Rongeurs
Evaluation de la protection induite par des formulations vaccinales contre des pathogènes respiratoires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Quatorze séries de prélèvements par animal en six mois, sang à la joue, fèces, salive provoquée, prélèvements vaginaux : 747 souris vont être utilisées, dont 432 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont vaccinées jusqu'à quatre fois, puis infectées par voie nasale avec la grippe, le virus respiratoire syncytial ou le métapneumovirus, et peuvent perdre jusqu'à 20 % de leur poids dans les sept jours qui suivent. Une injection intraveineuse d'anticorps marqué précède immédiatement la mise à mort, et toutes sont tuées pour prélever les tissus respiratoires. Le bénéfice annoncé, une protection durable des muqueuses que les vaccins actuels n'obtiennent pas, reste à démontrer, quand la perte de poids et l'infection, elles, sont attendues.
Objectifs
Les virus respiratoires, comme ceux causant la grippe ou la bronchiolite, provoquent des infections respiratoires aigües entraînant des pathologies légères à sévères chez l’humain. Très contagieux, ces pathogènes sont responsables d’épidémies saisonnières ou de pandémies, et ils continuent à etre une cause majeure de mortalité notamment chez les jeunes enfants et les personnes agées. Différents candidats vaccins contre les pathogènes respiratoires sont en cours de développement dans le laboratoire pour une administration par voie injectable, par voie nasale ou orale. En continuité avec un projet précédent visant à déterminer les formulations vaccinales qui induisent les plus fortes réponses immunitaires, le but de ce projet est d’étudier la protection conférée par ces candidats vaccins dans un modèle d’infection de souris jusqu’à 6 mois après la vaccination initiale. Ainsi, après la vaccination, les souris seront infectées avec une des souches de virus respiratoires comme Influenza, le virus respiratoire syncytial ou metapneumovirus afin de déterminer la protection conférée par les candidats vaccins.
Bénéfices attendus
Les vaccins contre les virus respiratoires permettent de réduire la sévérité de la maladie mais ils sont actuellement peu efficaces pour induire une réponse immunitaire dans les tissus respiratoires eux-memes permettant une protection à long-terme contre les infections et la transmission. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies vaccinales contre ces virus. Ce projet permettra de déterminer si nos formulations vaccinales administrées par voie intranasale, orale ou intramusculaire induisent de fortes réponses immunitaires protectrices. De plus, ce projet permettra d’apporter des nouvelles connaissances sur le développement des réponses durables au niveau des tissus nasaux et pulmonaires.
Procédures
- Le marquage des souris sera réalisé à leur arrivée. Ce geste dure quelques secondes. - Les souris seront vaccinées au maximum 4 fois. La durée maximum de la vaccination est de 3 mois. - Les prélèvements de sang au niveau de la joue est un geste qui dure 30 secondes quand il est réalisé par une personne expérimentée. - Les souris isolées pour le prélèvement des fèces seront maintenues dans des boîtes qui n’entravent pas leurs mouvements jusqu’à récupérer suffisamment de fèces, et ne seront pas gardées au-delà de 20 minutes dans ces boîtes. - Des prélèvements vaginaux seront réalisés. Ils durent environ 5 min. - Des prélèvements de salive seront effectués après injection d’une solution qui fait saliver la souris. Tous ces gestes seront réalisés avant chaque immunisation, 2 fois par mois jusqu’au 6ème mois et avant la mise à mort (14 fois dans la procédure durant 6 mois au maximum). - Les souris seront infectées avec un virus respiratoire par voie nasale. - Des lavages nasaux seront réalisés deux fois après l'infection . - Une injection intraveineuse avec un anticorps marqué sera réalisée juste avant la mise à mort. Cet anticorps permettra de marquer des cellules d’intérêt circulant dans le sang.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables peuvent survenir chez les souris après la vaccination comme une augmentation de la température du corps et une diminution de l’activité ainsi que du poids. Après infection, les animaux pourraient développer des signes de pathologies respiratoires, caractéristiques des infections à virus respiratoire : une perte de poids jusqu'à 20% dans les premiers 7 jours après administration nasale de virus, une accélération du rythme respiratoire, une perte d’activité légère entre 2 et 7 jours après administration nasale de virus.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour préléver des tissus afin d'analyser les réponses immunitaires et la protection.
Remplacement
La caractérisation des nouveaux candidats vaccins est réalisée dans un premier temps dans des modèles in vitro de cellules épitheliales humaines ou animales. Cependant, il n’existe pas de méthode in vitro pour tester l’efficacité des formulations vaccinales à induire une protection après infection. L’interaction entre le virus et l’intégralité du système immunitaire d’un organisme est beaucoup trop complexe pour être réduit à l’utilisation de lignées cellulaires et requiert l’utilisation du modèle animal pour évaluer la protection générée par des candidats vaccins.
Réduction
La réduction des animaux se fera principalement sur la mise en place des expériences qui seront optimisées afin d’inclure le maximum de groupes expérimentaux dans une seule expérience. Le design de ces expériences est basé sur des données préliminaires établies par nos collaborateurs en 2020 puis 2025.
Raffinement
Après une anesthésie chimique, un suivi accru sera fait jusqu’au réveil et la reprise d’activité de chaque animal. De plus, les souris seront observées dans les heures suivant la vaccination. La température corporelle et le poids des souris seront suivis après chaque vaccination. De plus, ce même suivi se fera pendant 14 jours après l’infection avec le virus au rythme de 1 fois par jour et pourra être augmenté à 2 fois par jour si besoin. Des points limites ont été définis selon différents critères biologiques et si ceux-ci sont atteints lors de la surveillance, l’animal sera mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
La souris est le modèle le mieux adapté pour évaluer les réponses immunitaires et la protection induites par un candidat vaccin car la souris a une génétique proche de l’humain et c’est un modèle relativement aisé à mettre en place. Les expériences d’infection avec un virus seront réalisées sur des souris de plus de 7 semaines au début de l’expérience car avant 7 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire complétement développé.
Evaluation de l’action anti-fibrosante d’un anticorps neutralisant d’un facteur de croissance pour la prévention de l’insuffisance cardiaque chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un infarctus du myocarde est provoqué chirurgicalement chez chaque souris, en moins de vingt minutes, puis suivi de sept injections quotidiennes et de deux échocardiographies sous anesthésie. 384 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente comme effets indésirables principaux l'inconfort de la préhension et une douleur légère au point d'injection, avant de décrire l'insuffisance cardiaque provoquée par l'opération, avec fatigue à l'effort, œdèmes et détresse respiratoire possible. Toutes sont tuées pour prélever le cœur et le sang, afin de mesurer l'effet d'un anticorps censé freiner la fibrose cardiaque.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque est une maladie qui se traduit par l’incapacité du coeur à assurer son rôle de pompe. Elle affecte plus d’un million de personne en France. La cause majeure de l’insuffisance cardiaque est l’infarctus du myocarde. Ce dernièr est caractérisé par une modification structurelle du tissu cardiaque résultant le développement de la fibrose. Ces modifications mèneront à l’augmentation de la rigidité du muscle cardiaque ce qui augmente le risque d’insuffisance cardiaque. Actuellement, il n’existe aucun traitement qui inhibe la fibrose et améliore la prise en charge des patients, d’où la nécessité de comprendre ses mécanismes et de limiter son développement par des traitements ciblés. L’objectif de ce projet est de produire un anticorps qui inhibe un facteur de croissance impliqué dans le développement de la fibrose cardiaque. En effet, l’expression de ce facteur de croissance diminue au cours du développement, et est très faible (voir meme absente) dans le coeur adulte mais augmente en réponse à un stress notamment en cas d’infarctus du myocarde. De même, ce facteur de croissance a été identifié dans la circulation sanguine, avec un pic de sécrétion dans le 2-4 jours après l’infarctus. Cet anticorps sera testé in vivo et nous validerons son action dans un modèle prè-clinique d’infarctus du myocarde. Ces résultats seront considérés comme un programme de développement pré-clinique pouvant soutenir le passage ultérieur chez l’humain.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le bénéfice d'une approche thérapeutique qui pourrait empecher le développement de la fibrose cardiaque. A terme, ceci conduira à développer un nouveau anticorps pour lutter contre le développement de l’insuffisance cardiaque, une pathologie qui touchent des millions de patients et qui impacte fortement leur qualité de vie au quotidien.
Procédures
Dans le cadre de ce projet de recherche, nous allons : Dans un premier temps, réaliser une échocardiographie sous anesthésie générale sur tous les animaux afin de mesurer la fonction cardiaque de base, cet examen dure environ 10 min. Dans un second temps, induire un infarctus du myocardique. Cette intervention est unique, réalisée une seule fois sur chaque souris modèle et dure moins de 20 minutes. Les souris seront injectées quotidiennement et pendant 7 jours, cette injection dure environ 5 secondes. 7 jours après la chirurgie, réaliser une deuxième échocardiographie pour mesurer la fonction cardiaque post chirurgie et post traitement.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés à l’expérimentation, principalement l’inconfort lié à la préhension des animaux et la douleur légère de courte durée au point d’injection. Il y a également les effets indésirables liés à la chirurgie comme l’insuffisance cardiaque. En effet, la chirurgie est une source de douleur pour les animaux et l’insuffisance cardiaque engendrée par l’opération est également une source de souffrance pour la souris et se traduit généralement par une fatigue à l’effort, des Œdèmes et peux aller jusqu’à une détresse respiratoire.
Devenir
A l’issue des différents gestes techniques réalisés sur le même animal, tous les animaux seront mis à mort dans le but de prélever le coeur et le sang. Ceci nous permettera d’étudier l’efficacité de l’anticorps à l’aide de différentes techniques d'analyse.
Remplacement
L’anticorps neutralisant à étudier fait l’objet de tests préliminaires in vitro qui permettent de démontrer son pouvoir neutralisant, d’évaluer sa puissance d’action et sa capacité à réduire l'activation des cellules impliquées dans la fibrose cardique. Notre projet nécessite d'utiliser ensuite un modèle in vivo pour valider ces effets, et ceci en raison d’une approche physiopathologique du système cardiovasculaire intégrée sur animal entier. La réalisation de ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application chez l’homme de ces approches thérapeutiques.
Réduction
les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés
Raffinement
Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié et la mise en place de points limites stricts et adaptés au projet permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection des antalgiques et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire.
Choix des espèces
La recherche clinique sur l’infarctus du myocarde chez l’humain est limitée pour des raisons éthiques, c’est pourquoi le recours aux modèles animaux est devenu indispensable pour élucider les mécanismes mis en jeu. La souris est un modèle de choix, la structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proche de celle de l’homme. Les mêmes populations cellulaires sont présentes. Des souris jeunes adultes (agées de 8 à 10 semaines) car leur système cardiovasculaire est bien developpé.
Modèles expérimentaux de pathologies pulmonaires et administration de candidats médicaments et d’excipients par voie systémique ou inhalatoire chez les rongeurs
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Rats : 4800
Sensibilisés chaque semaine puis exposés quotidiennement pendant quarante-cinq jours à un produit qui provoque l'asthme, ou traités deux fois par un composé fibrosant, 4 800 souris et 4 800 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les atteintes annoncées vont de la difficulté à respirer aux crachats de sang, en passant par la toux, la perte de poids et les œdèmes liés aux injections répétées. Chaque animal est ensuite tué pour prélèvement d'organes, après une mesure de fonction respiratoire qui immobilise les rats jusqu'à vingt-quatre heures. Le porteur annonce vingt candidats médicaments testés par an pendant cinq ans, sans nommer ni le produit sensibilisant, ni le composé fibrosant, ni les molécules évaluées.
Objectifs
Les maladies respiratoires chroniques sont des maladies qui affectent les voies aériennes (trachée, bronches) et les poumons. Parmi les plus courantes, on retrouve l'asthme, la BPCO (bronchopneumopathie chronique obstructive) le cancer du poumon, les infections virales (grippe, COVID-19) la mucoviscidose, les maladies pulmonaires professionnelles (ex mésothéliome). L’asthme (population jeune) et la BPCO (population âgée), représentent un problème de santé publique majeur en France et dans le monde entier. Ce sont des maladies « civilisationnelles ». L’asthme sévère (10% des asthmes) qui limite fortement l’activité physique malgré un traitement bien conduit, n’a toujours pas de solution thérapeutique réellement efficace. Selon les dernières estimations, la BPCO sera la 4ème cause de mortalité en France en 2030. Aucun traitement curatif n’est disponible à ce jour. L’objectif de notre projet est de mettre en place des modèles expérimentaux de pathologies pulmonaires chez les rongeurs, afin de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques et des approches technologiques innovants. Les pathologies pulmonaires sont des maladies complexes, qui ne peuvent être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers avec leur physiologie et leur système immunitaire. Pour l'instant, il n'est pas possible de prouver l'efficacité des médicaments en utilisant seulement des methodes alternatives à l'expérimentation animale.
Bénéfices attendus
Le but de notre étude est de quantifier l’effet de candidats médicaments par des traitements aigues ou chroniques, afin de valider de nouvelles stratégies thérapeutiques et des approches technologiques innovants pour les pathologies pulmonaires, notamment l’asthme et la fibrose pulmonaire. Nous estimons de tester 20 candidats médicaments par an, donc 100 médicaments pourront être testés sur 5 ans. Cela permettra, à moyen ou long terme, d’identifier de nouveaux médicaments plus satisfaisants pour soigner les patients touchés par ces graves pathologies.
Procédures
Pour le modèle d’asthme chronique, les animaux seront traités par une combinaison de 2 produits sensibilisant, 1 fois par semaine pendant 3 semaines. Ensuite, les animaux seront soumis à une administration pulmonaire quotidienne d’un produit sensibilisant pendant 30 minutes/jour et cela pendant 45 jours. Dans le même temps, les animaux seront traités (3 fois par semaine pendant 6 semaines) avec le candidat médicament. Un prélèvement de sang sera realisé 1 fois par semaine, pour un total de 7 prélévements. La durée de chaque prélèvement de sang sera de 5 minutes. Lors du premier et du dernier jour de traitement avec le candidat médicament, la fonction respiratoire sera analysée à l’aide d'appareils spécifiques (chez la souris pendant 60 minutes; chez le rat pendant 24 heures maximum), puis l’animal sera mis à mort. Pour le modèle de fibrose pulmonaire, la fonction pulmonaire sera analysée, lors du premier et du dernier jour de traitement avec le candidat médicament, à l’aide d'appareils spécifiques (chez la souris pendant 60 minutes; chez le rat pendant 24 heures maximum). La pathologie respiratoire sera induite par 2 administrations d'un produit chimique connu pour induire la fibrose chez l'homme et les animaux. Ensuite à partir du septième jour après la dernière administration du produit fibrosant, les animaux seront traités avec les candidats médicament 1 fois par jour pendant 21 jours. Pendant ce temps, 5 prélèvements de sang seront réalisés. La durée de chaque prélèvement de sang sera de 5 minutes. Par la suite, les animaux seront mis à mort. Pour le modèle de toxicologie, les produits à tester seront administrés par voie pulmonaire pendant 30 minutes pendant 1 jour, 3 jours ou 9 jours, ensuite les animaux seront mis à mort. Deux prélèvements de sang seront effectués pour chaque groupe expérimental. La durée de chaque prélèvement de sang sera de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront sujets aux nuisances typiques des pathologies pulmonaires : réponse inflammatoire étendue, un dépôt de collagène et un épaississement des muscles lisses des voies respiratoires similaires aux pathologies observées chez l’Homme. D’autres nuisances probables seront la difficulté à respirer, des « crachats » de sang, une toux, des éternuements, la perte de poids, de l’inconfort ou une irritation de la gorge dû aux gavages et des problèmes d’irritation ou d’inflammation aux niveaux des yeux/joues à cause des prélèvements de sang et enfin du stress et de la douleur liée à la pathologie. Les animaux pourraient développer des œdèmes à cause des administrations sous-cutanée, intrapéritonéal, intramusculaire et prélèvement de sang submandibulaire. Ils pourront aussi développer l’addition des mauvais signes clinique, tel que : poil hérissé, vibrisse en touffe, léthargie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement/analyses d’organes.
Remplacement
Bien que nous menions en parallèle des études sur des cellules humaines épithéliales de l’appareil respiratoire en co-culture avec des fibroblastes, l’asthme et la fibrose pulmonaire sont des pathologies complexes, qui ne peuvent être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers avec leur physiologie et leur système immunitaire complet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi, il ressort que 12 animaux/groupe seront nécessaires, étant donné la variabilité interindividuelle. Le nombre de lots est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les cages sont de type à ventilation individuelle en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés 5-6 par cage (souris) ou 2-3 par cage (rats), en fonction de leur poids corporel et ainsi permettre aux animaux de pouvoir interagir et entretenir des liens sociaux avec leurs congénères, tout en gardant un espace suffisant. Des morceaux de coton, des igloos et des bâtonnets en bois seront intégrés dans les cages d'hébergement. Pendant la manipulation pour l’induction de la pathologie pulmonaire, les animaux sont maintenus sur des tapis chauffants en condition d’anesthésie gazeuse. Ensuite après l’anesthésie et pendant la phase expérimentale, les animaux recevront quotidiennement un complément alimentaire hypercalorique et des graines de tournesol stériles, en plus de la nourriture standard pour rongeurs, afin de limiter la perte de poids. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Des modèles animaux d'asthme ont été développés chez la souris et le rat, car ils partagent de nombreuses caractéristiques de l'asthme allergique humain. Les principaux symptômes de l'asthme, tels que l'hyperréactivité et l'inflammation des voies respiratoires, peuvent être reproduits plus facilement chez le rat que chez la souris. De plus, la taille des rats permet de collecter de plus grandes quantités d'échantillons. Pour ces raisons, les modèles d'asthme chez le rat gagnent en importance. La reconnaissance du potentiel d'un produit chimique spécifique à induire une fibrose pulmonaire chez l'homme a conduit à son utilisation dans des modèles expérimentaux. Depuis quarante ans, elle constitue le modèle le plus fréquemment utilisé pour la fibrose pulmonaire expérimentale. Elle a été utilisée chez de nombreux animaux, notamment la souris, le rat, le cobaye, le hamster, le lapin, le chien et les primates, mais rats et souris sont les plus fréquemment utilisées. Le stade de développement utilisé sera animaux adultes, à partir de 8 semaines d'âge. En effet, les pathologies étudiées sont présentes principalement chez les adultes.
Mise en évidence du rôle majeur du noyau dorsal du raphé et de ses circuits dans la dépression induite par la douleur neuropathique : Caractérisation neuroanatomique, fonctionnelle et moléculaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 460 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie de vingt minutes leur inflige une douleur neuropathique chronique que le porteur indique ne pas pouvoir soulager, puisqu'elle est l'objet même de l'étude. Suivent trois tests de douleur jusqu'à trois fois par semaine, puis, huit semaines après l'induction, six tests censés mesurer l'anxiété et la dépression, avec isolement et jeûne. L'objectif reste la compréhension des circuits cérébraux qui lient douleur chronique et dépression, et le porteur écrit qu'il lui est "indispensable" de travailler sur un animal entier, la souris étant selon lui "incontournable" en neurosciences.
Objectifs
La douleur chronique est fréquemment associée aux troubles émotionnels et cela affecte fortement la qualité de vie des patients. Elle représente un fardeau économique majeur sur la société, estimé à plus de 800 millions d’euros en Europe. Le taux de prévalence des troubles anxio-dépressifs est de l'ordre de 30 % chez les patients douloureux chroniques. Il est donc nécessaire de comprendre les circuits neuronaux qui sous-tendent cette comorbidité ainsi les potentiels cibles thérapeutiques. Grâce à l’utilisation de modèles animaux il est aujourd’hui montré que le décours temporel des comportements anxieux et/ou dépressif associés à une douleur neuropathique est hautement dépendant du sexe. De précédents résultats montrent l’implication de structures cérébrales clés. Nous souhaitons approfondir la caractérisation de ces réseaux en manipulant certains gènes ou populations neuronales. L’objectif est de mieux comprendre comment prévenir ou traiter la douleur et/ou la dépression. Ces travaux permettront d’éclairer les mécanismes génétiques et cellulaires impliqués dans le développement de cette comorbidité.
Bénéfices attendus
A l'issue de ce projet, nous serons dans la possibilité d’identifier des réseaux neuronaux et des marqueurs moléculaires impliqués dans la chronicisation de la douleur et le développement des troubles anxio-dépressifs en tenant compte du polymorphisme sexuel. Ces avancées permettront de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant cette comorbidité et sans doute la mise en place de stratégies thérapeutiques adaptées.
Procédures
Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Les chirurgies (d’une durée de 20 minutes) se déroulent sous anesthésie générale avec une administration d’anesthésie locale et d’un anti-inflammatoire en post-chirurgie. Les animaux subissent 3 tests évaluant la douleur de 20 minutes maximum par jour, 1 à 3 fois par semaine. A partir de 8 semaines post-induction de la douleur, les animaux seront évalués avec 6 tests évaluant les comportements de type anxio-dépressifs d'une durée de 5 à 10 min selon le test (avec 48h minimum entre chaque test). Les animaux subissent une chirurgie terminale sous anesthésie générale afin de procéder au prélèvement de tissu d’intérêt. Ce geste a une durée maximale de 15min.
Impact sur les animaux
La présence de la douleur chez le modèle animal est inévitable et ne peut pas être soulagée car c'est l'objet de l'étude. La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48 h. Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec le développement d’un état dépressif. Les animaux subissent une injection pour l’administration des composés pharmacologiques, induisant une légère douleur transitoire. L'isolement et le jeûne nécessaire aux tests de comportement provoquent un stress.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxiodépressive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie générale et locale sont mises en place et selon les gestes chirurgicaux, des méthodes d’analgésie sont utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la structure chargée du bien-être des animaux à l'institut (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le modèle animal, souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.
Toxicité (subaiguë) par inhalation : étude sur 28 jours – Ligne directrice de l’OCDE n°412
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Enfermer des rats dans des tubes où ils ne sont pas libres de se mouvoir, plusieurs heures par jour, jusqu'à cinq jours par semaine pendant quatre semaines : le protocole suit la ligne directrice n°412 de l'OCDE, que les industriels appliquent avant de mettre une substance sur le marché. 1 050 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. S'y ajoutent le rasage du dos, jusqu'à seize prélèvements de sang sous anesthésie, deux examens ophtalmologiques et jusqu'à douze séjours de vingt-quatre heures en cage à métabolisme. Les substances qui seront testées ne sont pas connues, et le seul bénéfice avancé est de répondre à des "requis réglementaires" ou à des questionnements sanitaires.
Objectifs
Les industriels doivent montrer qu’ils maîtrisent les risques de l’exposition aux substances chimiques qu’ils utilisent et/ou souhaitent mettre sur le marché pour répondre à des exigences réglementaires et de sécurité. Les tests validés pour en caractériser les dangers suivent notamment les lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour les essais de produits chimiques. L’objectif de ces études est d’évaluer la toxicité subaiguë de l’exposition par inhalation à des substances chimiques chez le rongeur (rats). L’analyse des signes de toxicité in vivo et de paramètres ex vivo après l’exposition aux substances permettra de déterminer les potentielles atteintes physiologiques et d’évaluer leur dangerosité.
Bénéfices attendus
Ces études renseigneront sur les effets toxiques de l’exposition subaiguë à des substances chimiques pour répondre à des requis réglementaires ou des questionnements sanitaires.
Procédures
Observations cliniques et pesées (moins de 5 min) : au moins 2 fois/semaine, au maximum tous les jours. Rasage (moins de 5 min) : 1 fois avant l’exposition en mode « corps entier » ; contention manuelle des animaux vigiles et rasage d’une partie du dos à l’aide d’une tondeuse dédiée aux petits animaux. Habituation au placement dans les dispositifs d’exposition (jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs) : 1 fois avant la 1ère exposition ; placement des animaux vigiles dans les loges de l’enceinte d’exposition pour ceux exposés « corps entier », dans une aire où sont disposés des tubes d’exposition (1er et 2ème jour) et dans les tubes (3ème jour) pour ceux exposés par voie oro-nasale. Exposition en mode « corps entier » (au maximum 4h) : 7 ou 20 fois ; placement individuel des animaux vigiles dans les loges d’une enceinte dédiée et exposition. Exposition par voie oro-nasale (au maximum 4h) : 7 ou 20 fois ; placement des animaux vigiles dans les tubes d’exposition et exposition. Examen ophtalmologique (moins de 5 min) : 2 examens (avant l’exposition et la fin de l’étude) ; contention manuelle des animaux vigiles et observation des yeux. Prélèvement de sang (moins de 5 min) : 1 à 16 prélèvements (1 prélèvement/semaine/4 mois) ; anesthésie des animaux et prélèvement d’au maximum 1 mL de sang. Habituation au placement dans les cages à métabolisme (jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs) : 1 fois avant la 1ère collecte, et collecte d’excrétas (jusqu’à 24h) : 1 à 12 collectes (1 collecte/semaine/3 mois) ; placement des animaux vigiles dans les cages à métabolisme.
Impact sur les animaux
Rasage, examen ophtalmologique : stress lié à la contention ; Exposition en mode « corps entier » : stress lié au placement dans les dispositifs d’exposition, à l'impossibilité de se nourrir et à l'isolement ; Exposition par voie oro-nasale : stress lié à la contention impliquée par le placement dans les tubes d’exposition, à l'immobilisation, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement ; Prélèvement de sang : stress lié à l’anesthésie et à la contention ; Collecte d’excrétas : stress lié au placement dans les cages à métabolisme et à l'isolement. De manière générale, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront l’exposition (effets habituellement relevés suite à une exposition aiguë par inhalation chez des animaux témoins de même souche, âge et sexe). L’exposition à la substance pourra également induire des effets locaux et systémiques susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux, affectant notamment la respiration, la peau et les muqueuses, pourront être observés. Les études ont été classées sévères relativement au cas où tous les animaux seront exposés aux substances à tester par voie oro-nasale. Suivant ce mode d’exposition, ils seront placés dans des tubes dans lesquels ils ne seront pas libres de se mouvoir 6h/jour jusqu’à 5 jours/semaine durant 4 semaines. Le choix du mode d’exposition qui sera mis en œuvre étant dépend des substances qui seront testées, et celles-ci n’étant à ce jour pas connues, le scenario le plus contraignant a été envisagé a priori pour chaque étude.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort aux temps d'euthanasie définis selon les objectifs d’étude à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Dans certains cas, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale actuellement validées par la réglementation ne permettent pas à elles seules de déterminer les effets toxiques de l’exposition subaiguë à des substances chimiques par inhalation. Les études in vivo sont pour cette évaluation requises. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations de la ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°412 (utilisation de rats mâles et/ou femelles) à l’âge adulte et de souches couramment utilisées en laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux qui sera utilisé suivra les recommandations de la ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°412. Une analyse des données bibliographiques disponibles sur chaque substance d’essai et ses analogues sera réalisée préalablement aux expérimentations pour déterminer les concentrations d’intérêt à tester. Au plan statistique, les groupes seront comparés par les tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution. Plusieurs paramètres seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux seront enrichies pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés à plusieurs par cage pour leur socialisation. Un animal sera isolé de ses congénères en cas de lésions, d’agressivité, de respiration anormale ou de comportement anormal. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et limiter le stress des expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront disposés dans leurs cages d’hébergement. Pour les animaux exposés « corps entier », après la tonte préalable à l’exposition, des friandises seront déposées dans leurs cages d’hébergement. Pour les animaux exposés par voie oro-nasale, des tubes semblables à ceux utilisés pour l’exposition seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour leur permettre de se familiariser avec le dispositif et se cacher. Préalablement à l’exposition, les animaux seront habitués au placement dans l’enceinte d’exposition, pour ceux exposés « corps entier », et à la contention imposée par le placement dans les tubes, pour ceux exposés par voie oro-nasale. Après chaque phase d’habituation, des friandises seront déposées dans leurs cages d’hébergement. L’eau de boisson sera supplémentée avec un complément de réhydratation et/ou des gels nutritifs seront mis à disposition dans les cages d’hébergement. En cas d’exposition « corps entier » dans une enceinte de plus d’1 m3, des biberons seront mis à disposition des animaux durant l’exposition. Préalablement à la collecte d’excrétas, les animaux seront habitués au placement dans les cages à métabolisme. Après chaque phase d’habituation, des friandises seront déposées dans leurs cages d’hébergement. Les animaux seront observés attentivement au plan clinique dans les heures qui suivront chaque exposition jusqu’à ce que leur bon état de santé soit avéré. Des critères de raffinement des gestes techniques qui seront pratiqués, des points limites relatifs à l’apparition de signes de douleur et des actions correctives visant à soulager les animaux ont été définis en adéquation avec les paramètres étudiés pour assurer leur bien-être. Des critères supplémentaires à ceux listés dans la présente demande pourront être définis au cas par cas suivant les informations toxicologiques disponibles sur la substance étudiée. Le cas échéant, ils seront indiqués dans le protocole d’essai associé.
Choix des espèces
Ces expérimentations seront réalisées chez le rat car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets respiratoires et systémiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations de la ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°412 pour l’étude de la toxicité subaiguë par inhalation, d’utilisation du rat et de souche couramment utilisée en laboratoire, d’animaux jeunes adultes, âgés de 7 à 9 semaines le jour de la randomisation, et de femelles nullipares et non gravides.
Evaluation de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement de la dysplasie corticale focale chez des modèles murins de la pathologie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un bout de queue prélevé sans anesthésie entre sept et dix jours, puis des crises d'épilepsie quotidiennes vers deux mois chez la moitié des animaux : 11 298 souris vont être utilisées, dont 5 176 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent ensuite jusqu'à dix injections, ou dix administrations orales, ou une injection intracérébrale sous anesthésie, puis passent six tests comportementaux que le porteur nomme, locomotion, exploration, cognition, anxiété, sociabilité et mémoire, ce dernier jusqu'à huit essais par jour pendant treize jours. Une partie subit en plus une chirurgie d'une heure pour implanter des électrodes cérébrales, suivie d'un hébergement individuel dont le porteur reconnaît qu'il génère du stress. Toutes sont tuées à l'issue, pour prélever des tissus ou parce que leur modification génétique interdit de les réutiliser.
Objectifs
Les dysplasies corticales focales sont des pathologies cérébrales du développement induisant des malformations du cerveau (malformations corticales), une épilepsie résistante aux traitements actuels et des troubles neurodéveloppementaux. Pour mieux comprendre et traiter ces maladies, nous utiliserons deux modèles de souris génétiquement modifiées reproduisant les symptômes de la pathologie. Notre objectif sera tout d’abord d’élever les animaux pour produire nos lots expérimentaux. Puis, ces lots permettront ensuite d’évaluer les effets de traitements innovants sur les différentes caractéristiques de la maladie.
Bénéfices attendus
L'épilepsie touche plus de 50 millions de personnes dans le monde. Les épilepsies focales sont parmi les plus fréquentes et sévères des épilepsies, et sont souvent liées à une malformation cérébrale, en particulier ce que l’on appelle les dysplasies corticales focales, sujet de ce projet. Ces dysplasies sont actuellement la cause la plus fréquente de chirurgie cérébrale pédiatrique du fait de la forte proportion de patients résistants aux traitements antiépileptiques actuels. A court terme ce projet pourrait permettre de valider de nouvelles cibles thérapeutiques et de valider l’efficacité de nouveaux traitements agissant sur ces cibles chez des modèles murins de la pathologie. A plus long terme, cela pourrait permettre d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques aux patients atteints de dysplasie corticale focale, moins risquées qu’un retrait chirurgical de la zone responsable des crises d’épilepsies.
Procédures
Pour identifier le patrimoine génétique de nos animaux, un petit prélèvement de l’extrémité de la queue sera effectué sur tous les souriceaux (moins d’1 min par animal, 1 seule fois, sans anesthésie car le jeune âge des animaux rend l’extrémité de leur queue peu sensible). La moitié des animaux que nous produirons développera un phénotype dommageable c’est-à-dire qu’ils présenteront les mêmes symptômes que ceux de la pathologie à partir de 2 mois environ (crises d’épilepsie, modifications du comportement). Tous les animaux recevront un traitement ou son placebo soit par injection (1 injection par jour maximum, tous les 1 à 3 jours pendant maximum 2 semaines, soit 10 injections maximum, moins d’une minute par injection), soit par voie orale (10 administrations réparties sur un maximum de 3 semaines, moins d’une minute par administration), soit par voie intracérébrale (une injection unique réalisée au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée, durée 1h maximum). Pour une partie des lot expérimentaux, avant la phase de traitement, puis après, une partie des animaux participera à des tests comportementaux (6 tests avec 24h minimum entre chaque test, répartis sur une durée maximale d’un mois, trois fois maximum). Le test 1 permettra d’évaluer la locomotion (1 essai, 20 min), le test 2 évaluera la capacité exploratoire (10 minutes par jour, 2 jours), le test 3 évaluera les capacités intellectuelles (1 essai, 8 min), le test 4 évaluera l’anxiété (1 essai, 5 min), le test 5 évaluera la sociabilité (1 heure, 1 fois), et enfin le test 6 évaluera les capacités de mémorisation (au maximum : 8 essais par jour de 90 secondes par essai, pendant 13 jours). Pour une partie des lot expérimentaux, avant la phase de traitement (ou de façon concomitante en cas de traitement par voie intracérébrale), une partie des animaux aura une procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée (durée 1h, une fois) pour implanter des électrodes au niveau du cerveau. L’activité électrique du cerveau des animaux sera ensuite mesurée en connectant (connexion simple et indolore) les électrodes à un système d’enregistrement (fait avant et, ou après la phase de traitement donc 2 fois 3 sessions de 5 jours consécutifs maximum, enregistrement en continu, 1 semaine minimum de repos entre chaque session de 5 jours). Les animaux seront vigiles lors des enregistrements, et pourront se déplacer librement durant le test.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : Premièrement, une légère et brève douleur lors du prélèvement pour déterminer le patrimoine génétique des animaux, ainsi qu’un stress lors des manipulations nécessitant une contention. Deuxièmement, le développement de crises d’épilepsies avec plusieurs crises par jour, la possible survenue de mort due aux crises et des modifications du comportement (diminution de l’anxiété et des interactions sociales entre animaux) Ensuite, une légère et brève douleur lors de l’administration de traitement par injection, avec une possible apparition d’hématome ou d’œdème suite à la répétition des injections. De même, possible douleur au niveau de l’œsophage suite à l’administration de traitement par voie orale. Les animaux pourront également subir un stress dû à l’analyse comportementale et au changement d’environnement pour la réalisation des tests. Il y aura également un risque hypothermique à la suite d’un test impliquant que les animaux soient mouillés. Enfin, la chirurgie nécessaire à l’implantation locale d’électrode et, ou, au traitement intracérébral pourra induire une douleur, une gêne et un inconfort post-opératoire. L’anesthésie générale pratiquée pour cette chirurgie sera associée à un risque d’hypothermie (stress thermique) et un risque d’arrêt cardiorespiratoire. L’hébergement individuel des animaux prévus pour l’enregistrement de l’activité électrique du cerveau engendrera un stress pour les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés pour prélever des tissus d’intérêt pour répondre à notre question scientifique ou parce qu’il n’est pas possible de les réutiliser ou de les replacer du fait de leur modification génétique.
Remplacement
Les études de tissus issus de chirurgies de patients ont permis de déterminer les gènes impliqués dans la pathologie, d'améliorer le diagnostic des patients, d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes à l’origine de la pathologie, et de créer des modèles animaux. Cependant, le faible nombre de tissus disponibles (environ une naissance sur 100 000) et le fait que ces tissus soient collectés après l’apparition des crises épileptiques limitent considérablement le champ des expérimentations possibles pour nos projets. Enfin, les études sur les patients de nouveaux traitements nécessitent une validation préalable sur des modèles proches de la physiologie humaine et reproduisant les crises épileptiques, comme les modèles de souris utilisés dans ce projet. Deuxièmement, la culture cellulaire seule ne suffit pas pour nos projets. Bien qu’elle ait permis de nombreuses avancées dans l’étude de ces pathologies (validation de mutations découvertes chez les patients, étude des mécanismes impliqués dans la pathologie, etc.), elle ne permet pas la création de modèles suffisamment complexes et représentatifs de l’ensemble des mécanismes en jeu in vivo. Elle ne permet pas non plus de reproduire les crises d'épilepsie observées chez les patients. Enfin, la modélisation informatique nécessite des données expérimentales encore manquantes. Les modèles de souris que nous utiliserons ont déjà été validés pour l’étude de cette pathologie et sont donc adaptés à la validation de nouvelles cibles thérapeutiques et à l’évaluation de l’efficacité de nouveaux traitements agissant sur ces cibles.
Réduction
Nous veillerons à générer le minimum d'animaux nécessaires pour leur utilisation dans des expériences visant à produire des conclusions scientifiques statistiquement fiables. Nous utiliserons au total dans ce projet un maximum de 11 298 animaux. La taille des effectifs par groupe a été établie grâce à un calcul de puissance et sera ajustée selon les premiers résultats obtenus. Ainsi, nous avons définis qu’un effectif de 10 à 15 animaux par groupes serait nécessaire en fonction des critères évalués. Nous procèderons à des tests statistiques sur les données obtenues pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils seront observés quotidiennement, et ceux susceptibles de développer un phénotype dommageable bénéficieront d’une surveillance spécifique. Pour chaque procédure, nous avons établie des points limites spécifiques pour éviter toute souffrance animale. Le geste de biopsie (prélèvement d’une petite quantité de tissus pour connaitre le statut génétique des animaux) sera de la plus petite taille possible. Le geste sera réalisé dans une pièce dédiée, au calme, avec du matériel propre et désinfecté entre chaque animal pour éviter toute infection ou contamination croisée. Les petits seront immédiatement replacés avec leur mère après le geste et il sera vérifié qu’ils soient bien repris en charge immédiatement après le retour en cage puis 20 minutes environ après. Pour les animaux recevant un traitement, nous les pèserons du premier au dernier jour de traitement afin de détecter une éventuelle perte de poids et d’adapter le volume administré. Pour les souris recevant une injection, la zone et la méthode ont été déterminées pour limiter au maximum les potentiels effets indésirables sur les animaux. Pour les souris recevant un traitement par voie orale, la prise dans l’eau de boisson ou dans du lait concentré-sucré avec une pipette sera préférée au maximum et le schéma thérapeutique pourra être réévalué en cours de traitement pour limiter au maximum la souffrance des animaux. Les tests comportementaux seront précédés d’une période d’habituation à l’expérimentateur. Les tests seront effectués du moins au plus stressant et avec une période d’habituation à la pièce avant chaque test. Nous observerons un temps de repos entre les traitements et les tests et inversement. Dans le cas du test impliquant de la nage, la température de l’eau sera rigoureusement vérifiée et les animaux seront séchés entre chaque phase du test. Pour la procédure chirurgicale, nous prendrons en compte le risque d’hypothermie en maintenant la température des animaux pour toute la durée de l’anesthésie. La douleur sera prévenue par analgésie et anesthésie. Après la chirurgie, l’expérimentateur réalisera une surveillance spécifique quotidienne durant 5 jours, puis une fois par semaine. Un enrichissement supplémentaire sera fourni aux animaux hébergés seuls en post-chirurgie, ils seront également surveillés spécifiquement pour détecter tout signe clinique en lien avec cet hébergement.
Choix des espèces
Ce projet nécessitera de travailler sur la souris. Ce choix a été motivé par des raisons scientifiques car le projet porte sur une pathologie génétique ce qui implique de générer un modèle reproduisant les mutations génétiques observées chez les patients. La souris fait partie des espèces permettant ce type de modifications. De plus, l’utilisation de cette espèce permet l’obtention rapide de groupe d’individus homogènes diminuant la variabilité de nos résultats et permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les souris ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des crises épileptiques. Plusieurs modèles de souris ont déjà été créés et étudiés pour modéliser les crises d’épilepsies. Les souris ont donc été explorées de manière exhaustive, permettant une solide base scientifique. Ce projet nécessitant l’administration de traitements, nous utiliserons donc des souris adultes. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera fait à l’âge de 7 à 10 jours. Cet âge précoce permet d’une part de profiter de la cicatrisation rapide des jeunes animaux et d’autre part de connaitre leur génotype très tôt et donc pouvoir inclure les animaux dans les procédures dès leur sevrage.
Optimisation d’immunothérapie par un agent pharmacologique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Huit prélèvements sanguins, neuf séances d'imagerie et vingt-cinq injections par animal : 180 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour les analyses post-mortem. La douleur attendue vient de la croissance des tumeurs et de la manipulation hebdomadaire. Le projet doit confirmer chez l'animal un résultat déjà obtenu en culture, un agent pharmacologique qui renforce l'activité antitumorale des lymphocytes T. Le porteur situe le bénéfice dans l'élaboration de futures procédures d'immunothérapie, un horizon indéterminé face aux tumeurs et aux injections répétées inscrites dès maintenant au protocole de chaque souris.
Objectifs
Ces dix dernières annéees, les immunothérapies ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant nos défenses immunitaires à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards de chimiothérapie et radiothérapie. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus in vitro montrent une potentialisation des outils cellulaires à la base des immunothérapies dans le contexte du cancer.
Procédures
Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : - 8 prélévements sanguins sous anesthésie générale, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 9 séances d'imagerie, sous anesthésie générale, la durée de ce geste est évaluée à 3 minutes 25 injections sous anesthésie locale, la durée de ce geste est évaluée à moins de 1 minute.
Impact sur les animaux
Des nuisances potentielles pourraient résulter du stress généré lors des injections et plus globalement par la manipulation hebdomadaire des animaux, mais également de la douleur résultant de la croissance tumorale. Cette douleur sera modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements et les analyses post-mortem nécessaires à l'étude
Remplacement
Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une potentialisation des fonctions antitumorales après traitement par un inhibiteur pharmacologique nouvellement identifié. Le recours aux modèles animaux est indispensable pour valider le gain résultant de l'utilisation de cet inhibiteur sur des approches d'immunothérapies au sein d’un organisme vivant entier.
Réduction
Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par palpation des tumeurs et par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d'étude sont faits le plus souvent en même temps, afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base de nos travaux antérieurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les interventions seront précédées d'une anesthésie locale pour les injections et générale pour les prélèvements, afin de prévenir la douleur. Nous utiliserons l'imagerie pour un suivi de la charge tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basées sur cette approche pour les études ultérieures. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix et de référence pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Les modèles murins permettent en effet d'apprehender la complexité de la réponse tumorale. Ces modèles permettent notamment d'apprehender la possibilité de rencontre des cellules de l'immunité et des cellules tumorales au sein de l'organisme. Ces modèles permettent également de prendre en compte la survie des cellules immunes et le maintien de leur activité antitumoral au sein du microenvironement tumorale, qui le plus souvent met en place des mécanismes pour inhiber la réponse immune. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).
Impact de la signalisation du récepteur NMDA par le peptide AETA dans la cognition sociale
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 880 souris vont être utilisées, 2 160 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 720 d'un niveau léger. Une partie subit une chirurgie du cerveau de 40 minutes pour y injecter des outils viraux activant ou inhibant certaines cellules, d'autres une chirurgie terminale sans réveil, toutes une biopsie du bout de la queue sous anesthésie par le froid. Elles passent ensuite des tests nommés, test des trois chambres, interaction sociale, labyrinthe en Y et piscine de Morris avec six à sept jours d'apprentissage, avant d'être tuées pour prélèvement du cerveau, les souris dépourvues du génotype recherché étant tuées après génotypage ou gardées pour l'entretien de la lignée. L'objet déclaré est la mémoire sociale et ses défauts dans la schizophrénie, et le porteur prévoit pour certaines expériences un isolement de trois semaines qu'il reconnaît stressant, imposé à des animaux dont il mesure ensuite la sociabilité.
Objectifs
La cognition sociale est essentielle pour interagir correctement avec les autres. Elle nous permet de comprendre et de réagir aux pensées, émotions et intentions des gens autour de nous. Certaines maladies psychiatriques, comme la schizophrénie, affectent cette capacité. Les personnes atteintes ont du mal à interpréter les émotions et intentions des autres, ce qui complique leurs relations et peut aggraver leurs symptômes. Pour mieux comprendre ces troubles, il est important d’identifier les circuits cérébraux impliqués dans la cognition sociale. Des recherches récentes montrent qu’une connexion entre l’hippocampe (mémoire) et le cortex préfrontal (prise de décision) joue un rôle clé dans la mémoire sociale, un élément fondamental de la cognition sociale. Cette connexion repose sur la capacité des neurones à s’adapter et à traiter l’information. Notre équipe a récemment découvert qu’un peptide appelé AETA pourrait influencer cette connexion en régulant un type particulier de récepteurs du cerveau (récepteurs NMDA), connus pour être perturbés dans la schizophrénie. Nos premiers résultats suggèrent qu’un dysfonctionnement de cette régulation pourrait être responsable des difficultés sociales observées chez les patients. L’objectif de ce projet est donc de comprendre le rôle du peptide AETA dans la mémoire sociale et son impact sur les comportements sociaux. Nous voulons aussi explorer comment son dysfonctionnement pourrait être impliqué dans la schizophrénie, afin d’ouvrir la voie à de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux appréhender les origines biologiques, d’obtenir des informations sur les modifications cellulaires/moléculaires et d’ouvrir la voie vers des traitements adaptés en lien avec la cognition sociale. Par ailleurs, cela pourrait permettre l’identification d’une nouvelle cible prometteuse pour le traitement de la schizophrénie. La schizophrénie touche environ 0,25 % à 0,64 % de la population mondiale, selon les estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) et de l'Institut national de la santé mentale (NIMH). Cela signifie qu'environ 1 personne sur 200 à 1 personne sur 400 dans le monde est atteinte de schizophrénie. Cette étude est donc primordiale pour tester notre hypothèse in vivo et définir de nouvelles pistes de thérapie contre cette maladie psychiatrique qui affecte et qui reste sans traitement adapté à ce jour.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents protocoles. Notamment à une biopsie du bout de la queue afin de les génotyper, cela se fera suite à une anesthésie par le froid. Certaines souris recevront une chirurgie cérébrale afin d'injecter des outils permettant de modifier, activer ou inhiber certaines cellules du cerveau. Cela se fera sous médication pharmacologique anesthésique/analgésique et durera maximum 40 minutes. Certains animaux recevront une chirurgie terminale sans réveil sous anesthésie pharmacologique profonde, après administration d’analgésique/anesthésique. Cette technique est utilisée afin de maintenir les tissus du cerveau et de permettre une étude du site d’injection, elle durera maximum 10 minutes. les animaux seront soumis à différents tests comportementaux répartis sur plusieurs semaines, permettant d’évaluer l’apprentissage, la mémoire spatiale et de travail ainsi que les comportements sociaux. Certaines de ces expérimentations nécessiteront une période préalable d’isolement de trois semaines. Dans le cadre du 3-chamber test, les souris passeront par trois phases successives, chacune d’une durée de 10 minutes (soit 30 minutes au total). Pour le test d’interaction sociale, une période d’habituation de 5 minutes précédera une phase de test de 10 minutes (soit 15 minutes au total). Le test du labyrinthe en Y sera réalisé sur une durée de 10 minutes. Concernant la piscine de Morris, les souris seront d’abord familiarisées avec l’eau et la plateforme, puis suivront une phase d’apprentissage de 6 à 7 jours comprenant 4 essais séparés par 15 minutes. 24 heures après la fin de cette phase, elles effectueront un premier essai test, suivi d’un second essai sept jours plus tard. Enfin, chacun de ces tests sera espacé d’au minimum une semaine, voire davantage selon les protocoles.
Impact sur les animaux
Le projet s’intéresse à la composante sociale d’une pathologie psychiatrique. Par conséquent, les effets indésirables seront principalement liés à la dérégulation des circuits neuronaux et pourront se manifester à l’échelle comportementale par des troubles de sociabilité et de mémoire. Cela n’entraine pas de dérégulations des systèmes impliqués dans la douleur mais provoque des modifications des comportements sociaux. Les tests comportementaux seront sans douleur et basés sur la tendance naturelle des animaux à explorer ou éviter une zone nouvelle ou un nouveau congénère. Il pourrait y avoir une douleur transitoire post-opération lors de la biopsie du bout de la queue et suite à l'injection de la micropuce. Il pourrait y avoir des effets indésirables comme état confusionnel transitoire au réveil après chirurgie et une douleur post-chirurgicale. Une nuisance de l'injection lors de l'anesthésique est aussi attendue.
Devenir
Procédure 1 : après le génotypage, les animaux présentant le génotype d'intérêt seront gardés pour les procédure 2 et 3. Les animaux ne possédant pas le génotype d'intérêt seront soit euthanasiés, soit maintenus pour le maintien de la lignée. Procédure 2 : après les tests, les souris seront euthanasiées afin de prélever le cerveau et vérifier les résultats de la chirurgie ou réaliser des études post-mortem. Procédure 3 : Après les tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés pour prélever et réaliser des études post-mortem.
Remplacement
Notre projet étant en grande partie orienté sur des approches de physiologie intégrée, il n’existe, aujourd’hui, aucune méthode substitutive qui pourrait remplacer l’utilisation des animaux dans nos expériences. Les structures étudiées étant très conservée entre Homme et Souris, cela en fait un modèle de choix pour notre étude. De plus, les outils viraux qui seront utilisés sont très bien décrits et spécifiques pour la souris aussi, les lignées génétiquement modifiées que l'on va utiliser dans ce projet ne sont disponibles que chez la souris.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été évalué afin d'avoir une bonne estimation des effectifs suffisants pour l'obtention de données statistiquement fiables tout en s'assurant d'une utilisation des animaux au strict nécessaire. De plus, chaque souris suit le maximum de procédures envisageables sans interférence. Pour finir, la mise en groupe de souris est optimisée pour chaque lot d’animaux lors du sevrage grâce au génotypage avant sevrage.
Raffinement
Nous appliquerons plusieurs techniques de raffinement dans les différentes procédures. Lors des chirurgies, les soins opératoires et post-opératoires ainsi que la fréquence de suivi des animaux seront adaptés. Ainsi lors des chirurgies, une hydratation sous-cutanée pré et post-opératoire sera réalisée, de même que l’injection d’analgésique avant et une administration d’anti-inflammatoire/analgésique pendant 5 jours post-opératoire. Un tapis chauffant est placé sous l’animal lors de la chirurgie (régulation via sonde rectale) et également sous les cages de réveil afin de faciliter celui-ci et éviter toute hypothermie. Les souris auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Lors de la procédure de comportement, il faudra que les animaux soient isolés pendant 3 semaines. Bien que la procédure d’isolement puisse être stressante pour les animaux, leur bien-être restera le point le plus important. Par conséquent, nous ferons en sorte que les animaux aient des cages avec enrichissements (bâtons en bois, abris et oates pour la nidification), à limiter le stress. Ces animaux seront suivi de très près tout au long de l’isolement afin de détecter très rapidement des problèmes éventuels de comportement dû à l’isolement. Pour les animaux dans toutes les procédures les signes potentiels de souffrance sont recherchés et des points limites adaptés aux différentes phases des procédures ont été fixés.
Choix des espèces
Les caractéristiques morphologiques et physiologiques des souris sont largement documentées. De plus elles possèdent une proximité évolutive, un cycle de vie cours permettant de répéter les expériences afin de s’assurer de la robustesse des résultats, ce qui constitue un atout pour développer efficacement notre étude. C’est un très bon modèle pour l’étude des circuits neuronaux sous-jacent les comportements sociaux. Les mécanismes moléculaires et cellulaires ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau des structures d’intérêt sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension des mécanismes impliqués dans la mémoire sociale et des effets de la schizophrénie et ainsi de pouvoir mieux cibler de possibles approches thérapeutiques. Nous disposons des modèles murins requis et des techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie), faisant de ces souris un excellent modèle pour l’étude de cette pathologie. Pour notre étude, la période d’intérêt étant d’environ 8 semaines (âge adulte), les animaux seront donc utilisés à cette période afin d’effectuer des tests comportementaux ou des mesures d’activité cellulaire.
Comprendre les causes de l’arrêt respiratoire dans le syndrome d’Ondine (maladie génétique qui touche le contrôle de la respiration) grâce à des souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
- Système respiratoire
Les souriceaux de ce projet naissent avec une mutation qui les empêche de respirer normalement, apnées, respiration faible et absence de réaction à l'excès de gaz carbonique dans le sang. 464 souris vont être utilisées, 180 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 264 modéré et 20 léger, toutes tuées à l'issue. Chaque nouveau-né est séparé de sa mère jusqu'à une heure pour les mesures cardio-respiratoires, subit le prélèvement de deux à trois millimètres de queue avant son quatrième jour de vie pour le génotypage, et est manipulé toutes les deux heures le jour de sa naissance pour vérifier sa vitalité. Les souriceaux sont tués par décapitation au quatrième jour, ou plus tôt si un point limite est atteint, le porteur ayant retenu comme critères le score d'adaptation à la vie extra-utérine et le comportement de la mère envers sa portée.
Objectifs
Nous voulons comprendre comment et pouquoi des mutations aboutissent au syndrome d'Ondine. Cette maladie se manifeste à la naissance par une apnée, une respiration faible et une absence de rélfexe respiratoire (pas d'augmentation de la respiration à une élévation de la teneur en gaz carbonique dans le sang). Ces problèmes se manifestent pendant le sommeil ce qui est dangeureux pour le nouveau-né. Il s'agit d'identifier les structures qui ne se forment pas et/ou les structures qui sont malformées à l'expression de la mutation et leurs conséquences sur la respiration.
Bénéfices attendus
Le projet pourrait avoir un impact fondamental par l’identification des circuits neuronaux impliqués dans les déficits respiratoires du syndrome d'Ondine. Le projet pourrait également apporter de nouvelles connaissances sur les structures du cerveau impliquées dans le maintien de la respiration pendant le sommeil, informations critiques à la compréhension du développement du syndrome d'Ondine et plus largement des pathologies respiratoires du sommeil comme les apnées obstructives.
Procédures
1/ Séparation maternelle d'une heure pour la mesure cardio-respiratoire 2/ Le prèlèvement d'un morceau de queue de 2-3 mm et d'une durée de 3 secondes pour l'identification du statut génétique est réalisée avant quatre jours de vie (souriceau sans poils) 3/ vérification de la vitalité du souriceaux (durée : 1 min par souriceau) le jour de naissance toutes les deux heures sur 6h d'observations puis deux fois par jour. Aucune necessité de recourir à de l'anesthésie.
Impact sur les animaux
1/ angoisse à la séparation maternelle d'une heure pour les mesures respiratoires 2/ Douleur au prèlèvement de 2-3mm de queue pour l'identification du statut génétique 3/ détresse respiratoire liée à la mutation 4/ angoisse à la vérification de la vitalité du souriceau (1 min par souriceau) 3 fois en 6h (le jour de naissance et 2 fois par jour juqu'à P4. 5/Stress lié à la detresse respiratoire engendrée par mutation.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Les souriceaux sont euthanasiés par décapitation à la fin de la procédure (4 jours de vie) ou en cas d'atteinte de point limite. S'il y a un besoin de prélèvement d'organes notamment du cerveau sur les souriceaux nouveau-nés, ça sera en postmortem.
Remplacement
Dans le cas du syndrome d’Ondine, il n’y a actuellement pas de prise en charge pharmacologique. Cependant, les modèles génétiques murins sont disponibles pour élaborer et/ou affiner les stratégies thérapeutiques. Si les avancées obtenues par les recherches sur les cultures cellulaires permettent d'éclaircir les mécanismes et les conséquences de la mutation à l'échelle moléculaire et cellulaire, une validation sur des animaux en développement est nécessaire pour comprendre la maladie et les conséquences fonctionnelles sur un organisme entier. L’utilisation de l’animal ne peut alors être évitée.
Réduction
Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle et d'une éventuelle mortalité à la naissance, nous avons déterminé un lot expérimental de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Les études publiées sur les variables respiratoires valident l’effectif de 30 animaux par groupe pour obtenir une puissance statistique satisfaisante. Cet effectif sera réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.
Raffinement
Des points limites adaptés à l’âge des souriceaux sont décrits et comportent le score d’adaptation à la vie extra-utérine pour le souriceau et le comportement de la mère envers sa portée. Pour les mesures, nous utilisons une technique non invasive (animal non anesthésié) et contrôlée (durée de la mesure, température constante dans les chambres de mesure) pour minimiser une possible angoisse des animaux. La durée de séparation maternelle le temps d’une mesure est d’une heure au maximum. Les cages avec les portées sont enrichies en cellulose douce pour le nid. De plus, l’équipe de l’animalerie effectue une surveillance réglementaire quotidienne des espaces d'hébergement et de toutes les cages.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle pour l'étude du développement du cerveau humain. Plus largement, la souris génétiquement modifée contribue à la compréhension d'une maladie génétique. Dans le cas du syndrome d'Ondine, les modèles animaux existants sont murins. C’est une maladie qui se manifeste dès la naissance. Nous avons des outils adaptés pouvant prendre en charge les modèles murins dès la naissance permettant ainsi de tester et d’évaluer des stratégies thérapeutiques. De plus, le recours aux modèles animaux en développement constitue une des recommandations de l'Agence Européenne du médicament pour évaluer les médicaments à visée pédiatrique. Les souriceaux sont étudiés dans la période juste avant et après leur naissance, jusqu'à leurs 4 premiers jours de vie.
Effets de l’altération du microbiote intestinal sur le développement des neurofibromes cutanés (NFc) chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Pour vérifier si un déséquilibre du microbiote intestinal accélère l'apparition de tumeurs cutanées, 32 souris porteuses d'une neurofibromatose de type 1 vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la peau de leur dos. Elles boivent des antibiotiques pendant huit semaines au maximum et passent deux fois sous anesthésie pour un rasage, une épilation et des photographies du dos. Certaines sont isolées, un stress social que le porteur dit compenser par des abris et des matériaux de nidification. Il présente ce protocole comme un modèle "plus éthique" et moins invasif que les lésions cutanées jusqu'ici pratiquées, alors que l'objectif déclaré est d'évaluer l'efficacité des antibiotiques à accélérer la croissance des tumeurs.
Objectifs
La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie génétique qui touche environ un million de personnes dans le monde. Les signes de cette maladie peuvent varier considérablement d’un individu à l’autre, même au sein d’une même famille. L’une de ses caractéristiques les plus visibles est l’apparition de petites tumeurs bénignes sur la peau, appelées neurofibromes cutanés (NFc), dont le nombre et la sévérité sont très hétérogènes. En plus de l’impact esthétique, ces tumeurs peuvent provoquer des démangeaisons, des douleurs et altérer fortement la qualité de vie. Cette grande variabilité suggère que, outre les causes génétiques, d’autres facteurs, notamment environnementaux, pourraient influencer l’apparition et la gravité des symptômes. Le microbiote intestinal désigne l’ensemble des micro-organismes (bactéries, virus, champignons, etc.) qui colonisent le tube digestif. Il joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions physiologiques, telles que la digestion, l’immunité et l’équilibre métabolique. Un déséquilibre de cette communauté microbienne, appelé dysbiose, est fréquemment associé à des pathologies inflammatoires ou tumorales. Des résultats préliminaires obtenus à partir d’un modèle murin reproduisant la NF1 humaine montrent que l’administration d’antibiotiques, connue pour induire une dysbiose, est associée à un développement des NFc. Le lien de causalité entre cette altération du microbiote et les effets observés reste toutefois à établir. Le projet proposé vise précisément à mieux comprendre ce lien et à identifier les mécanismes sous-jacents.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à valider et approfondir une observation préliminaire concernant l’effet d’un traitement antibiotique sur l’apparition et la progression des NFc. Il a pour objectif de mieux comprendre les liens entre le microbiote intestinal, l’inflammation et la tumorigenèse dans la NF1, ainsi que d’évaluer si ces effets peuvent être modulés par des interventions complémentaires. Les bénéfices attendus incluent des avancées scientifiques significatives sur le rôle des facteurs environnementaux dans la pathogénie de la NF1. Par ailleurs, grâce à un plan expérimental repensé, ce projet vise également à valider un nouveau modèle d’étude de la NF1 plus éthique, en proposant des protocoles moins invasifs ou stressants pour les animaux et cliniquement pertinent, reflétant davantage la diversité des patients.
Procédures
Les antibiotiques à tester seront administrés aux souris dans leur eau de boisson, pendant une période maximale de 8 semaines. Cette méthode est simple et ne cause aucune douleur ni gêne aux animaux, car elle ne nécessite pas d’anesthésie ni de manipulation particulière. Pour observer l’évolution des NFc, des photographies du dos des souris seront prises après un rasage et une épilation localisés. Ces interventions se dérouleront sous anesthésie générale (moins de 5 minutes par animal), afin d’éviter tout stress ou douleur. Deux séances seront réalisées, espacées de plusieurs semaines, dans des conditions standardisées garantissant la reproductibilité des observations et le respect du bien-être animal.
Impact sur les animaux
Les NFc qui apparaissent dans ce modèle murin sont petits, plats et non douloureux. Des études récentes montrent que, chez les personnes atteintes de NF1, ces tumeurs sont souvent moins sensibles aux sensations de chaleur ou de pression que les zones de peau normales. Dans les observations précédentes, les animaux porteurs de la mutation ne présentent aucun signe de souffrance ni de détérioration de l’état de santé avant l’âge d’un an. Le traitement antibiotique utilisé dans cette étude peut toutefois entraîner des effets secondaires, comme des troubles digestifs ou des modifications du comportement. C’est pourquoi les animaux seront surveillés de près tout au long de l’expérience, afin d’identifier rapidement tout signe de gêne ou d’inconfort. Certaines manipulations, telles que le maintien doux pendant quelques minutes ou l’anesthésie courte pour les prises d’image, peuvent entraîner un stress modéré, maîtrisé grâce à un entraînement préalable à la manipulation. L’épilation occasionnelle peut provoquer une irritation cutanée temporaire, systématiquement contrôlée. Dans les cas où des souris doivent être isolées, des mesures spécifiques seront mises en place pour limiter l’impact du stress social, notamment par l’enrichissement du milieu (abris, matériaux de nidification). L’ensemble des procédures a été conçu pour minimiser les effets indésirables potentiels, dans le respect strict des standards de bien-être animal.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures décrites dans le projet, tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements, afin d’évaluer l’efficacité des antibiotiques à accélérer la croissance des tumeurs cutanées. Pour cela la peau du dos de chaque souris sera prélevée en vue de faire une analyse cellulaire et moléculaire et seront comparées au groupe contrôle qui n’a pas reçu les molécules.
Remplacement
À ce jour, aucun modèle alternatif in vitro ou in silico ne permet de reproduire fidèlement la formation des NFc observés chez les patients atteints de NF1. Le modèle murin utilisé ici reste actuellement le seul outil disponible pour l’étude de cette forme tumorale et pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Réduction
L’inclusion des femelles dans cette étude, et probablement dans les futures — rendue possible par l’induction des symptômes via l’antibiothérapie — permet d’optimiser l’utilisation des portées issues des croisements, tout en réduisant la nécessité de générer de nouveaux animaux. Le nombre total de souris par groupe a été défini à partir de la fréquence attendue des lésions, de leur sévérité et du nombre d’observations nécessaires pour obtenir des données statistiquement robustes. Les protocoles, le suivi et les méthodes d’analyse ont été standardisés à partir d’expériences antérieures, permettant une réduction notable du nombre d’animaux requis.
Raffinement
Toutes les procédures ont été conçues pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort. L’administration des antibiotiques se fait par l’eau de boisson, sans manipulation directe. Les anesthésies nécessaires (épilations et photographies) sont brèves, réalisées avec précautions (utilisation d’un tapis chauffant et d’un gel ophtalmique). Des soins post-interventionnels comme l’application de vaseline limitent les irritations cutanées. L’isolement temporaire de certains animaux sera compensé par un enrichissement environnemental renforcé. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel technique, y compris les week-ends, avec l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être incluant des points limites. En cas de signe de détresse persistant plus de 24 h, l’animal sera retiré du protocole et mis à mort selon les standards réglementaires. Enfin, ce projet permet de valider un modèle reposant sur la dysbiose intestinale comme facteur déclenchant, sans recours aux lésions cutanées jusqu’ici nécessaires. Cette avancée ouvre la voie à des pratiques plus respectueuses du bien-être animal dans les futures études sur la NF1.
Choix des espèces
Le modèle utilisé est une lignée murine génétiquement modifiée reproduisant fidèlement les manifestations cutanées de la NF1, notamment l’apparition progressive des NFc. Ce modèle constitue à ce jour l’outil le plus adapté pour l’étude des mécanismes pathologiques de la NF1 et pour le criblage préclinique de nouvelles approches thérapeutiques. Les animaux utilisés seront des souris mâles et femelles âgées de 45 jours au début du protocole. Ce stade de développement correspond à la période initiale de formation des NFc dans ce modèle, garantissant la pertinence des observations et l’efficacité du suivi longitudinal.
Cibler les mégacaryocytes hébergeant des virus pour une restauration immunologique efficace dans les syndromes post-infectieux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 553 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 367 d'un niveau léger. Les unes reçoivent le SARS-CoV-2 par instillation nasale sous anesthésie et perdent environ 12 % de leur poids en quatre jours, une sur dix mourant de l'infection à la dose retenue. Les autres reçoivent les virus Mayaro ou Chikungunya en sous-cutané et développent un gonflement de la patte injectée. Le prélèvement de sang se fait par voie rétro-orbitale et chaque animal est tué immédiatement après, le porteur indiquant que les organes recherchés ne peuvent pas être obtenus autrement.
Objectifs
Les syndromes infectieux post-aigus (PAIS) sont des maladies qui apparaissent après une infection, quand la phase la plus forte de la maladie est terminée. Ces maladies peuvent durer longtemps et rendre la vie difficile à ceux qui en souffrent. Même si on connaît ces syndromes depuis longtemps, on ne comprend pas encore bien comment ils fonctionnent ni comment les soigner. Un exemple connu est le COVID long, qui touche certaines personnes après une infection au coronavirus. Le virus SARS-CoV-2, responsable du COVID-19, provoque d’abord des problèmes respiratoires, mais chez certains, il reste présent dans le corps et cause des symptômes qui durent plusieurs mois. D’autres virus, comme le Mayaro et le Chikungunya, présents surtout dans les régions tropicales, peuvent aussi provoquer ce genre de maladies chroniques. Ils pourraient même arriver en Europe. Notre objectif est de mieux comprendre comment ces virus restent dans le corps, en particulier dans certaines cellules. Nous nous intéressons notamment aux mégacaryocytes, des cellules surtout connues pour produire des plaquettes sanguines, mais qui pourraient aussi jouer un rôle dans la défense contre les infections. Mieux comprendre ces mécanismes pourrait aider à trouver des solutions pour améliorer la vie des personnes touchées par ces maladies.
Bénéfices attendus
Certaines cellules du sang, comme les plaquettes et les mégacaryocytes, peuvent servir de cachette à des virus. Notre équipe va donc étudier le rôle de ces cellules dans des modèles de souris atteintes de COVID long et lors d’infections par les virus Mayaro et Chikungunya (en collaboration avec l’Université Fédérale de Rio de Janeiro, au Brésil). Nous pensons qu’en ciblant ces cellules, il serait possible de renforcer le système immunitaire et d’améliorer la santé des personnes qui souffrent de symptômes persistants après une infection virale. Pour l’instant, il n’existe pas de modèles en laboratoire alternatifs à l’experimentation animale qui permettent de reproduire exactement ce qui se passe dans le corps humain à long term, après une infection. C’est pourquoi nous utilisons des souris pour mieux comprendre comment ces virus agissent et comment ils provoquent des maladies chroniques. Ces modèles sont essentiels pour tester de nouvelles idées et développer des traitements efficaces contre ces syndromes post-infectieux.
Procédures
(1) Infection du virus du COVID-19 (SARS2) par voie nasale. L’instillation nasale du virus sera réalisée sous anesthésie générale obtenue par inhalation d’isoflurane. La durée totale de la procédure, comprenant l’anesthésie, est d’environ 2 à 3 minutes. (2) Infection de MAYV/CHIKV par voie sous-cutanée. Cette procédure, effectuée sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane, dure environ 2 minutes, incluant l’installation, l’anesthésie et l’injection sous-cutanée. (3) Prélèvement sanguin par voie rétro‑orbitale. Une analgésie locale sera réalisée par le dépôt d’une goutte de collyre à base de tétracaïne. Une anesthésie générale sera obtenue par inhalation d’isoflurane. L’ensemble de la procédure dure environ 3 minutes. Les animaux seront euthanasiés immédiatement après ce prélèvement.
Impact sur les animaux
Lorsqu’on infecte les souris avec le SARS2, elles perdent du poids (environ 12 % en quatre jours) et environ 1 souris sur 10 peut mourir à cette dose. Ce modèle permet d’étudier comment le virus provoque des maladies graves, comme des atteintes aux poumons, chez l’humain. Pour les virus Mayaro et Chikungunya, lorsqu’on les injecte à des souris, celles-ci présentent un gonflement de la patte (là où le virus est injecté) et perdent aussi du poids dans les jours qui suivent. Cependant, le risque de décès avec ces virus est très faible. Ces modèles animaux sont donc utiles pour comprendre comment ces virus agissent sur le corps et pour tester de futurs traitements
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans chaque procédure sera euthanasié à terme, y compris ceux affectés aux groupes contrôles. Cette étape est indispensable car l’étude nécessite le prélèvement de tissus et d’organes spécifiques, afin d’analyser la réponse immunitaire, la persistance virale et les mécanismes pathologiques induits par l’infection. Les échantillons d’organes ne peuvent être obtenus autrement. La durée maximale de maintien en vie des animaux après le début des expériences sera d’un (1) mois.
Remplacement
Pour étudier ces maladies, il existe des modèles en laboratoire comme les organoïdes (mini-organes créés à partir de cellules). Cependant, ces modèles ne sont pas encore assez avancés ou adaptés pour notre recherche, car les syndromes post-infectieux touchent plusieurs organes à la fois. C’est pourquoi nous avons besoin d’étudier l’effet des virus sur des animaux entiers, pour mieux comprendre ce qui se passe dans tout le corps.
Réduction
Nous faisons très attention à utiliser le moins d’animaux possible tout en obtenant des résultats fiables. Pour chaque expérience, nous utiliserons seulement le nombre minimum de souris nécessaire pour que les résultats soient valides et puissent être analysés correctement. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une approche statistique permettant de garantir la puissance nécessaire des expériences. Les expériences seront répétées trois fois, avec six souris par groupe. Au total, nous aurons besoin de 550 souris d’une première lignée de souris pour l’étude du SARS2, et 370 d’une autre lignée de souris pour l’étude du MAYV/CHIKV, y compris celles utilisées pour préparer les expériences et maintenir les lignées. Cela nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Nous mettons tout en œuvre pour garantir le bien-être des animaux. Cela passe par des procédures précises, une formation du personnel, un suivi quotidien de la santé des animaux, et l’utilisation de méthodes les moins douloureuses possible. Si un animal montre des signes de souffrance, il sera pris en charge rapidement, et une euthanasie pourra être pratiquée si nécessaire pour éviter toute douleur inutile. Chaque animal sera observé chaque jour, et son état de santé sera noté selon une grille précise pour s’assurer qu’il ne souffre pas.
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé pour étudier comment notre corps réagit aux infections virales, car son système immunitaire ressemble beaucoup à celui de l’humain. De plus, il est très difficile d’obtenir certains tissus, comme la moelle osseuse, chez l’humain pendant une infection, alors que c’est possible chez la souris. Cela nous permet d’en apprendre plus sur les réactions du corps face à ces virus. Il existe aussi de nombreux outils scientifiques adaptés à la souris, ce qui rend l’analyse des réactions immunitaires plus facile et plus précise. Dans nos recherches, nous infecterons des souris femelles de la lignée Balb/c avec le virus du COVID-19 à l’âge de 8 semaines, car à cet âge, leur système immunitaire est complètement développé.Pour les virus Mayaro et Chikungunya, nous utiliserons des souris femelles de la lignée 129/sv âgées de 3 semaines, car elles présentent alors des symptômes similaires à ceux observés chez les humains malades. Cela nous aide à mieux comprendre comment ces maladies se développent et à chercher des solutions pour les traiter.
Etude du profil pharmacocinétique et de l’impact sur des biomarqueurs métaboliques circulants et tissulaires d’un composé X développé comme traitement de la dystrophie de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
174 souris saines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, réparties en sous-groupes de quatre parce que chaque point de mesure exige un très large volume de sang, obtenu en tuant les animaux. Elles reçoivent neuf administrations du composé testé, avec un risque de fausse route, de perforation de l'œsophage, de saignement et de reflux gastro-œsophagien. Le projet est mené pour une société cliente qui développe un traitement de la dystrophie de Duchenne, maladie pour laquelle il n'existe aujourd'hui aucun traitement. La perspective d'un premier médicament passe par un dossier d'autorisation d'essai clinique encore à monter, alors que l'étude mesure ici la distribution du composé chez des souris qui ne sont pas malades.
Objectifs
Le présent projet sera mené pour une société cliente qui développe un composé visant à améliorer les symptômes de la maladie de Duchenne, une pathologie humaine rare d'origine génétique touchant à 99% des hommes et pour laquelle il n'existe actuellement aucun traitement. En outre, plus de 50% des patients atteints présentent une obésité, qui résulte de la réduction d'activité physique induite par la maladie ainsi que d'une résistance musculaire à l'action de l'insuline. L'objectif du projet est de réaliser une étude pharmacocinétique chez la souris saine et de coupler cette dernière à une étude de l'impact du composé testé sur un ensemble de biomarqueurs plasmatiques et tissulaires. Compte tenu du mode d'action connu du composé testé et de la résistance musculaire à l'insuline associée à la pathologie, cette étude sera réalisée dans deux contextes métaboliques différents : à l'état basal et après administration de glucose.
Bénéfices attendus
Le projet permettra : - 1) de mieux caractériser les paramètres pharmacocinétiques plasmatiques et tissulaires du composé testé, une étape incontournable dans tout développement préclinique de médicaments. - 2) d'étudier l'impact du composé testé sur une batterie de marqueurs tissulaires et plasmatiques afin de mieux décrire son mode d'action Si elles s'avèrent positives, ces données seront alors exploitées afin de monter un dossier de demande d'autorisation d'essai clinique chez le patient humain et pourraient aboutir à la mise sur le marché d'un premier traitement pour la maladie de Duchenne.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (4 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de traitements (9 administrations; durée : 1 minute)
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel et autres manipulations et les administrations des traitements pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations de traitements occasionneront également une douleur aux animaux. Elles pourraient être également l'objet, dans de très rares cas, de fausse route chez l'animal, de perforations de l'oesophage et de saignements, ainsi qu'à des reflux gastro-oesophagiens.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer un large volume de sang nécessaires aux dosages ainsi que certains organes afin d'y étudier la distribution du composé testé.
Remplacement
Le présent projet vise à déterminer les paramètres pharmacocinétiques ainsi que l'impact sur différentes voies métaboliques du composé testé. Le recours à l’animal entier reste une étape nécessaire et obligatoire d'un point de vue règlementaire pour une demande de premier essai clinique chez l'humain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure d'obtenir des données significatives sur les paramètres pharmacocinétiques étudiés. Le nombre d'animaux par groupe a été choisis selon les recommandations d'un ouvrage de référence. Le nombre de 28 animaux par groupe a été choisi en tenant compte de la nécessité de créer 7 sous-groupes de 4 animaux par groupe expérimental (hormis le groupe contrôle qui comprend 34 animaux du fait d'un sous-groupe supplémentaire de 6 animaux). Ces sous-groupes sont nécessaires car la finalité du projet nécessite un très large volume sanguin pour chaque point de prélèvement sanguin afin de déterminer les paramètres pharmacocinétiques plasmatiques et les dosages des voies métaboliques étudiées dans le projet, ainsi qu'un prélèvement d'organes afin d'étudier la distribution tissulaire du composé testé.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (3/4 souris par cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur.
Choix des espèces
La souris est classiquement utilisée pour les études de pharmacocinétique. En effet, il s'agit d'un modèle pratique, génétiquement modulable et scientifiquement validé pour explorer les caractéristiques pharmacocinétiques d’un candidat médicament. En outre, malgré des différences interespèces, les souris partagent beaucoup de voies métaboliques avec l’humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte (10 semaines à réception). Ce stade de développement a été choisit car le traitement en développement qui est évalué dans le présent projet est destiné à une administration chez le jeune adulte.