloo, jeux). Tous les animaux seront suivis quotidiennement pour détecter tout signe de souffrance ou de détresse. Les antibiotiques seront administrés dans l’eau de boisson ce qui évitera toutes manipulations trop invasives.
Choix des espèces
La souris Swiss est un modèle de choix répandue dans la greffe d’infection gastro intestinale à Enterococcus faecalis. Des souris femelles âgées de 8 semaines seront utilisées dans cette étude à la demande du client et selon les données de la littérature.
Comment interagissent une hormone digestive et un facteur de croissance dans le contrôle du métabolisme musculaire et du comportement ? Le microbiote, acteur de ce contrôle ?
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Quatorze jours seule en cage pour mesurer son activité sur roue, quarante heures en chambre métabolique : 150 souris hypermusclées, privées de myostatine, et leurs frères et sœurs témoins subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 54 mâles sont mis en présence d'un congénère pendant un quart d'heure pour mesurer leur agressivité, avec des combats possibles, et 48 autres passent des tests d'anxiété, un jeûne de dix heures et une prise de sang. Le porteur déclare 78 souris replacées en élevage après les tests non invasifs, mais annonce aussi 96 mises à mort en fin d'expérimentation, deux comptes impossibles à concilier sur 150 animaux. Il explique avoir observé "fortuitement" une agressivité accrue chez ces souris et cherche à la relier à la ghréline, l'hormone de la faim.
Objectifs
Pour subvenir à ses besoins de manière discontinue, l’être humain organise sa prise alimentaire en une série d’événements périodiques répartis en trois phases : pré-ingestive, ingestive et post-ingestive. Chaque phase est associée à des sensations alimentaires physiologiques (faim et appétit, rassasiement et satiété) qui permettent de réguler la prise alimentaire. L’absence de satiété, la faim, conduisent à une recherche de nourriture et une augmentation de l’activité motrice, qui peuvent s’accompagner d’agressivité. La ghréline est une hormone qui contrôle la prise alimentaire. La myostatine contrôle le développement musculaire. Les deux hormones peuvent avoir un rôle dans le comportement en particulier l’agressivité. L’absence de satiété, la faim, conduisent à une recherche de nourriture et une augmentation de l’activité motrice, qui peuvent s’accompagner d’agressivité. Notre projet a pour but d’étudier le comportement d’activité motrice et d’agressivité d’une lignée de souris hyper musclées, dépourvues de myostatine, et d’établir s’il y a un lien avec l’hormone de satiété Ghreline.
Bénéfices attendus
Plusieurs maladies humaines se traduisent par des modifications de la prise alimentaire et de l’activité motrice spontanée (ex : anorexie). Le comportement relationnel est aussi souvent altéré chez les patients. L’observation fortuite d’une agressivité plus importantes chez les animaux dont la myostatine est inactivée, nous a conduit à rechercher s’il pouvait y avoir un lien entre la ghréline, la myostatine et les enzymes qui modifient la ghréline. Ce projet nous permettra une meilleure compréhension des mécanismes pouvant être impliqués dans des pathologies humaines impactant le comportement alimentaire et moteur.
Procédures
48 animaux vigiles seront maintenus en contention lors de la mesure de composition corporelle (moins de 2min, 5 fois). Ils seront individualisés pour l’évaluation de l’activité spontannée sur roue et du métabolisme repiratoire (2 semaines et 40h). 48 autres animaux subiront des tests de comportement permettant d'évaluer leur anxiété (2 tests de 10 min) puis une mise à jeun de 10h et un prélèvement d'une goutte de sang lors de la mesure de glycémie (3 secondes). 54 mâles réaliseront un test de mise en présence avec un congénère pendant moins de 15 minutes pour évaluer leur comportement social. Enfin, au total, 96 animaux auront une contention et une injection d’anesthésique en fin d’expérimentation (moins de 5 secondes).
Impact sur les animaux
Les tests de comportements, les pesées, les mesures de composition corporelle et l’individualisation de certains animaux peuvent induire du stress. Les expériences de mise en présence de congénères de courte durée (15 minutes maximum) pourront induire un stress plus élevé et entrainer des combats si les animaux sont agressifs. Nous observerons en continu les animaux et appliquerons des points limites pour arrêter le test en cas de blessure. L’évaluation du métabolisme respiratoire, du comportement d’agressivité et de l’activité spontanée nécessitent l’individualisation des animaux (respectivement 40h, 10 jours et 14 jours). Ils garderont cependant le contact visuel et olfactif pour les durées les plus longues. Les animaux pourront présenter une légère perte de poids lors de la mise à jeun de 10 heures. En fin d’expérimentation les animaux ressentiront une légère douleur lors de la mesure de glycémie et lors de l’injection de l’anesthésique.
Devenir
Pour les procédures non invasives d’évaluation du comportement, 78 animaux seront ensuite replacés en élevage. Pour 96 animaux, nous réaliserons des euthanasies en fin d’expérimentation afin de réaliser des analyse moléculaires et histologiques sur différents tissus de façon à pourvoir vérifier notre hypothèse.
Remplacement
L’étude du rôle d'hormones sur le comportement ne peut être réalisée sur des modèles cellulaires déconnectés des systèmes de communication (système nerveux, système endocrinien, flore intestinale). Ce projet inclut des procédures sur des modèles murins car il est important ici de préserver le dialogue entre les organes (système digestif producteur de ghréline, muscle, cerveau), contexte qu’il n’est pas possible de recréer sans étude in vivo. Des variables sur l’organisme entier seront ainsi mesurées (poids corporel, composition corporelle, concentration d’hormone, comportement…).
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre minimum nécessaire d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement de nos résultats. Les calculs ont été effectués avec un logiciel spécialisé. Lors de la production des lots expérimentaux nous utiliserons les individus porteurs de la mutation d'intérêt et comme contrôles, les individus non mutés frères et sœurs. Les 78 animaux utilisés pour l'évaluation du comportement et de l’activité spontanée ne seront pas euthanasiés et retourneront en élevage après les tests.
Raffinement
Pour nos expérimentations, nous avons fixé des points limites basés sur la bibliographie et nous ferons un premier essai de mise au point pour les préciser. Pour habituer les animaux au passage dans le tube d’analyse de composition corporelle, nous mettrons dans les cages un tunnel de plexi rouge. Celui-ci servira à la fois d’enrichissement et de tunnel de transport des animaux. Ce paramètre est particulièrement important lors des tests d’évaluation du comportement des animaux. Ce tunnel sera aussi utilisé lors du change pour le transfert des animaux. Pour l’évaluation de l’activité spontanée, nous avons développé des cages qui permettent d’héberger deux roues d’activités. Les animaux sont alors simplement séparés par une grille qui permet de garder le contact social. Comme développé pour chacun de nos protocoles expérimentaux, nous allons porter une attention particulière au bien-être de nos animaux. Le suivi quotidien des animaux permet d’identifier des signes de souffrance caractérisés par l’état du pelage, le comportement de la souris (apathie, vocalise, mobilité, alimentation…). Le report hebdomadaire des poids corporels sera un paramètre intégré à nos protocoles. Lors de l'anesthésie, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter le risque de refroidissement.
Choix des espèces
L’étude du rôle de la myostatine sur le comportement ne peut être réalisée sur des modèles cellulaires déconnectés des systèmes de communication (système nerveux, musculaire digestifs). Ce projet inclut des procédures sur des modèles murins génétiquement modifiés car il est important ici de préserver le dialogue entre les organes (muscle, cerveau, tube digestif, glandes surrénales). Ce projet est en continuité avec les nombreuses études déjà réalisées sur les souris dont le gène de la myostatine est inactivé. Les procédures concerneront des animaux âgés de 12 à 16 semaines (jeunes adultes). Nous utilisons des souris à l’âge adulte, âge auquel l'hypermusculation des souris myostatine est acquis.
Evaluation préclinique de produits de santé pour l’orthopédie – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Cochons d'Inde : 120
Lapins : 540
Chiens : 240
Chèvres : 330
Moutons : 660
Opérés sous anesthésie générale pendant trente minutes à trois heures pour recevoir un dispositif orthopédique à tester, puis parfois réopérés pour le retirer, 2 100 animaux non-humains vont être utilisés et tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Il s'agit de 660 moutons, 330 chèvres, 240 chiens, 540 lapins, 210 rats et 120 cochons d'Inde, exposés selon le porteur à un risque infectieux, à des hématomes ou des œdèmes pouvant entraîner un déficit sensitif ou moteur des membres postérieurs, dans des études qui peuvent durer plusieurs années. Les essais fournissent les données de tolérance et de performance exigées pour la mise sur le marché de produits de santé orthopédiques, et les tissus prélevés après la mise à mort sont analysés au microscope. L'effectif, indique le porteur, dépend "directement du nombre d'études signées avec les différents donneurs d'ordre".
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en orthopédie . Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et de tolérance des produits de santé en orthopédie. Ainsi, il est possible d’étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 0h30 et 3h00). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), analgésie et antibiothérapie . Certains animaux peuvent être soumis à une intervention chirurgicale supplémentaire si le but de l'étude est aussi d'évaluer la cicatrisation après retrait du dispositif de son site d'implantation (cette intervention chirurgicale peut durer entre 00h30 et 3h00). Cette intervention aura lieu dans les mêmes conditions que celles précédemment citées. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude (plusieurs années possibles), 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie (nuisance modérée). - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours (nuisance légère)- risque infectieux lié à la chirurgie (nuisance modérée à sévère)- hématome ou oedème au niveau du site opératoire, pouvant entrainer une gêne locomotrice en plus de la douleur (exemple : déficit sensitif et/ou moteur des membres postérieurs) (Nuisance légère à modérée).
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des vertèbres pour évaluer la fusion dans le cadre de la procédure de stabilisation de la colonne vertébrale ). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en orthopédie.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes", sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d’animaux est arbitré à partir du nombre de sites requis en analyse. Le nombre total d’animaux utilisés dépend directement du nombre d’études signées avec les différents donneurs d’ordre durant les 5 années du projet. De cette façon, le nombre d’animaux précisé ci-dessus constitue une estimation basée sur l’historique des essais conduits durant ces dernières années. De plus les normes requierent un nombre minimal d'animaux par produit analysé et par délai d'analyse, et le type de dispositif implanté ne permet pas toujours la réalisation d'un grand nombre de sites par animal. Le nombre d’études sur 5 ans est donc estimé à 36 (3 x 12 procédures expérimentales ; pour 660 ovins ; 330 caprins ; 240 chiens ; 540 lapins ; 210 Rats ; 120 cobayes).
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : Avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…). - La douleur des animaux : En phase post-opératoire, les suivis sont renforcés et completée par des scores de suivi de la douleur. La présence d'un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Les signes cliniques servant de points limites sont listés dans le document joint en annexe, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez les rongeurs ou le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le chien ou les ovins/caprins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie). Le choix entre les grands modèles repose aussi sur les similarités avec l’Homme : - Caractéristiques anatomiques (structure des os, épaisseur du cartilage...), poids, propriétés mécaniques et régénération osseuse des ovins/caprins et des chiens - Caractéristiques anatomiques et mécaniques des lapins, des cobayes et des rats. Ces espèces sont souvent utilisées également pour des raisons économiques et éthiques (exemple : réalisation d’études de faisabilités via la réutilisation d’animaux d’études précédentes ) - Colonne vertébrale uniforme et régulière simplifiant les procédures chirurgicales, structure et biomécanique de la colonne lombaire et thoracique similaires.
Efficacité et toxicité de candidats médicaments impliqués dans le traitement du cancer [MODIFICATION]
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
15 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la plupart tuées à l'issue. Immunodéficientes, immunocompétentes ou dotées d'un système immunitaire ou d'un foie humanisé, elles reçoivent selon les études des greffes de tumeurs humaines ou murines, des injections répétées de candidats médicaments, des injections de plasmides qui peuvent provoquer des troubles cardio-respiratoires, et pour certaines une castration, des prélèvements vaginaux quotidiens ou des séances d'imagerie. Parmi les risques de la chirurgie, le porteur cite le cas où "la souris se réveille en cours de procédure". 1 200 souris sont déclarées réutilisées, et le porteur prévoit que des souris n'ayant subi qu'une partie de la procédure puissent passer dans un projet de formation interne aux gestes techniques. Il indique enfin qu'aucune approche statistique n'a fixé l'effectif, prévu pour 309 études de 50 souris et estimé d'après les années antérieures, avec une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines sur des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé. Différentes stratégies d’implantation des tumeurs pourront être mises en œuvre en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser sa toxicité et l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la fonctionnalité de candidats médicaments dans des modèles se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'humain.
Procédures
[MODIFICATION] Identification par puce électronique : 2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les administrations de traitements ou de cellules seront réalisées par injections qui pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines procédures nécessiteront des actes chirurgicaux pour la castration, l’implantation de fragments de tumeurs et/ou de dispositifs sous-cutanés, réalisés sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. L’implantation durera environ 8 minutes et pourra être répétée selon les besoins de l’étude. Concernant la castration, celle-ci durera moins de 10 minutes. Le suivi de la croissance tumorale pourra se à l’aide d’un pied à coulisse pour une durée de quelques secondes et/ou par imagerie pour une durée comprise entre 10 et 45 minutes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.
Impact sur les animaux
[MODIFICATION] -Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. -Prélèvements vaginaux : peut engendrer une irritation locale, une inflammation ou un stress temporaire. -Chirurgie : douleur, hémorragie, un défaut du système d’anesthésie / analgésie (ex : la souris se réveille en cours de procédure), un état clinique détérioré au réveil (ex : hypothermie), mauvaise cicatrisation. -Administration de traitements ou de cellules cancéreuses : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : anémie, hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire (ajout de gel ophtalmique en prévention). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne voire potentiellement douleur si présence de tumeurs au niveau abdominal. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions, au développement des tumeurs et des éventuelles métastases. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux en fin d'étude, ayant atteints les points limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire. Ceci ne pourra être envisagé que dans les cas ou des animaux ont subi seulement une partie de la procédure (ex : animaux du groupe contrôle négatif) et ne présentant pas d’altérations résiduelles de leur état de santé.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 15480 souris seront utilisées, couvrant une période de 3 ans et permettant de réaliser 309 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée, pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction de la variabilité de croissance historique sur un modèle déterminé.
Raffinement
En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant de creuser, se cacher et réaliser un nid. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles pour synchroniser le cycle œstral. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, elles bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. [MODIFICATION] Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse. Un relais dans l’eau de boisson pourra ensuite être réalisé. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement sous anesthésie sans réveil, suivi d’une euthanasie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Des mesures pour éviter tout stress au moment de l’euthanasie sont prévues. Les points limites sont définis selon l’état général (score clinique), perte de poids ou volume tumoral.
Choix des espèces
90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. De plus, le métabolisme des souris présente des similarités avec celui des humains, ce qui permet de prédire la distribution, biotransformation et élimination d’un médicament. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang. Les animaux humanisés avec des cellules modifiées seront inclus à partir de 5 semaines, âge auquel la greffe de cellules dans le sang est la plus efficace.
Evaluation du potentiel allergique et de sensibilisation de novo de la graine de chanvre in vivo, en comparaison à un allergène fort et un allergène faible chez la souris Balb/cJRj
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
220 souris Balb/cJRj vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et chacune est anesthésiée et rasée avant chaque sensibilisation, répétée quatorze jours de suite ou une fois par semaine pendant six semaines selon les protocoles. L'allergène, graine de chanvre, noisette ou épinard, leur est appliqué par un patch posé sur le dos ou après grattage de la peau du ventre, l'étude pilote évaluant l'usage du papier de verre. Trois à dix jours après la dernière sensibilisation, un gavage doit déclencher l'allergie, avec des tremblements, une chute de la température corporelle et des douleurs à l'estomac possibles. Le porteur écrit que ce travail "permettrait de pouvoir prédire ou bien d'avoir une indication du niveau de risque encouru par les consommateurs de graine de chanvre".
Objectifs
Les allergies alimentaires sont un problème de santé publique qui connait une augmentation en termes de prévalence et de sévérité ces dernières années. Les allergies sont répandues et ont été classées comme la quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ce projet prend part dans un contexte de transition de régime alimentaire visant à utiliser de nouvelles sources de protéines comme la graine de chanvre. Il est possible de rentrer en contact avec la graine de chanvre par le biais de deux voies majeures : orale et cutanée. La consommation de la graine de chanvre est en plein essor de par son fort intérêt nutritionnel et peut se faire au travers de la farine, de barres énergétiques, de pâtes, de biscuits, de boissons ou encore de yaourts. D’autre part, un contact cutané est possible à travers l’huile ou des crèmes à base de graine de chanvre, utilisées en cosmétiques. La recherche sur les allergies à la graine de chanvre est essentielle, d’une part car les allergènes déjà connus dans les fleurs et le pollen de chanvre peuvent se retrouver dans la graine et d’autre part par la présence de protéines de stockage dans la graine, connues pour leur fort potentiel allergène. Afin de prévenir les possibles allergies qui pourront être liées à la graine de chanvre, il est alors nécessaire d’évaluer son potentiel allergique par rapport à un allergène fort, ici la Noisette ainsi qu’un allergène faible, l’épinard. Dans le cadre de l’allergie, deux manifestations majeures peuvent avoir lieu, i) une sensibilisation de novo, ce qui veut dire devenir allergique à la graine elle-même ou ii) une réaction dite croisée par le biais d’une similarité entre les protéines de la graine de chanvre et d’autres protéines allergènes. La connaissance de la capacité de sensibilisation de novo des protéines est importante pour appréhender et anticiper les risques allergiques futurs. Actuellement, il n'existe aucune connaissance sur la capacité de sensibilisation de novo de la graine de chanvre dans une population générale Non Allergique, malgré l'exposition croissante de la population à la graine de chanvre par le biais des aliments et des cosmétiques. Ce projet sera donc tourné sur le potentiel de sensibilisation de novo de la graine de chanvre.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel allergénique et plus précisément de sensibilisation de novo de la graine de chanvre en comparaison avec un allergène fort, la Noisette connue pour induire des allergies et un allergène faible, l’Epinard qui n’est pas connu pour induire beaucoup d’allergies. Ceci permettrait de pouvoir prédire ou bien d’avoir une indication du niveau de risque encouru par les consommateurs de graine de chanvre ou de produits contenant des graines de chanvre et ainsi de prédire le risque de voir une personne devenir allergique à la graine de chanvre par la suite. De plus, ce projet permettra une compréhension plus approfondie des mécanismes immunologiques associés à une sensibilisation à la graine de chanvre.
Procédures
Toutes les souris seront anesthésiées et rasées au préalable de chaque sensibilisation. Les souris seront sensibilisées quotidiennement avec la pose d’un patch, ou 1 fois par semaine pendant 6 semaines avec la pose d’un patch pendant 3 jours ou bien par grattage et application transdermale de l’allergène sur l'abdomen. Le déclenchement des symptômes de l'allergie sera effectué par un gavage, respectivement 3, 10 ou 7 jours après la dernière sensibilisation. Pour un gavage oral, la durée des interventions correspond au temps d’administration (soit environ 10 secondes). Pour les applications épicutanées avec la pose du patch ou transdermale avec le grattage sur l’abdomen, la durée d’intervention correspond au temps d’anesthésie soit 15 à 20 minutes environ. Selon la procédure, les souris auront également un prélèvement d'une goutte de sang à l'extrémité de la queue 1 fois par semaine (de la sensibilisation 3 à la sensibilisation 6) soit 4 prélèvements au total. Ce geste dépend du débit sanguin et dure environ 30 secondes. Pour l’étude principale, les mêmes interventions que pour l’une des procédures de l’étude pilote seront réalisées et les temps d’interventions seront donc similaires.
Impact sur les animaux
Lors de ce protocole, il est possible que les souris aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués : les méthodes de sensibilisation peuvent provoquer certaines nuisances en raison de la répétabilité des gestes (14 jours consécutifs ou 1x par semaine pendant 6 semaines) mais aussi de par la présence d’un patch sur le dos, des démangeaisons dues au rasage et des irritations dues au patch, un inconfort abdominal suite au grattage lors de la sensibilisation transdermale, des symptômes liés à la mise en place de l’allergie provoqués par le gavage oral (tremblements, chute de la température corporelle, douleurs stomacales), ainsi que les anesthésies gazeuses répétées. La prise de température par voie rectale peut également entrainer un inconfort pour les souris.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de l’allergie et ainsi valider nos modèles.
Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques complexes et en particulier le système immunitaire. Dans l’allergie, de multiples types cellulaires peuvent être impliqués et leurs interactions peuvent avoir un rôle dans la physiopathologie. De plus, l’allergie alimentaire est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux et en particulier les souris peuvent adéquatement reproduire.
Réduction
Des protocoles d’allergie alimentaire sont régulièrement réalisés au sein du laboratoire, mais aucun protocole utilisant la graine de chanvre ou la Noisette n’a encore été fait. De ce fait, il est impossible de faire un test de puissance. Néanmoins, en se basant sur des tests statistiques et sur la variabilité individuelle lors des anciens protocoles, le nombre de souris pour l’étude principale avec un allergène fort et un allergène faible a été déterminé à 12 souris par groupe soit 48 souris au total par sexe. Cette procédure sera répétée une deuxième fois avec les mêmes 4 groupes de 8 souris par sexe pour s’assurer de la reproductibilité du protocole. Pour l’étude pilote, le nombre de souris a été réduit à 10 par procédure soit 30 souris au total par sexe. Nous anticipons des écarts nets entre les différentes procédures testées, avec des réponses contrastées de type "tout ou rien". Cette amplitude attendue des effets justifie le recours à un effectif réduit, tout en permettant d’identifier le protocole le plus prometteur dès cette première phase. Pour l’étude principale, ce nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place des procédures expérimentales d’analgésie (avec notamment l'injection d'anti-inflammatoire) et d’anesthésie permet de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront hébergées avec au moins 3 enrichissements (dôme, tube et coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi une étude pilote sera effectuée sur un nombre de souris restreint pour appréhender les méthodes de sensibilisation, l’effet de l’application du patch et l’utilisation du papier de verre et afin d’affiner et de choisir au mieux, le protocole qui sera appliqué par la suite ainsi que pour appréhender la prise en charge de la douleur le cas échéant. Une attention particulière sera portée à la détection précoce des signes de douleur ou de mal-être chez les animaux. Des points limites adaptés ont été définis pour garantir que tout changement significatif d’état de santé d’un animal déclenche une réévaluation. Un arbre décisionnel encadre les actions à mener : surveillance renforcée, tentative de soulagement, puis prise de décision, avec le responsable du bien-être animal et le vétérinaire si l’état de l’animal ne s’améliore pas. En cas de souffrance persistante ou jugée irréversible, l’animal sera retiré du protocole et mis à mort. Cette approche vise à limiter la souffrance et à respecter les principes éthiques de l’expérimentation animale.
Choix des espèces
La souche de souris utilisée constitue un modèle de choix, reconnue dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de cette souche. Aujourd'hui, il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent pour le moment reproduire adéquatement. Ainsi, le modèle animal ici est un élément nécessaire pour modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système lors d’une allergie. Les souris auront 3 semaines de vie à la réception et 4 semaines de vie en début de procédure. Quatre semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature.
Etude de mécanismes de l’allergie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Sensibilisées puis soumises à un choc allergique, 60 souris reçoivent quatre injections et un prélèvement sanguin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées après prélèvement et imagerie. L'objectif déclaré porte sur les événements vasculaires de l'anaphylaxie, la perméabilité des vaisseaux et la perte de volume sanguin qui accompagnent les formes les plus graves. Le porteur mentionne que "la chirurgie peut causer des saignements", sans que le RNT décrive nulle part quelle intervention chirurgicale les souris subissent.
Objectifs
Selon l’Organisation mondiale de la santé, l’allergie est une réaction d’hypersensibilité systémique dont les formes les plus sévères peuvent mettre la vie en danger. Elle se manifeste par une apparition rapide de troubles respiratoires, circulatoires ou des voies respiratoires, potentiellement mortels, et s’accompagne généralement – mais pas systématiquement – de modifications cutanées ou des muqueuses. Il est donc essentiel d’en étudier les mécanismes afin d’améliorer la qualité des soins et la prise en charge des patients. Le système cardiovasculaire est l’un des principaux systèmes impliqués dans la physiopathologie de la réaction. Plus précisément, le système vasculaire joue un rôle clé car il est impacté par les médiateurs biologiques libérés par différents types de cellules impliquées dans la réaction allergique. L’altération des vaisseaux provoque une augmentation de la perméabilité des vaisseaux sanguins et une perte conséquente du volume sanguin circulant vers l'espace extracellulaire entraînanant une hémorragie. L'objectif principal est d'étudier les événements vasculaires se produisant dans un modèle d'allergie chez la souris.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de faire progresser la connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans les réactions allergiques et anaphylactiques les plus sévères. L'objectif est de rechercher de nouvelles stratégies immunothérapeutiques pouvant être utilisées en pratique clinique et de rechercher des marqueurs de gravité permettant de personnaliser les traitements des patients afin d'améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Dans cette étude, nous utiliserons un modèle murin d’allergie réalisé sous anesthésie générale et analgésie systématique. Le protocole comporte quatre injections (incluant les traitements et l’analgésique), chacune durant environ 5 secondes. Les souris feront également l’objet d’un prélèvement sanguin, dont la durée est estimée à 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les injections causent un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins causent un stress et une douleur légère de courte durée. L’induction de l’allergie (sensibilisation) peut causer une réaction inflammatoire au site d’injection.. La chirurgie peut causer des saignements.
Devenir
Les souris seront mises à mort après prélèvements sanguins et analyse par imagerie.
Remplacement
À l'heure actuelle, il est impossible de réaliser des études sur les cellules pour atteindre les objectifs du projet, car il est obligatoire de disposer d'un système physiopathologique chez l'animal intact qui reproduit les conditions qui se produisent dans les cas d'allergie alimentaire, d'asthme et d'anaphylaxie pour transférer les conclusions à la situation clinique.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude statistique a été réalisée au préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Les groupes expérimentaux ont été conçus de manière optimisée sur la base d’études antérieures, afin de garantir l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. L’analyse des résultats reposera sur des méthodes statistiques appropriées, assurant une interprétation rigoureuse des données tout en respectant le principe de réduction de l’usage des animaux
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur potentiellement liée au modèle, un traitement antalgique sera administré en amont des manipulations expérimentales. L’état de santé des animaux sera suivi de manière rigoureuse à l’aide d’une grille d’évaluation spécifique, incluant des points limites stricts et adaptés au projet. Ce dispositif permettra une détection rapide de toute souffrance, assurant une prise en charge appropriée. En cas de douleur, un traitement adapté sera mis en place, et si nécessaire, une mise à mort sera effectuée conformément à la réglementation en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge 10 semaines. C'est l’âge où le système immunitaire est mature.
Rôle des cellules dendritiques dans l’activité antitumorale des cellules NK
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules de lymphome dans la veine de la queue, sur animal vigile, puis jusqu'à quatre injections intrapéritonéales. Le porteur indique que les cellules tumorales se disséminent dans tout l'organisme et peuvent se développer dans le foie ou le cerveau, ou provoquer une paralysie par atteinte de la moelle osseuse. Aucun médicament contre la douleur ne leur sera administré, ces substances modifiant le système immunitaire étudié et risquant de "fausser les résultats".
Objectifs
Le cancer est une maladie grave qui touche des millions de personnes chaque année dans le monde, et reste l’une des principales causes de décès. Ces dernières années, de nouveaux traitements appelés immunothérapies, qui utilisent les défenses naturelles de notre corps, ont permis de mieux soigner certains cancers et d’augmenter la durée de vie des patients. Ces progrès sont possibles grâce à une meilleure compréhension du système immunitaire, en particulier grâce à des études chez la souris dont le fonctionnement est proche de celui de l’humain. Parmi les cellules du système immunitaire, les cellules Natural Killer (ou cellules NK) sont très importantes : elles sont capables de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses. Malheureusement, dans beaucoup de cas, ces cellules deviennent moins efficaces au fil du temps, comme si elles s’épuisaient. Notre projet cherche à comprendre pourquoi les cellules NK perdent leur efficacité face au cancer. Dans un modèle de lymphome chez la souris que nous avons développé, les cellules NK réagissent d’abord bien aux tumeurs, mais finissent par devenir inactives. Nous pensons que certaines cellules du système immunitaire appelées cellules dendritiques (ou DCs), ainsi que d’autres cellules proches, produisent des substances (les cytokines) qui aident à maintenir l’activité des cellules NK. Mais, quand la tumeur grandit, elle perturbe ce soutien, ce qui rend ces dernières moins efficaces. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour étudier de plus près les échanges entre cellules NK et cellules dendritiques au cours du processus tumoral. Grâce à ces recherches, nous espérons mieux comprendre comment les cellules NK s’épuisent face à un cancer, quel rôle les cellules dendritiques jouent dans ce processus, et surtout, comment agir pour renforcer les cellules NK. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour améliorer les traitements contre le cancer.
Bénéfices attendus
Les immunothérapies, qui stimulent le système immunitaire pour qu’il combatte le cancer, ont profondément changé la manière de traiter certains cancers. Malheureusement, ces traitements ne fonctionnent pas chez tous les patients, et beaucoup meurent encore prématurément de la maladie. Il est donc essentiel de mieux comprendre pourquoi ces traitements échouent parfois, pour les améliorer et sauver plus de vies. Notre projet s’inscrit dans cet objectif. Nous cherchons à comprendre pourquoi certaines cellules du système immunitaire, appelées cellules NK, s’épuisent et deviennent moins actives face aux tumeurs. Nous étudions le rôle dans ce processus de leur dialogue avec un autre type de cellules immunitaires, les cellules dendritiques (ou DC). Les connaissances que nous allons acquérir dans ce projet pourraient ouvrir de nouvelles pistes pour rendre les immunothérapies plus efficaces, et ainsi augmenter les chances de guérison des patients atteints de cancer.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique des cellules tumorales dans la veine de la queue d’une durée de quelques secondes. La manipulation des souris pour les pesées ou la contention représentera un stress de courte durée pour les souris. Les animaux inclus dans les différentes procédures subiront au maximum 4 injections intrapéritonéales de courte durée.
Impact sur les animaux
Un inconfort temporaire sera induit par l’injection de cellules tumorales dans une veine de la queue, effectuée sur des animaux éveillés, pouvant entraîner un léger stress ou une petite douleur passagère. Les manipulations nécessaires pour peser les animaux ou les maintenir immobiles provoquent un stress de courte durée. Les injections intrapéritonéales de certains produits peuvent générer un léger stress ou une petite douleur passagère. Le développement des tumeurs elles-mêmes peut entraîner des douleurs chez les animaux. En effet, l'injection par voie intraveineuse des cellules tumorales entraîne leur dissémination dans tout l'organisme, ce qui peut favoriser le développement tumoral dans des organes vitaux (foie, cerveau) ou entrainer une paralysie suite à l’atteinte de la moelle osseuse. D'autres effets indésirables peuvent être observés tels qu'une perte de poids ou une modification du comportement (prostration).
Devenir
A la fin de chaque procédure, la totalité des animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse par divers protocoles. La quasi-totalité aura reçu une injection de cellules tumorales.
Remplacement
Dans ce projet, nous avons besoin de mesurer différentes réactions du système immunitaire pendant un développement de tumeur, directement dans un organisme vivant. Cela s’explique par la complexité du système immunitaire, qui repose sur de nombreuses interactions entre différents types de cellules. Ces échanges sont essentiels au bon développement des réponses immunitaires et à leur capacité de réagir face à une tumeur. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle vivant complet, comme la souris, pour pouvoir observer ces mécanismes dans leur ensemble, dans des conditions proches de la réalité. Les modèles alternatifs dans l’état actuel des connaissances ne permettent pas d’étudier les interactions complexes entre cellules immunitaires dans le développement tumoral du lymphome.
Réduction
Nous ferons tout pour utiliser le moins d’animaux possible dans ce projet, tout en garantissant la qualité des résultats. Pour cela, nous travaillerons avec une souche de souris, qui a l’avantage de donner des résultats plus homogènes entre les individus. Cela nous permet de limiter le nombre de souris à 3 ou 10 par groupe, selon les expériences. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une approche statistique garantissant la fiabilité des résultats obtenu. Chaque expérience sera reproduite plusieurs fois (jusqu’à 2 fois), car la croissance des tumeurs peut varier d’une souris à l’autre. Une première expérience, dite "pilote", nous servira à trouver la bonne dose de la molécule utilisée pour éliminer certaines populations de cellules immunitaires , et à vérifier son effet dans le temps. Cette étape sera faite seulement 2 fois maximum, et si elle fonctionne dès le premier essai, nous n’aurons pas besoin de la refaire, ce qui permettra de réduire encore le nombre d’animaux utilisés. Enfin, si lors des expériences principales aucune différence n’est observée entre les groupes traités et les groupes témoins, nous pourrons réduire le nombre de répétitions pour ces derniers, ce qui contribuera encore à limiter l’utilisation d’animaux dans l’ensemble du projet.
Raffinement
Pour éviter au maximum le stress des animaux, ils seront maintenus en petits groupes stables, composés de souris compatibles entre elles. Elles auront également du matériel pour faire des nids et se cacher, ce qui contribue à leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé chaque jour, en observant leur poids, leur apparence et leur comportement. Si des signes de souffrance ou de détresse apparaissent, des seuils d’alerte précis ont été définis pour intervenir rapidement, selon une grille d’évaluation adaptée à chaque type de procédure. Certaines injections seront faites sur des animaux éveillés, mais elles seront réalisées avec soin par du personnel formé et expérimenté, pour réduire au minimum la gêne ou le stress. Pendant les séances d’imagerie, les animaux respireront un gaz anesthésiant pour les endormir légèrement. Cela permet qu’ils ne bougent pas et qu’ils ne ressentent pas de stress pendant l’examen. Enfin, dans ce projet, nous ne pourrons pas utiliser de médicaments contre la douleur, car ces substances modifient le fonctionnement du système immunitaire et risqueraient de fausser les résultats. Nous veillerons donc à limiter l’inconfort et la souffrance au maximum par des mesures correctives adéquates.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus adapté pour ce type d’étude, car elle se reproduit rapidement, sa taille est pratique pour la recherche, et son patrimoine génétique est bien connu. Cela nous permet de réaliser des manipulations précises, y compris avec des souris génétiquement modifiées, indispensables pour nos expériences. Le fonctionnement de l’organisme de la souris est assez proche de celui de l’humain, en particulier pour ce qui concerne le système immunitaire. Étudier la souris nous aide donc à mieux comprendre les mécanismes immunitaires chez l’homme. Nous utiliserons des souris des 2 sexes âgées de 7 à 30 semaines, car, à cet âge, leur système immunitaire est arrivé à maturité. Pour éviter les différences liées à l’âge au sein d’un même groupe, nous veillerons à ce que les souris d’un même groupe aient au maximum 2 semaines d’écart, ce qui garantit une meilleure fiabilité des résultats.
Etude de la réponse immunitaire adaptative dans un modèle murin de colite
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Croisées pour être dépourvues de lymphocytes T et B tout en développant une colite chronique à partir de huit semaines, les souris de ce projet sont 1 764, dont 1 156 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une bague auriculaire et une biopsie de la queue pour le génotypage, et plusieurs centaines subissent des injections répétées de sérum, d'anticorps ou de cellules, avec prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur indique que l'inflammation intestinale peut entraîner un retard de croissance, une perte de poids, une déshydratation ou un prolapsus rectal, et que certains traitements testés pourraient l'aggraver. Les souris gardées pour la reproduction sont tuées à huit mois pour renouveler les accouplements, celles dont le génotype ne convient pas à six semaines.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont des pathologies qui se traduisent par une inflammation durable du côlon, dont les causes exactes restent encore mal connues. Le système immunitaire pourrait jouer différents rôles dans ce contexte : il pourrait être responsable d’une réaction excessive contre les bactéries naturellement présentes dans l’intestin, mais aussi, au contraire, contribuer à limiter leur passage dans les tissus lésés et à réguler l’intensité de l’inflammation. Le but de ce projet est de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires, en particulier des lymphocytes T et B, dans le déclenchement et l’évolution de l’inflammation intestinale. Pour cela, nous allons créer un nouveau modèle de souris génétiquement modifiées. Objectif 1 : Développer des modèles de souris qui présentent une colite avec ou sans système immunitaire adaptatif. Cela permettra de comparer directement l’influence de ce système sur la maladie. Chez les animaux dépourvus de ce type de défense, il sera possible de réintroduire des éléments du système immunitaire (anticorps ou cellules) afin d’évaluer leur rôle. Objectif 2 : Étudier plus particulièrement le rôle des anticorps dans le développement de la colite et tester l’effet de traitements basés sur leur administration. Pour cela, des souris dépourvues de réponse immunitaire adaptative seront reconstituées avec différents composants issus d’animaux immunocompétents, et l’effet de l’injection d’anticorps sera analysé selon différents modes d’administration. Objectif 3 : Évaluer l’impact d’une réponse immunitaire dirigée contre les bactéries intestinales. L’expérience consistera à stimuler le système immunitaire des souris avec des éléments du microbiote afin de voir comment cela influence l’évolution de la colite.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre le rôle du système immunitaire adaptatif dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin à travers la réalisation et l’exploitation d’un nouveau modèle expérimental murin. Ce modèle servira aussi à explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Par exemple, nous évaluerons l’effet de l’injection d’anticorps humains déjà utilisés en clinique dans d’autres maladies, afin de voir s’ils limitent le passage des bactéries et l’inflammation intestinale. Nous comparerons aussi leur efficacité selon différentes modalités d’administration. Enfin, nous testerons une stratégie vaccinale innovante visant à “éduquer” le système immunitaire contre des composants bactériens, dans l’objectif de réduire l’inflammation et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ou de futurs marqueurs biologiques utiles pour le suivi des MICI.
Procédures
Tous les animaux (1764 souris) auront une bague auriculaire et une unique biopsie caudale pour le génotypage. Ces gestes, très courts (quelques secondes) sont réalisés sur animal vigile. Quatre-vingts souris recevront deux injections de sérum à 7 jours d’intervalle sous anesthésie légère. L’injection dure environ 5 minutes. Cent-vingt autres souris recevront pendant 5 jours consécutifs une injection d’anticorps sans anesthésie. Chaque injection dure 10 secondes. Deux prélèvements sanguins de 100µl seront réalisés chez ces animaux vigiles. Ce type de prélèvement dure 5 minutes au maximum. Une injection de cellules sera réalisée sur 140 autres animaux légèrement anesthésiés. Un prélèvement sanguin sera aussi réalisé sur ces mêmes animaux vigiles. Deux cents autres souris recevront 3 injections de 200µl de composés à 4, 6 et 8 semaines de vie. Ces injections se feront sur animaux vigiles et durent 10 secondes. Deux prélèvements sanguins de 100µl seront réalisés avant l’immunisation et 1 semaine après la dernière injection chez tous ces animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les souris dépourvues de défenses immunitaires présentent un risque accru d’infections. Toutefois, elles seront élevées dans des conditions protégées et conformes à la réglementation, dans un environnement exempt de pathogènes, ce qui limite fortement ce risque et ne provoque pas de souffrance particulière dans ces conditions. En revanche, les souris utilisées pour mimer la maladie développent une colite chronique à partir d’environ 8 semaines d’âge. Cette inflammation intestinale peut entraîner un retard de croissance, une perte de poids, une déshydratation ou, plus rarement, un prolapsus rectal. Dans ces cas, les animaux seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les injections nécessaires au projet durent moins de 5 minutes et n’entraînent qu’une gêne légère et transitoire liée à la piqûre. Les traitements dureront de 10 jours à 16 semaines en fonction des procédures appliquées. Certains traitements testés pourraient améliorer l’inflammation, tandis que d’autres pourraient l’aggraver en accélérant son apparition et/ou en augmentant son intensité. Pour cette raison, les animaux recevant un traitement feront l’objet d’une surveillance renforcée afin de détecter rapidement tout signe de souffrance et d’intervenir en conséquence.
Devenir
Tous les animaux de la procédure 5 « génotypage » restent en vie à l’issue de la procédure. A l’issue des procédures 1 et 2, les animaux ayant le génotype d’intérêt serviront pour la reproduction et l’entretien des lignées et pour certaines autres procédures. Les animaux en reproduction seront euthanasiés à l’âge de 8 mois afin de renouveler les accouplements. Les animaux de génotype inadéquats, donc inutilisables, seront euthanasiés à 6 semaines. Les animaux des autres procédures seront euthanasiés à la fin de l’étude pour réaliser les prélèvements.
Remplacement
Le système immunitaire adaptatif est un processus complexe impliquant différents types de cellules (par exemple, les lymphocytes T et B) qui interagissent entre elles et avec d’autres cellules pour déclencher ou réguler l’inflammation. Dans les maladies intestinales, cette inflammation résulte aussi de relations encore mal connues entre les bactéries naturellement présentes dans l’intestin (le microbiote), les cellules de la paroi intestinale et les défenses immunitaires. Ces interactions sont trop complexes pour être reproduites uniquement par des expériences en laboratoire sur cellules isolées ou par des modèles informatiques. La création d’une nouvelle lignée de souris combinant deux modèles existants offrira donc une opportunité unique pour analyser plus en détail le rôle du système immunitaire adaptatif dans le déclenchement et l’évolution de l’inflammation intestinale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire grâce à une gestion rigoureuse des programmes de reproduction. Les croisements seront organisés de manière à obtenir prioritairement les génotypes utiles pour les expériences, tout en réduisant au maximum la naissance d’animaux porteurs de caractéristiques susceptibles d’altérer leur bien-être. Une attention particulière sera portée au suivi des nouveaux génotypes afin d’évaluer précocement leur état de santé et leur qualité de vie, conformément aux recommandations européennes. Pour les expériences, le nombre d’animaux par groupe a été fixé à 10. Ce choix correspond aux standards de la littérature scientifique et permet de tenir compte de la variabilité biologique naturelle, tout en garantissant une solidité statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Cette approche évite de multiplier inutilement le nombre d’animaux en cas d’études inconcluantes, et respecte ainsi le principe de réduction parmi les 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer).
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués progressivement à l’expérimentateur, grâce à une routine d’élevage et à des manipulations douces et régulières, afin de réduire leur stress. Leur hébergement sera enrichi de matériel pour la construction de nids, favorisant leur confort. L’élevage sera maintenu à l’état hétérozygote pour limiter l’apparition d’animaux présentant des caractéristiques potentiellement dommageables. Pour les souris immunodéficientes, un environnement protégé et conforme à la réglementation sera assuré. Les cages seront changées dans des conditions stériles afin de réduire le risque de contact avec des agents infectieux. Des contrôles sanitaires réguliers seront réalisés pour garantir le maintien de ces conditions sécurisées. Chez les animaux développant une colite, une surveillance quotidienne sera effectuée par du personnel formé, avec une pesée bihebdomadaire et une observation attentive des signes cliniques (perte de poids, modifications du comportement, état du pelage, posture, cris ou blessures). Les cages de ces animaux présentant une colite seront nettoyées plus fréquemment pour préserver leur confort. Si des signes de souffrance apparaissent, des mesures adaptées de prise en charge de la douleur seront mises en place. En cas de mauvaise tolérance ou de souffrance importante, le protocole expérimental sera interrompu, et les animaux concernés seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris pour ce projet car ses mécanismes immunitaires sont très proches de ceux de l’Homme. De plus, des lignées génétiquement modifiées ciblant des gènes clés impliqués dans la réponse immunitaire adaptative et dans le développement de l’inflammation intestinale sont disponibles. Le croisement de ces deux lignées permettra d’obtenir des animaux dépourvus de lymphocytes T et B et susceptibles de développer une colite similaire à celle observée chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. La souris est également l’espèce la mieux adaptée aux conditions d’élevage de notre animalerie, ce qui permet d’assurer leur bien-être tout en réalisant des expériences scientifiquement pertinentes. Les expériences seront menées sur des souris sevrées, âgées d’au moins 4 semaines. Au-delà de 4 semaines le système digestif et le système immunitaire sont suffisamment matures pour les études prévues. L’âge auquel les animaux seront euthanasiés pour l’analyse des résultats dépendra du type d’expérience réalisée. Cette décision sera basée sur les données de la littérature scientifique et/ou sur les observations préliminaires obtenues lors des procédures expérimentales, afin de garantir la pertinence scientifique tout en minimisant la souffrance animale.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques dans le modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
1 836 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à soixante-seize administrations de composés et jusqu'à soixante-dix-neuf injections au total sur une étude de vingt-quatre jours. 816 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 816 un niveau modéré, et toutes sont tuées pour prélèvements. L'inflammation du système nerveux central qui leur est provoquée entraîne des douleurs pendant huit jours et un déficit moteur modéré à sévère selon le degré de paralysie, sur commande de laboratoires clients qui fournissent les molécules à tester. Le porteur indique que les études menées sous le projet précédent n'ont mis en évidence aucune molécule prometteuse dans cette pathologie.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie auto-immune inflammatoire démyélinisante du système nerveux central. Une inflammation liée à un mécanisme auto-immunitaire est à l'origine d'une dégénérescence progressive de la gaine de myéline entourant les fibres nerveuses des neurones. Ce phénomène est à l’origine du ralentissement ou de l’arrêt de la conduction nerveuse induisant une faiblesse musculaire, des troubles de la motricité, de la vision, etc. La sclérose en plaques représente la première cause de handicap sévère non traumatique chez les jeunes adultes. L’âge moyen de début des symptômes est en effet 30 ans. Environ 110 000 personnes sont touchées en France avec 4 000 à 6 000 nouveaux cas par an. D’une manière générale, les causes de la maladie ne sont pas bien identifiées et l’origine exacte de la pathologie reste inconnue. De même, aucune thérapie n’existe à l’heure actuelle pour soigner cette pathologie très invalidante. C’est pourquoi l’étude de nouvelles molécules thérapeutiques est nécessaire. Les molécules thérapeutiques en développement ont pour objectif d’agir sur 3 axes : optimiser la stratégie anti-inflammatoire, favoriser la remyélinisation et la neuroprotection. Pour le traitement de la poussée, l'activité anti-inflammatoire des corticoïdes (anti-inflammatoires) accélère la rémission et permet de réduire le taux de rechutes à court terme. La phase pré-clinique qui consiste à étudier l’action des agents pharmacologiques in vivo chez le rongeur est une étape essentielle dans le développement de médicaments. Ce projet fait suite au projet #21592 arrivé à échéance. Il a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire en comparaison avec une molécule de référence et d’obtenir une efficacité égale, voire supérieure à celle-ci.
Bénéfices attendus
Un traitement anti-inflammatoire permet de diminuer cette phase inflammatoire qui mène à la destruction des axones et gaines de myélines. Les traitements disponibles à ce jour ne permettent pas de guérir la maladie, des injections d'anti-inflammatoires permettent de traiter les symptômes et peuvent prévenir les poussées qui reviennent par intermittences. Ce type de forme évolue par poussées, avec des épisodes de rémission plus ou moins long entre celles-ci contrairement aux formes progressives qui évoluent de façon continue, indépendamment des poussées. Dans les formes progressives de la maladie, l’efficacité des traitements n’est pas définitivement démontrée et semble au mieux très partielle. Ce projet a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire permettant de diminuer ou d’inhiber le développement de la maladie. Les études réalisées sur la précédente DAP n’ont pas permis de mettre en évidence des molécules prometteuses dans cette pathologie.
Procédures
Administrations de composés: maximum 76/souris (30 secondes/souris); Prélèvements de sang: maximum 4 prélèvements/souris (3 prélèvements sur animaux vigiles 1x/semaine et 1 prélèvement sous isoflurane en terminal, 1 minute/souris); Induction de la maladie: 3 injections/souris (30 secondes/souris, injection du premier jour sous isoflurane). Cela représente au total maximum 79/souris injections au cours d’une étude de maximum 24 jours avec 14 jours de traitements préventifs.
Impact sur les animaux
Ce projet va permettre d’induire un modèle expérimental transitoire d’inflammation du système nerveux central chez la souris. Plusieurs injections seront nécessaires (solutions immunogéniques et molécules thérapeutiques à tester) et induiront des douleurs légères de courte durée. L’inflammation induite (mimant celle rencontrée chez l’homme lors de sclérose en plaque) sera à l’origine de douleurs de faibles à modérées (selon le stade de développement de la maladie) sur 8 jours et un déficit moteur (sur maximum 48h) de modéré à sévère (selon le degré de paralysie) selon l’efficacité ou non de la molécule thérapeutique testée. La douleur chez l’animal pourra induire malnutrition, faim, soif et stress même si des mesures seront mises en place pour limiter ces nuisances au maximum. Ces signes cliniques ont été observés chez moins de 5% dans la DAP précédente.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques et d’analyser l’effet des différentes molécules testées.
Remplacement
Nous proposons de mettre en place un modèle de sclérose en plaques chez la souris afin de tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies: une thérapie composée d’un seul médicament (monothérapie) ou de plusieurs molécules (combinaison thérapeutique). La dose du composé est choisie en fonction des études in vitro réalisées par le laboratoire donneur d’ordre. Nos clients s’engagent, par signature d’une clause du contrat, à ce que la toxicité des composés ainsi que le véhicule fourni soient validés in vitro sur des modèles pertinents. La dose optimale choisie correspond à la dose induisant un meilleur effet thérapeutique avec le moins d’effets indésirables. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires. Les études in vitro ne permettent pas l’étude du système nerveux/immunitaire intervenant dans la maladie. L’exploration des différentes fonctions physiologiques impliquées dans la pathologie demande l’étude d’un organisme complet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire (nombre validé par l’expérience acquise des dernières années sur ce modèle, il a été augmenté à 12 par groupe dû à la variabilité inter-individu observée), pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour limiter les nuisances au maximum et détecter les premiers signes de douleur au moment de l’expérimentation. Des points limites prédictifs ont été mis en place, si des animaux présentent des signes de souffrance (surveillance renforcée) au cours de l'étude, un analgésique sera administré. La surveillance renforcée d’un animal implique 2 visites par jour (une visite en début de matinée et une autre l’après-midi). De plus, en cas de mobilité réduite ou de perte des poids des animaux, des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajoutés dans les cages.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifique, pratique et éthique : - Mammifères proches de l’Homme: plus de 90 % des deux génomes correspondent à des régions portant des gènes de même fonction et dans le même ordre. Seulement 1 % des gènes murins n’a aucun équivalent chez l’homme et il existe de grandes analogies entre les deux espèces dans les systèmes et leur fonctionnement . - C'est l’animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique et pour les études précliniques, selon les références bibliographiques. La méthodologie envisagée est aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Le modèle est basé sur les publications (protocoles d’induction, grille d’évaluation de la maladie) afin d'éviter de refaire des études préliminaires. De plus ce modèle est maîtrisé depuis plusieurs années au laboratoire. Les animaux utilisés seront âgés de 7 semaines à 10 mois afin d’avoir un système immunitaire développé et mature. La sclérose en plaque étant une maladie neuro-dégénérative qui peut se déclarer en majorité chez des individus âgés, il est pertinent de réaliser des études chez des souris à un âge avancé (de 4 - 10 mois).
Imagerie exploratrice in vivo : mise en place, validation, optimisation de protocoles et caractérisation de nouveaux radiotraceurs et produits de contrastes chez le rongeur sain (rat et souris).
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
Rats : 105
Recrutés de préférence parmi les animaux déjà passés par d'autres protocoles de la plateforme, 105 souris et 105 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Chacun peut subir jusqu'à dix anesthésies gazeuses, de quinze minutes à trois heures, avec pose d'un cathéter veineux caudal ou intrapéritonéal pour injecter les produits de contraste ou les radiotraceurs. Il s'agit de valider in vivo des protocoles d'imagerie déjà mis au point sur des mannequins, pour "améliorer l'offre de prestation" de la plateforme aux équipes de recherche et aux entreprises. Une fois les mises au point terminées, les animaux sont encore utilisés pour des séances de tutorat à la pose de cathéter, puis soumis à une anesthésie terminale qui sert elle aussi au maintien des compétences des agents.
Objectifs
Pour améliorer son offre de prestation aux équipes de recherche et aux entreprises, notre plateforme est amenée à développer (en collaboration avec les équipes support et utilisatrices) de nouvelles méthodes et de nouveaux protocoles d’imagerie. Ces développements méthodologiques sont réalisés et validés sur animaux factices dans un premier temps. Une fois cette étape de validation atteinte, il est néanmoins nécessaire de les valider in-vivo cette fois-ci, sur un nombre limité d'animaux.
Bénéfices attendus
Chaque développement sera fait en réponse à la demande d’un utilisateur. L’optimisation des différents protocoles d’imagerie sera ensuite mise à disposition de tous les utilisateurs de la plateforme, ce qui permettra d’améliorer la qualité des résultats obtenus et de diminuer la quantité d’animaux nécessaires à la réalisation d’un projet.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs anesthésies gazeuses (maximum 10 anesthésies de 15 minutes à 3h00). En fonction des protocoles, il peut être nécessaire de poser un cathéter veineux caudal (5 minutes), ou un cathéter intra péritonéal (5 minutes) pour l’injection de produits de contraste ou de radiotraceur.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à plusieurs anesthésies à l’isoflurane, ce qui peut provoquer un stress lors de l’induction. Ils pourront ressentir une légère douleur au niveau du point d’injection des produits de contraste ou du radiotraceur.
Devenir
A la fin de la procédureLorsque la mise au point sera terminée, soit directement en sortie d’imagerie, soit minimum 48h après la dernière imagerie, les animaux auront une application de crème à la lidocaïne sur la queue pour permettre une session de tutorat / maintien des compétences à la pose de cathéter intra veineux caudal pour les différents agents de la plateformeles animaux seront soumis à une anesthésie terminale pour permettre une session de tutorat / maintien des compétences pour les différents agents de la plateforme.
Remplacement
Les développements méthodologiques sont réalisés et validés dans un premier temps sur des animaux facticesobjets test. Il est néanmoins nécessaire de valider in vivo ces nouvelles méthodes et protocoles sur un nombre limité d’animaux vivants, afin de les tester en conditions expérimentales réelles (configuration matérielle nécessaire, position de l’animal, suivi physiologique spécifique, synchronisation aux mouvements respiratoires ou cardiaques…).
Réduction
Dans la mesure du possible, les animaux utilisés seront préférentiellement des animaux issus de procédures légères à modérées d’autres protocoles de la plateforme. Les effectifs prévus représentent un maximum. En effet, les mises au point étant réalisées séquentiellement, la procédure sera arrêtée dès que l’objectif sera atteint.
Raffinement
Les animaux seront maintenus sous anesthésie gazeuse pendant toute la durée des examens. Lors de l’induction, une lampe infrarouge sera systématiquement utilisée pour réchauffer la boite d’induction et limiter la perte de température corporelle lors de cette étape. Le seul acte invasif sera la pose éventuelle d’un cathéter veineux ou intra péritonéal. La température et la respiration des animaux seront surveillées en permanence par un système de monitorage afin d’être le plus précis sur les doses d’anesthésique utilisés. Du gel ophtalmique sera utilisé pour prévenir la sécheresse oculaire. Après la session d’imagerie, les animaux seront placés sous une lampe chauffante pendant leur phase de réveil avant de retourner dans leur pièce de stabulation. Chaque examen aura une durée maximale de 3h00 et nous prévoyons un temps de repos minimal de 48h entre deux imageries. Des points limites génériques seront utilisés pendant l'hébergement pour détecter tout signe de mal être le plus précocément possible et des points limites spécifiques (fréquence respiratoire et température) seront utilisés prendant les imageries.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont des animaux largement utilisés en recherche, notamment en neuroscience. Ce sont des animaux de référence pour l’imagerie préclinique. Le besoin méthodologique va porter sur ces deux espèces, en fonction des projets des chercheurs. Les animaux pourront être jeunes adultes à adultes. Un poids maximal de 600g pour les rats sera respecté pour correspondre aux contraintes d’encombrement dans les imageurs.
Effets cardiaques du Tofacitinib dans un modèle murin de troubles de la conduction cardiaque – étude pilote
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
20 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Entre leur quarantième et leur quarante-huitième semaine de vie, elles reçoivent une injection cinq jours sur sept et passent deux fois un électrocardiogramme et une échocardiographie sous anesthésie générale. Cette étude pilote cherche à savoir si le tofacitinib, déjà utilisé en médecine humaine contre des maladies inflammatoires, freine la fibrose cardiaque. Le porteur écrit que ce modèle "mime parfaitement" la maladie génétique visée, tout en précisant que ces souris ne développent ni bloc de conduction complet ni tachycardie ventriculaire sévère, contrairement aux patientes et patients les plus atteints.
Objectifs
L'objectif du projet est de déterminer si un traitement chronique au tofacitinib, une molécule déjà utilisée en pharmacopée humaine pour le traitement de diverses maladies inflammatoires, permet de bloquer la survenue de fibrose cardiaque dans un modèle de souris transgénique. Ce modèle mime parfaitement une maladie génétique caractérisée par des troubles progressifs de la conduction cardiaque et la survenue de fibrose cardiaque au cours du vieillissement. A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement préventif médicamenteux pour les patient.e.s affecté.e.s par cette maladie, dont les plus séverement touché.e.s doivent être implanté.e.s avec un stimulateur et/ou un défibrillateur cardiaque. Pour ce projet, 20 souris transgéniques, mâles et femelles, seront traitées chroniquement avec le tofacitinib, ou le véhicule, pendant 8 semaines à partir de l'âge de 40 semaines, qui correspond au début du remodelage fibrotique. L'effet du traitement sur la survenue de fibrose cardiaque (analyse histologique), ainsi que sur la fonction électrique (électrocardiogramme) et contractile (échocardiographie), sera évalué en fin de traitement.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une prévention, au moins partielle, du remodelage fibrotique cardiaque normalement observé dans le modèle transgénique à partir de 40 semaines.
Procédures
A l'âge de 39 semaines et de 48 semaines, les souris seront soumises à un enregistrement de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) et un examen échocardiographique (15-20 min) réalisés sous anesthésie générale. Entre 40 et et 48 semaines, les souris seront soumises à une injection 5 jours sur 7.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé dans ce projet est étudié depuis de nombreuses années. Ces souris présentent un trouble de la conduction de l'influx électrique cardiaque qui augmente progressivement avec l'âge, comme pour les patient.e.s, mais qui ne conduisent pas à des blocs complets de la conduction ou à la survenue de tachycardies ventriculaires sévères et/ou fibrillation ventriculaire comme chez les patient.e.s les plus sévèrement touché.e.s. Elles se développent normalement et ne présentent pas de signes notables de souffrance. Les examens électrocardiographiques et échocardiographiques ne sont pas des techniques générant de la douleur mais seront cependant réalisés sous anesthésie générale (anesthésie gazeuse) pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable, en contrôlant leur température corporelle. Sur la base de la bibliographie, aucun effet indésirable du tofacitinib n'est attendu à la dose utilisée. Les injections seront l'acte produisant le plus d'effets indésirables, en particulier de stess, lors de la manipulation.
Devenir
Les souris seront mises à mort à l'issue de l'étude, après la dernière échographie, afin de prélever leur coeur pour des études histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Seule l'expérimentation réalisée sur des animaux vivants peut permettre de démontrer une efficacité du traitement sur la structure et la fonction cardiaque. Très spécifiquement dans le cadre de ce projet, les effets protecteurs de ce traitement sur les anomalies structurales du myocarde (fibrose) apparaissant au cours du vieillissement ne peuvent être appréhendés que sur l'animal.
Réduction
Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux (électrocardiographie et échocardiographie), afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. La taille des lots de souris a été déterminée à l'aide d'un logiciel de statistiques sur la base de notre expérience antérieure. Une analyse statistique des résultats sera réalisée.
Raffinement
Les animaux sont surveillés quotidiennement. Lors des examens électrocardiographiques et échographiques, ainsi que lors de la mise à mort, les animaux sont sous anesthésie générale à l’isoflurane. Lors des anesthésies, la température corporelle est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant rétrocontrôlé par une sonde rectale. A l'issue des procédures nécessitant une anesthésie, les souris sont placées dans des cages placées sur des tapis chauffants et surveillées de façon accrue jusqu'à leur réveil complet. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance des souris, des signes cliniques (avec score de gravité) ont été définis pour chaque procédure et définissent les points limites au-delà desquels l’expérimentation est arrêtée et l’animal euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisé est le seul modèle murin de perte de fonction du gène de la conduction. Ce modèle est bien caractérisé et représente un bon modèle des pathologies humaines résultant des mutations "perte de fonction" de ce gène. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 39 semaines, le traitement commencant à l'âge de 40 semaines, jusqu'à l'âge de 48 semaines.