Rongeurs
Développement d’une nouvelle thérapie génique ciblant la production de leptine adipeuse pour traiter le syndrome de Rett
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tester une thérapie génique visant la leptine dans le syndrome de Rett conduit à utiliser 510 souris modifiées pour développer les symptômes de la maladie. 375 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 135 un niveau sévère, et toutes sont tuées à l'issue. Biopsie de la queue vers le dixième jour de vie, injection sous-cutanée au vingtième, un ou deux prélèvements sanguins, puis tests moteurs, cognitifs et sociaux, mesure de l'activité respiratoire et suivi de l'épileptogenèse entre le 45e et le 50e jour. Les souris mâles ont une espérance de vie réduite à deux mois et le porteur annonce qu'il évaluera l'effet du traitement sur cette durée de vie, les animaux étant tués quand une grille de score signale une dégradation de leur apparence ou une perte de poids.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. Ce syndrome entraîne un polyhandicap qui se manifeste par une déficience intellectuelle sévère, infirmité motrice, des troubles respiratoires et présence d’activité épileptique. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif de la maladie. Diverses thérapies géniques ou pharmacologiques sont envisagées pour traiter ce syndrome. Notre objectif est de développer une nouvelle thérapie génique ciblant la leptine. La leptine est une hormone sécrétée par le tissu adipeux, capable d’agir au niveau du cerveau et de contrôler de nombreuses fonctions physiologiques telles que la prise alimentaire, le métabolisme, les activités respiratoires et cardio-vasculaires, l’anxiété, les fonctions cognitives et la susceptibilité à l’épilepsie. Ces fonctions sont affectées chez les patients atteints du syndrome de Rett et chez les modèles murins de la pathologie, ce qui soulève la possibilité que des niveaux excessifs de leptine puissent contribuer à la progression du syndrome de Rett. En accord avec cette hypothèse, des taux élevés de leptine circulante ont été observés chez des patients atteints du syndrome de Rett et dans des modèles murins. Notre objectif est de tester le rôle de l’hormone adipocytaire, leptine, dans les troubles associés au syndrome de Rett sur un modèle murin, au niveau comportemental et neuronal.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet pre-clinique est de démontrer un rôle de la leptine dans l’etiologie du syndrome de Rett et d'ouvrir vers le développement d'une nouvelle approche thérapeutique pour traiter cette maladie qui devra être tester dans d'autres étdues cliniques.
Procédures
Dans ce projet, nous utiliserons des souris modifiées génétiquement qui récapitulent les symptômes et troubles décrits chez les patients atteints du syndrome de Rett. Ces souris seront générées et élevées au laboratoire. Un prélèvement de poils pour le génotypage et une injection sous-cutanée seront réalisées chez les animaux mâles et femelles au sevrage (20-21ieme jour de vie postnatale). Certains animaux seront soumis à un (au 40ieme jour de vie) ou deux (au 30ieme et 40ieme jour de vie) prélèvement(s) sanguin(s). Des analyses comportementales (moteur, cognitif et social), physiologique (activité respiratoire) et pathologique (épileptogenèse) seront réalisées entre le 45ieme et 50ieme jour de vie postnatale. Nous évaluerons également les effets du traitement sur l’espérance de vie des animaux, d’une durée moyenne de 2 mois chez les animaux non-traités. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les symptômes seront rapportés sur une grille de score nous permettant de définir le point limite d'euthanasie afin de limiter leur souffrance.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour présenter les symptômes observés chez les patients souffrant du syndrome de Rett. Ces symptômes, qui apparaissent vers le 30ieme jour de vie, sont des difficultés respiratoires, des troubles locomoteurs et cognitifs, des activités épileptiques (chez les souris femelles), et une perte de poids (uniquement chez les souris mâles). Les souris mâles présentent une espérance de vie réduite de 2 à 3 mois. Une biopsie de la queue sera effectuée vers le 10iéme jour de vie pour définir le génotype des animaux ce qui entrainera une douleur légère de courte durée. Les animaux recevront une injection sous-cutanée au 20ieme jour de vie. Certains animaux seront soumis à un (au 40ieme jour de vie) ou deux (au 30ieme et 40ieme jour de vie) prélèvement(s) sanguin(s). Ces injectons et prélèvements devraient provoquer une douleur légère et de courte durée.
Devenir
Dans toutes les procédures, les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être. En fonction de l’évolution de différents critères comme par exemple l’apparence de l’animal ou une perte de poids, les animaux seront euthanasiés pour réduire toute forme de souffrance. Tous les animaux utilisés pour l'analyse comportementale seront euthanasiés à la fin de l'étude.
Remplacement
Seule l'expérimentation chez l'animal permettra de remplir les objectifs de ce projet. Il n'est actuellement pas possible par des méthodes in vitro (non animales) de reproduire les processus pathologiques complexes du syndrome de Rett. L’organisation et le fonctionnement des réseaux neuronaux ne peuvent être reproduits dans des modèles de lignées cellulaires ou de cultures neuronales.
Réduction
Des calculs statistiques utilisant les données d'études antérieures ont été utilisés pour calculer le nombre minimum d'animaux requis tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement significatifs. Les tâches proposées permettent d’évaluer les animaux sur plusieurs paramètres au niveau comportemental et neuronal, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Pour les enregistrements de l’activité nerveuse, 2 chercheurs seront mobilisés. La présence de 2 chercheurs pour ces enregistrements permettra d’augmenter le nombre de neurones enregistrés par animal, et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés pour atteindre une taille de l’échantillon permettant une analyse statistique.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement via l’observation de leur aspect général (poil hirsute, position voûtée, yeux) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation). Le suivi de leur poids sera également un critère. Lorsque les points limites sont atteints (signes visibles de la maladie, perte ou prise de poids excessive) les animaux seront euthanasiés. L'équipe continuera à examiner les dernières découvertes afin d'identifier toute nouvelle possibilité d'affiner l'expérience de ces animaux, tout en atteignant les objectifs de l'étude. Nous respecterons un délai de 15 jours entre les deux prélèvements pour éviter toutes complications (choc hypovolémique, et anémie). Dans le cas peu probable où une anémie serait observée, nous cesserons immédiatement les prélèvements. Dans le cas peu probable où un choc hypovolémique serait observé, l’animal sera euthanasié. Les animaux destinés à l’analyse comportementale seront habitués à la manipulation par l’expérimentateur. Les animaux seront anesthésiés avant d’être euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé en recherche biomédicale. Elle présente de nombreux intérêts : sa taille, son rythme rapide de reproduction et une gestation courte par rapport à d’autres organismes-modèles. De nombreux animaux existent permettant par exemple de déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans différentes pathologies. Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement qui récapitulent les symptômes décrits chez les patients atteints du syndrome de Rett. Il s’agit donc d’un modèle pertinent concernant les objectifs du présent projet. Pour ce projet, les analyses comportementales et neuronales seront réalisées à partir du 40ieme jour de vie, qui correspond à la période d'apparition et d'aggravation des symptômes.
Evaluation pré-clinique de thérapies innovantes dans des modèles précliniques de glioblastome chez les rongeurs EU 1/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 705
Greffe d'une tumeur dans le cerveau, jusqu'à 51 séances d'imagerie, 28 prélèvements de sang, 56 injections, 8 ouvertures de la barrière hémato-encéphalique, une résection tumorale et de la radiothérapie : un même animal peut subir tout cela. 3 510 souris et 705 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 3 015 d'entre eux et modéré pour 1 200. Le porteur décrit pourtant un hébergement assurant "une qualité de vie optimale tout au long de l'étude", chez des animaux immunodéficients dont la tumeur cérébrale provoque des troubles neurologiques et des difficultés de déplacement. Tous sont tués à un temps défini ou dès l'atteinte des points limites, pour des prélèvements post mortem, certains ayant été transportés vivants entre deux établissements pour accéder aux appareils d'imagerie.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales primitives et en particulier les glioblastomes sont des cancers très résistants aux traitements anti-tumoraux conventionnels (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie cytotoxique). En effet, la survie globale médiane des patients est comprise entre 12 et 24 mois. De nouveaux traitements sont donc indispensables pour améliorer le pronostic des patients souffrant de glioblastome. Les traitements candidats sont évalués dans le cadre d’essais cliniques longs et coûteux, et le plus souvent négatifs, avant leur approbation pour une utilisation en pratique clinique chez les patients. Compte tenu du nombre important de traitements candidats, notre projet vise l’accélération de l’évaluation de ces traitements innovants candidats et leur hiérarchisation en vue d’essais cliniques chez l’Homme. En effet, une évaluation préclinique rigoureuse permet de réduire le taux d’attrition des essais cliniques. (MODIFICATION) Le projet nécessite une modification sans augmentation du nombre d'animaux car le projet se déroulera dans deux établissements en raison de la nécessité d'utiliser des appareils d'imagerie spécifiques disponibles seulement dans le second établissement.
Bénéfices attendus
Les gliomes et en particulier les glioblastomes (GBM) sont les cancers cérébraux les plus fréquents et les plus graves chez l’adulte. Le pronostic des patients souffrant de glioblastome est réservé (12-24 mois de survie médiane) malgré des traitements lourds. De nouveaux traitements sont donc nécessaires. Le projet présenté ici vise donc à évaluer de nouvelles thérapies dans un contexte le plus biologiquement pertinent grâce à nos modèles de glioblastome qui sont en quelque sorte des avatars de patients atteint de cette maladie. Ultimement, nous visons à identifier de nouveaux traitements actifs contre le glioblastome qui pourront être évalués dans le cadre d'études cliniques chez l'homme.
Procédures
Les animaux auront tous une greffe tumorale cérébrale (30minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) ou une greffe tumorale cutanée (1minute, 1x, animal anesthésié). Tous les animaux auront un suivi par prélèvement sanguin (2minutes, 28x maximum, animal vigile ou anesthésié et analgésié si l'animal est en fin de procédure) et certains par imagerie également (5minutes à 4h, 51x maximum, animal anesthésié). (MODIFICATION) Certaines imageries nécessiteront un transfert d'un établissement à un autre (transfert de 10 minutes, 1 fois, animal vigile). Une partie des animaux auront également des traitements administrés par injections simples (1min, 56x maximum, animal vigile) ou par injections nécessitant une chirurgie (30min maximum, 1x, animal anesthésié et analgésié). Les administrations pourront être couplées à une ouverture de la barrière hémato encéphalique (pour que le traitement atteigne le cerveau) (1h maximum, 8x, animal anesthésié) ou à une résection tumorale (30 minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) et;ou à de la radiothérapie (10 minutes, 1 fois, animal anesthésié).
Impact sur les animaux
La greffe de cellule tumorale induit une croissance tumorale qui peut donner des troubles neurologiques ou des difficultés de déplacement. Les chirurgies pourront engendrer une douleur modérée post opératoire ainsi que des risques d’infection. Les anesthésies peuvent engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire. Les traitements pourront avoir des effets secondaires comme des diarrhées ou des inflammations aux sites d’injection engendrant une perte de poids. Les piqûres peuvent induire une douleur légère de courte durée au point d’injection. Les prélèvements sanguins pourraient induire une douleur légère de courte durée ainsi qu’un hématome. Les imageries pourront induire un léger stress chez les animaux. (MODIFICATION) Certaines imageries devront être réalisées dans un autre établissement, les animaux pourront ressentir un stress lié au transport entre les deux établissements et aux changements d'environnement. Le phénotype dommageable des animaux immunodéficients ou immunodéprimés induit une sensibilité accrue aux infections.
Devenir
Pour toutes les procédures, tous les animaux sont euthanasiés à un temps défini (ie quelques jours/heures post traitement etc) ou dès qu’ils atteignent les points limites décrits afin de faire des prélèvements post mortem.
Remplacement
Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes. Il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro ; que ce soit par le biais de cultures de cellules tumorales issues de patients ou bien de culture 2D ou encore 3D. Ces approches in vitro sont réalisées en amont des procédures in vivo pour justifier l'intérêt scientifique. De plus, cet environnement module la biodisponibilité d’une molécule thérapeutique au sein de la tumeur. Aussi, positionner les cellules tumorales cérébrales chez l’animal, dans un microenvironnement tissulaire et moléculaire complexe (cérébral) constitue un modèle d’étude pertinent. Ce dernier se rapproche au maximum des conditions observées chez les patients souffrant de tumeur cérébrale et chez qui les cellules cancéreuses prolifèrent dans du tissu nerveux central complexe.
Réduction
4215 animaux seront utilisés dans ce projet. Les efforts fournis afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sont: i) Seuls les composés efficaces in vitro par rapport aux traitements standards, seront testés in vivo. ii) Les cellules tumorales cérébrales greffées chez l’animal sont visibles par fluorescence ce qui permet de suivre le développement tumoral, cela évite l'euthanasie à différents temps et réduit donc le nombre d’animaux utilisé (iii) La fluorescence des tumeurs permet également de suivre l’efficacité des traitements testés en temps réel ce qui apporte une information supplémentaire à la survie. (iv) Une étude statistique détermine le nombre d’animaux nécessaire minimum pour atteindre un niveau de significativité acceptable. Cela permet de limiter le nombre d’animaux et d’éviter les études ne permettant pas de répondre à une question posée par manque de puissance statistique.
Raffinement
Durant toute la durée de leur vie, les animaux sont logés en groupe afin de favoriser leur bien-être social, l’isolement étant évité autant que possible. Cette approche groupée est cruciale, car les souris, comme de nombreux rongeurs, sont des animaux sociaux et leur isolement peut entrainer un stress psychologique et des comportements anormaux. Elles sont hébergées sur des portoirs ventilés, qui permettent une circulation d'air optimale et un environnement propre. Chaque cage est équipée d’un système d'abreuvement automatique garantissant un accès constant à l’eau et d’un approvisionnement ad libitum en nourriture, ce qui répond à leurs besoins nutritionnels et hydriques tout en permettant une gestion optimale des ressources. Le milieu de vie est enrichi avec au moins deux éléments, tels que des objets manipulables ou des matériaux permettant d'explorer et de satisfaire les comportements naturels des souris, comme le grattage, le fouissage ou la nidification. Cet enrichissement environnemental est essentiel pour prévenir l’apparition de comportements stéréotypés liés à l'ennui ou au stress et pour assurer une qualité de vie optimale tout au long de l’étude. Les animaux sont suivis quotidiennement par des vétérinaires et du personnel qualifié. Lors de procédures susceptibles de provoquer des douleurs modérées à sévères, comme des interventions chirurgicales, les animaux reçoivent une anesthésie générale appropriée et en complément, un analgésique leur est administré en préopératoire et postopératoire pour prévenir toute douleur et minimiser l'inflammation. Pour prévenir les risques d'infections des souris immunodéprimées, les animaux sont hébergés dans des cages propres avec litière, aliment et enrichissement irradiés ainsi que de l'eau osmosée pour boisson. Les injections seront toujours réduite au minimum suivant le composé testé (fréquence et volume), l'alternance des sites sera privilégiée quand cela est possible et les animaux seront anesthésiés si nécessaire pour leur bien être. Un système de points limites est mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’inconfort, tant à court qu'à long terme. Ces points limites prennent en compte des critères variés : l’observation du comportement, l'aspect général de l’animal, son niveau d'activité, ainsi que son poids corporel. Si un animal présente des signes de détresse, des mesures immédiates sont prises pour garantir son confort et sa santé.
Choix des espèces
Les souris sont choisies dans nos études thérapeutiques en raison de leur petite taille et de leur poids faible. Cette caractéristique permet l’utilisation de quantités réduites de composés cytotoxiques. De plus, ces modèles permettent l’utilisation de volumes expérimentaux limités, facilitant ainsi les études tout en respectant les principes de réduction des animaux dans la recherche. Les souches de rongeurs telles que les souris immunodéficientes sont particulièrement utiles pour leur incapacité à rejeter les cellules tumorales humaines. En parallèle, les souches immunocompétentes sont indispensables pour étudier la croissance tumorale dans un contexte immunologique complet. Les modèles animaux immunodéprimés sont utiles pour explorer l’impact d’un système immunitaire humanisé dans les réponses thérapeutiques contre les cancers. Enfin, les rats, sont choisis ici pour des scénarios nécessitant une plus grande précision chirurgicale. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 mois car le glioblastome est une tumeur de l’adulte chez l’Homme.
Formation concepteur – Rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 150
Former jusqu'à vingt-quatre étudiants par an à la contention, aux injections et à la mise à mort des rongeurs : 150 souris et 150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Chaque participant manipule un seul animal par séance, une séance avec des rats et une avec des souris. Les injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intramusculaires et intraveineuses ainsi que les gavages volontaire et imposé se font sans anesthésie, sur une dizaine de minutes, les prélèvements de sang étant eux réalisés sous anesthésie. La mise à mort fait partie du programme et se prolonge par des prélèvements d'organes, le porteur écrivant qu'après un apprentissage sur maquettes, modèles en silicone et peluches, il reste "incontournable" de réaliser quelques gestes de base sur souris vigiles.
Objectifs
La formation sera conposée de séances de travaux pratiques intégrées au modules d'enseignements. Leurs objectifs seront dans un 1er temps de bien connaître les bonnes pratiques de manipulation des rongeurs, incluant l’enrichissement de leurs milieux d’hébergement. Les participants seront initiés aux principaux gestes techniques réalisés sur rats et souris (différentes méthodes de préhension et de contention dans le cadre de socialisation, pesée...). Les séances viseront également à apprendre les techniques d’administrations et de prélèvements sur animaux vigiles les mieux adaptées. La gestion de la souffrance (reconnaissance des signes) et de la douleur grâce à l’emploi adapté d’analgésiques et d’anesthésiques. Ensuite, les participants apprendront les meilleures techniques de mise à mort des animaux et à effectuer des prélèvements d’organes post-mortem. Pour ces séances, nous avons estimé qu’il serait suffisant de faire deux séances dans lesquelles chaque participant manipulera un seul animal : une séance avec rats et une séance avec souris. Etant donné l’objectif de ce projet, les tests statistiques ne sont pas nécessaires. Au cours de ce projet 24 étudiants au maximum seront formés par an.
Bénéfices attendus
Les travaux pratiques permettront l'acquisition des principaux gestes techniques dans le respect de la régle des 3 R, aux participants de notre formation concepteur de procédures expérimentales chez le rongeur.
Procédures
Toutes les administrations seront effectuées sans anesthésie (ou sur animaux vigiles), à savoir : les administrations intrapéritonéales, sous -cutanées, intra-musculaires, et intraveineuses, ainsi que les gestes de gavages volontaire et imposé (les volumes de solution de NaCl injectés lors de ces travaux pratiques seront réduits au minimum). L'ensemble dure 10 minutes. Tous les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie : le prélèvement de sang au niveau de la veine caudale chez le rat (5 minutes) et le prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire chez la souris (5 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances seront liées à l'apprentissage de la contention des animaux et de l’administration par voie orale par les apprenants pratiquant pour la premier fois ce geste avec un animal vigile. Les injections et prélevements sanguins pourront être à l’origine de douleurs légères et de courtes durées.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. De plus cela permettra de faire des prélèvements post mortem afin de compléter l’apprentissage.
Remplacement
Nous avons mis en place des méthodes alternatives pour l’anatomie (utilisation de maquette et de table numérique Anatomage), les gestes basiques (modèles en silicone, peluches pour l'apprentissage des injections et prélèvements…). Ce projet a été ainsi conçu avec le minimum possible d’animaux. Cependant, il apparaît incontournable de réaliser quelques gestes de bases sur souris vigiles dans ce contexte de formation.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux pour la formation, les apprenants auront 1 animal par TP. Nous utiliserons les animaux des 2 sexes : 3 mâles et 2 femelles souris et rats; et 2 mâles et 3 femelles souris et rats par session de TP.
Raffinement
Les animaux sont hébergées par lot dans des cages dont la taille est règlementaire, avec enrichissement modifiable (tubes, feuilles de papier ouaté, dômes…). Cet hébergement sera réalisé dans une animalerie en conditions contrôlées. Un suivi de soin journalier sera effectué durant toute la période d'hébergement. Les format.eurs.rices sont des experts en expérimentation animale, maitrisant tous les gestes basiques sur souris et les rats. Tous les gestes techniques seront appris et répétés sur des mannequins, ce qui limitera le risque de nuissance sur animaux vivant lors des séances. Le gavage sera réalisé avec des sondes souples, limitant toute nuisance. Par ailleurs les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie. En cas d'atteinte des points limites, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La Formation concepteur (Rongeurs ) demandée ici est liée à la « Formation à l’utilisation des rongeurs à des fins scientifiques – Conception et Réalisation des Procédures » que nous proposont concernent l'utilisation des rongeurs (rats et souris) majoritairement utilisés dans les laboratoires de recherche. Notre agrément de formation concernera uniquement ces 2 espèces. Les animaux seront tous adultes pour faciliter l'apprentissage des gestes techniques.
Sélection de nouvelles constructions génétiques chez la souris pour la restauration visuelle par stimulation optique ou ultrasonore.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une injection de particules virales dans les deux yeux, quatre séances d'imagerie du fond d'œil et, pour une partie, un électrorétinogramme de trente minutes, chaque acte sous anesthésie générale : 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées après treize semaines au maximum pour prélever les yeux et le cerveau. L'injection peut provoquer une hémorragie oculaire, une cataracte ou une inflammation de la rétine, et toute atteinte oculaire sévère entraîne la mise à mort de l'animal. Il s'agit de comparer des protéines sensibles à la lumière et des protéines sensibles aux ultrasons, introduites par vecteur viral, pour sélectionner des constructions génétiques candidates à une restauration de la vision. La moitié des souris appartient à une lignée mutante dont les photorécepteurs ont entièrement disparu à cinq semaines, ce qui reproduit selon le porteur les conditions de cécité étudiées.
Objectifs
Notre projet vise à mettre au point de nouvelles méthodes pour restaurer la vision chez des personnes devenues aveugles. La perte de la vue représente un handicap majeur qui réduit fortement l’autonomie. Parmi les principales causes figurent la rétinite pigmentaire et le glaucome, deux maladies pour lesquelles il n’existe pas encore de traitement permettant de retrouver une vision utile. Nous étudions deux approches innovantes et complémentaires : l’optogénétique, qui repose sur l’utilisation de protéines sensibles à la lumière, et la sonogénétique, qui utilise des protéines sensibles aux ultrasons. L’idée est de rendre certaines cellules nerveuses de la rétine réactives à ces signaux afin de restaurer la transmission d’informations visuelles au cerveau, même lorsque les photorécepteurs ont disparu. Nos expériences sont menées sur deux types de souris : une lignée non génétiquement altérée et une lignée mutante présentant une dégénérescence complète de la rétine, qui reproduit les conditions observées dans certaines formes de cécité. Nous sélectionnons différentes protéines photosensibles ou mécanosensibles, que nous introduisons dans les cellules nerveuses à l’aide de vecteurs de thérapie génique sûrs dérivés de virus. Plusieurs combinaisons sont testées afin d’identifier celles qui offrent la meilleure efficacité et la meilleure sensibilité. Enfin, nous analysons la réponse des rétines ainsi traitées pour déterminer les conditions d’activation les plus adaptées, avec l’objectif final de transférer ces stratégies vers de futures applications cliniques.
Bénéfices attendus
La rétinite pigmentaire (RP) regroupe des dystrophies rétiniennes héréditaires caractérisées par une dégénérescence progressive des photorécepteurs. Elle débute le plus souvent par une perte du champ visuel périphérique (dite vision en tunnel), pouvant évoluer vers une atteinte centrale. Sa prévalence est estimée à 1/3 000–5 000, soit environ 1,5 million de patients dans le monde, dont 30 000 à 40 000 en France. Maladie rare et génétiquement très hétérogène, la RP ne bénéficie pas encore de traitement curatif. À l’inverse, le glaucome est une neuropathie optique fréquente, caractérisée par la perte progressive des cellules ganglionnaires rétiniennes et une atteinte du nerf optique, souvent liée à une élévation de la pression intraoculaire. Il évolue silencieusement, entraînant une perte du champ visuel périphérique puis central. Principale cause de cécité irréversible, il touche environ 80 millions de personnes dans le monde, dont 1 à 1,5 million en France, avec une forte proportion de patients non diagnostiqués. L’optogénétique et la sonogénétique représentent deux pistes prometteuses pour redonner la vue à des personnes atteintes de cécité liée à des maladies de la rétine. L’optogénétique utilise des protéines sensibles à la lumière, tandis que la sonogénétique fait appel à des protéines réactives aux ultrasons. Ces approches visent à rendre certaines cellules de la rétine capables de transmettre à nouveau un signal visuel au cerveau, même lorsque les photorécepteurs ont disparu. L’optogénétique est déjà bien avancée : les premières preuves expérimentales datent de 2006 et un premier essai clinique chez l’homme a eu lieu en 2021. Ce projet s’inscrit dans cette dynamique en cherchant à améliorer ces thérapies au niveau de l’œil, tout en explorant le potentiel complémentaire de la sonogénétique. L’approche sonogénétique, développée récemment présente de nombreux avantages sur la stratégie optogénétique, notamment grâce aux évolutions conjointes des sondes d’imagerie qui permettent de stimuler en imageant les structures stimulées. Dans ce projet, nous identifions des constructions génétiques candidates (vecteurs candidats) pour des tests précliniques qui pourraient en découler. La comparaison des résultats entre stimulation lumineuse pour l’optogénétique et par ultrason pour la sonogénétique sera également un atout majeur, apportant un bénéfice direct de joindre ces tests.
Procédures
Un premier lot d’animaux non génétiquement altérés sera soumis à une chirurgie consistant en une injection intraoculaire de particules virales, réalisée sous anesthésie générale et analgésie. L’intervention, d’une durée d’environ dix minutes, sera effectuée une seule fois par animal sur les deux yeux. Ces animaux feront également l’objet de séances d’imagerie oculaire permettant l’observation du fond d’œil. Ces examens, eux aussi réalisés sous anesthésie générale, dureront environ dix minutes pour les deux yeux et seront répétés quatre fois par animal. Un second lot d’animaux mutants suivra le même protocole chirurgical, avec une injection intraoculaire de particules virales sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée d’une dizaine de minutes, réalisée une fois pour les deux yeux. Ils bénéficieront également de quatre séances d’imagerie du fond d’œil, chacune d’environ dix minutes sous anesthésie générale. Enfin, ces animaux feront l’objet d’un enregistrement de l’activité électrique de la rétine par électrorétinogramme, toujours sous anesthésie générale et analgésie, pour une durée d’environ trente minutes, effectué une seule fois pour les deux yeux.
Impact sur les animaux
L’imagerie du fond de l’œil et l’enregistrement de l’activité rétinienne par electroretinogramme comportent un risque faible de défaillance cardio-respiratoire lié à l’anesthésie. L’injection intraoculaire présente également ce risque, auquel s’ajoute la possibilité de provoquer une petite hémorragie oculaire localisée lors de l’administration du vecteur candidat. Cette hémorragie se résorbe généralement dans les 24 heures. Dans les jours qui suivent l’injection, une cataracte ou une inflammation localisée du tissu rétinien peut apparaître, cette dernière disparaissant le plus souvent en moins de quinze jours. Ces complications demeurent cependant peu fréquentes, avec une incidence inférieure à cinq pour cent. Enfin, pour les souris ayant reçu une injection intraoculaire, toute atteinte oculaire sévère, telle qu’une inflammation marquée ou un gonflement, entraînera l’euthanasie de l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié en fin de période de maintien (13 semaines au maximum) par une méthode réglementaire. Des prélèvements et analyses ex-vivo des tissus (yeux et cerveau) sont nécessaires post mortem pour les animaux inclus dans ce projet.
Remplacement
Avant toute expérimentation in vivo, des mesures de remplacement ont été mises en œuvre afin de limiter le recours aux animaux. Les séquences des vecteurs candidats ont d’abord fait l’objet d’analyses in silico approfondies afin d’évaluer leur efficacité potentielle d’expression et leur spécificité. Seules les constructions les plus prometteuses identifiées par cette étape préliminaire ont été retenues pour un passage à l’expérimentation animale, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire. Les expériences impliquant les animaux sauvage et mutant aboutissent à la collecte des rétines et du cerveau, une analyse détaillée ex vivo sera réalisée permettant d’obtenir une pré-validation des vecteurs candidats, en définissant leur efficacité fonctionnelle. Nous voulons également utiliser les tissus collectés pour la culture de coupe de cerveau ou de morceau de rétine, ce qui permettra de tester des vecteurs candidats de façon plus détaillée ou de tester d’autres constructions. Ces tests ex-vivo restent cependant limités notamment pour évaluer les capacités de traitement des vecteurs viraux. Les mécanismes physiologiques de diffusion des particules virales dans l’œil et la pénétrance de ces particules dans la rétine, ne peuvent être observés que sur un œil en fonctionnement. L’utilisation de l’animal est donc indispensable.
Réduction
Le nombre et le type de vecteurs viraux utilisés dans ce projet ont été rigoureusement optimisés en amont afin de limiter le recours aux animaux. Parmi l’ensemble des constructions génétiques théoriquement possibles, seules celles présentant un intérêt scientifique clairement établi et une pertinence démontrée ont été retenues. Cette sélection permet de réduire le nombre de conditions expérimentales testées tout en garantissant la validité des résultats obtenus. Ainsi, le protocole proposé repose sur un choix restreint mais justifié de vecteurs, évitant toute utilisation superflue et respectant les principes de réduction et de raffinement de l’expérimentation animale. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables et répondre aux objectifs scientifiques. Ce nombre a été calculé à partir d’études précédentes et confirmé par des méthodes statistiques permettant de s’assurer que les résultats auront une valeur scientifique solide. Concrètement, cela signifie que nous avons choisi la plus petite taille de groupe possible tout en garantissant que les conclusions soient robustes et interprétables. Au total, nous prévoyons d’utiliser 480 souris non génétiquement altérées et 480 souris présentant une mutation spécifique.
Raffinement
Les animaux venant de l’extérieur passeront une période d’adaptation d’au moins 5 jours. Ils seront logés dans des cages équipées de matériel d’enrichissement, avec nourriture et eau disponibles en permanence. La température et l’humidité de la salle seront maintenues stables. Nous utilisons de la litière de peuplier dépoussiérée afin de limiter les irritations possibles des yeux. Lors des séances d’imagerie, les animaux recevront une anesthésie par gaz. Pour les enregistrements d’électrorétinogramme, une anesthésie locale de la cornée sera ajoutée, et les animaux seront installés sur une table chauffante. La chirurgie d’injection dans l’œil sera réalisée dans des conditions stériles, avec les animaux placés sur un tapis chauffant. Ils recevront une anesthésie générale (par gaz) et locale (sur la cornée), ainsi qu’un traitement antidouleur à base d’opioïdes. Après la chirurgie, une surveillance quotidienne renforcée sera mise en place grâce à une signalisation spécifique. Des critères précis permettront de définir des points limites pour assurer le bien-être des animaux
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle expérimental car elle est largement utilisée pour l’étude du système visuel et validée pour explorer la perception sensorielle ainsi que le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce projet, deux modèles complémentaires seront employés : l’un avec une rétine intacte et fonctionnelle, l’autre présentant une dégénérescence complète des photorécepteurs, reproduisant ainsi la situation rencontrée chez l’humain dans certaines maladies rétiniennes responsables de cécité. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de cinq semaines, moment où les structures cérébrales et rétiniennes ont atteint leur maturité fonctionnelle. Chez les modèles dégénérés, ce stade correspond à la perte complète des photorécepteurs, ce qui garantit la pertinence de leur utilisation pour reproduire les conditions de cécité étudiées.
Implication de la voie de signalisation Hippo dans la radiorésistance de métastases cérébrales d’origine bronchique.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Pour comprendre pourquoi les métastases cérébrales d'origine bronchique résistent à la radiothérapie, 180 souris immunodéprimées de souche Nude vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever le cerveau et la tumeur. Des cellules tumorales humaines leur sont implantées dans le cerveau au cours d'une chirurgie de trente minutes, suivie de deux séances d'IRM par semaine sous anesthésie et, pour quatre-vingt-dix d'entre elles, de trois séances d'irradiation en trois jours. L'irradiation cérébrale entraîne une fatigue et une dégradation de l'état général jusqu'à une semaine après, avec porphyrine autour des yeux et de la bouche et pelades sur la tête. Perte de poids, de motricité et de sensibilité constituent les points limites, et le porteur indique avoir adapté la surveillance pour "anticiper et éviter l'exclusion des animaux par atteinte de points limites".
Objectifs
Ce projet a pour but de caractériser l’effet d’une inhibition de la voie Hippo sur l’irradiation des tumeurs cérébrales d’origine bronchique, décrites dans la littérature comme résistantes à la radiothérapie (RT) actuelle. En effet une inhibition de cette voie de signalisation permettrait d’élucider son implication dans l’inefficacité des traitements actuels tels que la RT. Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer les connaissances des phénomènes de radiorésistance de ces tumeurs et l’implication de la voie de signalisation. L’étude de tumeurs humaines implantées dans des souris immunodéprimées permettront un modèle plus similaire aux cas cliniques. Cibler la voie Hippo en parallèle de la RT pourrait améliorer la prise en charge des patients et leur taux de survie.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques d’irradiation des métastases cérébrales d’origine bronchiques actuelles en ciblant la voie de signalisation hippo.
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, tous les animaux sont concernés. -Imagerie (IRM pour suivi de la taille tumoral, sous anesthésie générale) : 2 séances par semaine à partir d’une semaine post chirurgie : 3 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances sur 3 jours consécutifs : 12 minutes maximum par animal, 90 animaux sont concernés. - Injection sous-cutanée d'analgésique (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur. Toutefois, ces critères représentent les points limites de l’étude et ainsi si l’un de ces éléments apparait, les animaux concernés seront mis à mort. Nous nous attendons également à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation. Nous avons adapté en conséquence le suivi des animaux, le raffinement des conditions expérimentales et le scoring afin d’anticiper et d’éviter l’exclusion des animaux par atteinte de points limites. A chaque sortie des animaux de la zone protégée, lors des séquences d’imagerie par IRM, un risque d’infection ou de contamination par les autres animaux n’ayant pas un phénotype dommageable existe.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de prélever le cerveau et la tumeur pour analyses post-mortem (totale de 180 animaux).
Remplacement
Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses à la RT. Ce projet intervient après plusieurs études in vitro ayant permis de montrer les effets de l’irradiation sur la voie de signalisation Hippo mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive (IRM) se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est, dans ce cas, son propre contrôle et permet de réduire drastiquement le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 15 animaux par groupe sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants et ainsi comparer les effets des différentes expressions de la voie Hippo, en fonction du temps. Ces 15 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux basés sur nos travaux antérieurs. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculés est un nombre maximal. Grâce notamment aux études en imageries qui sont quantitatives, nous réaliserons des analyses séquentielles. Ainsi, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux immunodéprimés seront placés en groupe sociaux dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques (portoirs Innovive) répondant aux normes européennes, ces derniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiés à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation (minimum 7j) et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Toutefois, dans tous les protocoles d’imagerie, d’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, ce qui entraine une hypothermie et une déshydratation des membranes qui sont contrés par l’application de vitamine A sur les membranes et l’utilisation de couvertures chauffantes thermorégulées .
Choix des espèces
Les souris immunodéprimées sont l’espèce de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Les souris immunodéprimées retenues pour réaliser ce travail sont la souche Nude. Cela permet l’implantation de xénogreffes humaines sans prendre le risque du rejet. Cependant, le système immunitaire est encore capable de produire des cellules permettant de se rapprocher d’un micro-environnement plus représentatif de la situation clinique. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.
Test de stratégies expérimentales permettant de prévenir les troubles moteurs et cognitifs dans un modèle murin de paraplégie spastique héréditaire MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les souris porteuses de deux copies du gène muté développent des difficultés locomotrices, une prostration et une perte de poids à partir de seize mois, un phénotype que le porteur réserve aux lots expérimentaux. 3 086 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la quasi-totalité et modéré pour quarante d'entre elles. Le génotypage passe par le prélèvement de l'extrémité de la queue, puis viennent un traitement de sept mois incorporé aux croquettes ou un gavage unique de la mère gestante. Suivent trois séries de deux tests comportementaux, un test de mémoire répété cinq jours et un test de coordination motrice répété trois jours, et pour un groupe jusqu'à quatorze prélèvements de sang sous anesthésie toutes les deux semaines. Les couples reproducteurs sont tués dès que leur reproduction baisse, les autres à la fin de chaque procédure pour récupérer des tissus ou prélever des embryons.
Objectifs
Les paraplégies spastiques héréditaires sont des maladies neurodégénératives d’origine génétique caractérisées par une mort neuronale, mais aussi parfois des troubles de développement du cerveau. Ces maladies sont très hétérogènes et sont causées par des mutations dans environ 80 gènes différents. Elles touchent environ 3 personnes sur 100.000 en Europe, avec un début généralement à l’âge adulte mais qui peut apparaitre dans l’enfance. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour la prise en charge de ces pathologies. Nous travaillons sur une des formes les plus fréquentes de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles de développement du système nerveux. Nous utiliserons un modèle animal (souris) pour cette forme de paraplégie spastique héréditaire. Nous avons déjà montré que ce modèle présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau et il récapitule les principaux signes observés chez les patients. L’objectif du projet est de mieux caractériser les différentes étapes d’évolution de la maladie, de son développement à la mort neuronale, et d’évaluer dans un modèle animal des stratégies thérapeutiques qui pourraient permettre de prévenir l’apparition des symptômes et la mort neuronale. MODIFICATION : l’allongement du temps de maintien des animaux de 8 à 12 mois implique l’ajout de tests comportementaux et d’un prélèvement sanguin ce qui nécessite une modification du projet initial sans ajout d'animaux.
Bénéfices attendus
Nous travaillons sur une des formes les plus fréquente de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles du neurodéveloppement et actuellement aucun traitement ne peut être proposé aux patients. Un premier aspect du projet permettra de tester l’efficacité de deux médicaments sur la mort neuronale dans le modèle animal de la maladie. Si nous pouvons démontrer qu’au moins un de ces deux médicaments retarde la mort neuronale, notre projet pourrait permettre d’avancer vers une stratégie thérapeutique pour les patients atteints de cette paraplégie spastique héréditaire. Par ailleurs, nous savons que la maladie que nous étudions est associée à de légers défauts de développement du cerveau, mais nous ne savons pas si, et dans quelle mesure, ces défauts participent à l’apparition des symptômes de la maladie. Notre projet pourrait permettre de répondre à cette question. Comme le diagnostic des patients a généralement lieu à l’adolescence, après la phase de développement, la compréhension du rôle du développement permettra de mieux expliquer la maladie aux patients et d’améliorer leur prise en charge.
Procédures
La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un petit prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué sur les jeunes animaux. Cet acte sera réalisé rapidement (moins d’une minute par animal) et une seule fois sur chaque animal. Nous réaliserons des traitements pour évaluer leur impact sur l’évolution de la maladie. Une approche sera un traitement chronique pendant 7 mois qui sera administré par incorporation dans les croquettes pour éviter des gestes invasifs. Une autre approche sera une administration unique par gavage de la mère gestante à un moment précis du développement embryonnaire (une fois, inférieur à une minute). Une partie des animaux sera soumise à trois séries de 2 tests comportementaux sur des animaux vigiles (à l’âge de 6 semaines, 4 mois et 8 mois, ou 4 mois, 8 mois et 12 mois). Le premier test est répété pendant 5 jours et vise à étudier les troubles de la mémoire (3minutes maximum par session, 2 fois 5 jours) ; le second test est répété pendant 3 jours et vise à tester la coordination motrice (5 minutes maximum par session, 5 fois 3 jours). A l’issue de chaque série de tests comportementaux, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie générale (3 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement). Un groupe d’animaux sera soumis à des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie générale toutes les 2 semaines (14 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement) L’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire en fin de procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour le génotypage peut générer une légère douleur chez l’animal et un risque rare de saignement. Pour l’étude de l’effet thérapeutique de médicaments, des effets secondaires (diarrhées, perte de poids) pourraient être associés au traitement. Pour l’étude sur la contribution du développement à la maladie, nous administrerons un médicament par gavage, ce qui peut générer une gêne et un inconfort et des effets indésirables liés à la molécule administrée. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. Les prélèvements de sang peuvent générer un stress, une douleur et un inconfort lié à la piqûre, et leur répétition peut engendrer une déshydratation. Il existe un risque d’hématome après le prélèvement. L’anesthésie générale mise en place pour les prélèvements sanguins sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque rare de dépression cardiorespiratoire. La mutation génétique portée par les souris porteuses de 2 copies du gène muté peut générer des souffrances après de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.
Devenir
Les couples ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem ou prélever des embryons.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons dans la mesure du possible des modèles in vitro qui évitent l’utilisation d’animaux. En effet, nous utilisons des modèles in vitro qui miment le développement du cerveau et qui permettent de répondre à certaines questions sur la contribution de ce développement sur la maladie que nous étudions. Cependant ce modèle in vitro ne permet pas de répondre à toutes les questions car : (i) le comportement des neurones diffère selon leur environnement in vitro et in vivo ; et (ii) la mise en place de l'organisation du cerveau ne peut pas être reproduite in vitro. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de mener des expériences comportementales. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable pour notre projet, mais nous utiliserons le modèle in vitro dès que possible afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans le cadre de la maladie que nous étudions, il existe un modèle de souris permettant d’évaluer les différents aspects que nous souhaitons étudier dans ce projet et ainsi obtenir des données transposables chez l’homme. L’étude de l’effet thérapeutique de médicaments sur les symptômes de la maladie ne peut se faire que sur un modèle animal et ne peut pas être remplacé par un modèle in vitro. De même, l’étude de l’influence d’un développement anormal sur l’organisation du cerveau adulte et ses conséquences comportementales ne peut se faire qu’avec des modèles animaux. Il n’existe pas de méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettent d'étudier le développement du cerveau et ses effets sur des troubles moteurs et cognitifs. Ces éléments rendent l’utilisation de l’animal indispensable pour notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte la lignée de souris génétiquement modifiée nécessaire à l'étude et en réduisant au plus le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables et valides. Nous affinerons les analyses statistiques en fonction de données à analyser. De plus, afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. En nous basant sur nos études précédentes, nous estimons qu’il nous faudra de 8 à 20 animaux par groupe en fonction des analyses à réaliser. Ainsi, au total, nous estimons qu’il faudra 3086 animaux pour obtenir des résultats significatifs dans ce projet. Toutefois, si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux, tous ne seront pas utilisés, ni produits. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour nos lots expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce et seront observés quotidiennement. Les animaux que nous utilisons sont génétiquement modifiés. Comme seules les souris porteuses de 2 copies du gène muté présentent un phénotype dommageable, nous privilégierons un schéma de croisement permettant de limiter le risque d’expression du phénotype dommageable seulement aux animaux nécessaires pour les lots expérimentaux. Le maintien de la lignée privilégiera les animaux avec une seule copie du gène muté. Les animaux porteurs de 2 copies du gène muté seront particulièrement surveillés pour détecter tout signe précoce d’expression du phénotype dommageable, notamment des difficultés locomotrices et une prostration qui sont 2 signes caractéristiques liés à la mutation. La biopsie pour génotypage sera la plus petite possible et réalisée sur un animal jeune (cicatrisation rapide). Il s’agit d’un geste rapide, réalisé au calme et parfaitement maitrisé. Pour le maintien de notre lignée, afin d’éviter toute dérive génétique, toutes les 10 générations, nous croiserons notre lignée de souris avec des souris sauvages provenant d’un élevage extérieur. Les souris qui recevront des traitements à visée thérapeutique seront traitées à des doses déjà utilisées dans des publications et n’entrainant pas d’effets délétères. Ces souris seront néanmoins surveillées dans les jours qui suivent l’intervention pour vérifier qu’elles continuent à s’alimenter. De plus, les traitements chroniques seront administrés par incorporation à la nourriture afin de diminuer la manipulation des animaux. Pour réduire le stress en lien avec les prélèvements de sang ils seront réalisés sous anesthésie générale. Pour les animaux soumis à des prélèvements répétés, après chaque prélèvement une injection de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir toute déshydratation. Des points limites spécifiques à chaque procédure sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris afin qu’elle se fasse sans douleur et sur un animal pré-sédaté.
Choix des espèces
Dans le projet, nous utiliserons un modèle de souris déjà caractérisé et qui récapitule les principaux symptômes observés chez les patients atteints de la forme de maladie que nous étudions. L’étude de ce modèle nous permettra donc d’obtenir des données transposables chez l’homme. Le modèle de souris utilisé présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau. Ce modèle est donc parfaitement adapté pour répondre à notre question scientifique, et il est impossible de répondre à cette question sans l’utilisation d’un modèle animal. Afin d’étudier les différentes composantes de la maladie et l’impact d’un traitement à différents âges sur son évolution, nous étudierons des animaux à partir du stade embryonnaire jusqu’à l’âge de 12 mois. La mutation génétique des animaux sera vérifiée à l’âge de 7 à 10 jours.
Développement d’un antigène universel comme cible pour l’immunothérapie dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Incision d'un centimètre à l'abdomen ou au crâne sous guidage stéréotaxique, injection de cellules tumorales, suture par clips retirés sept à quatorze jours plus tard sous une nouvelle anesthésie : 696 souris passent par cette chirurgie. 796 souris en tout vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une centaine d'entre elles développant spontanément des tumeurs mammaires vers vingt-quatre semaines. Il s'agit de faire exprimer aux cellules cancéreuses un antigène synthétique, un drapeau artificiel que des anticorps ou des macrophages génétiquement modifiés viendraient reconnaître, sur des protocoles pouvant durer huit mois. Le porteur écrit que l'isolement des animaux sera évité, puis qu'un isolement temporaire pourrait être envisagé si les clips de suture provoquent des comportements agressifs entre souris.
Objectifs
Ce projet vise à développer une nouvelle approche d’immunothérapie contre le cancer, capable de s’attaquer à un grand nombre de tumeurs solides, en contournant l’une des principales limites actuelles : la variabilité des antigènes tumoraux d’un patient à l’autre, voire au sein d’une même tumeur. Notre idée repose sur l’introduction dans les cellules cancéreuses d’un antigène synthétique, une sorte de « drapeau » artificiel qui signale la cellule cancéreuse au système immunitaire. Ce marquage pourrait ensuite être reconnu par des traitements immunothérapeutiques spécialement conçus pour cibler cet antigène. Le projet se structure autour de trois axes complémentaires : 1. Création de modèles de tumeurs exprimant l’antigène synthétique Nous développerons des lignées de cellules tumorales murines, notamment de cancer du sein et de tumeurs cérébrales (gliomes), modifiées pour exprimer cet antigène à leur surface. Ces lignées seront ensuite utilisées dans des souris avec un système immunitaire fonctionnel, afin d’étudier si le système immunitaire est capable de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses ainsi marquées. 2. Utilisation de vecteurs viraux pour délivrer l’antigène dans les tumeurs Nous utiliserons des petits virus à ADN non pathogènes, déjà bien connus pour leur sécurité, pour introduire le gène de l’antigène synthétique directement dans les cellules tumorales. Ces virus seront conçus pour cibler uniquement les cellules cancéreuses, grâce à des systèmes de régulation activés spécifiquement dans l’environnement tumoral. L’objectif est de garantir une expression du marqueur uniquement dans la tumeur, sans affecter les tissus sains. 3. Développement de traitements ciblés contre cet antigène Enfin, nous concevrons deux types d’immunothérapies ciblant spécifiquement cet antigène : des anticorps thérapeutiques, et des macrophages génétiquement modifiés (CAR-M). Ces cellules modifiées seront capables de reconnaître, attaquer et éliminer les cellules cancéreuses marquées, tout en stimulant une réponse immunitaire plus large contre la tumeur.
Bénéfices attendus
Ce projet représente une avancée majeure dans le développement d’une nouvelle immunothérapie capable de cibler spécifiquement les tumeurs solides du sein et du cerveau, en combinant l’utilisation d’un antigène synthétique, de vecteurs viraux adaptés et de traitements innovants tels que les anticorps thérapeutiques et les macrophages génétiquement modifiés (CAR-M). À court terme, il permettra de surmonter les limites des thérapies actuelles en offrant une méthode plus efficace et sécurisée pour éliminer les cellules tumorales, tout en limitant les effets sur les tissus sains. À plus long terme, cette approche pourrait être étendue à d’autres types de cancers solides, élargissant ainsi son impact thérapeutique. Par ailleurs, le projet vise à établir un protocole robuste pour l’intégration de cette stratégie dans les traitements cellulaires de nouvelle génération, améliorant la précision et la sécurité des immunothérapies. Enfin, si les résultats précliniques sont prometteurs, ce travail ouvrira la voie à une première application clinique, offrant une nouvelle option aux patients souffrant de tumeurs résistantes et contribuant ainsi à améliorer significativement leur prise en charge.
Procédures
Le projet se déroulera en 5 parties dont plusieurs étapes sont communes. Une partie des animaux (696 souris) sera pesée (1 min) puis recevra une injection d'anti-douleur (30 sec) avant d'être anesthésiée par voie gazeuse (durée anesthésie : 20 min). Sous anesthésie, une incision de 1 cm maximum sera réalisée au niveau de l'abdomen (348 animaux) ou du crâne à l'aide d'un appareil de guidage spécifique (348 animaux) (durée : 1 min). Des cellules tumorales seront alors injectées au niveau du site (1min) et une suture sera réalisée au moyen de clips (1 min). Les clips seront retirés après cicatrisation (7 à 14 jours) sous anesthésie gazeuse (durée : 5 min). Pour les modèles cérébraux (348 animaux), un système de canule de traitement sera mis en place afin de limiter de multiples interventions chirurgicales pour le traitement des tumeurs. Le poids des souris sera évalué 2 fois par semaine (1 min) et la croissance des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine au moyen d'un pied à coulisse (348 animaux ; 2 min) ou par imagerie sous anesthésie (348 animaux ; durée anesthésie : 20 min). Pour l'imagerie, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et maintenus sous anesthésie à l’aide d’un masque. Ils recevront ensuite l’injection d’une molécule permettant la réalisation de l’imagerie (durée : 30 sec). Dans les parties 1 et 2, 32 animaux recevront un traitement dans leur eau de boisson. Dans les parties 3, 4 et 5, une semaine après l'injection des cellules tumorales, 536 animaux recevront 1 à 2 injections de petits virus à ADN non pathogènes ou d’immunothérapies espacées de 4/5 jours (durée : 1 à 6 min) au niveau de la tumeur ou par voie générale. Pour 250 souris, cette injection se fera sous anesthésie gazeuse (durée 20 min). En parallèle, nous utiliserons dans la partie 5, des animaux (100 souris) développant spontanément des tumeurs au niveau mammaire à 24 sem. d'âge environ. Le poids des souris sera évalué 2 fois /semaine (1 min) et la croissance des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine avec un pied à coulisse (2 min). Ces animaux recevront 1 à 2 injections de petits virus à ADN non pathogènes ou d’immunothérapies espacées de 5 jours (durée : 1 à 6 minutes) au niveau de la tumeur. Les animaux seront surveillés quotidiennement selon des critères précis. Au moindre signe de souffrance, les animaux seront mis à mort selon la méthode réglementaire définie (durée max des procédures : 8mois).
Impact sur les animaux
Les procédures que nous prévoyons de réaliser pourraient être à l’origine d’un stress lié à la manipulation. De plus, le développement de tumeurs sur l’abdomen de l’animal ou au niveau de la zone subventriculaire du cerveau des animaux pourrait être à l’origine d’une faible gêne de la mobilité ou encore une potentielle perte de poids de l’animal. L’étape initiale d’injection des cellules nécessitant une anesthésie gazeuse, les animaux pourraient souffrir de stress au cours de cette manipulation qui serait de quelques minutes (2 ou 3 minutes jusqu’à l’anesthésie complète). Les pesées et mesures de masse tumorale pourront également conduire à un stress léger de courte durée (1 minute) répété deux fois par semaine. Malgré les précautions prises, l’utilisation de clips pour la suture des animaux après injection des cellules cancéreuses pourrait provoquer un inconfort ou des comportements agressifs inter-individuels jusqu’à la cicatrisation complète (5 à 7 jours). Dans ce cas, un isolement temporaire pourrait être envisagé après avis de la structure de Bien-être des Animaux et en accord avec les recommandations ministérielles. Les cellules injectées conduisant à la croissance tumorale et potentiellement à la dissémination de métastases, cette dernière pourrait avoir un effet sur le comportement des animaux qui sera étroitement surveillé.
Devenir
À l’issue des procédures expérimentales prévues dans ce projet, tous les animaux seront mis à mort selon les normes éthiques en vigueur, afin de limiter toute souffrance inutile et de permettre la récupération des tissus pour analyses scientifiques. La mise à mort interviendra soit à la fin du protocole expérimental planifié, soit de manière anticipée si des signes cliniques de souffrance, de détresse ou de dégradation de l’état général sont observés.
Remplacement
Dans un modèle cellulaire, nous avons développé l’antigène synthétique et confirmé son adressage à la membrane plasmique des cellules cancéreuses mammaires et de gliome par différentes techniques. Nous avons également établi des lignées cellulaires stables exprimant l’antigène synthétique, ainsi que des lignées à expression qui peut être induite. Ces cellules ont été cultivées dans des conditions avec très peu d’oxygène et l’expression de l’antigène a été vérifiée à l’aide des mêmes techniques. Par ailleurs, des co-cultures ont été réalisées entre les cellules cancéreuses exprimant l’antigène synthétique et les macrophages CAR évaluant ainsi leur capacité à reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Ces résultats confirment la pertinence de poursuivre par des études dans un modèle animal, essentielles pour valider nos hypothèses dans un environnement biologique plus complexe et pour développer de nouvelles stratégies d’immunothérapie.
Réduction
Nous avons mis en œuvre plusieurs stratégies pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant des résultats robustes et statistiquement significatifs. Tout d’abord, des expérimentations préliminaires dans des cellules ont permis de sélectionner l’antigène synthétique optimal et les conditions optimales pour l’efficacité des immunothérapies (macrophages CAR et anticorps thérapeutiques). Ces études incluent le développement et l’analyse de lignées cellulaires stables ou pouvant être induites ainsi que des co-cultures pour valider les interactions immunitaires. Ensuite, les calculs de puissance statistique ont été réalisés pour minimiser le nombre de souris nécessaires par groupe tout en assurant une détection fiable des différences biologiques. Enfin, des techniques avancées comme la cytométrie en flux et l’imagerie par bioluminescence seront utilisées pour maximiser les données obtenues à partir de chaque animal, réduisant ainsi le besoin d’augmenter les cohortes. Ces approches permettent de réduire au strict minimum le nombre d’animaux respectant ainsi le principe des 3R, sans altérer la robustesse de nos résultats.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi (maison, carré de coton, copeaux de cartons...) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). L’isolement d’animaux sera évité. Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Afin de prévenir le stress des animaux lié à la manipulation par l’expérimentateur, les souris seront préalablement habituées à la présence de l’expérimentateur et à leur manipulation par l’humain. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance lié au score observé sur la grille d’évaluation de la douleur, un traitement analgésique sera envisagé jusqu’à disparition des signes de souffrance. Des points limites à ne pas dépasser ont été définis préalablement au projet et l’atteinte de l’un d’entre eux ou l’inefficacité du traitement analgésique conduirait à la mise à mort immédiate des animaux selon la méthode définie. Ces points limites comportent notamment toute blessure de la tumeur mais aussi toute atteinte aux libertés fondamentales de l’animal (telles que la gêne au déplacement, à la posture, à l’expression d’un comportement normal ou la présence de souffrance et/ou de détresse chez l’animal) Le poids des souris sera évalué deux fois par semaine. Une perte de poids de plus de 15% constatée et maintenue sur plus de 72h conduira à la mise à mort de l’animal. La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines, car à cet âge leur système immunitaire est pleinement développé. Cela est essentiel pour notre projet, qui étudie des traitements agissant via le système immunitaire pour éliminer les cellules cancéreuses. Le choix de la souris comme espèce repose sur plusieurs raisons : ● Tout d’abord, les cellules cancéreuses utilisées dans notre étude proviennent de souris. Il est donc logique et scientifiquement cohérent d’utiliser un modèle murin pour garantir une compatibilité biologique. ● Par ailleurs, la souris est l’un des modèles les plus utilisés en recherche sur le cancer, car elle présente de nombreuses similitudes avec l’humain en ce qui concerne le développement des tumeurs et la réponse immunitaire.
Evaluation de la tolérance et de la sécurité d’un candidat vaccin contre la fièvre jaune chez la souris gestante A129 MODIFICATION
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Les souris A129 portent une mutation qui les prive d'une partie de leur réponse interféron, ce qui les rend plus sensibles aux infections virales et permet de détecter le vaccin dans leur sang. 3 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la plupart et modéré pour cent d'entre elles, la modification du projet ajoutant 160 femelles pour atteindre le nombre de gestations attendu. Mises à l'accouplement puis contrôlées chaque jour, les femelles gestantes reçoivent une injection sous-cutanée unique d'un candidat vaccin contre la fièvre jaune, suivie de prélèvements de sang sous anesthésie sans réveil. Après la mise à mort des mères, une césarienne permet d'examiner les portées, les fœtus étant séparés puis tués quelques minutes plus tard, couverts d'un tissu doux censé mimer un nid pour limiter le stress de la séparation.
Objectifs
MODIFICATION L’objectif de ce projet est la réalisation d’une étude réglementaire de toxicologie de la reproduction chez la souris immunodéprimée (souris A129). Cette étude consiste en l’administration unique du produit à tester (nouveau vaccin contre la fièvre jaune) suivie d’observations régulières des animaux, pesées corporelles, évaluation des portées, analyse macroscopique, évaluation de l’immunogénicité et de la virémie du produit. Cette étude permettra d’accéder aux essais cliniques afin de confirmer la sécurité et l’efficacité du produit chez l’Homme avant d’obtenir l’autorisation de mise sur le marché. POUR ATTEINDRE LE NOMBRE ATTENDU DE GESTATION, UNE MODIFICATION DU PROJET AVEC L’AJOUT DE 160 FEMELLES NECESSITE UNE NOUVELLE AUTORISATION DE PROJET
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - la détermination de la tolérance et de la sécurité d’un vaccin chez l'animal - l'obtention de l'autorisation d'essai clinique et la réalisation d'essai clinique chez l'homme avec le maximum de sécurité pour les personnes incluses - à long terme la mise sur le marché d’un vaccin présentant moins d’effets indésirables que celui déjà sur le marché.
Procédures
MODIFICATION La procédure consiste en l’administration unique d’un vaccin à tester (et vaccins de référence) par voie sous cutannée pendant la gestation. LES ANIMAUX SERONT MIS EN ACCOUPLEMENT AU PREALABLE POUR INDUIRE UNE GESTATION ET UNE VERIFICATION DE L’ACCOUPLEMENT SERA FAIT QUOTIDIENNEMENT. La durée de l’administration est rapide, généralement de quelques secondes. Les administrations sont suivies de prélèvements de sang pour mesurer la virémie et l’immunogénicité (collectés sur animaux anesthésiés et sans réveil). Après euthanasie des mères, une césarienne sera faite pour évaluer le développement morphologique des portées. Les fœtus seront donc séparés de leur mère pendant un temps court (quelques minutes) avant leur euthanasie.
Impact sur les animaux
MODIFICATION La procédure consistant en l’administration unique d’un candidat vaccin par voie sous cutanée, des effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration du candidat médicament à tester (perte de poids transitoire, diminution d’activité transitoire, hypertermie transitoire, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). IL N’EST PAS ATTENDU D’EFFET INDESIRABLE SUITE A L’ACCOUPLEMENT DES ANIMAUX ENTRE EUX. DES EFFETS PHYSIOLOGIQUES LEGERS (MODIFICATION DU CYCLE OESTRAL) PEUVENT ETRE OBSERVES SUITE A LA VERIFICATION DE L’ACCOUPLEMENT.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes, de sang ou de tissus (examens macroscopiques et examens fœtaux) tels que requis par la réglementation.
Remplacement
A ce jour, il n’existe pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux qui permettent de déterminer la toxicité de substances sur un organisme entier, ni de déterminer sa distribution et la dose sans effet adverse. Dans ces études sur le développement embryo-fœtal, un relevé de poids, des signes cliniques et une évaluation macroscopique des organes ainsi que l’évaluation des fœtus et de leur developement est requise. Il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les lignes directrices en vigueur (ICH S5R3).
Réduction
MODIFICATION Le nombre d’animaux par groupe ou sous groupe (jusqu’à 104, INCLUANT LES animaux principaux et LES animaux dédiés aux prises de sang et/ou d’embryons en fonction des groupes et du taux d’accouplement ou de gestation) est établi au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des lignes directrices en vigueur (ICH S5R3), des objectifs de l’étude et du nombre de produits administrés (1 contrôle, 1 candidat vaccin et 2 vaccins de référence). Une seule dose sera testée pour chaque composé (dose humaine ou inférieure) et sera administrée en début de gestation ou en millieu de gestation (groupe control et candidat vaccin uniquement).
Raffinement
Pour améliorer leur bien être, les souris seront hébergées dans des cages sur fond plastique et sur de la litière avec un enrichissement adapté (papier kraft, batonnet de bois, cocon et mouchoir en papier) en portoirs ventillés pour limiter le risque d’exposition à des agents pathogènes. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week-end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques ayant des répercussions importantes sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire. Le volume d’administration et de prélèvement de sang de cette étude se basent sur les recommandations éthiques. Après la césarienne, les fœtus seront couverts par un tissu doux avant l’euthanasie pour mimer un nid et limiter le stress physique lié à la séparation de la mère.
Choix des espèces
La souris est une espèce rongeur acceptée par les agences réglementaires. Le choix des souris transgénique de souche A129 a été est fait en fonction de critères scientifiques précis. Cette souche qui exprime une mutation sur certains interférons qui permet de détecter le vaccin dans le sang après administration d’un vaccin antiviral prophilactique, au contraire des rats et des souris wild-type. Elle est plus sensible aux infections virales car la mutation entraine des déficiences immunitaires facilitant une réplication virale sans complètement annuler la réponse immunitaire. Le virus de la fièvre jaune et son vaccin utilisant les interférons, l’utilisation de ces souris permet une meilleure exposition au vaccin. Les animaux utilisés dans l’étude seront des femelles sexuellement matures et accouplées par le fournisseur d’animaux et leurs petits.
Utilisation à visée thérapeutique de bactéries pour induire des structures lymphoïdes tertiaires dans des modèles murins de cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 598 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent des cellules tumorales qui forment des tumeurs du poumon, jusqu'à quatre injections de bactéries, jusqu'à six injections d'anticorps et, pour les porteuses de tumeurs, une à deux séances d'imagerie sous anesthésie par semaine pendant trois à cinq mois. Le porteur indique que les bactéries peuvent provoquer une douleur modérée et une difficulté à se mouvoir et à s'alimenter, et que les tumeurs peuvent entraîner douleur, perte de poids et réduction de la mobilité, les souris atteignant un point limite étant alors tuées. Le but est de savoir si ces bactéries font apparaître dans les tumeurs des amas de cellules immunitaires qui renforceraient les immunothérapies, et le porteur qualifie la souris de "modèle nécessaire et indispensable" pour les étudier.
Objectifs
Les immunothérapies, notamment les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ou ICI), ont révolutionné le traitement de plusieurs cancers solides, dont le cancer du poumon. Cependant, seuls jusqu'à 40 pour cent des patients atteints d'un cancer du poumon obtiennent une réponse après traitement par ces immunothérapies. Des recherches récentes ont montré que la présence, dans les tumeurs, de petits groupements de cellules immunitaires appelés "structures lymphoïdes tertiaires" (ou TLS) est liée à une meilleure réponse à ces traitements. Ces structures se forment en cas d’inflammation et disparaissent une fois l’inflammation résolue. Il a été récemment montré qu’une molécule, issue de certaines bactéries, pouvait provoquer l’induction de TLS dans les poumons de souris. Ce projet vise donc à tester si certaines bactéries peuvent, elles aussi, induire la formation de ces structures, et si cela améliore l’efficacité des immunothérapies dans des modèles murins de cancer. Nous chercherons aussi à comprendre les mécanismes impliqués dans la formation et la maturation des TLS, dans l’objectif, à long terme, de développer de nouvelles stratégies pour renforcer l’efficacité des traitements chez les patients atteints de cancer.
Bénéfices attendus
En France, le cancer du poumon touche plus de 50 000 personnes chaque année et est responsable de près de 33 000 décès. Il représente également un coût économique majeur estimé à plus d’un milliard d’euros par an pour le système de santé. Malgré les avancées en immunothérapie, notamment avec les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ICI), seulement environ 40 pour cent des patients atteints d’un cancer du poumon répondent favorablement à ces traitements. Ce projet vise à renforcer l’efficacité des immunothérapies. Il reposera sur un modèle de cancer du poumon chez la souris, dans lequel des bactéries seront administrées soit à titre préventif (comme une vaccination), soit à titre curatif (après l’apparition de la tumeur). L’objectif est d’évaluer leur capacité à induire des structures immunitaires dans les tumeurs, appelées structures lymphoïdes tertiaires (TLS), et à améliorer la survie des souris. Le projet permettra de déterminer : 1) si ces bactéries améliorent la survie des souris et induisent la formation de TLS ; 2) si l’effet thérapeutique de ces bactéries est dû à la formation des TLS ; 3) les mécanismes immunitaires à l’origine de l’effet thérapeutique de ces bactéries 4) les mécanismes immunitaires à l’origine de l’induction et de la maturation de TLS. Les résultats de ce projet pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteints de cancer, soit en utilisant directement ces bactéries comme traitement, soit en développant de nouvelles molécules capables de stimuler la formation de TLS dans les tumeurs. Cette approche pourrait s’appliquer non seulement au cancer du poumon, mais aussi à d’autres types de cancers dans lesquels la présence de TLS est associée à un meilleur pronostic
Procédures
Les animaux seront soumis à : des injections pour administrer les cellules tumorales (animal vigil ou anésthésié, 1 à 2 fois, 1 minute), des injections pour administrer les bactéries (animal vigil, 1 à 4 fois, 1 minute), un suivi par imagerie (animal anesthésié, 1 à 2 fois par semaines pour 3 à 5 mois, 15 minutes) avec injection au préalable de produit de contraste (animal vigil, 1 à 2 fois par semaines pour 3 à 5 mois maximum, 1 minute) pour les animaux avec tumeurs, une injection d'une substance qui agit sur le système nerveux (animal vigil, 2 fois, 1 minute) ainsi qu'une injection d’anticorps dans certains cas (animal vigile, jusqu’à 6 fois au maximum, à raison de 2 fois par semaine pendant 3 semaines au maximum, 1 minute).
Impact sur les animaux
Les manipulations des animaux pourront induire un stress. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les injections répétées peuvent induire un risque de péritonite. L’injection de bactéries pourra engendrer une réponse inflammatoire générant une douleur modérée à l’animal associée à une difficulté de se mouvoir et s’alimenter. L’injection de cellules tumorales pourrait engendrer une gêne à se mouvoir. L'imagerie in vivo sera effectuée sous anesthésie et pourra engendrer une baisse de la thermorégulation. Ces administrations et anesthésies pourront également engendrer une gêne respiratoire transitoire. L'induction de tumeur pourra induire une douleur modérée, une perte de poids ainsi qu'une réduction de la mobilité.
Devenir
Les souris injectées avec des cellules tumorales développeront des tumeurs pulmonaires. Dès l’apparition de signes cliniques indiquant l’atteinte d’un point limite défini, elles seront euthanasiées afin de prévenir toute souffrance inutile. Les autres animaux seront euthanasiés à des temps définis expérimentalement pour permettre le prélèvement d’organes. Ces échantillons seront utilisés pour analyser la réponse immunitaire induite, notamment l’organisation locale du système immunitaire suite à l’injection de bactéries ou en réponse à la présence de cellules tumorales.
Remplacement
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. En effet, il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués dans l’effet thérapeutique du BCG (Bacillus Calmette-Guérin), une souche atténuée de Mycobactérium Bovis, et dans la formation des TLS. Ainsi, les modèles souris sont considérés comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumeur. Les éventuelles voies d’interactions entre les cellules immunitaires seront testées tout d’abord in vitro puis in vivo.
Réduction
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. En effet, il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués dans l’effet thérapeutique du traitement et dans la formation des TLS. Ainsi, les modèles souris sont considérés comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumeur. Les éventuelles voies d’interactions entre les cellules immunitaires seront testées tout d’abord in vitro puis in vivo Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé par un calcul de puissance statistique et réduit au strict nécessaire pour atteindre les objectifs sans compromettre la validité des résultats. En raison de la variabilité de la croissance tumorale entre les souris, 7 souris par groupe seront utilisées dans les expériences suivant l’effet des traitements sur la survie et la progression tumorale (jusqu’à atteinte d'un point limite ou au maximum 3 mois après la dernière injection de cellules tumorales). Pour étudier la présence et le stade de maturation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS), 3 souris par groupe seront utilisées à chaque point temporel. Afin d’établir les cinétiques d’induction et de maturation des TLS, 5 souris par time point seront nécessaires. Les analyses par cytométrie nécessiteront quant à elles 7 souris par groupe et par point temporel. Les écarts attendus entre les groupes devraient garantir une puissance statistique suffisante malgré la taille restreinte des groupes. Pour les expériences nécessitant des souris survivantes, 20 animaux seront inclus initialement pour assurer un nombre suffisant de survivantes, qui seront ensuite soit réinjectées avec des cellules tumorales, soit euthanasiées pour récupérer les cellules immunitaires. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé par imagerie, permettant des mesures répétées sur un même animal. Chaque expérience sera répétée au moins 2 fois afin d’assurer la reproductibilité des résultats, conformément aux bonnes pratiques expérimentales. Au total, 3 598 animaux seront utilisés dans ce projet
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des portoirs ventilés dans un environnement A2 et ne seront expérimentés qu'après une semaine minimum de stabulation. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (hébergement individuel limité à la fin des expériences s’il ne reste qu’une seule souris survivante dans la cage) en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le milieu est enrichi avec 2 des enrichissements ci-après : 6 à 10 bâtonnets de coton, 1 à 2 rouleau en carton ou 1 à 2 maisonnette. La taille des cages est variable, permettant d’héberger jusqu’à 12 souris, tout en respectant la densité réglementaire. Dans les situations nécessitant un hébergement individuel de l’animal (dernier animal dans la cage), il bénéficiera d’un enrichissement en plus et il sera vérifié par le responsable du Bien-Être Animal de l'animalerie pour valider son hébergement individuel. Les conditions de températures et d'hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Dans la réalisation de ce projet, l'ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie). Tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum les nuisances. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. L'évolution tumorale sera suivie et mesurée. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les animaux seront vérifiés quotidiennement. Ils seront également pesés au minimum deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de la procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie).
Choix des espèces
L’utilisation de souris comme modèle est un outil précieux pour étudier les structures lymphoïdes tertiaires (TLS), car leur système immunitaire fonctionne de manière similaire à celui des humains, en particulier pour les réponses immunitaires innée et adaptative. Malgré quelques différences, la souris reste un modèle pertinent pour comprendre comment se forment les TLS et comment les cellules immunitaires interagissent avec les cellules cancéreuses dans le microenvironnement tumoral. Le modèle de cancer que nous utiliserons a déjà permis d’observer des TLS chez la souris. De plus, il existe de nombreux outils expérimentaux adaptés à ce modèle, comme des anticorps spécifiques ou des cellules tumorales modifiées permettant le suivie de la croissance tumorale par imagerie, ce qui facilite les analyses. Enfin, plusieurs protocoles déjà validés chez les souris commerciales femelles non génétiquement modifiées permettent de mener les expériences efficacement, sans augmenter le nombre d’animaux, ce qui est essentiel dans une démarche préclinique responsable. Les animaux seront reçus à l'âge de 7 ou 11 semaines puis mis en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire mature. Les animaux seront identifiés par un code couleur et le nombre de points fait aux feutres sur la base de la queue de l'animal.
Evaluation de principes actifs dans un modèle de xénogreffe ou d’allogreffe par injection de cellules tumorales chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
500 rats vont être utilisés, dix au maximum par groupe, soit une cinquantaine de groupes d'étude, tous tués et autopsiés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection de cellules cancéreuses, humaines ou de rongeur, puis des traitements répétés jusqu'à quatorze semaines après l'injection, avec un prélèvement de sang par semaine sur animal vigile et une ponction de liquide synovial sous anesthésie en fin d'étude. Les produits testés ne sont pas nommés et leur fréquence d'administration reste à définir selon les médicaments de chaque étude, les effets indésirables attendus devant être "abordés avec le client" avant toute mise en œuvre. Les bénéfices annoncés, mieux comprendre les mécanismes d'action et accélérer le développement de médicaments, sont renvoyés au court et au long terme, face à des tumeurs implantées et une mise à mort systématique.
Objectifs
L'objectif du projet est d’évaluer la croissance de tumeur et la réponse à des traitements anticancéreux potentiels en injectant des cellules cancéreuse chez le rat. Les cancers sont des pathologies particulièrement invalidantes dont les traitements ont de lourds effets secondaires et nécessitent d’être constamment améliorés. Les modèles de cancer réalisés chez le rongeur par injection de cellules cancéreuses humaines ou de rongeurs offrent des mesures robustes et reproductibles sur la base de modèles parfaitement décrits, calibrés et admis par la communauté scientifique. L’injection de cellules cancéreuses chez le rongeur permet de mimer différents types de cancers grâce au choix des cellules cancéreuses et à l’endroit où elles sont injectées, et ainsi de tester différents composés pouvant potentiellement réduire ou détruire les tumeurs. Le suivi de l’évolution de la tumeur, de la survie et de l’état général des animaux permettra d’identifier de nouveaux candidats médicaments et d’améliorer la compréhension des mécanismes de résistance au cancer.
Bénéfices attendus
Les bénéfices escomptés de ce projet de recherche se déclinent à court et long termes. A court terme, ce projet permettra d'obtenir des informations cruciales sur (1) les mécanismes impliqués dans le traitement de différents types de cancers ; (2) la tolérance ou la potentielle toxicité des médicaments testés ; (3) l’efficacité de nouveaux candidats médicament. À plus long terme, ce projet contribuera de manière significative au développement de nouveaux traitements en oncologie. Les données obtenues seront en effet essentielles pour : (1) Affiner la compréhension des mécanismes d'action des nouveaux médicaments ; (2) Guider la sélection des molécules les plus prometteuses pour les essais cliniques ; (3) Optimiser les stratégies des traitements pour une meilleure prise en charge des patients. En fournissant une base solide de connaissances précliniques, avec notamment le suivi de l’évolution des tumeurs, de la survie et de l’état général des animaux, ce projet accélérera potentiellement le processus de développement de médicaments innovants, offrant ainsi de nouvelles options thérapeutiques aux patients atteint de cancers.
Procédures
La procédure comporte une injection de cellules cancéreuses : durée de l'opération en fonction du type d’injection 1 minute à 15-30 minutes. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et avec une gestion appropriée de la douleur pré et post-opératoire. Des radiographies pourront être prises au moment de la chirurgie, les animaux seront anesthésiés et la procédure durera 5 à 10 minutes. Les traitements à tester seront appliqués avant et/ou après l’injection de cellules cancéreuses et répétés tout au long de la durée de l’étude, 14 semaines maximum après l’injection. Chaque administration dure 1 à 2 min. La fréquence d’administration des traitements sera définie selon le mode d’administration ainsi que selon les médicaments utilisés pour chaque étude. Une analyse du sang ou des urines pourra aussi être réalisée au cours de l’étude pour rechercher des marqueurs liés au développement de cancers. Les prélèvements de sang pourront être effectués sur l’animal sans anesthésie et dureront moins de 5 min par animal. Une période minimum d’une semaine de récupération sera nécessaire à l’animal avant de procéder à un nouveau prélèvement, avec au maximum 1 prélèvement par semaine pendant l’étude. Un prélèvement de liquide synovial pourra être réalisé sous anesthésie, à la fin de l’étude uniquement.
Impact sur les animaux
Une observation quotidienne de l’état général des animaux, ainsi qu’une évaluation détaillée 2 fois par semaine du comportement, du poids, seront réalisées tout au long de l’étude afin d’identifier au plus vite une éventuelle gêne ou douleur occasionnée par les manipulations effectuées. Des nuisances liées au modèle et à l’induction du modèle et au développement de cancer sont attendus dans ce protocole. Plus précisément, nous surveillerons l'état général et clinique des animaux pour estimer un éventuel traumatisme et une inflammation au niveau des sites d’injections des cellules cancéreuses. Des nuisances liées aux médicaments à tester peuvent être rencontrés, tels qu’une perte de poids, un comportement anormal de l’animal, ou une réaction pendant l’administration. Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront abordés avec le client avant toute mise en œuvre du projet. Ils seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours de protocoles préalablement réalisés et appuyés d’une veille bibliographique inhérente aux médicaments à administrer.
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés. Les organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins, urinaires et de liquide synovial seront utilisés pour mesurer la concentration du médicament testé, évaluer sa toxicité ou la réponse de l’animal suite au traitement. Les organes pourront également être utilisés pour mesurer la concentration du médicament, ou regarder la structure des organes par histologie ou imagerie.
Remplacement
De manière générale, les médicaments que nous évaluons in vivo ont fait l’objet d’études préalables réalisées sans animaux, mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des médicaments testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres liés à un individu dans sa globalité. Le cancer étant une pathologie complexe, il n'existe à ce jour aucune méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l'influence de différentes cellules dans le développement de tumeurs.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable pour l’évaluation des composés à testés, tout en prenant en compte le bien-être animal.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière, enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation), nous utiliserons des traitements anti-douleurs dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué avec prise de poids 2 fois par semaine et observations de caractéristiques spécifiques au modèle. Les animaux seront maintenus un minimum de temps en situation d’inconfort lors de leur manipulation (ex : au moment de leur pesée et mesure de la tumeur, ou au moment des prélèvements sanguins). Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible grâce au suivi clinique et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié.
Choix des espèces
Le rat a été choisi pour ce projet car ce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires proches de celles observées chez l'homme. Ces rongeurs, étant fréquemment utilisés à des fins de recherche, permettent de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, leur taille permet d’obtenir un volume suffisant de sang parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ces animaux permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux agents thérapeutiques.
Mise au point d’élevage de puces
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
1 214 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des souriceaux âgés de deux à sept jours sont placés sans contention pendant une heure au contact de colonies de puces, et lorsque plus de mille puces se nourrissent en même temps l'exsanguination entraîne une perte de conscience puis la mort en cinq minutes environ. Aucun anesthésique n'est administré, le porteur indiquant qu'il perturberait la prise de repas des puces, et des souris adultes rasées puis maintenues en contention stricte pendant une heure sont prévues en dernier recours. L'objectif est d'établir en laboratoire des colonies de puces de rongeurs pour étudier la transmission de la peste, et les molécules analgésiques que les puces injectent en piquant sont présentées comme "une forme de raffinement biologique supplémentaire".
Objectifs
La peste est une maladie transmise par les puces, qui touche principalement les rongeurs et parfois de nombreux mammifères, y compris les humains. Les raisons ayant conduit à la disparition de la peste en Europe, ainsi que les conditions d’une éventuelle réémergence ou propagation sur le territoire français et européen, restent mal comprises. Cette incertitude tient en grande partie à notre méconnaissance des espèces de puces présentes localement et de leur capacité à transmettre Yersinia pestis, que ce soit dans des contextes passés, actuels ou futurs. Or, cette connaissance est essentielle pour mieux comprendre les épidémies anciennes et évaluer les risques contemporains de résurgence. Dans ce contexte, la mise en place de colonies stables de puces constitue une étape préalable indispensable à toute étude expérimentale visant à caractériser leur biologie, leur comportement alimentaire et leur compétence vectorielle. Notre projet a ainsi pour objectif d’établir en laboratoire des colonies viables de puces de rongeurs, issues de sept espèces différentes au maximum, à partir d’individus adultes collectés sur le terrain. Pour cela, nous développerons des protocoles d’élevage spécifiques à chaque espèce, selon une approche progressive et itérative combinant observation, ajustements environnementaux et documentation rigoureuse. Ce travail vise à poser les bases d’un modèle expérimental aujourd’hui inexistant pour des espèces d’intérêt majeur en santé publique et animale.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est l’établissement de colonies stables de puces de rongeurs collectées sur le territoire français, dans des conditions expérimentales reproductibles. A ce jour, aucun protocole validé ne permet l’élevage en laboratoire de la plupart des espèces ciblées, pourtant cruciales pour comprendre leur écologie et leur rôle potentiel dans la transmission de pathogènes. L’obtention de telles colonies représentera une avancée méthodologique majeure, en fournissant pour la première fois un matériel biologique vivant, contrôlé et standardisé. Elle ouvrira la voie à des recherches expérimentales sur la biologie de ces puces, leur comportement alimentaire, leur physiologie et leur compétence vectorielle. Ce projet posera ainsi les bases d’une capacité expérimentale inédite, au service de la santé publique, de la santé animale et de l’écologie vectorielle.
Procédures
Les animaux seront exposés une seule fois au contract de puces pendant une durée d'heure.
Impact sur les animaux
L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire. Chez l’adulte, la contention est douce et de courte durée, constituant une source de stress supplémentaire, sans douleur manifeste observée.
Devenir
Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable chez les espèces ciblées ici. Ils exposent également les puces à des anticoagulants et à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte. L’objectif de ce projet, en développant un modèle expérimental fiable, est aussi de jeter les bases de futures alternatives, plus éthiques, reproductibles et standardisées.
Réduction
L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre réduit d’animaux. Un seul souriceau remplace le volume sanguin obtenu par 4 à 5 souris adultes dans un système artificiel équivalent. Cette approche contribue significativement à la réduction du nombre total d’individus utilisés. Par ailleurs, notre stratégie expérimentale a été conçue pour limiter autant que possible le recours aux animaux, tout en garantissant la validité scientifique du modèle. Lors de la phase initiale de mise au point, un nourrissage tous les deux jours est prévu pour identifier les conditions optimales de développement et de reproduction pour chaque espèce. Dès qu’une reproduction est confirmée, la fréquence est réduite progressivement à trois, puis à deux nourrissages hebdomadaires, en fonction de la dynamique de la colonie. Un suivi de la viabilité des colonies sera mis en place afin d’ajuster en continu le nombre d’animaux requis pour le maintien de chaque lignée.
Raffinement
Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix participe activement au raffinement, en limitant le stress et la douleur. Le stade utilisé (2 à 7 jours) correspond à une période de développement où le système nerveux central est encore immature, ce qui réduit la perception de la douleur. Si aucune reproduction n’est observée avec les souriceaux de 2 à 5 jours, un test sera réalisé avec des individus légèrement plus âgés (6 à 7 jours). En cas d’échec persistant, des souris adultes pourront être utilisées en dernier recours. Elles seront rasées sur le flanc et placées en contention stricte pendant une heure, avec surveillance renforcée du bien-être. Aucun anesthésique ne sera administré, car il perturberait la prise de repas des puces et compromettrait la reproductibilité du modèle. Des observations systématiques seront réalisées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Le raffinement repose ainsi sur plusieurs axes : réduction de la durée d’exposition, sélection de stades faiblement sensibles à la douleur, recours limité aux adultes en cas d’échec des protocoles sur souriceaux, contention encadrée, et ajustement progressif du rythme de nourrissage au strict nécessaire. Enfin, les puces injectant naturellement des molécules aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires lors de la prise de sang, cet effet propre à leur mode de nutrition constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental, notamment dans les protocoles publiés pour les espèces du genre Xenopsylla. Son statut d’espèce modèle, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Trois stades de développement pourront être utilisés dans ce projet, chacun sélectionné pour des raisons scientifiques et éthiques spécifiques. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès (~5 minutes après exposition). La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés : un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Souriceaux âgés de 6 à 7 jours. Ce stade sera utilisé uniquement en cas d’échec avec les souriceaux plus jeunes. Les yeux sont encore fermés, mais une pilosité débute. Cette évolution pourrait influencer la prise alimentaire ou la reproduction des puces via des facteurs physiologiques ou comportementaux. Comme pour les stades plus jeunes, l’absence de contention et la durée d’exposition limitée permettent de maintenir un bon niveau de raffinement. Souris adultes. L’utilisation de souris adultes est envisagée en dernier recours, uniquement si les tentatives de nourrissage sur souriceaux s’avèrent inefficaces.
Efficacité d’une approche thérapeutique par combinaison d’anticorps dans un modèle de souris syngénique de cancer du côlon
- Recherche appliquée
- Cancers
L'anticorps testé est développé par l'équipe depuis une dizaine d'années et vient d'entrer en essai clinique pour d'autres pathologies, l'enjeu étant ici d'étendre ses indications au cancer du côlon. 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever tumeurs et foie. Chaque animal reçoit une injection unique de cellules cancéreuses sous la peau sous anesthésie, puis pour certains deux injections d'anticorps par semaine pendant quatre semaines sur animal vigile, avant un prélèvement de sang terminal, la croissance de la tumeur pouvant provoquer une ulcération de la peau et une déshydratation. Le porteur écrit que la validation de l'approche exige un "modèle physiologique complet sur animal entier", après des essais déjà menés sur lignées cellulaires et sur tissus de patients.
Objectifs
Le cancer du côlon est la 2ème cause de mortalité attribuable au cancer dans le monde et est en augmentation depuis 20 ans. De nouveaux types de traitement faisant appel à des anticorps ciblant le système immunitaire se sont montrés efficaces dans d’autres types de cancers mais n’ont pas encore fait leur preuve pour le côlon. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du côlon. Nous avons montré dans le cancer du foie que notre anticorps pouvait réduire la taille des tumeurs, influencer le système immunitaire et améliorer les thérapies ciblant ce dernier à la fois chez l’homme et la souris. L’objectif de notre projet est d’étendre nos recherches au cancer du côlon afin d’évaluer l’efficacité de notre anticorps dans ces cancers.
Bénéfices attendus
Le cancer du côlon est un grave problème de santé public. Il est très fréquent et ses formes les plus graves se soignent très mal. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et ainsi la survie très nombreux malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologies.
Procédures
Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux peut entraîner un stress physique modéré. L’injection de cellules tumorales en sous-cutané, ainsi que les injections intrapéritonéales répétées d’anticorps, induisent une douleur légère et transitoire liée à la piqûre de l’aiguille. Au cours de l’expérience, la croissance tumorale peut occasionner une gêne plus ou moins importante, selon la taille de la tumeur et sa localisation (ventrale, dorsale ou latérale). Dans certains cas, une ulcération cutanée peut apparaître au niveau du site d’implantation des cellules tumorales. De même une déshydratation peut survenir secondairement à la pathologie tumorale.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foie) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons prévu de procéder à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble pour le rongement et des tunnels en kraft pour le refuge. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans des cages sur portoir ventilé. Les injections de cellules tumorales en sous-cutané seront réalisées sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane, afin de limiter la douleur et le stress liés à la procédure. Les autres procédures potentiellement invasives ou stressantes seront également effectuées sous anesthésie et/ou analgésie, lorsque cela est nécessaire. Une période d’acclimatation de 14 jours sera respectée avant le début des procédures. Durant cette période, les souris seront laissées sans manipulation pendant les 2 à 3 premiers jours, puis progressivement habituées à la contention au cours de la deuxième semaine. Cette familiarisation permet de diminuer le stress lors des injections répétées et des mesures de suivi (taille tumorale, température corporelle). Des points limites précoces ont été définis afin d’interrompre immédiatement les procédures et de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance excessive
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront âgés au minimum de 8 semaines (adultes) afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.