Rongeurs

Tuées à la fin de chaque procédure parce qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées, 1 112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la rate par chirurgie, puis viennent jusqu'à dix injections, dix prises de sang et neuf séances d'imagerie sous anesthésie par animal, pour tester un vaccin contre le cancer du foie lié au virus de l'hépatite B. Le porteur écrit que la croissance de la tumeur hépatique "est tolérée par les souris" tout en indiquant qu'elle peut affecter leur capacité à s'alimenter. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer l'immunogénicité des vecteurs et que la complexité des réponses vaccinales dans un "organisme entier" impose l'animal.

Objectifs

Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules qui subissent une transformation maligne. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement certaines cellules immunitaires capables de tuer des cellules tumorales de façon spécifique. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur de nouveaux candidats vaccins pourrait être particulièrement efficace pour activer ces cellules immunitaires et contrôler la prolifération tumorale. Dans un premier temps, le but est d'établir des lignées tumorales exprimant des antigènes du virus de l'hépatite B au niveau du foie des souris. En cas de succès, l’objectif sera d'évaluer l’efficacité des candidats vaccins seuls, ou en combinaison avec des molécules anticancéreuses, à éliminer ces tumeurs. Cela permettra d’établir la preuve de concept de cette immunothérapie contre le cancer du foie et d’étudier les mécanismes du contrôle immunitaire mis en place dans l’organisme par une vaccination thérapeutique basée sur ces nouveaux candidats vaccins. Ultimement, les vaccins candidats ayant une activité antitumorale notable seront développés en vue d’un essai clinique

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme de ce projet sont la validation de la preuve du concept préclinique d'utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur des candidats vaccins, avec ou sans combinaison avec d’autres molécules anticancéreuses, dans l’immunothérapie du cancer du foie lié à l'infection par le virus de l'hépatite B. L’avantage à long terme du projet actuel sera l'utilisation de ces vaccins d’immuno-oncothérapie dans le contexte d’une co-administration en clinique dans le but d’obtenir un effet additif ou synergique de la réponse immunitaire contre des tumeurs hépatiques.

Procédures

Pour un groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 7x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 7x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 6x Pour un autre groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 10x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 10x - Injections sur animaux vigiles (quelques secondes): 1 ou 2x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 9x Pour un autre groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 10x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 10x - Injections sur animaux vigiles (quelques secondes): 4x - Injection sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 9x

Impact sur les animaux

L'injection dans la rate des cellules tumorales nécessite une chirurgie et des complications post-opératoires comme des infections peuvent survenir pendant toute la période de suivi. La croissance de la tumeur au niveau hépatique est tolérée par les souris mais peut, dans certains cas, s’associer à une perte d'activité et affecter leur capacité à s'alimenter. Les animaux sont susceptibles de ressentir une légère douleur au moment des injections de vaccins, d'anticorps ou des prises de sang. Cette douleur sera de courte durée et sans impact significatif sur leur bien-être ou leur état général. Douleur au point de piqure et stress lors des prélèvements de sang sur animaux vigils.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les souris présentant des tumeurs seront euthanasiées pour des raisons éthiques (pour éviter les souffrances). Les souris sans tumeur ne peuvent être réutilisées car leur système immunitaire a été modifié par la vaccination.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité vaccinale antitumorale d’un vaccin thérapeutique, injecté seul ou en co-injection avec des molécules anticancéreuses, destiné ultimement à la thérapie de certains cancers du foie. Actuellement, aucun système cellulaire in vitro ne peut être utilisé pour remplacer la recherche vaccinale, car aucun modèle in vitro ne permet d’évaluer l’immunogénicité des vecteurs d’immunisation. Ce type d’étude implique nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité des réponses vaccinales et antitumorales au niveau d’un organisme entier. Les mécanismes en jeu sont multifactoriels et ne sont pas encore caractérisés de manière exhaustive. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’humain, en complément des études réalisées in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience est déterminé en prenant en compte que le développement d’une tumeur et son interaction avec le système immunitaire comporte une large variabilité entre les individus, comme chez l’homme. En choisissant des animaux d’âge proche, il est possible de réduire au maximum cette variabilité. Toujours pour réduire le plus possible le nombre de souris utilisées tout en s’assurant qu’un nombre suffisant sera inclus de façon à rendre les résultats concluants, le nombre d’animaux et de répétitions par expérience ont été définis en fonction de la nature de l’expérience et validés suite à l’exposé et à la discussion du projet avec un biostatisticien. Sur ses conseils, les groupes seront constitués de 10 animaux du fait de la capacité d’implantation et de la variabilité de la croissance tumorale de manière à obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes. Ce nombre pourra être réduit si la variabilité observée lors de la première procédure est moins élevée que celle actuellement estimée. Des études précédentes ont permis d’optimiser notre protocole de vaccination et de définir la cinétique de vaccination permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les vaccins utilisés dans cette étude ont été préalablement validés par des études d’immunogénicité chez la souris afin de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses spécifiques contre les tumeurs chez la souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. Si les tumeurs ne s'implantent pas ou si un candidat vaccin n'a pas d’effet significatif sur la croissance de la tumeur, les procédures suivantes ne seront pas réalisées.

Raffinement

L'injection dans la rate des cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie gazeuse avec une prise en charge de la douleur avant, pendant et après l'injection. L’implantation de tumeurs hépatiques peut induire une gêne modérée qui sera spécifiquement monitorée 2 à 3 fois par semaine au cours des expériences. Selon notre expérience antérieure, l’injection des vecteurs lentiviraux vaccinaux n’induit aucun signe clinique chez les souris. Les animaux seront observés 2 à 3 fois par semaine pour détecter tout signe d’inconfort ou de souffrance. Si un point limite est atteint, la souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents, comme des poils hérissés, inactivité, plusieurs mesures seront prises. Cela inclut l’ajout de gel hydrique, la réhydratation sous cutanée, le chauffage des cages ou bien l’amélioration de l’enrichissement qui consistera à ajouter la litière à base de cellulose pour éviter l’irritation par les copeaux de bois.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe un modèle de tumeur hépatique qui peut être utilisé chez la souris pour tester notre candidat vaccin. Nos études précédentes montrent que les vecteurs vaccinaux évalués sont immunogènes chez la souris. De plus, de nombreux outils sont disponibles pour étudier les réponses immunitaires chez cette espèce. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.

Des lignées de souris sont élevées pour développer avec l'âge une inflammation chronique, une hypertrophie cardiaque ou une fibrose pulmonaire : 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nuisances annoncées sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Le porteur écrit ensuite que les conditions d'élevage seront adaptées pour que les animaux ne développent pas de symptômes, alors que le phénotype dommageable est précisément ce que cet élevage produit, les souris atteintes n'étant pas gardées au-delà de vingt semaines. Une partie des petits sert au renouvellement des accouplements, les autres partent vers des expériences menées sur un autre site, et tous sont tués à terme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’élever des animaux spécialement conçus pour nos expériences scientifiques. Grâce à ces expériences, nous cherchons à comprendre comment le métabolisme des lipides influence certaines maladies inflammatoires chroniques (ici par exemple le syndrome d'Aicardi-Goutières).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de découvrir des solutions thérapeutiques pour alléger les symptômes présents chez les patients souffrant d’inflammation chronique.

Procédures

Ces animaux developperont une inflammation chronique avec l'âge. Ces lignées murines modèles de maladies inflammatoires developpent avec le temps un hypertrophie cardiaque ou une fibrose pulmaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances liées à l'inflammation chronique dans ces modèles sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Les animaux ne seront pas maintenus plus de 20 semaines, les conditions d'élevage seront donc adaptées pour qu'ils ne dévellopent pas de symptômes.

Devenir

Les animaux issus de l'élevage seront soit utilisés pour renouveler les accouplements soit utilisés pour les expérimentations dans le cadre d'une utilisation continue sur un autre site. Les animaux ne présentant pas le phénotype dommageable seront intégrés dans les groupes "contrôles". Tous les animaux seront utilisés. A la fin, ils seront tous euthanasiés.

Remplacement

L'objectif du projet scientifique associé à ces élévages nécessite l'utilisation de modèles animaux. Les méthodes substitutives notamment l'utilisation de modèle in vitro ne permet pas d'étudier la communication inter-organes.

Réduction

Afin de réduire le biais associé au sexe, des groupes équivalents d’animaux des deux sexes seront utilisés dans les protocoles expérimentaux proposés. Tous les animaux issus des accouplements seront conservés pour l'expérimentation.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues à la délétion génétique dommageable. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. De plus les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. De fait, afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux, les animaux seront placés en cage 3 individus (trio d'accouplements) avec pour enrichissement une maisonnette en carton et du coton pour la nidification. Les animaux avec un phénotype dommageable ne seront pas gardés en vie au delà de 20 semaines d'âge.

Choix des espèces

Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expérimentales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les animaux seront utilisées pour l'élevage, les animaux seront donc mis en accouplement entre 7 et 8 semaines et les animaux à phénotype dommageable seront maintenus en accouplements pour une durée maximale de 12 à 13 semaines ( âge maximum des animaux 20 semaines).

Dix semaines de gavage intragastrique et treize semaines de tests : 80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles doivent appuyer sur un levier pendant soixante minutes par jour pour obtenir une nourriture appétente, sous privation alimentaire, et leur prise de boisson est mesurée trente minutes par jour. Le porteur veut savoir si une bactérie intestinale humaine réduit la motivation pour le gras et le sucre, et si elle limite la prise de poids sous régime hypercalorique, en vue d'un usage comme probiotique contre l'obésité. Une perte de poids supérieure à 20 % associée à un score de souffrance maintenu plus de quarante-huit heures déclenche la mise à mort par dislocation cervicale.

Objectifs

Le but du projet est de caractériser l'effet de la bactérie intestinale commensale humaine Phascolarctobacterium faecium G104 sur le comportement alimentaire chez la souris (objectif 1) ainsi que de déterminer son rôle dans la prévention de la prise de poids en réponse à l'ingestion d'un régime hypercalorique (objectif 2).

Bénéfices attendus

Ce travail fournira des preuves scientifiques des effets de la bactérie intestinale commensale humaine P. faecium G104 sur le comportement alimentaire en explorant son rôle sur la motivation pour les aliments palatables. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il nous permettra de mieux comprendre les avantages métaboliques de cette bactérie et son utilisation potentielle comme probiotique pour prévenir et traiter l'obésité.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : Administration des traitements par sonde intragastrique pendant 10 semaines (80 souris, vigiles) ; Mesures comportementales pendant 13 semaines (80 souris, vigiles). L'adminstration par gavage oral prend moins de 10 sec par animal. Lors des tests comportementaux les animaux peuvent librement se déplacer: on mesure la consommation de nourriture palatable après appui sur un levier pendant 60 minutes par jour. Test de préférence/ aversion gustative on mesure la prise hydrique pendant 30 minutes par jour. Rythmes circadiens du comportement alimentaire sera mesuré pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

L´injection intrapéritonéale et l´administration par gavage oral peuvent être cause de stress pour l’animal dû à la contention/préhension. – Le test comportemental pour évaluer la motivation pour la nourriture palatable nécessitent une déprivation alimentaire légère. L’exposition au régime hyperlipidique entraine une prise de poids et des désordres métaboliques pour les souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour l'étude des effets du traitement au probiotique sur le cerveau (80 animaux)

Remplacement

Notre projet de recherche vise à mieux comprendre comment une bactérie spécifique présente dans l’intestin influence les habitudes alimentaires. Plus précisément, nous voulons savoir si cette bactérie peut moduler la motivation pour des aliments palatables comme les aliments sucrés et gras et si cette bactérie peut réguler la prise de poids lors d’une exposition à une régime obésogène. Notre projet vise à comprendre les mécanismes neurobiologiques par lesquels cette bactérie intestinale module le comportement alimentaire. Pour étudier cette question de manière approfondie, nous devons utiliser des modèles animaux. Nous avons choisi d'étudier des souris de la souche C57BL/6J, car cette souche développe une obésité lorsqu'elle est nourrie avec un régime riche en graisses et en sucres. Il n'existe pas d'alternative à l'étude des effets de cette bactérie sur les comportements et le cerveau. Ce travail fournira des preuves scientifiques des effets de la bactérie intestinale commensale humaine P. faecium G104 sur le comportement alimentaire en explorant son rôle sur la motivation pour les aliments palatables. Ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), et nous permettra de mieux comprendre les avantages métaboliques de cette bactérie et son utilisation potentielle comme probiotique pour prévenir et traiter l'obésité.

Réduction

Les mêmes souris (80 au total) seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la caractérisation des effets. Le nombre d'animaux nécessaires (10 par groupes) est basé sur des expériences précédemment effectuées dans l'équipe permettant de révéler des différences statistiques entre groupes dans ce type de tâches comportementales . Il est nécessaire d'utiliser deux lots d'animaux pour obtenir des tissus frais et des tissus perfusés et fixés, la taille totale de l'échantillon incluant les deux lots est donc de 80 souris (40 x 2).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. - Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille (foournie en annexe) : si un score supérieur à 3 (associé à une perte de poids >20%) persiste pendant plus de 48h les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé.Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Avant la mise à mort, les animaux recevront un traitement analgésique suivi d'un traitement avec un anesthesique.

Choix des espèces

la souris est un bon modèle pour l'étude du comportement alimentaire et la motivation. Le comportement sera étudié à l'âge adulte, qui constitue la population la plus exposée à l'obesité en clinique.

Toutes tuées en fin de protocole pour le prélèvement de leurs organes, 304 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections par semaine pendant six mois, sont pesées chaque semaine et passent une imagerie sous anesthésie deux fois par mois pendant les traitements, puis une fois par mois ensuite. Le porteur cherche à savoir si bloquer une voie de réponse au stress cellulaire retarde les effets du vieillissement, avec l'ambition affichée de développer des molécules anti-vieillissement. Le projet peut durer vingt-quatre mois, soit à peu près l'espérance de vie d'une souris de laboratoire, sans que cette durée soit justifiée autrement que par le suivi du vieillissement.

Objectifs

Bien que les mécanismes conduisant au vieillissement ne soient pas encore complètement connus, il est maintenant établi que les effets du vieillissement sont corrélés à une augmentation du nombre de cellules sénescentes dans les tissus. Les cellules sénescentes se distinguent par de nombreux changements morphologiques et métaboliques et leur élimination (génétiquement ou pharmacologiquement) peut prévenir ou retarder le dysfonctionnement des tissus et ainsi prolonger la durée de vie chez la souris. La sénescence a longtemps été considérée comme un mécanisme suppresseur de tumeurs via l’arrêt permanent du cycle cellulaire. Cependant, certaines molécules sécrétées par la cellule sénescente peuvent contribuer à un microenvironnement favorable à la transformation de cellules pré-cancéreuses. Ce rôle promoteur de tumeurs est également souligné par le fait que des cellules sénescentes sont trouvées dans des tumeurs bénignes et que des cellules épithéliales en culture peuvent échapper de façon spontanée à la sénescence et ré-entrer dans le cycle cellulaire avec des caractéristiques néoplasiques. Par ailleurs, la sénescence est également associée à de nombreuses pathologies liées au vieillissement comme les fibroses tissulaires conduisant à terme à des défaillances d’organe. Ainsi, l’étude des mécanismes de sénescence au cours du vieillissement nous semble particulièrement intéressante. La modulation de ces mécanismes pourrait ainsi permettre de bloquer dans le même temps le développement de pathologies fibrotiques et/ou cancéreuses ou plus généralement des pathologies liées à l’âge. Nous avons montré dans nos précédentes études dans des modèles de cellules que l’inhibition d’un certain nombre de facteurs associés à une voie de signalisation spécifique ("voie de réponse aux protéines mal conformées") provoque un retournement des caractéristiques observées dues à la sénescence. Une étude plus approfondie de ces différents acteurs pourrait permettre de mieux comprendre l’implication de cette voie au cours de la sénescence mais surtout pourrait potentiellement aboutir au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Nous souhaitons, au travers de cette étude, déterminer si le ciblage de la voie de réponse aux protéines mal conformées dans un modèle animal pourrait avoir des effets et, ainsi, retarder ou réduire les pathologies liées au vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale vise à mieux comprendre les mécanismes régissant le vieillissement et pouvant conduire à la mise en place de processus pathologiques. Les résultats que nous obtiendrons pourraient permettre d’envisager l’inhibition spécifique d'une branche de la voie de signalisation impliquée dans les phénomènes de sénescence dans des conditions physiologiques et pathologiques et de déterminer quels inhibiteurs présenteront le meilleur potentiel thérapeutique. A terme, nous souhaitons développer des molécules « médicaments » ayant des effets anti-vieillissement et par conséquent des effets bénéfiques sur l’apparition de maladies liés au vieillissement, y compris la fibrose et le cancer.

Procédures

Après leur arrivée, tous les animaux (304 souris) seront acclimatés à leur zone d'hébergement pendant une semaine puis seront habitués à la manipulation humaine pendant une semaine supplémentaire. Les animaux recevront ensuite une injection de traitement ou de solution contrôle (durée : 1 min) à raison de 2 fois par semaine sur une durée de 6 mois. Les animaux seront pesés une fois par semaine (durée : 1 min) tout le long de la procédure. Dès la première semaine de traitements, l'effet de ces derniers sur la sénescence des cellules sera évalué par imagerie. Pour cela les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse, tondus pour faciliter l'imagerie (durée : 30 sec.) et l'injection d'une molécule facilitant la lecture des images sera réalisée (durée : 30 sec). Après la lecture, les animaux seront surveillés jusqu'à leur réveil (durée totale anesthésie : 30 minutes). Cette lecture sera réalisée deux fois par mois pendant les 6 mois de traitements puis une fois par mois jusqu'à la fin du projet. A la fin des traitements, les souris seront maintenues en hébergement pour suivre leur vieillissement (durée maximale du projet : 24 mois).

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient ressentir un stress léger de courte durée au moment de la manipulation lié à la nécessité de réaliser une contention et une injection pour l'administration des traitements. Les étapes nécessitant une anesthésie gazeuse pourraient également être source d'un stress léger et de courte durée.

Devenir

Afin d'étudier les effets de nos traitements sur la sénescence des cellules de différents organes, il nous est nécessaire de pouvoir les récupérer à la fin du projet. Tous les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Avant de procéder à l'étude in vivo, nous avons évalué les différents inhibiteurs des effecteurs de la voie de signalisation qui nous intéresse ainsi que leur efficacité in vitro. Nous avons pu identifier et caractériser les cibles d'intérêt de notre projet. Ces étapes préliminaires réalisées dans des modèles n'impliquant pas d'animaux ont ainsi permis de réduire le nombre d'animaux impliqués dans cette étude. Afin de valider dans un modèle complexe les différents inhibiteurs identifiés, l'utilisation d'un modèle animal à la fois jeune et âgé demeure cependant nécessaire.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées, nos cibles d’intérêts ont déjà été identifiées et caractérisées et l’efficacité des inhibiteurs a déjà été évaluée dans un modèle n'utilisant pas d'animaux. Le nombre de souris par groupe a été déterminé par une approche statistique tout en se basant sur les connaissances et l'expertise du laboratoire sur la manipulation de ce type de souris dans une expérience à long terme afin d'obtenir des résultats robustes. De plus, l'utilisation d'un système permettant le suivi longitudinal par imagerie de l'expression de notre facteur d'intérêt permet de réduire le nombre total d'animaux en évitant la mise à mort d'animaux à des temps intermédiaires.

Raffinement

Afin de limiter au maximum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 6 animaux par cage dans un environnement enrichi (carré de coton pour la nidification) et dans des conditions classiques d'hébergement (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés avant la mise en place de l’expérimentation afin de procéder à une habituation. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant les procédures pouvant induire un stress ou une angoisse ainsi qu’avant la mise à mort. Des points limites ont été définis préalablement à l’expérience et un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance excessive nécessitant l’arrêt de la procédure et leur mise à mort (qui sera réalisée à distance des autres animaux). Les souris vieillissantes risquant de développer des pathologies non rencontrées chez des souris jeunes, nous apporterons des points de vigilance supplémentaires à leur suivi. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparence permettant la réalisation d’un score basé sur ce qui a été décrit dans la littérature

Choix des espèces

L’utilisation de souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques préexistants de manière à suivre l’évolution de la sénescence. De plus, la souris est un modèle largement étudié par la communauté scientifique ce qui permet de comparer les résultats avec les autres laboratoires et d’utiliser certaines conditions comme témoin de la validité de nos résultats. Les procédures expérimentales étant très encadrées, les paramètres de douleur ou de souffrance éventuelle sont plus facilement contrôlables. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (2 mois), c’est-à-dire après la phase de croissance ainsi que des souris adultes âgées (9 mois), âge auquel l’accumulation de cellules sénescentes devient détectable. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (2 mois), c’est-à-dire après la phase de croissance ainsi que des souris adultes âgées (9 mois), âge auquel l’accumulation de cellules sénescentes devient détectable.

Pour sélectionner des composés contre l'hyperactivité de la vessie, 960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une irritation de la vessie leur est provoquée par de la capsaïcine ou de la prostaglandine, et l'effet des molécules est mesuré par cystométrie, jusqu'à quatre heures avec un cathéter posé dans la vessie sous anesthésie. Certains animaux reçoivent une pompe implantée sous la peau, des prélèvements de sang et des collectes d'urine en cage individuelle de moins de vingt-quatre heures, le protocole étant arrêté en accord avec une entreprise pharmaceutique partenaire. Le porteur présente le recours au rat comme un choix limitant "l'utilisation d'animaux tels que le chien".

Objectifs

L’hyperactivité de la vessie touche environ 15 % de la population, et devient plus fréquente avec l’âge. Elle entraine des envies urgentes et fréquentes d'uriner, des incontinences et des lever nocturnes qui perturbent grandement la vie au quotidien des patients souffrants de cette pathologie. Les causes de ce trouble sont encore mal connues, mais on pense qu’il est lié à un fonctionnement anormal du muscle de la vessie. Les traitements actuels reposent principalement sur des médicaments appelés antimuscariniques dont le but est d'inhiber les contractions involontaires de la vessie en agissant sur certains récepteurs. Cependant, leur efficacité est souvent limitée, et ils provoquent des effets secondaires (sécheresse de la bouche, constipation, troubles de la vision...) qui amènent de nombreuses personnes à arrêter leur traitement. Il est donc important de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques. Pour cela, des recherches sont menées à l’aide de modèles expérimentaux qui reproduisent les symptômes de l’hyperactivité de la vessie. Ce projet vise à tester de nouveaux composés destinés à traiter l’hyperactivité vésicale. Certains de ces composés testés agissent différemment des traitements actuels, tandis que d'autres utilisent les mêmes mécanismes, mais avec moins d'effets secondaires. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez le rat, dans lequel une irritation temporaire de la vessie est provoquée à l’aide de substances comme la capsaïcine (un composé extrait du piment). Ces tests permettront d’évaluer l’efficacité des traitements avant d’envisager leur utilisation chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels de l’hyperactivité vésicale sont souvent mal tolérés, peu efficaces, ou contraignants à utiliser. Beaucoup de patients finissent par les abandonner, faute de résultats satisfaisants. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques, mieux adaptées aux besoins des malades. L’objectif de ce projet est justement de contribuer à la mise au point de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux supportés. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez le rat, qui permet de reproduire certains symptômes du trouble observé chez l’humain. Ce modèle permet de tester rapidement et de manière fiable l’efficacité et l’innocuité de nouvelles molécules. À terme, ce travail pourrait aboutir à des traitements innovants qui améliorerait significativement le quotidien des patients. Il pourrait aussi permettre de mieux comprendre les causes de ce trouble, ce qui ouvrirait la voie à d'autres avancées médicales. Enfin, en réduisant les complications liées à l’hyperactivité de la vessie, comme les infections à répétition ou les problèmes rénaux, ces recherches pourraient également contribuer à diminuer les hospitalisations et les coûts de santé.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront le traitement à tester ou bien un placébo. La durée et la fréquence du traitement dépendront du médicament étudié, mais resteront en général inférieures à six mois. L'administration du traitement sera rapide : elle dure moins d'une minute lorsque l'animal est éveillé, moins de 30 minutes si une anesthésie est nécessaire, et au maximum 45 minutes si le produit doit être injecté dans la vessie sous anesthésie profonde. Dans certains cas, un examen spécifique pourra être réalisé pour évaluer l'effet du traitement sur la vessie. Cet examen, appelé cystométrie, permet de mesurer le fonctionnement de la vessie pendant quelques heures (jamais plus de 4 heures) et nécessite l’installation préalable d’un petit tube dans la vessie. Au cours de l’étude, des prélèvements pourront être faits (sang, urine) afin de procéder à des analyses pour mieux comprendre les effets du traitement. Chaque prise de sang dure moins de 3 minutes, et la collecte d’urine se fait sur moins de 24 heures dans une cage adaptée. Il est important de souligner que tous les animaux ne subiront pas toutes ces procédures. Les interventions seront limitées à ce qui est strictement nécessaire, selon les objectifs du projet, et en accord avec les recommandations établies dans le cadre de notre collaboration avec une entreprise pharmaceutique.

Impact sur les animaux

Certaines étapes du projet peuvent entraîner un inconfort temporaire pour les animaux, bien que tout soit mis en œuvre pour les limiter. Les effets indésirables possibles incluent : - Un léger stress ou une gêne lors de l’administration du traitement, car nécessitant que l’animal soit maintenu immobile pendant un court instant. - Une douleur ou gêne temporaire liée à l’implantation d’une petite pompe sous la peau, ou bien à l’administration du composé à tester directement dans la vessie. - Un stress léger lié à la collecte d’urine (sur une période inférieure à 24h) ainsi qu'aux prises de sang.

Devenir

Les animaux recevront les traitements à tester, soit en une seule fois, soit de manière répétée sur une période plus longue, selon les besoins de l’étude. L’efficacité de ces traitements sera évaluée par différents moyens, notamment : - L’analyse de la quantité d’urine produite sur une période de moins de 24 heures, - Un examen permettant d’étudier le fonctionnement de la vessie, - L’analyse d’échantillons de sang, d’urine ou d’organes. À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur garantissant l’absence de douleur. Cette étape sera réalisée par du personnel formé, expérimenté et autorisé à le faire, conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

L’utilisation d’animaux dans ce projet se justifie par l’absence de méthode alternative permettant d’étudier efficacement l’hyperactivité de la vessie. Cette maldie dépend de nombreux mécanismes complexes (nerveux, hormonaux, métaboliques…) qui interagissent entre eux dans un organisme vivant. Aujourd’hui, aucun modèle en laboratoire ne permet de reproduire cette complexité de manière fiable. L’utilisation de modèles animaux reste donc indispensable pour développer de nouveaux traitements mieux adaptés aux patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été calculé avec soin, afin d’être le plus faible possible tout en garantissant des résultats fiables. Une méthode statistique a été utilisée pour déterminer le nombre minimum nécessaire par groupe. De plus, lorsque cela sera possible, deux traitements seront testés en même temps. Cela permettra de limiter encore le nombre d’animaux en évitant de répéter inutilement certaines expériences, notamment pour les groupes qui ne reçoivent pas de traitement ou qui reçoivent un traitement de référence déjà connu.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long du projet. - Les rats sont hébergés par deux dans une même cage, dès que cela est possible, afin de préserver leur bien-être en favorisant le contact social. - Chaque jour, les soigneurs spécialisés vérifient l’état de santé général de chaque animal, leur comportement et la propreté de leur environnement. - Des critères de surveillance précis ont été définis. Si un animal montre des signes de douleur ou de souffrance, les responsables du projet sont immédiatement alertés, et les soins nécessaires sont apportés sans délai. - Les interventions chirurgicales, comme l’implantation de pompes ou les injections dans la vessie, sont réalisées sous anesthésie générale avec des médicaments contre la douleur. Un traitement antibiotique est également donné pour prévenir les infections. - D’autres procédures, comme la pose de petits cathéters (tubes) pour les examens de la vessie, ainsi que les examens eux-mêmes, sont aussi réalisés sous anesthésie complète, afin que l’animal ne ressente aucune douleur.

Choix des espèces

L’expérimentation animale est nécessaire pour l’étude d’une fonction physiologique complexe telle que l’hyperactivité vésicale. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et limitant l’utilisation d’animaux tels que le chien. Le choix des protocoles est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chances d’obtenir des résultats satisfaisants. Par ailleurs, les évaluations incluses dans le cadre de ce projet sont plus faciles à réaliser chez le rat, par rapport à la souris. Concernant l’analyse des données de miction spontanée, la vessie du rat a une capacité plus importante et permet de faciliter l’analyse de la mesure du volume uriné. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines d'âge). Ce choix est justifié par la littérature scientifique.

4 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection destinée à déclencher un cancer du foie, d'un volume équivalant à environ 9 % de leur poids corporel, qui dilate le foie et augmente le volume sanguin, puis jusqu'à quinze échographies hépatiques sous anesthésie et huit injections de traitements immunomodulateurs sur trois à six mois. Le porteur reconnaît que la croissance de la tumeur peut dégrader l'état général des animaux, fatigue et perte de poids comprises. Les retombées annoncées se limitent à de futurs outils de diagnostic et de pronostic, le porteur affirmant que la souris est le "seul modèle préclinique" permettant d'éteindre ou d'activer des gènes tissu par tissu.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC, Carcinome Hépato-Cellulaire) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent à caractériser fonctionnellement les populations immunitaires notamment celles impliquées dans la réponse anti-tumorale. Ce projet sera axé sur les cellules lymphocytes. La compréhension de la fonctionnalité des cellules immunitaires servira de bases fondamentales pour le développement d’immunothérapie pour combattre le cancer du foie. Ce projet sera mené pour une durée de 5 ans.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle d’acteurs clés de la réponse immunitaire, lors du développement du cancer du foie. Ces travaux pourraient ainsi permettre le développement de nouveaux outils diagnostic/pronostic pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Des animaux recevront une injection unique visant à mimer le cancer du foie (1 fois, 10 secondes/animal vigile). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs hebdomadaire dès l’apparition de tumeurs (entre 5 et 8 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront suivis par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 2 à 4 semaines ou toutes les semaines selon les conditions expérimentales (entre 2 échos minimum et 15 échos maximum) jusqu’à euthanasie à la fin de la procédure expérimentale (3-6 mois) par une méthode réglementaire. Des animaux recevront une injection unique visant à mimer l’initiation tumorale (1 fois, 5 minutes/animal anesthésié). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs (4 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale par une méthode réglementaire. Des animaux recevront une injection unique visant à mimer la progression du cancer du foie (1 fois, 5 minutes/animal anesthésié). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs hebdomadaire dès l’apparition de tumeurs (entre 5 et 8 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront suivis par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 2 à 4 semaines ou toutes les semaines selon les conditions expérimentales (entre 2 échos minimum et 10 échos maximum) jusqu’à l’euthanasie à la fin de la procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons une injection qui peut provoquer un léger inconfort de courte durée, lié au passage de l’aiguille à travers la peau. De plus, le fait de maintenir l’animal pendant l’injection peut entraîner un stress temporaire. L’injection intra-veineuse comporte des risques de saignement local et/ou d’hématome. L’injection correspond à un volume de liquide équivalant à environ 9 pourcents du poids de l’animal. Elle peut provoquer une douleur passagère et entraîne une dilatation importante mais temporaire du foie (moins de 30 minutes), ainsi qu’une augmentation du volume total de sang. Lors de l’anesthésie par gaz utilisée pour l’échographie du foie, une baisse de la pression sanguine et de la température corporelle peut survenir. Enfin, la croissance prévue de la tumeur au niveau du foie pourrait entraîner une dégradation de l’état général des animaux (fatigue, perte de poids, etc.).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire de l’ensemble des animaux).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant le carcinome hépatocellulaire.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 4032 animaux seront étudiés. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les souris utilisées dans ces procédures seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 à 8 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans le développement tumoral. Une souris trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.