Rongeurs

60 souris rendues obèses par onze semaines d'un régime dont 60 % des calories viennent des graisses vont recevoir soixante-quatorze injections quotidiennes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent quinze pesées, deux mesures de composition corporelle et une session de soixante-douze heures en cage individuelle pour mesurer leurs dépenses énergétiques, isolement que le porteur reconnaît comme une nuisance pour une espèce sociale. Toutes sont tuées pour des prélèvements d'organes. Le projet teste le candidat médicament d'un client à un stade précoce de développement, et le porteur rappelle que plusieurs molécules anti-obésité autorisées ces vingt dernières années ont été retirées du marché pour effets secondaires graves.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus d'1 milliard de personnes en 2022, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un véritable fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (15 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Injection quotidienne de traitements ou du composé de référence ou véhicule (74 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (2 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Mesure de dépenses énergétiques (1 session de mesures de 72h)

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les injections de traitement ou véhicule seront source de douleurs légères de courte durée et de stress. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude pour prélèvements d'organes nécessaires à des dosages biochimiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés sur le modèle de souris soumis à une alimentation enrichie en graisses. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées par un test statistique adapté.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte âgés de 17 semaines (souris obèses) et de 18 semaines (souris non obèses). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de préconditionnement de 11 semaines de régime enrichi en graisse réalisée chez notre fournisseur.

Nées avec une mutation qui réduit leur poids dès le sevrage, des souris modèles d'une maladie mitochondriale deviennent apathiques entre un mois et un mois et demi, et certaines perdent brutalement du poids puis s'isolent entre quatre et sept mois. Une échographie cardiaque sous anesthésie générale, un test sur tapis roulant et cylindre rotatif, une IRM cérébrale de trente à soixante minutes, deux administrations orales par jour pendant deux mois et trois prélèvements de sang à la veine submandibulaire jalonnent le protocole appliqué à 2 720 animaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur range en sévérité modérée les seules nuisances liées aux gestes expérimentaux et décrit à part la dégradation due à la mutation, tout animal isolé dans sa cage ou ayant perdu plus de 20 % de son poids étant mis à mort. Les reproducteurs sont gardés pendant leur phase reproductive, de deux à six mois, puis tués comme tous les autres.

Objectifs

Les mitochondries jouent le rôle essentiel de centrale énergétique dans nos cellules. Les maladies mitochondriales regroupent de nombreuses pathologies héréditaires qui résultent d'un dysfonctionnement du métabolisme énergétique mitochondrial. Ces pathologies ont été associées à de nombreux symptômes incluant désordres du mouvement, cécité, surdité, épilepsie, accidents vasculaires, atteintes cardiaques ou encore neurodégénérescence. Les maladies mitochondriales peuvent débuter à tout âge, de la naissance, dans l'enfance et chez l’adulte jeune. A ce jour il n’existe pas de traitement curatif pour ces maladies. De ce fait, la recherche dans ce domaine des thérapies pour ces maladies mitochondriales est capitale. Nous avons identifié des médicaments candidats pouvant améliorer le fonctionnement des mitochondries. Certaines de ces molécules prometteuses ont été ensuite testées sur des cellules de peau de patients de maladies mitochondriales. Afin de tester les effets bénéfiques de ces médicaments sur un modèle in vivo, nous avons généré des souris présentant une mutation retrouvée chez des patients humains. Notre objectif principal pour ce projet est donc de caractériser en profondeur la pathologie de ces souris et valider l'efficacité des médicaments candidats identifiés, qui pourront ensuite être testés chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet est justifié d'un point de vue scientifique, car il propose d'étudier les effets de médicaments candidats dans les maladies mitochondriales, maladies qui ne bénéficient pas actuellement de traitements curatifs. Le développement d’une médecine mitochondriale est fortement compromis par l’absence de thérapies efficaces avec un nombre limité d'essais cliniques à ce jour. Raison pour laquelle la recherche sur les pathologies mitochondriales humaines s’oriente aujourd'hui résolument vers la thérapeutique. La présence de mutations pathogènes mitochondriales est responsable de maladies mitochondriales sévères et souvent fatales. Ainsi, déterminer l’impact de plusieurs médicaments pourrait permettre de restaurer le fonctionnement mitochondrial, apparaissant comme un objectif important, qui pourrait déboucher sur des essais cliniques pour les patients souffrant de maladies mitochondriales.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: Echographie cardiaque sous anesthésie générale (30 minutes, 1 fois); Test de la fonction motrice sur tapis roulant et cylindre rotatif (durée variable en fonction des performances des animaux); Imagerie par Résonance Magnétique du cerveau (sous anesthésie, durée 30 à 60 minutes, 1 fois); Administration par voie orale par pipette du médicament supplémenté d’une solution appétante ayant pour but que les souris viennent spontanément prendre le médicament (gavage si nécessaire à l'aide d'une sonde adaptée dans le cas où il serait difficile de délivrer le médicament par la technique d’administration orale par pipette ou si la solution appétante ne faciliterait pas le processus) (2 fois par jour pendant 2 mois) et un prélèvement sanguin au niveau de la veine faciale submandibulaire (5 minutes maximum) à 1.5 mois, 2.5 mois et 3.5 mois (1 fois à chaque temps).

Impact sur les animaux

Les souris des deux modèles, présentant une mutation que nous allons utiliser, sont de nouveaux modèles murins pour lesquels nous décrivons un phénotype pour la première fois. Les effets indésirables de cette mutation sur le modèle se traduit par un poids plus faible dès le sevrage et un comportement apathique qui apparaît entre 1 et 1,5 mois pour le modèle KI/KO et entre 2,5 et 4 mois pour le modèle KI/KI. Nous avons observé qu'entre l'âge de 4 mois et 7 mois, certains animaux présentent une perte de poids brutale et un isolement dans la cage. Les jeunes souris peuvent également parfois présenter une dépilation transitoire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins au niveau de la veine faciale submandibulaire sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquences sur le bien être de l'animal. Dans le cas où il serait difficile de délivrer le médicament par administration par voie orale par pipette, le gavage remplacera cette technique. Celle-ci, si utilisée régulièrement, pourrait entraîner un stress chez l'animal, lié au geste de contention et du geste de gavage, et une irritation de l’œsophage lié à la répétition de l'administration.

Devenir

Les reproducteurs seront utilisés pendant leur phase reproductive (2 à 6 mois) puis mis à mort. Pour toutes les autres expériences prévues, tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires humains tels que les fibroblastes de peau pour répondre à certaines questions scientifiques. Cependant ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans les maladies mitochondriales, puisqu'elles ne tiennent pas compte l’ensemble des interactions biologiques existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour la suite du programme de recherche et pouvoir valider et passer aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Aucune expérience inutile ne sera menée. Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, nos expériences solides des méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental par sexe pour la métabolomique. Pour la biologie moléculaire et l'histologie, des groupes de 8 animaux/génotype sont prévus, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux sans compromettre l'obtention de résultats statistiquement valides.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure de Bien-Etre Animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent, et seront pris en charge selon la grille de points limites suivante: Perte de poids 20% = 3 points Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points Isolement: 3 points. A partir de 1 point, un signalement sur la cage avec le numéro de l’animal concerné sera apposé, de telle sorte à ce qu’il y ait une attention particulière lors du contrôle quotidien pour déceler rapidement toute évolution négative, 2 points, surveillance bi-quotidienne de l'animal concerné, 3 points, l’animal est mis à mort en point limite. Pour les procédures de traitements des animaux, nous utiliserons au maximum, à la place du gavage, la technique dite MDA (micropipette-drug administration) qui consiste à donner oralement par pipette le médicament supplémentée d’une solution appétant pour habituer les souris à venir boire spontanément d’elle-même le médicament. En utilisant cette technique, nous évitons le stress et les irritations possibles par le gavage au niveau œsophage.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le présent projet, la souris que nous utilisons est un modèle de maladie mitochondriale unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des médicaments candidats sur les fonctions mitochondriales dans les tissus habituellement affectés dans ces pathologies, que sont le cerveau, les muscles squelettiques et les coeur. Les animaux utilisés pour la mise en place de l'élevage le seront dans leur phase reproductive (2 mois à 6 mois). Pour la caractérisation de la maladie, les animaux seront utilisés entre les âges de 2 mois et 12 mois. De plus, nous traiterons les souris avec des médicaments candidats de l'âge de 1.5 mois à 4 mois dans la phase d'expérimentation de traitements potentiels.

Une nécrose, une ulcération de la tumeur ou une paralysie liée aux métastases comptent parmi les effets que le porteur juge possibles, et déclenchent la mise à mort. 400 souris, immunodéprimées ou immunocompétentes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la mamelle, subissent l'exérèse chirurgicale de la tumeur en vingt minutes, jusqu'à quatre prélèvements de sang sous anesthésie et des micro-prélèvements pouvant aller à deux par jour. Le projet sert à caler les conditions de greffe et les fenêtres de traitement pour de futures études de composés, sans qu'aucun traitement y soit encore évalué, à raison de dix souris par groupe et jusqu'à dix études en un an.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. Les études menées dans le cadre de ce projet seront réalisées chez la souris. Les lignées murines utilisées pourront être immunodéprimée ou immunocompétente. L’objectif de ce projet préliminaire, situé en amont des études d’efficacité anti-tumorale de composés thérapeutiques, consiste à déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur en intra-mammaire (dose cellulaire, souche de souris, utilisation de matrice de membrane basale, etc.), leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début des traitements à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales qui constitueront nos modèles d’études.

Bénéfices attendus

Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur intra-mammaire et leurs caractéristiques de croissance tumorale afin de disposer de modèles fiables et robustes utilisables pour la sélection de composés thérapeutiques pour une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.

Procédures

• Sur animal vigile : Administration post-opératoire d’analgésique (2 à 3 fois, 15 s) ; Micro-prélèvement de sang (maximum 2 fois/jour, 15 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) ; Greffe de cellules tumorales (1 injection, 15 s) ; Exérèse chirurgicale de la tumeur (1 fois, 20 min) ; Prélèvement de sang (maximum 4 fois, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal (1 fois, 5 min).

Impact sur les animaux

Douleur légère ou modérée en post chirurgie mammaire. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur, paralysie (dans le cas de métastases).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours ou en fin d’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort.

Remplacement

Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats, statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et de celle du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Ces études sont menées à l’aide de différents modèles statistiques. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 10 études sera mené sur 1 an. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule, un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse associée à un anti-inflammatoires non stéroïdiens et un analgésique opioïde. Les conditions d’asepsie en expérimentation animale seront respectées et la température des animaux régulée. Un traitement analgésique adapté sera dispensé jusqu’à 3 jours après l’intervention et une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée pour s’assurer de la bonne tenue des sutures et de la bonne récupération des animaux. Au-delà de ces jours d’observation post opératoire et dans le cas d’absence de complications, ce suivi sera réalisé, au minimum deux fois/semaine. L’apparence/comportement de l’animal, l’aspect et le volume de la tumeur et la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou la mise à mort de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum deux fois/semaine. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée dans la cage pour faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum deux fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral. Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (jusqu’à 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.

Toutes tuées pour que leur cerveau soit prélevé, 60 souris de quatre à six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection de kaïnate déclenche chez elles des crises convulsives généralisées, cotées sur l'échelle de Racine, suivies d'un état épileptique puis de crises récurrentes. S'y ajoutent la pose d'un cathéter intraveineux et une incision du cuir chevelu avec fraisage du crâne pour installer une fenêtre crânienne, opération de trente minutes dont les animaux ne se réveillent pas. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro, ex vivo, in silico ou sur puce microfluidique ne reproduit la complexité en jeu, et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".

Objectifs

L’épilepsie pharmacorésistante reste un défi thérapeutique majeur, notamment dans les formes sévères associées à des crises prolongées ou récurrentes. Le cannabidiol (Epidiolex®) et la fenfluramine (Fintepla®) ont montré une efficacité clinique dans certaines formes d’épilepsie pédiatrique (syndromes de Dravet et de Lennox-Gastaut), mais leurs mécanismes d’action restent mal compris, et leur efficacité dans d'autres contextes épileptiques n’a pas été pleinement explorée. Par ailleurs, des études chez la souris ont montré un rôle spécifique des récepteurs cannabinoïdes de type 2 (CB2) dans les mécanismes de protection dans le contexte d’épilepsie pédiatrique. Cependant, leurs effets sur les altérations neurovasculaires associées aux crises, notamment sur la barrière hématoencéphalique (BHE), restent peu étudiés. La BHE joue un rôle central dans le contrôle de l’environnement cérébral, et sa perturbation est maintenant reconnue comme un acteur clé dans la genèse et la chronicisation de l’épilepsie. Des études ont montré que les crises épileptiques induisent une ouverture de la BHE, facilitant l’infiltration de cellules immunitaires et de composants plasmatiques pro-inflammatoires dans le parenchyme cérébral, ce qui peut aggraver l’excitabilité neuronale. L’utilisation du modèle murin d’épilepsie induite par injection systémique de kainate chez la souris permet de reproduire de manière fiable des crises convulsives aiguës suivies d’un état épileptique et d’une phase chronique avec crises récurrentes, mimant certains aspects de l’épilepsie humaine. Ce modèle est largement validé pour l’étude des mécanismes physiopathologiques de l’épilepsie et pour l’évaluation préclinique de nouvelles approches thérapeutiques. Il est donc particulièrement adapté pour étudier l’impact de traitements antiépileptiques sur la restauration de l’intégrité de la BHE, la modulation de la neuroinflammation et les interactions neurovasculaires. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer si l’activation du système sérotoninergique et/ou du système endocannabinoïde (récepteurs CB2) est capable de préserver l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique et l’infiltration immunitaire dans le contexte des crises épileptiques pédiatriques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont significatifs. Il vise à évaluer l’effet thérapeutique d’un agoniste sélectif des récepteurs cannabinoïdes de type 2 (CB2) dans un modèle préclinique bien établi d’épilepsie induite par le kaïniate. En particulier, le projet se concentre sur l’impact de ce traitement sur l’intégrité et la perméabilité de la barrière hématoencéphalique (BHE), qui joue un rôle central dans la physiopathologie de l’épilepsie, notamment dans les formes pharmacorésistantes. Ce travail pourrait permettre de mieux comprendre le rôle des récepteurs CB2 dans la modulation de l’inflammation neurovasculaire et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le contexte de l’épilepsie pédiatrique. À terme, il pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches de traitement non seulement pour les patients pédiatriques mais aussi ceux atteints d’épilepsie réfractaire.

Procédures

Type d’interventions, nombre et durée : 1. Induction du modèle d’épilepsie: Cette procédure dure environ 1 à 2 heures par animal (1 seule fois). 2. Pose d’un cathéter intraveineux (10 minutes/souris ; 1 fois). Intervention légère sous anesthésie générale avec analgésie préopératoire. 3. Chirurgie pour la mise en place d’une fenêtre crânienne sous anesthésie générale et analgésie (30 minutes/souris ; 1 fois). 4. Traitements pharmacologiques expérimentaux (durée 2 minutes, 1 fois/jour).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, l’induction du modèle d’épilepsie est susceptible d’entraîner des effets indésirables chez les souris. Ces effets incluent des crises convulsives généralisées (évaluées selon l’échelle de Racine), une altération de l’état général (perte de poids, hypomotricité), ainsi qu’un stress aigu durant la phase d’induction. Cette phase est considérée à sévérité modérée, et restera strictement encadrée par des critères de surveillance clinique renforcée de la part des expérimentateurs, avec mise en place de points limites clairs pour interrompre l’expérience en cas de souffrance excessive. Cette étude prévoit également une chirurgie pour la mise en place d’une fenêtre crânien. Cette procédure est associée à une nuisance modérée, incluant une incision cutanée et un fraisage du crâne. Une anesthésie générale et une analgésie préopératoire sera systématiquement administrée pour réduire au minimum la douleur et le stress liés à cette intervention. Cette dernière intervention sera sans réveil. Les traitements pharmacologiques expérimentaux ne sont pas connus pour induire de toxicité aiguë aux doses prévues, mais une surveillance spécifique de la part des expérimentateurs sera mise en place pour détecter d’éventuels effets indésirables (notamment sédation excessive, modifications cardiovasculaires ou comportementales). L’ensemble des procédures expérimentales respectera les recommandations du 3R, avec un effort particulier sur le raffinement (analgésie systématique, suivi clinique rapproché, intervention immédiate en cas de souffrance non anticipée) et une justification du nombre d’animaux utilisés.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour récupération de leur cerveau pour analyses ultérieures.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d’un agoniste sélectif des récepteurs CB2, en comparaison avec la traitement utilisé en clinique, sur l’activité épileptique et l’intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE) dans un modèle in vivo d’épilepsie pharmacorésistante. À ce jour, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire fidèlement la complexité des interactions neurovasculaires, immunitaires et électrophysiologiques impliquées dans l’épilepsie et ses comorbidités, en particulier en ce qui concerne la dynamique de la BHE en situation pathologique. Les systèmes cellulaires en culture (cultures primaires, co-cultures ou organoïdes cérébraux) permettent d'étudier certains mécanismes moléculaires isolés, mais ils sont incapables de modéliser les crises épileptiques dans leur dimension systémique (réseau neuronal global, perfusion cérébrale, réponse immunitaire périphérique, comportement animal, etc.). De même, les modèles in silico ou les approches sur puce microfluidique ne peuvent pas intégrer la dimension spatiotemporelle et multifactorielle des altérations observées in vivo, notamment l’impact du traitement pharmacologique sur les paramètres physiologiques globaux. L’utilisation d’un modèle animal avec induction d’un status épileptique, est donc indispensable pour répondre à la problématique scientifique posée. Ce modèle est bien caractérisé, cliniquement pertinent et permet d’étudier de manière intégrée les effets d’un traitement sur les crises épileptiques, les altérations de la BHE, l'inflammation cérébrale et les effets comportementaux. Ainsi, aucun substitut expérimental ne permet aujourd’hui d’acquérir les données nécessaires avec un degré de pertinence biologique équivalent, ce qui justifie le recours à un modèle animal pour ce projet.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Tout d’abord, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives comme l’IRM permet de réduire le nombre d'animaux utilisés ; de cette manière, les procédures utilisées ont été réfléchies de manière à les rendre compatibles entre elles (nous utiliserons d’abord l’IRM –technique non invasive- et le lendemain l’imagerie biphotonique chez la même souris, ce qui nous permet de réduire de moitié le nombre de souris à utiliser dans le projet). Ainsi, nous avons conçu ce projet de façon à ce que les mêmes souris nous permettent d’obtenir des résultats sur l’inflammation vasculaire, la perméabilité de la BHE, la réponse immunitaire des cellules résidentes du cerveau (microglie) et les phénomènes d’infiltration leukocytaire (rolling et adhésion de leukocytes circulants aux parois vasculaires).

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, il est prévu l'utilisation d’analgésie péri-opératoire et post-opératoire ainsi que d'anesthésie pour toute procédure chirurgicale et imageries. Les points limites adaptés à l’étude ont été établis; une grille de score (grimace-scale) sera utilisée. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par les expérimentateurs 7/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l'angoisse, la souffrance de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et en immunologie. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris se rapproche de celui de l'homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la dynamique de microglie dans les conséquences des crises épileptiques. Les animaux transgéniques utilisés seront âgés de 4 à 6 semaines et auront un poids d'environ 12-18 g. Nous réaliserons nos modèles sur des jeunes souris afin de pouvoir mimer la pathologie épileptique pédiatrique.

Ouvertes sous anesthésie générale pour qu'un mélange d'ADN soit injecté dans le cerveau de leurs embryons, des femelles gestantes comptent parmi les 706 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des nouveau-nés d'un à quatre jours reçoivent une injection de tamoxifène ou de virus, et 346 animaux subissent une perfusion intracardiaque sous anesthésie, sans réveil. L'objet déclaré est le rôle d'une protéine dans la formation de l'interface entre astrocytes et vaisseaux sanguins du cerveau, sans application annoncée. Le porteur écrit que des points limites intermédiaires permettront de soigner les animaux en "évitant la mise à mort", alors que toutes les souris du projet sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé.

Objectifs

Les astrocytes sont les cellules gliales majoritaires du système nerveux central et sont maintenant des acteurs reconnus de la physiologie de celui-ci. Notamment, les astrocytes sont importants dans le maintien dans le cerveau adulte des fonctions vasculaires comme la barrière hémato-encéphalique. In vitro leur rôle dans l’induction de ces propriétés a été largement étudié. Cependant, aucune claire démonstration de ce rôle n’a été faite in vivo. Une des raisons pour cela est le manque de connaissance sur le développement du compartiment astrocytaire périvasculaire et plus généralement l’évolution de l’interaction entre les astrocytes et les vaisseaux sanguins au cours du développement cérébral. Au cours d'une première étude, nous avons identifié une protéine qui pourrait jouer un rôle important dans le développement de cette interaction au cours du développement postnatal. Nous cherchons donc maintenant à étudier son rôle, en utilisant plusieurs stratégies d'imagerie et moléculaires. La première partie du projet consistera à mettre en place la délétion précoce spécifiquement dans les astrocytes de ce gène. Dans la deuxième partie du projet, nous réaliserons une analyse histologique, pour les différents marqueurs astrocytaires et vasculaires, ainsi que la densité cellulaire, pour identifier si son absence a des conséquences sur les propriétés de l'unité gliovasculaire et sa composition moléculaire. La morphologie des astrocytes sera également étudiée. Dans la troisième partie du projet, nous analyserons les potentielles modulations au niveau moléculaire.

Bénéfices attendus

Les astrocytes sont des cellules gliales indispensables au fonctionnement du cerveau qui ont une morphologie très ramifiée et complexe et qui contactent en particulier les vaisseaux sanguins cérébraux. Les astrocytes régulent les fonctions cérébrovasculaires mais les modalités de ces régulations sont encore mal caractérisées. Notre projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle d’une protéine chaperonne des lipides gras polyinsaturés dans le développement et la maturation des astrocytes cérébraux et en conséquence, le développement de l’unité gliovasculaire.

Procédures

4 interventions sont utilisées dans ce projet. 1) injection dans le cerveau d’embryon (in utero) : des femelles gestantes sous anesthésie générale sont opérées. Un mélange d’ADN et de colorant est injecté dans le cerveau des embryons. Nombre d’embryons concernés : 60. Cette chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois (durée: 30 min maximum). 2) Injection de Tamoxifen : du tamoxifen est injecté chez des nouveau-nés de 1 ou 4 jours et à 30 jours de vie. Cette injection n’est réalisée qu’une seule fois (pour le snouveaux-nés) ou 5 jours de suite (chez les souris de 30 jours). Elle est sans douleur et ne nécessite pas d’anesthésie. Nombre d’animaux concernés : 700 (durée: 1min). 3) injection de virus chez des nouveaux-nés. Cette injection se fait une seule fois, sous anesthésie locale. Nombre d’animaux : 60 (durée 15min). 4) Perfusion intracardiaque: Réalisée sous anesthésie générale, cette intervention est sans réveil. Nombre d’animaux concernés : 346 (durée: 15min)

Impact sur les animaux

La totalité des animaux subiront une injection sous-cutanée d’un produit chimique, ce qui peut engendrer un stress lié à la contention de l’animal et une douleur locale liée à l’injection (nuisance légère). Certains animaux recevront une injection intraveineuse dans la joue de virus. Ce geste peut entrainer une gêne au niveau du site d’injection (nuisance modérée). Un lot de femelles gestantes subira une chirurgie pour l’injection d’ADN chez les embryons, qui peut entrainer des effets modérés. Une observation particulière des animaux dans les jours suivants et l’application des points limites permettent de limiter la nuisance et la souffrance des animaux.

Devenir

La mise à mort des animaux est nécessaire pour récupérer les cerveaux afin d’étudier les propriétés des astrocytes.

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Tests statistiques : Pour l’ensemble des questions il faut obtenir les observations sur au minimum 5 réplicas biologiques pour chaque génotype, pur chaque sexe, à chaque stade et pour chaque condition de traitement. Ce nombre de 5 est un minimum pour intégrer dans notre étude la variabilité entre les animaux. C’est un prérequis dans l’ensemble des publications de travaux scientifiques. Elle est particulièrement cruciale pour l’étude développementale où les programmes de différentiation cellulaire peuvent légèrement varier d’un individu à l’autre. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets observés seront évalués

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les nouveau-nés subissant une injection feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure et les jours suivants. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, des points limites intermédiaires permettant la mise en place de soin aux animaux seront mis en place évitant la mise à mort des animaux. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront co-administrés pour limiter toute souffrance à l’animal. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, actes de chirurgie ou d’injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous prévoyons 4 stades à étudier : 10, 15, 60 et 200 jours après la naissance. Ces stades ont été choisis sur la base de nos études préalables (en particulier dans notre laboratoire) qui montrent que l’Unité Gliovasculaire se met en place entre 5 et 15 jours après la naissance, avec une période critique entre les jours 10 et 15. Il est par ailleurs important de déterminer si ce sont des phénomènes uniquement développementaux (étude aux jours 10 et 15) ou maintenu chez l’adulte (études aux jours 60 et 200).

2 120 souris immunodéficientes vont être utilisées, chacune pouvant recevoir le traitement jusqu'à sept fois par semaine et passer deux séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une greffe de cellules cancéreuses humaines sous la peau ou dans la prostate, des mesures répétées de la tumeur au pied à coulisse, un prélèvement de sang par semaine à la veine mandibulaire, puis une chirurgie de retrait de la tumeur. Toutes sont tuées pour que les tumeurs et les organes voisins soient prélevés. Le porteur indique que ses molécules ont déjà montré leur efficacité et leur spécificité sur des cellules, et renvoie au conditionnel la stratégie thérapeutique qui serait un jour proposée aux patients, alors que les greffes et les gestes répétés sont, eux, programmés.

Objectifs

Le traitement du cancer par chimiothérapie cible avant tout les cellules à renouvellement rapide dont les cellules cancéreuses mais pas que. Cette absence de sélectivité engendre des effets secondaires importants avec une une toxicité adjacente pour les tissus sains. Les autres traitements tels que les rayons peuvent également toucher les tissus sains autour de la tumeur et l'immunothérapie est un traitement lourd avec des effets secondaires qui altère l'état général car il y a nécessité de stimuler le système immunitaire. Au sein de notre laboratoire, nous avons développé des molécules thérapeutiques anti-cancéreuses dont l’efficacité et la spécificité ont été démontrées. L’innocuité du traitement chez la souris a été vérifié. Nous planifions d’utiliser des modèles tumoraux tels que 1) le développement des tumeurs primaires localisées sous la peau des souris (modèle classique d’oncologie pré-clinique) 2) le développement des tumeurs primaires localisées en orthotopiques (c’est-à-dire l’organe duquel les cellules tumorales sont issues) comme la prostate. Ces modèles permettront d'évaluer l’efficacité de molécules présentant des propriétés anticancéreuses. 

Bénéfices attendus

Ces molécules thérapeutiques ont déjà montré leur efficacité et leur spécificité sur des cellules Pour valider ces résultats, nous avons besoin que les tumeurs évoluent dans leur environnement de prédilection, à savoir dans un environnement en 3 dimensions complexe et multicellulaire, idéalement dans leur organe d’origine. C’est pour cela que nous allons réaliser des greffes de cellules cancéreuses humaines qui nous permettent de positionner les cellules tumorales dans leurs organes d’origine. En validant ces résultats chez la souris, nous pourrons à terme proposer une stratégie thérapeutique anti-cancéreuse aux patients qui ciblera spécifiquement la tumeur et aboliera la formation de métastases.

Procédures

Les animaux sont anesthésiés pour les procédures suivantes : - une implantation de cellules tumorales sous-cutanée (

Impact sur les animaux

La répététion des gestes techniques peuvent creer des nuisances chez les animaux . Pour limiter ces effets nous regroupons au maximum ces gestes pendant les séances d'imagerie où les animaux sont sous anesthésie générale. Les animaux seront soumis à l’injection des cellule tumorales sous cutanée avec une aiguille de très faible diamètre. Cette injection dure très peu de temps et n’aura lieu qu’une fois et sur des animaux endormis évitant leur douleur et stress. Par la suite, les gestes techniques : acquisition d’image , mesure du volume de la tumeur avec un pied à coulisse , retrait de la tumeur, prélevement d’un petit volume de sang à la joue auront également lieu sur animaux endormi pour éviter du stress supplémentaire. Une injection de d'une molécule permettant de visualiser la bioluminescence sera réalisée par voie intra péritonéale avec une aiguille de très faible diamètre d’un petit volume adapté qui nécessite quelques secondes de contention indolore. Des nuisances plus importantes peuvent être attendues dans la procédure de la greffe prostatique telles que des difficultés pour les animaux à se redresser completement sur les pattes arrières ou une gène liée à la chirurgie les heures suivantes. Pour limiter et éviter toute douleur et stress liée à la chirugie ou le retrait de la tumeur, les animaux seront sous anti douleur et l’accès à l’eau et la nourriture sera facilitée les heures suivant l'opération. Les animaux peuvent se défaire un point de suture ou la plaie peut ne pas bien cicatriser auquel cas l’expérimentateur refera immédiatement le point et desinfectera la plaie sous anesthésie. Par la suite, le développement de la tumeur peut générer une gène ainsi qu'une baisse de l'état général qui sera au maximum anticipé par l'expérimentateur. L’évolution de la taille de la tumeur sera donc surveillée 2 fois par semaine, sur animaux endormis, par le système d’imagerie in vivo (IVIS) non invasif qui detecte la luminescence de la tumeur.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, le développement des tumeurs sera suivi chez les animaux et les animaux seront mis à mort pour prélèvements. Les tumeurs ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs seront prélevés juste après l'euthanasie.

Remplacement

Les molécules thérapeutiques ont été caractérisées in vitro avec la même lignée cellulaire utilisée chez la souris. Cependant le modèle d’étude doit nécessairement refléter la complexité multi cellulaire d’une tumeur avec son micro environnement multicellulaire complet. Les études réalisées in cellulo ne permettent pas de conserver et reconstituer le microenvironnement exhaustif des tumeurs et reproduire sa constitution globale, son évolution spatio-temporelle tels qu’ils ont lieu in vivo dans un organisme entier. En effet nous ne pouvons pas in vitro (ni dans les organoïdes, ni dans une flasque de culture) reconstituer tout le micro environnement sécrétoire, le stroma, le système immunitaire et l’endothélium autour des celles tumorales en 3 dimensions qui reflèterait la réalité d’une tumeur chez un patient.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux en expérimentation, nous avons réalisé une étude approfondie de la littérature actuelle concernant les modèles de greffe qu’on utilise pour ne pas reproduire des résultats d’expérience déjà réalisés. Grâce au système d’imagerie in vivo, il est possible de suivre longitudinalement et de manière non invasive les tumeurs bioluminescentes qui se développent au sein des animaux sans nécessiter d’euthanasie. Nous construisons également nos manips pour extraire un maximum d’informations par animal pour éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires. Un projet pilote est également inclus pour calibrer le protocole et réduire le nombre des animaux nécessaire pour qualifier l’efficacité de la nouvelle molécule.

Raffinement

Les conditions d’hébergement se feront selon les recommandations de la directive 2010/63 EU. Du papier absorbant, du sizzle (lanières de papier kraft), des tunnels seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, de diminuer leur stress et de leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. Les animaux étant immunodéficients, le statut sanitaire sera strictement contrôlé, l’expérimentateur portera systématiques les EPI adaptés et les animaux seront manipulés sous un poste à sécurité microbiologique. Notre équipe à une expérience solide (>20 ans) dans l’expérimentation animale avec une formation continue des expérimentateurs pour être en cohérence avec les pratiques éthiques les plus récentes et approprié à nos modèles. Cela permet un suivi, une évaluation et une anticipationau plus juste de la souffrance animale. Les expérimentations ont été réfléchie de sorte que la majorité des gestes techniques qui peuvent générer du stress soient réalisées sur animaux endormis. La préhension se fera de cette façon : l’animal sera dirigé doucement sur notre main posée en coupelle dans la cage, avant de le poser sur une grille et d’effectuer la contention de l’animal. Les personnes qui réaliseront la chirurgie possède le diplôme de chirurgie et microchirurgie. Les chirurgies se feront en début de semaine afin de garantir le meilleur suivi des animaux les jours suivant l’opération. Les animaux sont posés sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie et nous recouvrirons leurs yeux par du gel oculaire afin d’éviter le dessèchement. Les animaux sont sous anesthésie profonde surveillée par l’expérimentateur. De l’analgésique sera administré aux souris avant et après l’opération pour éviter toute douleur. En complément du tapis chauffant, les animaux seront délicatement déposés entre deux chaufferettes préalablement réglées à 37°C. Les animaux sont remis dans leur cage sur du coton afin d’améliorer leur confort. Des granulés alimentaires déposés dans la cage afin d’éviter le redressement. Une attention particulière sera portée à la récupération post-implantation des tumeurs. L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations quotidiennes comportementales et physiologiques. Des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Dès les 1ers signes anticipant l’apparition du point limite, la décision d’euthanasier l’animal sera prise pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont un excellent modèle d’étude selon plusieurs critères : -La littérature scientifique définit le modèle murin comme pertinent pour étudier le développement tumoral en particulier pour une greffe avec cette lignée cellulaire. -La souche utilisée est immunodeficiente pour limiter le rejet de la greffe. -Leur petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo où plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie Les souris adultes peuvent être utilisées pour le projet . En effet nous nous intéressons à la pathologie du cancer de la prostate chez l’adulte humain. Les souris utilisées dans nos expériences devront avoir atteint un âge considéré comme adulte (après la maturité sexuelle à 6 semaines).