Rongeurs

Gavées chaque jour pendant vingt et un jours, infectées à J0 par Clostridioides difficile après une injection d'antibiotique, 60 souris âgées de douze à dix-huit mois subissent neuf prélèvements de sang et neuf prélèvements de fèces. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées sous anesthésie profonde après un dernier prélèvement. L'objet déclaré est de vérifier si une souche de Clostridium butyricum réduit la mortalité de cette colite, première cause de diarrhée nosocomiale dans le monde. La rubrique des effets indésirables tient en trois lignes, mentionne des "changements temporaires dans l'appétit ou le comportement" et des effets "potentiellement réversibles", sans décrire ni la diarrhée ni la mortalité que le projet annonce pourtant vouloir réduire.

Objectifs

La colite à Clostridioides difficile est la première cause de diarrhée nosocomiale dans le Monde avec une mortalité élevée. Nous avons, au cours de précédents travaux in vitro, observé une capacité inhibitrice de certaines souches de Clostrdidium butyricum sur la croissance de souches toxinogènes de Clostridioides difficile. Le projet consisite à évaluer l’efficacité et la tolérance de l’administration de Clostridium butyricum par voie orale afin de réduire la mortalité sur un modèle murin de colite à Clostridioides difficile.

Bénéfices attendus

- Identification de C. butyricum comme probiotique potentiel pour prévenir ou traiter les infections à C. difficile. - Contribuer à la recherche sur les mécanismes d'action des probiotiques dans le microbiote intestinal. - Fournir des informations sur l'interaction entre les bactéries bénéfiques et pathogènes dans l'intestin.

Procédures

Les souris seront soumises aux prélèvements suivants : neuf prélèvements sanguins seront effectués aux jours J-6, J-1, puis les jours J1 à J3 après le gavage de Clostridioides difficile, et ensuite aux jours J6, J8, J10 et J14. En parallèle, neuf prélèvements de fèces seront effectués aux mêmes dates. Chaque prélèvement prendra moins de 5 minutes. Par ailleurs, les souris recevront un gavage quotidien de Clostridium butyricum ou de solution de dilution (groupe témoin) depuis J-6 jusqu'à J14, d'une durée maximale de 5 minutes par gavage. Un gavage unique de Clostridioides difficile ou de solution de dilution sera administré au jour J0, également pendant 5 minutes maximum. De plus, les souris recevront une injection d'antibiotique (ou de tampon de dilution pour le groupe témoin) au jour J-1. A la fin de la procédure, pour l’acte d’euthanasie, l’animal sera en contention pour une durée de moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

- Réactions au site d'injection. - Changements temporaires dans l'appétit ou le comportement. - Effets liés à l'infection, potentiellement réversibles avec des soins appropriés.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux: Les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour permettre le prélèvement sanguin et/ ou d’organes avant l’euthanasie finale.

Remplacement

Il s'agirait ici d'une étude préclinique pour confirmer l'effet probiotique de certaines souches de C. butirycum sur l'infection à C. difficile. Nous avons choisi le modèle murin pour la colite à C. difficile comme décrit dans la littérature. Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie.

Réduction

L'outil statistique approprié, utilisé pour notre étude, suggère qu'il faudrait 60 souris au total pour ce projet comprenant 2 procédures. Une étude pilote sera réalisée en première intention sur 20 souris afin de réduire le nombre d'animaux dans l'ensemble de ce projet.

Raffinement

Lors de nos différentes procédures d’infection, les souris seront immobilisées pour une durée de moins de 5 min. A la fin de nos procédures ou en cas d’atteinte d’un point limite, les souris seront anesthésiées avant euthanasie. Un test de réflexe (pincement extrémité patte) sera effectué afin de valider l’anesthésie. En cas de survenue de signes avérés de souffrance suivant la grille de score couplé à ce projet, la température corporelle sera prise et un analgésique pourra être administré. Une surveillance appropriée sera mise en place par du personnel habilité.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie. Nous utiliserons des souris adultes (12 à 18 mois), car elles sont représentatives des conditions humaines en matière de réponse immunitaire et d'infection, ce qui est essentiel pour notre étude sur l'inhibition de C. difficile.

63 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont irradiées, puis reçoivent sans anesthésie une injection de cellules sanguines humaines qui déclenche une maladie du greffon contre l'hôte, atteignant la peau, le tube digestif et le foie, avec une perte de poids progressive sur quatre à six semaines. Une leucémie humaine leur est également greffée, puis suivie chaque semaine par imagerie sous anesthésie jusqu'à un volume tumoral fixé à l'avance. L'objectif immédiat est le dépôt d'un dossier non clinique auprès de l'ANSM, le porteur affirmant qu'aucune simulation informatique ne reproduit ces interactions et que le modèle murin reste "le seul modèle validé".

Objectifs

La greffe de cellules sanguines issues d'un donneur volontaire sain est considérée comme le seul traitement permettant d’obtenir la guérison de certains cancers du sang chez l'Homme. La greffe permet que le système immunitaire du donneur reconnaisse comme étrangères les cellules cancéreuses du receveur et les tue : c’est ce qu’on appelle l’effet anti- tumoral (ou anti-leucémique) du greffon. Toutefois, les cellules du système immunitaire du donneur sont incapables de faire la différence entre une cellule cancéreuse et une cellule saine du receveur. L’attaque des cellules saines du receveur par le système immunitaire du donneur s’appelle la maladie du greffon contre l’hôte. Une stratégie prometteuse qui permettrait de moduler la maladie du greffon contre l’hôte sans altérer l’effet l’effet anti- tumoral du greffon est la thérapie cellulaire, notamment avec les cellules myéloïdes régulatrices (MDSCs). Notre objectif est de développer un médicament de thérapie innovante pour moduler les conflits hôtes/greffon dans le contexte de la transplantation de cellules sanguines à partir d’un donneur volontaire sain. Nous avons développé une méthode pour obtenir rapidement des "MDSCs" obtenues à partir d’un échantillon de greffon de donneur sain, conduisant au dépot d'un brevet. Précedemment, nous avons identifié la dose injectée minimale pour obtenir une diminution de l'incidence et de la sévérité de la maladie du greffon contre l'hôte dans un modèle pré-clinique murin. L'objectif de ce projet est triple 1/Reproductibilité de l'efficacité des MDSCs injectées au moment de la transplantation, en injectant des MDSCs issues de 3 lots différents de production. 2/L'évaluation de la dispertion des cellules dans les organes cibles et l'infiltration/différenciation des cellules injectées dans ces organes. 3/ L'absence d'effet néfaste de la thérapie notamment de l'absence de favorisation de cellules leucémiques. Il s’agit d’un projet multisite dans deux EU différents.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus à moyen terme de ce projet sont de déposer un dossier technique complet (dossier non clinique) auprès de l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) afin de proposer un jour notre thérapie cellulaire chez l’Homme. Le projet va permettre de 1/ de confirmer chez l'animal l'efficacité du produit de thérapie cellulaire. 2/Etudier la répartition tissulaire des cellules après l'injection. 3/ Vérifier l'absence d'aggravation de la leucémie (leucémie, principale indication actuelle en clinique pour la greffe de cellules sanguines humaines à partir d'un donneur sain). A plus long terme, si ce produit de thérapie cellulaire est efficace et peu toxique dans la greffe de cellules sanguines, il pourrait s'étendre à d'autres applications comme la transplantation d'organes solides pour moduler les conflits hôte/greffon.

Procédures

-Une irradiation faible dose, de chaque animal pour 63 souris réalisée une seule fois (durée d'environ 2 minutes sur une journée).: -Une injection intraveineuse sur animal conscient (non anesthésié) de cellules sanguines humaines, une seule fois en début d’expérience pour 63 souris (dure environ 5 secondes sur une journée). -Une anesthésie générale répétée (X4 maximum) pour 63 souris (anesthésie générale de 15 à 30 minutes maximum sur une journée). L'anesthésie générale est prévue soit 4 fois dans 1 semaine pour suivre par imagerie la dispertion et répartition tissulaire des cellules une fois par semaine (maximum 4 semaines) pour le suivi de la leucémie.

Impact sur les animaux

-la douleur légère induite par la piqure d’aiguille à l’injection des cellules (J0) -stress modéré lors de la procédure d'irradiation à faible dose, -Potentielles mais rares lésions d'inflammation de la muqueuse de la bouche après irradiation (pendant 3-5 jours) -Stress lié aux injections et aux anesthésies générales -Potentiels signes de maladie du greffon contre l’hôte (atteinte de la peau, du tube digestif et/ou du foie), avec une sévérité habituellement modérée. Les souris vont alors très progressivement (sur 4 à 6 semaines) perdre du poids et montrer des signes de fatigue et d’altération de l’état général. -Développement leucémique lent infiltrant la rate, le foie et les ganglions. Cette infiltration leucémique des organes est contrôlé par l'imagerie hebdomadaire basée sur la bioluminescence (technique permettant de visualiser l'activité des cellules in vivo grâce à de la lumière produite par réaction chimique après injection d'une substance inoffensive) qui permet d'arrêter l'expérimentation à un volume tumoral cible sans laisser se développer les symptômes terminaux de la leucémie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour confirmer les données cliniques et de bioluminescence (technique permettant de visualiser l'activité des cellules in vivo grâce à de la lumière produite par réaction chimique après injection d'une substance inoffensive) par des données microscopiques. Tâche1: prélèvement des organes cibles de la maladie du greffon contre l'hôte (peau, tube digestif, foie) pour analyse au microscope de la sévérité de la maladie développée. Tâche 2: prélèvement des organes cibles dans lesquels patrouillent les MDSCs pour observer par microscopie la localisation exacte et le devenir des MDSCs. Tâche 3: prélèvement des organes envahis par la leucémie pour explorer d'éventuels contacts cellulaires entre les cellules leucémiques et les MDSCs.

Remplacement

Nous avons optimisé in vitro nos connaisances sur le mécanisme d'action des MDSCs. Toutefois, pour proposer les MDSCs comme médicament de thérapie innovante chez l'Homme, une étude pré-clinique robuste dans un modèle murin est indispensable. En effet, dans les cancers liquides, aucune simulation informatique ("modèle in silico" )ne permet aujourd'hui de reproduire en laboratoire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules en thérapie. A ce jour, le seul modèle validé est le modèle murin.

Réduction

Nos études antérieures ont révélé un effet important de nos traitements, aboutissant à des différences significatives entre des groupes même avec un faible nombre d'animaux (n=3). Ainsi pour chaque tâche expérimentale, des groupes de taille minimale de trois animaux seront constitués.Des analyses statistiques seront réalisées pour interpréter les résultats. Afin de prendre en compte une viariabilité liée au donneur (variation d'efficacité d'un produit cellulaire en fonction du donneur humain d'origine), chaque tâche sera repétée trois fois avec des cellules issues de trois donneurs différents.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un secteur spécifique pour les animaux avec une déficience profonde de leur système immunitaire, en animalerie exempte d'organisme pathogène spécifique. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Les expérimentations d'imagerie seront atourées d'une anesthésie. Les points limites sont clairement identifiés : des signes généraux sur l'évaluation clinique de l'état général de la souris et le développement de signes cliniques de conflits hôte/greffon) et des signes spécifiques de chaque expérimentation ( suivi de la croissance tumorale), conduisant à un arbre décisionnel pour l'arrêt anticipé de la souffrance.

Choix des espèces

La modèle animal murin utilisé est un modèle mondialement reconnu pour étudier la greffe de cellules sanguines humaines. Ces souris n'ont pas de système immunitaire fonctionnel capable de rejeter des cellules sanguines de l'Homme (ce qui permet une étude à long terme des cellules sanguines humaines injectées). En revanche elles ont des cellules présentatrices d'antigènes qui peuvent activer les cellules sanguines humaines acceptées. Ainsi, ce modèle reproduit la maladie du greffon contre l'hôte couramment observé chez les patients greffés. On observe une réactivité des cellules sanguines humaines contre les organes cibles de la souris ( la peau, le tube digestif et le foie), ce qui mime ce qui est observé chez l'Homme. D'autre part, la greffe de cellules sanguines d'un donneur sain vers un patient est en général indiquée pour véhiculer un effet du greffon contre la leucémie. Or l'adjonction de lignées leucémiques humaines dans ce modèle de souris reproduit le contexte leucémique d'un patient. Notre projet vise à étudier l'administration d'un nouveau médicament (produit à partir de cellules du greffon du donneur) dans ce contexte de greffe de cellules sanguines. Nous devons étudier l'impact de ce nouveau médicament sur l'incidence et la sévérité de la maladie du greffon contre l'hôte et l'absence d'effet qui pourrait favoriser la leucémie. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe de cellules humaines est meilleure dans cette période de vie

216 souris privées de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, avec un volume de tumeur autorisé jusqu'à 1 500 mm3. Cent quarante-quatre d'entre elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du pancréas sous la peau, cent huit une injection intraveineuse de nanoparticules, trente-six une injection directe dans la tumeur. Le porteur écrit pouvoir "imaginer" une perte de poids et de motricité chez les animaux dont la tumeur grossit. Aucun traitement n'est évalué à ce stade : les 216 souris sont utilisées pour choisir la souche, la dose et la voie d'administration de l'essai thérapeutique à venir, dont l'effectif n'est pas indiqué.

Objectifs

Le cancer du pancréas est la 12e forme de cancer la plus fréquente, mais l’une des plus meurtrières, avec un taux de survie très faible. En France, environ 15 000 nouveaux cas par an (légèrement plus d'hommes que de femmes) sont diagnostiqués avec une incidence en augmentation depuis plusieurs décennies, en partie à cause du vieillissement de la population et de facteurs de risque (tabac, obésité, diabète, alcool...). La survie du cancer du pancréas reste malheureusement l’une des plus faibles parmi tous les cancers, en raison de son diagnostic souvent tardif et de sa progression rapide. En France la survie nette à 5 ans (tous stades confondus) est Hommes : environ 9 % et Femmes : environ 10 %. L’objectif de ce projet est de faire une étude préliminaire (étude pilote) qui lèvera des verrous techniques (variabilité des modèles, voies optimales d’injection des nanoparticules) et scientifiques pour les choix du projet global à venir par la suite. Il s’agit d’une première partie d’étude préclinique pour le développement de nanoparticules thérapeutiques seules ou chargées dans des cellules qui seraient utilisées comme vecteurs. Ces nouvelles nanoparticules seront utilisées dans le traitement du cancer du pancréas. Plus précisément, les nanoparticules seront utilisées en présence de champs magnétiques et ce afin de valider une approche thérapeutique par hyperthermie magnétique. Ceci sera détaillé lors du dépôt de la seconde DAP dans laquelle le protocole thérapeutique sera détaillé. Le projet se découpe en 2 procédures expérimentales : La première procédure expérimentale vise à caractériser le développement tumoral de deux modèles in vivo chez des animaux immunodéficients. La deuxième procédure expérimentale vise à démontrer la tolérance et la bioaccumulation des nanoparticules dans les tissus en comparant deux voies d’administration.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet global sont de pouvoir valider une nouvelle nanoparticule pour le traitement du cancer du pancréas. Cette première partie, courte et considérée pilote nous aidera dans le choix de souche de souris d'intérêt, le type de cellules vecteurs plus pertinentes, la dose de nanoparticules et la voie d'administration d'intérêt. Cela permettra donc de réduire le nombre de groupes expérimentaux par la suite pour l’étude thérapeutique.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - chirurgie : injection de cellules sous-cutanée de cellules tumorales : 144 souris concernées = 5 min /souris - injection intraveineuse : 72 souris saines + 36 souris avec tumeurs = 5 min /souris - injection intra-tumorale : 36 souris avec tumeurs = 5 min /souris

Impact sur les animaux

D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous pouvons imaginer observer une perte de poids et de motricité chez les animaux ayant développé des tumeurs sous-cutanées de volume important. Afin d’éviter cela, nous avons prévu un volume maximum de tumeur à atteindre de 1500mm3. L’inoculation de tumeur sous-cutanée peut induire des douleurs, juste après l’inoculation. Pour la deuxième procédure, l’injection des particules véhiculées dans les différents types cellulaires est prévue en intraveineux. Une gêne autour de la veine de queue utilisée peut apparaître à ce moment. Dans le groupe avec une tumeur, les douleurs dues à l’inoculation de la tumeur en sous-cutanée peuvent apparaître juste après l’inoculation.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de cancer de pancréas afin de déterminer le comportement de ces lignées. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico. Le projet par lui-même est une étude pilote pour établir le bon choix de souche de souris, de modèle tumoral et de voie d’administration de la molécule d’intérêt qui traitera in fine des cancers du pancréas. Une suite est prévue une fois ces informations traitées.

Réduction

Nous avons établi des groupes d’animaux minimaux pour permettre de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur ainsi que la voie d’administration et les doses optimales à utiliser pour l’utilisation des nanoparticules dans les cellules vectrices. De plus, des simulations statistiques ont été réalisées à l’aide de données issues de la littérature complétées par des simulations à l’aide d’outils en ligne régulièrement utilisés en recherche.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de trois individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation de minimum 6 jours et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, coton). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera faite trois fois par semaine incluant une mesure de poids par balance et mesure des volumes tumoraux au pied à coulisse. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de leur cage ainsi que de complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter et compenser la perte de poids attendue suite aux procédures expérimentales. Les procédures ont été pensées de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Il s'agit d'animaux OGM, au système immunitaire affaibli. Ils sont donc hébérgés en animalerie spécifique, en environnement controlé afin d'éviter tout risque d'infection et donc éviter un phénotype dommageable.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la tumeur tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral dont les interactions avec les cellules tumorales qui peuvent biaiser l’effet thérapeutique du traitement. Le développement de tumeurs humaines nécessite l’utilisation d’individus immunodéficients afin d’éviter tout rejet de greffe. Nous utiliserons donc des souris au système immunitaire déficient « SCID » qui sont considérées les plus pertinentes dans l’étude de tumeurs pancréatiques. Nous utiliserons des mâles et des femelles, tenant compte que la prévalence du cancer du pancréas touche aussi bien les hommes que les femmes. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, tous les organes sont formés et fonctionnels.

Produire des souris qui développent d'elles-mêmes des tumeurs mammaires, puis les tuer pour en prélever les tissus : le projet ne prévoit pas d'autre activité que l'élevage d'une lignée transgénique. 134 souris femelles vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur écrit n'avoir jamais observé les stades les plus avancés, tout en admettant qu'ils pourraient s'accompagner d'une perte de poids, d'une apathie et d'une difficulté à se mouvoir. La conduite tient à un seuil de taille : quand un zootechnicien palpe une tumeur qui approche du maximum autorisé, il le signale et l'animal est sorti ou tué dans les plus brefs délais.

Objectifs

Le but du projet est de produire des souris présentant spontanément des tumeurs mammaires afin de prélever des tissus sur ces animaux après euthanasie.

Bénéfices attendus

En permettant l'élevage de cette lignée transgénique qui développe des tumeurs, le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des cancers mammaires.

Procédures

C’est l’élevage d’une lignée de souris présentant spontanément des tumeurs mammaires.

Impact sur les animaux

Seules les souris femelles (et pas les mâles) transgéniques développent spontanément des tumeurs mammaires. Il n'y a donc pas d'intervention pour favoriser ce processus de cancérisation. Cependant, même si nous ne l'avons jamais observé, aux stades les plus avancés de la maladie, des souris pourraient présenter des signes d'affaiblissement, avec une perte de poids et une apathie, voire une difficulté à se mouvoir si les tumeurs mammaires étaient maintenues au-delà du point limite.

Devenir

Les souris présentant des tumeurs sont euthanasiées à la fin des procédures, soit pour des prélèvements post-mortem, soit parce qu'elles atteignent le point limite.

Remplacement

Nos souris transgéniques développent spontanément des tumeurs mammaires. Elles serviront à générer des prélèvements après euthanasie qui seront utilisés en recherche. Même s’il est maintenant possible d'utiliser des cellules en culture, il n'est pas possible de reproduire la diversité de cellules présents dans une tumeur, ni l'évolution de la nature de ces cellules au cours du temps. L’étude de ces prélèvements permettra de comprendre les mécanismes sous-jacents au développement du cancer du sein.

Réduction

Le nombre de souris est limité au minimum pour maintenir la colonie et produire les animaux nécessaires pour notre étude. Ce nombre doit permettre d'obtenir un nombre suffisant d'animaux à prélever. Nous prévoyons que 134 souris développant des tumeurs seront produites au cours des 5 ans du projet.

Raffinement

Les souris sont élevées avec un enrichissement du milieu au niveau de la litière avec du coton et une cabane en carton. Les souris sont suivies quotidiennement et lorsque des tumeurs mammaires apparaissent, un suivi visuel et par palpation est réalisé. Si le zootechnicien constate l’apparition d’une tumeur qui pourrait s'approcher de la taille maximale autorisée, il doit le signaler immédiatement et l’équipe de recherche demande la sortie de l’animal ou l’euthanasie dans les plus brefs délais.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la croissance tumorale. Pour toutes les reproductions des animaux de 6 semaines en capacité optimale de reproduction sont utilisés. Les animaux utilisés à des fins scientifiques ont 4, 8 ou 12 semaines.

4 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises pendant six à douze mois à des régimes enrichis en gras et en sucre destinés à provoquer une stéatose puis un cancer du foie, avec une injection intraveineuse sous anesthésie, huit à douze échographies hépatiques, trois prélèvements de sang et un transport entre deux établissements. Le porteur attend une prise de poids importante pouvant modifier leur mobilité et leur comportement, ainsi qu'une altération de l'état général liée au développement des tumeurs. Les retombées annoncées, de nouveaux outils de diagnostic et de nouvelles pistes thérapeutiques, sont renvoyées à un "futur proche", tandis que le recours à la souris est déclaré "indispensable" au motif qu'aucune lignée cellulaire ne restituerait les interactions du foie avec les autres organes.

Objectifs

Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire. (MODIFICATION) L'ajout des prélèvements sanguins nécessite une modification du projet sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnostic et pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris) (MODIFICATION: et trois prélèvements sanguins seront réalisés sur ces animaux au cours du projet (3 fois, 1 minutes, animal vigile)]. Une autre partie des animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). (MODIFICATION :Un prélèvement sanguin de plus grand volume sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié en fin de projet (1 fois, 2 minutes)). Une partie des animaux sera sujette à un transport entre centres de recherche. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général. (MODIFICATION : De la douleur légère de courte durée peut être ressentie au point de prélèvement pour les prélèvements sanguins. Dans de très rares cas une perte de sang hémorragique peut être observée). Enfin, le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs impliqués peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (4608).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

4608 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.

Les souris utilisées portent une altération génétique censée reproduire la myopathie de Duchenne, mais le porteur précise que le modèle n'en présente qu'une forme légère, avec une espérance de vie intacte et une locomotion spontanée normale, quand les patients meurent vers 25 ans. 106 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit 53 administrations du composé testé, seize pesées, quatre mesures de composition corporelle, trois prélèvements de sang et deux mesures de force musculaire sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les muscles des pattes, le cœur et le diaphragme, au bénéfice d'un client dont le porteur espère qu'il portera la molécule jusqu'au marché.

Objectifs

La myopathie de Duchenne est une maladie d'origine génétique induisant une dégénérescence progressive de l’ensemble des muscles de l’organisme. Elle est liée à une anomalie génétique, responsable de la production d’une protéine impliquée dans le soutien de la fibre musculaire. Chez les patients atteints de cette maladie, qui sont à 99,5% des hommes, les fibres qui constituent les muscles squelettiques et cardiaque se détériorent à chaque contraction et finissent par se détruire. Des cellules souches musculaires tentent de régénérer le tissu musculaire lésé, mais ce processus est vite débordé et la dégénérescence finit par l’emporter. Les patients atteints de la maladie de Duchenne présentent ainsi une espérance de vie très réduite, de l'ordre de 25 ans, du fait notamment de complications cardiaques et respiratoires. La recherche est ainsi très active concernant cette maladie et plusieurs pistes visant à mise au point d’un traitement curatif sont actuellement à l’étude. Néanmoins, à aujourd'hui, il n'existe aucun traitement curatif sur le marché. En revanche, les patients sont le plus souvent traités à l'aide d'anti-inflammatoires afin de réduire l'inflammation musculaire et alléger quelque peu les symptômes de la maladie. Le présent projet vise à étudier les effets d'un composé X en développement sur les symptômes musculaires liés à la myopathie de Duchenne en association ou non avec ces anti-inflammatoires. Le modèle employé est un modèle de mutation génétique spontanée qui présente des symptômes proches de la maladie de Duchenne chez l'humain, bien que les symptômes soient moins prononcés. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur les capacités musculaires du modèle de maladie de Duchenne, dans le cadre d'une administration seule ou en co-traitement avec des anti-inflammatoires.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé visant à traiter les conséquences musculaires de la maladie de Duchenne chez l'humain. Alors que plusieurs molécules ont été testées ces vingt dernières années, il n'existe toujours aucun médicament curatif de la maladie de Duchenne. Il s'agit donc d'une pathologie présentant un besoin médical très important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de la maladie de Duchenne.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (16 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Analyse non invasive de composition corporelle (4 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 3) Administration de traitements (53 administrations; durée : 1 minute); 4) Mesures in vivo de la force musculaire sous anesthésie avec réveil (2 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 20 minutes), 5) Prélèvements sanguins (3 prélèvements, durée du prélèvement : 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle, les prélèvements sanguins et les administrations des traitements pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les injections pour réaliser les traitements seront source de douleurs légères et transitoires. Les mesures de force musculaire in vivo nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Enfin, les animaux pourront subir des troubles digestifs mineurs du fait des traitements chronique par les anti-inflammatoires.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les muscles des pattes, le coeur et le diaphragme pour des analyses fonctionnelles (mesures de force musculaire) et histologiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de tester, suite à une première série d'études menées sur cultures cellulaires, le composé sur organisme entier afin de vérifier que les effets observés dans ces premières étapes se traduisent effectivement en un bénéfice dans le cadre de la pathologie. Par ailleurs, l'étude sur animal reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre de 12 animaux par groupes utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés en tenant compte de l'hétérogénéité du modèle mdx. Le groupe contrôle du modèle, constitué de souris sauvages, a été réduit à 10 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu que la maladie de Duchenne touche à 99,5% des garçons, l'étude sera limitée au seul genre mâle.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2/3 souris par cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les procédures de mesure de la force des muscles de la patte arrière seront réalisée chez la souris anesthésié. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée. Il est a noter qu'une étude préalable de toxicité a été réalisée afin de déterminer la dose de composé X employée dans le présent projet : aucun effet toxique n’a été observé, même à des doses 10 fois supérieures à la dose qui sera ici employée. Enfin, pendant la seconde semaine d'habituation les animaux seront habitués par 2 fois (pendant 2 minutes) aux tubes de contention nécessaire à la mesure de composition corporelle et aux prélèvements sanguins.

Choix des espèces

La modèle génétiquement altéré que nous emploieront est classiquement utilisé pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la dystrophie de Duchenne et pour tester des candidats médicaments au stade préclinique visant à traiter cette pathologie. Le modèle récapitule de nombreux symptômes de la pathologie de Duchenne, bien qu'il n'exhibe qu'une forme relativement légère de la maladie comparativement à l'humain (espérance de vie non réduite et locomotion spontannée non affectée par la mutation). Ces souris présentent une diminution de leur force musculaire comparativement aux souris sauvages dès 5 semaines d'âge. Elles présentent également une hypertrophie musculaire, mais cette dernière ne compense pas la perte de force. Cette hypertrophie persiste jusqu'à la fin de vie des animaux (leur durée de vie n'est pas affectée par la mutation) mais reste néanmoins légère et n'entraine aucune perturbation de l'activité locomotrice spontanée des souris mutantes comparativement aux souris sauvages. Les souris seront reçues à 5 semaines d'âge. Cet âge a été déterminé en fonction de la cinétique des défaut musculaires observés chez ce modèle. En effet, à partir de 12 semaines, le modèle commence à présenter une hypertrophie musculaire progressive. Bien que la force musculaire des souris génétiquement altérées reste inférieure à celle des souris sauvages à tout âge, et compte tenu de la durée du traitement, nous souhaitons que les souris ne présentent pas une hypertrophie musculaire trop marquée en fin d'étude.

Une fausse route pendant le gavage entraîne la mise à mort immédiate de l'animal, et une perte de 20 % du poids déclenche la même issue. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs organes. Elles sont gavées une fois par jour pendant trois mois au maximum, subissent des prélèvements de sang derrière l'œil, des courses sur tapis roulant, un maintien en équilibre sur une roue en rotation, une heure trente d'IRM et vingt minutes d'échocardiographie. Le porteur affirme que le test chez la souris est un "requis obligatoire" avant le passage à l'homme, pour cinq composés déjà commercialisés dans d'autres indications.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour. Le projet se déroule dans 3 Etablissements Utilisateur: EU 1/3, EU 2/3, et EU 3/3.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (1 fois par jour pendant 3 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste, et uniquement si le traitement en eau de boisson n'a pas d'effet bénéfique) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Sur un même animal seront effectuées plusieurs gestes afin de tester la capacité des médicaments à supprimer des déficits: 1- suivi de poids à l'EU 1/3 (20 secondes par animal) 2- Course sur un tapis roulant et équilibre sur une roue en rotation, dans le but d'évaluer les fonctions musculaires (endurance, motricité et équilibre) à l'EU 1/3 (15 minutes maximum par animal) 3- Prélèvements sanguins dans le but d'effectuer des dosages à l'EU 1/3 (30 secondes par animal) 5- IRM dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 3/3 (1H30 par animal) 6- Echocardiographie dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 2/3 (20 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les projets précédents nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 4 et 3 mois respectivement. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. L'éventuel gavage (uniquement si le traitement dans l'eau de boisson n'est pas bénéfique) pourrait à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 1 fois par jour durant 3 mois lors d'un précédent projet n'ont pas révélé de nuisances particulières. Néanmoins, lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet précédentes.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des souris mâles modèles du syndrome de Barth inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance - points limites spécifiques à chaque geste développé dans chaque procédure. Le gavage 1 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l'animal sera immédiatement euthanasié. La surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux mâles modèles du syndrome de Barth, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les souris contrôle seront séparés des souris mâles modèles du syndrome de Barth dans les cages. Néanmoins les souris mâles modèles du syndrome de Barth n'ont pas montré de difficultés à se nourrir et à boire. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquat et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert entre établissements utilisateurs ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des caisses agréées contenant copeaux, cotons, nourritures et litière propre sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire; Puis période d'acclimatation de 3-4 jours sur le site d'accueil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage. Par ailleurs, les femelles allaitantes auront le traitement dans l'eau de boisson afin que les petits en bénéficie dès la naissance via le lait jusqu'au sevrage.