Rongeurs

Un à deux mois de restriction d'eau, la tête maintenue par une barre en titane vissée sur le crâne pendant des séances quotidiennes d'une heure : 750 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modérée, toutes tuées à l'issue pour vérifier au microscope où les virus ont été injectés. Toutes reçoivent une injection virale dans le cerveau, 250 une fenêtre crânienne, 500 un implant, puis sont transportées vers un second établissement. L'objet est fondamental, comprendre comment le cortex moteur secondaire arbitre entre exploiter ce que l'animal sait déjà et explorer autre chose. Le porteur décrit la pose de l'implant comme "non invasive et non douloureuse" tout en la réalisant sous anesthésie générale avec couverture antalgique.

Objectifs

La prise de décision est un processus crucial qui régit chacun de nos comportements les plus évolués. Tandis que nous apprenons de notre environnement et prenons des décisions sur la base de ces connaissances, nous conservons également la capacité d’adapter notre comportement face aux modifications soudaines de l’environnement. Cette adaptation serait favorisée par l’équilibre entre les comportements d’exploitation (c'est-à dire l'utilisation des connaissances déjà disponibles pour obtenir un gain connu) et ceux d’exploration (c'est-à-dire la recherche d’options plus favorables). Cette hypothèse résulte des études cognitives menées chez l'homme, les primates non humains et les rongeurs. L’objectif général de ce projet est d’étudier les mécanismes cérébraux responsables de la transition entre comportements d’exploitation et d’exploration chez la souris. De nombreuses structures corticales et sous-corticales pourraient participer à ce phénomène. En particulier, des recherches récentes proposent que le cortex moteur secondaire (M2) des rongeurs constitue un noeud critique permettant le contrôle flexible des actions volontaires. Ce constat est étayé par la spécificité de cette structure ayant un rôle démontré dans les comportements flexibles. Ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs vise donc à éclairer le rôle du le cortex moteur secondaire pour décider quand explorer ou quand exploiter l'environnement. Pour cela, nous utiliserons l’imagerie cérébrale des structures d’intérêts lorsque la souris est soumise à un test comportemental permettant de quantifier les comportements d’exploitation et d’exploration. Enfin, nous testerons le rôle causal des connexions neuronales identifiées pendant l'exploration et l'exploitation en effectuant des manipulations sélectives des différentes voies sous-corticales.

Bénéfices attendus

Cette étude est avant tout un projet de science fondamentale visant à comprendre les principes neuronaux permettant l’adaptation de la prise de décision dans des environnements changeants.Au-delà de cet aspect fondamental, ce projet possède une forte composante translationnelle. En effet, l'accent mis sur l'exploitation-exploration des actions volontaires est central dans les neurosciences cognitives, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre efficacement le compromis exploitation-exploration est une caractéristique frappante de plusieurs troubles mentaux comme la schizophrénie, les troubles de l’attention et de l’hyperactivité et la depression. En conséquence, ces patients ont moins de flexibilité d’apprentissage, ils s’adaptent moins aux nouveaux environnements, utilisent des strategies habituelles et présentent une extinction plus rapide des apprentissages. Notre projet permet d’étudier ces paramètres chez l’animal lors d’une tâche comportementale pour comprendre le rôle des régions cérébrales impliquées.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 semaines. Puis les animaux seront soumis à une chirurgie avec injection d’un virus puis pose d’une fenêtre crânienne ou pose d’un implant. Ces chirurgies se feront sous anesthésie, tous les animaux auront une injection de virus, 250 animaux auront une chirurgie avec pose d’une fenêtre crânienne et 500 animaux la pose d’un implant. Après 3 à 4 semaines de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 7 jours. Ensuite, les animaux auront une anesthésie pour permettre la pose d’une barre en titane nécessaire au comportement qui se fait en « tête restreinte», ils seront soumis à contrôle hydrique qui durera entre 1 et 2 mois. Pendant cette période, les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (7 jours), l’apprentissage (10 jours) et le contrôle (au minimum 1 mois). Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 20 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront au maximum une session d’une heure par jour. Les chirurgies pour l'injection du virus puis la pose d'une fenêtre cranienne ou la pose d'un implant se feront dans le premier établissement utilisateur. La pose de la barre en titane, le contrôle hydrique ainsi que le comportement auront lieu dans le second établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux : ● Le risque de douleur durant la chirurgie● Le risque de douleur aiguë liée à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le contrôle hydrique ● Contention "tête restreinte"

Devenir

A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort. Il est nécessaire de réaliser des contrôles histologiques ou des expériences d’immunohistochimie sur les cerveaux fixés afin de valider les coordonnées des sites d’injection des virus et des sites d'enregistrement.

Remplacement

L’étude des mécanismes de la prise de décision est un enjeu sociétal et économique majeur des neurosciences modernes, comme le relèvent de nombreuses situations humaines inadaptées (prise de risque, addiction au jeu, compulsivité, troubles psychiatriques). Par définition, ces mécanismes ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision et permettra de jeter les bases d'études plus appliquées.

Réduction

La nature innovante des méthodes utilisées (imagerie biphotonique chronique, et optogénétique chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l’expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre des animaux. En effet, certaines tâches dans les procédures mettent en jeu des techniques non invasives et non douloureuses qui seront réalisées de façon quotidienne pendant le comportement chez le même animal. Ces techniques modernes permettent donc de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groups expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique grâce à la buprénorphine injectée avant et après la chirurgie. Une injection de Mélloxicam en sous cutanée sera réalisée après la chirurgie pour augmenter la durée de la couverture analgésique. La couverture antalgique agira dès le réveil de l’animal et sera maintenue avec une injection de Buprénorphine et de Méloxicam 24h post chirurgie. Si l’animal montre des signes de souffrance de nouvelles injections seront réalisées toutes les 24h. La procédure d’implantation, bien que non invasive et non douloureuse se fera malgré tout sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les animaux ne sont jamais isolés mais maintenus en groupe sociaux (5 par cage avec nourriture adaptée et enrichissement : nid, maison et tunnel) et manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase sombre, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée (2 fois par jour) après le contrôle hydrique. Les animaux sont transférés entre les deux EU qui sont situés dans le même bâtiments dans leurs cages d'hébergement avec des chariots spécifiques. Les cages sont placées dans des sacs en kraft pour les isoler de la lumière et de tout contact visuel. Des points limites spécifiques suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux qui nous intéressent ici (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine sans avoir recours à des primates non-humains. Les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris seront donc largement transférables à l'homme, et permettront de mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision en général tout en jetant les bases d'études plus appliquées chez les humains. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Jeûnes répétés jusqu'à douze heures, six tests de tolérance au glucose de deux heures et demie, 72 à 120 heures enfermés seuls en cage de calorimétrie : 600 souris et 300 rats vont subir ce protocole dans des procédures d'un niveau de souffrance modérée, tous tués ensuite pour prélèvement d'organes. Les animaux sont d'abord rendus obèses par un régime hypercalorique prolongé, puis reçoivent des molécules par gavage, par injection intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou intradermique. Le porteur ramène l'effet de la surcharge pondérale à un "léger inconfort" pour la mobilité en cage. Le laboratoire est un organisme de recherche contractuelle qui teste ici les molécules de ses clients, et le résumé ne nomme ni les composés ni le nombre de prélèvements sanguins prévus.

Objectifs

Le surpoids est défini comme une accumulation excessive de masse grasse dans l’organisme. L’obésité est une maladie chronique complexe définie comme une accumulation excessive de masse grasse pouvant altérer l’état de santé d’un individu. Actuellement, 2,5 milliards de personnes dans le monde sont atteintes de surpoids, dont plus de 800 millions sont obèses (OMS, 2022). La prévalence du surpoids ne cesse de croître depuis les dernières décennies et l’un des facteurs prépondérants de cette évolution est la surconsommation de régimes déséquilibrés, riches en graisses et en sucres. L’obésité s’accompagne d’une inflammation systémique constante et d’intensité faible voire modérée, dite de bas-bruit. Cet état inflammatoire chronique contribue à développer d’autres maladies, telles que le diabète, la stéatose hépatique et bien d’autres, et cause ainsi quelques millions de morts chaque année. Dans ce contexte, l’importance de contenir ce statut inflammatoire et surtout, de stimuler sa résolution, est capitale. L’administration prolongée de régime hypercalorique chez le rongeur est l’un des moyens les plus simples et les plus couramment utilisés pour modéliser le surpoids et l’obésité chez l’animal. En faisant varier la durée du régime ainsi que sa valeur calorique, ce modèle permettra de collecter et d’étayer des données cruciales sur les mécanismes inflammatoires cellulaires et moléculaires impliqués. Le premier objectif consiste donc à détenir au sein de notre laboratoire le modèle de surpoids/obésité induit par un régime hypercalorique. Notre laboratoire étant un organisme de recherche contractuelle, notre activité consiste à étudier le potentiel résolutif de molécules candidates dans différents contextes inflammatoires, ici dans l’obésité. Ainsi, l’objectif final de ce projet est de tester l’administration conjointe de molécules candidates dans la résolution de l’inflammation induite par le surpoids ; et ainsi contribuer à terme à réduire voire supprimer l’impact délétère de l’obésité à tous les niveaux ; humains, sociaux, sociétaux et économiques. De plus, l'ajout d'une méthode d’analyse métabolique nécessite une modification du projet initial autorisé sans ajout d’animaux, faite dans un 2eme EU. Le projet devient multisite : Cette APAFIS est une modification d’un projet autorisé, qui, par l’ajout d’un établissement utilisateur (EU), devient multisite (EU 2/2 et EU 1/2).

Bénéfices attendus

Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des altérations induites par le surpoids/obésité. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour réduire les altérations multiples dues au surpoids et à l’obésité.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être soumis à : 1. 1 à 6 cessions de jeûne d’une durée de 2h à 12h sur la période diurne ou nocturne, espacées d’une semaine minimum. (EU 1/2) 2. Au maximum, 6 tests de tolérance au glucose et/ou à l’insuline (durée 2h30 environ) (EU 1/2) 3. Des mesures de composition corporelle, l’acquisition dure au maximum 2 minutes et cette mesure sera effectuée 1 à 5 fois au cours du protocole. (EU 2/2) 4. Des expériences de calorimétrie : les souris seront isolées en cage individuelles entre 72h et 120h. Chaque animal sera soumis une seule fois à ce genre de procédure. (EU 2/2) 5. Des administrations répétées du composé-client selon les modalités suivantes : Les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intravasculaires, intradermiques. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront moins d’une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). (EU 1/2) 6. Un prélèvement sanguin unique ou répété, précédé ou non d’un jeûne de 2 à 6h, suivi d’une semaine de récupération minimum sur souris vigile ou anesthésiée et sur rats anesthésiés, selon le volume prélevé. La durée d’un prélèvement sera de l’ordre d’une minute par animal; (EU 1/2).

Impact sur les animaux

Les trois principales nuisances attendues concernent la surcharge pondérale des animaux, la réalisation de prélèvements sanguins répétés sur la durée du protocole expérimental, l’administration répétée des molécules- clients à tester. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les types d’injection (intrapéritonéale, sous-cutanée, gavage, intradermique, intravasculaire). La surcharge pondérale pourra induire un léger inconfort chez les animaux, en comparaison avec des souris de poids normal, notamment pour leur mobilité au sein de la cage.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire et métabolique terminal.

Remplacement

Lorsque ce sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement ou en complément des tests animaux afin de remplacer le nombre d'animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement complet de l'expérimentation animale par des essais in vitro n'est pas envisageable pour une étude portant sur le surpoids. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires et cellulaires de la physiopathologie d'un animal entier. De plus, les étapes de validation d'une molécule thérapeutique nécessite qu'elle soit testée chez l'animal avant de pouvoir passer à l'étape de validation suivante : l'Homme.

Réduction

La problématique de ce projet faisant intervenir la régulation métabolique et inflammatoire sur du moyen/long terme (semaines, mois), induit intrinsèquement une variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes (n=12 souris / groupe expérimentaux). Le nombre de rats et de souris nécessaires a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples, en particulier sur des protocoles de plus courte durée. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. D’autre part, si plusieurs prélèvements sanguins sont à réaliser, nous les réaliserions sur des animaux dédiés (6 et 6 au sein d’un même groupe) afin de respecter les volumes, les délais de récupération et limiter le nombre de gestes invasifs sur un même animal. Enfin, nous utiliserons en priorité (sauf exigence spécifique de la part de nos clients) des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. C’est la conjonction de tous ces éléments qui nous a conduit à considérer des groupes de 12 animaux maximum.

Raffinement

Les souris et les rats seront hébergés en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/12h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, carré de coton et buchette de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole. Une boule en bois et/ou tunnel pourront être ajoutés, en concertation avec le souhait du client afin de leur permettre de se distraire, d’éveiller leur curiosité et de réaliser un peu d’activité physique. Les animaux seront vus quotidiennement. En cas de signe de mal-être (défini dans la procédure), un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal. Le transport des souris entre les établissements se fera avec une société spécialisé, et se déroulera selon les mesures de raffinement suivantes: Personnel qualifié aux bonnes pratiques de manutention animale et de transport inter-établissements seront mobilisés.Distance du trajet maîtrisée : le transport couvrira une distance d’environ 9 km entre les établissements, ce trajet étant court pour minimiser le stress et la fatigue liés au déplacement.Conditions de transport optimisées : caisses homologuées dotées d’un environnement stable — aérées, obscurité partielle, température contrôlée. Enrichissement et confort : maintien des repères olfactifs grâce à une litière propre et du matériel de nidification issu de leur cage d’origine. Hydratation adaptée : dispositif d’accès à l’eau valide pour le transport (gel hydratant) pour éviter le jeûne prolongé. Minimisation de la durée : en plus d’une courte distance, le trajet sera rendu le plus rapide possible, y compris au niveau de la planification logistique (horaires, conditions de circulation). Suivi avant/après transport : observation systématique de l’état des animaux au départ et à l’arrivée pour détecter tout signe de désordre physiologique ou comportemental.

Choix des espèces

L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Enfin, l'utilisation de rats et de souris comme modèle de surpoids/obésité est très largement documentée dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), car toutes leurs fonctions biologiques sont alors matures. L'âge des animaux pourra exceptionnellement être inférieur à 7 semaines, si le client souhaite étudier les conséquences du surpoids/obésité juvénile sur l'âge adulte. Dans ce cas, le régime hypercalorique pourra débuter au plus tôt à l'âge de 3 semaines.

37 440 cobayes vont être utilisés sur trois ans dans des procédures d'un niveau de souffrance modérée, 264 réutilisés d'une étude à l'autre et tous les autres tués. Chaque animal reçoit des injections d'adjuvant, porte un pansement occlusif pendant 48 heures puis un patch pendant 24 heures, avant que ses deux flancs soient examinés à la recherche d'érythèmes et d'œdèmes. Il s'agit de vérifier, avant leur mise sur le marché, si des matériaux de dispositifs médicaux déclenchent une allergie cutanée, à raison de 1 248 études pour un même protocole normalisé. Le porteur justifie la mise à mort par le fait que les animaux "ne sont donc plus utilisables", l'adjuvant employé étant "conçu pour engendrer des escarres".

Objectifs

Le projet s’inscrit dans les démarches réglementaires recommandées avant utilisation de ces produits chez l’Homme. En effet, tout fabricant doit s’assurer que l’utilisation de son produit ne compromette ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. L’évaluation des risques menée prend en compte le fait que les risques éventuels liés à l’utilisation du produit constituent des risques acceptables au regard du bienfait apporté au patient et sont compatibles avec un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité des patients comme des utilisateurs. Dans ce projet, le paramètre évalué est le potentiel sensibilisant cutané (manifestations allergiques cutanées) par contact chez le cobaye. Comme indiqué dans la norme, certains matériaux entrant dans la composition des dispositifs médicaux ont été testés (en particulier pour les matériaux dentaires). D'autres matériaux et leurs composants chimiques n'ont pas été testés et peuvent induire des effets indésirables lorsqu'ils entrent en contact direct et indirecte avec des tissus humains. Le fabricant est donc tenu d'évaluer les effets indésirables potentiels de chaque dispositif avant sa mise sur le marché.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de s’assurer avant sa mise sur le marché que l’utilisation du produit de santé ne compromet ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs (manifestations allergiques cutanées). Evaluer les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit et s’assurer le cas échéant qu’ils constituent des risques acceptables au regard des bienfaits/bénéfices apportés aux patients et sont compatibles avec un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité des patients comme des utilisateurs. Les résultats seront disponibles à l’issue des études et leur incorporation dans les dossiers de soumissions aux autorités de santé compétentes avant leur mise (ou leur maintien) sur le marché pourront en découler à court terme.

Procédures

Dans ce projet, le paramètre évalué est la capacité de l’élément testé à induire une manifestation allergique cutanée par contact chez le cobaye. Le test se déroule en trois phases principales. Les deux premières phases consistent à exposer un groupe d'animaux à deux reprises au produit testé. Lors de la première phase, les animaux sont injectés avec le produit et restent en contact avec le produit pendant 7 jours (environ 1 minute). Lors de la deuxième phase, les animaux sont mis en contact avec unun produit nécessaire à la réaction de sensibilisation pendant 48 heures une période de repos d’environ 14 jours, lors de la troisième phase, les animaux les animaux sont mis en contact via un patch dermique avec l’élément d’essai à tester pendant 24 heures Enfin, les sites d’application (sur les 2 flancs de l’animal) sont observés et une évaluation visuelle d’une éventuelle réaction locale est réalisée (érythèmes et/ou œdèmes). Le cas échant, en fonction de la nature de l’élément à tester, afin de ne pas biaiser la lecture du potentiel allergique cutané dans le test principal, une étape préalable permet de déterminer une concentration du produit n’interférant pas avec les modalités de l’étude principale. L’étape préalable nommé test préliminaire se compose comme suit : les animaux sont mis en contact avec le produit pendant 2 minutes puis observé de la même façon que décrit précédemment 24 heures après.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes : - Inconfort léger lors des injections réalisées (inconfort transitoire (acte inférieur à 1 minute) ; récupération rapide) -Stress léger lié aux contentions lors des différents actes et à la mise en place de pansements (inconfort transitoire (acte inférieur à 1 minute), actes espacés dans le temps ; temps totale de 9 à 10 min sur une durée total d'étude de 26 jours) -Inconfort modéré ponctuel lié au retrait des pansements (présence d’une compresse protégeant et limitant le contact de l’adhésif avec la peau, acte transitoire inférieur à 1 minute) -Inconfort modérée liée à la présence de pansement (tension du pansement adaptée, vérification de l’absence de gène dans les mouvements de l’animal, durée limitée, uniquement deux sessions de respectivement 48h et 24h (sur les 26 jours de l'étude), chacune séparée de 13 jours - Mise en place d'éléments compensatoires sur toute la durée de l'étude) - Inconfort modéré ponctuel lié à la présence d’érythème intense à la suite d’une réaction de sensibilisation (Durée limitée, maximum 48h sur les 26 jours de l’étude). - Douleur modérée en cas d’apparition de lésions cutanées suite aux injections réalisées (mise en place d'un traitement analgésique approprié).

Devenir

Etant donné que : - il s'agit du seul test sur cobaye réalisé, - les animaux ont déjà eu une sensibilisation, - l'ACF utilisé dans le cadre de ces études est conu pour engendrer des escarres, les animaux ne sont donc plus utilisables et sont donc mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives existantes ne permettent pas d’évaluer les effets sensibilisants des produits de santé, en raison de la complexité des mécanismes de régulation d’un organisme vivant (système immunitaire en particulier). De plus, il n'existe pas de test in vitro validé ni de modèle simulé par ordinateur capable de reproduire la complexité d'une réaction tissulaire. De ce fait, l’utilisation d’animaux est toujours requise par la réglementation (exemple : suivi des exigences de la norme ISO 10993).

Réduction

Le nombre minimum d’animaux est défini dans les textes normatifs de référence (10 animaux test et 5 animaux témoins dans 2 conditions différentes). Pour les tests sur certains produits (pur ou extrait) un test préliminaire sur un minimum de 4 animaux est réalisé pour déterminer les concentrations à appliquer. En effet, la réaction cutanée locale liée à cette irritation pourrait biaiser l’obtention des résultats du test de sensibilisation Ce test préliminaire sur minimum 4 animaux permet donc de réduire le risque d’échec du test réglementaire, évitant ainsi l’usage inutile de ce plus grand nombre d’animaux. Au vue de ces données, le nombre d'animaux utilisés sur 3 ans est estimé à 37440 soit un nombre d'études de 1248.

Raffinement

Chaque animal fait l’objet d’un suivi quotidien pour permettre de détecter des signes de souffrance ou angoisse. Si une telle détection avait lieu, un suivi spécifique est mis en place par l’équipe vétérinaire. En cas de détection de signes de douleur ou de détection d’une anomalie clinique pouvant laisser penser que l’animal présente une souffrance, un traitement analgésique sera mis en place au moins une fois par jour. En particulier, une évaluation renforcée a lieu dans les phases critiques de l’étude, pour s’assurer que la prise en charge est adaptée aux observations cliniques réalisées. Si ça n’était pas le cas, et qu’aucune autre prise en charge n’est scientifiquement possible, l’animal sera rapidement euthanasié. L’enrichissement du lieu d’hébergement et les éléments compensatoires sont fournis : des objets en bois, un tunnel et un galet de foin, afin de favoriser l’activité d’exploration et de mastication. Enfin, de la musique est diffusée dans les salles d’hébergement.

Choix des espèces

Espèce animale définie dans le (ou les) texte(s) de référence(s). Stade jeune adulte et/ou poids correspondant précisés dans le(s) texte(s) de référence (poids compris entre 300 et 500 g en début d’étude).

Dépourvues de système immunitaire fonctionnel, des souris nude sont utilisées pour qu'elles acceptent une lignée de cancer du poumon humain. 1 008 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvements et dosages. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales dans le poumon gauche sous anesthésie, puis jusqu'à dix séances d'imagerie de trente minutes espacées d'une semaine, et pour certaines deux à trois anesthésies supplémentaires pour la nébulisation des nanothérapies. Le porteur ramène les effets indésirables attendus au stress des manipulations, qu'il juge comparable à celui d'un change de cage, sans revenir sur la tumeur pulmonaire qui se développe pendant ces dix semaines.

Objectifs

Avec presque 30000 décès par an en France, le cancer du poumon est le cancer le plus mortel. Les options thérapeutiques actuelles ne sont pas encore optimales et nécessitent de proposer de nouvelles options. Notre objectif est donc d’évaluer dans un modèle murin de tumeurs pulmonaires de nouveaux nanosystèmes permettant l’administration optimisée de chimiothérapies par adressage avec des peptides ayant une action positive sur la pénétration intracellulaire des vecteurs.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à court terme est de documenter l’apport de nanovecteurs porteur de peptides pénétrant sur la limitation de la croissance de tumeurs pulmonaire implantées chez la souris.

Procédures

Tous les animaux de cette étude recevront une injection de cellules tumorales au niveau du poumon gauche. Ce geste sera réalisé sous anesthésie qui ne durera pas plus de 5 minutes. Pour les animaux traités par nébulisation ou par injection intraveineuse, 2 ou 3 anesthésies gazeuses supplémentaires, d’une durée de 10 min maximum seront réalisées. Concernant les imageries, elles seront également réalisées sous anesthésie et seront au nombre de 10 maximum, espacées d'une semaine, et d'une durée maximale de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés au stress induit par les manutentions lors de la piqure pour l’injection des cellules tumorales, de la nébulisation des thérapies ou du contrôle IRM. Le niveau de stress généré par ces gestes sera comparable à celui induit par les changes.

Devenir

A la fin de chacune des procédures les animaux sont euthanasiés pour prélèvements et dosages.

Remplacement

Il existe de nombreux tests d’évaluation de toxicité sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous ont permis de présélectionner les nanothérapies que nous allons évaluer. Les objectifs du projet étant d’évaluer leur efficacité thérapeutique dans un contexte complexe où le devenir des nanomédicaments peut être impacté par le microenvironnement de l’hôte, l’utilisation d’animaux est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante pour valider les résultats expérimentaux.

Raffinement

Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les animaux seront maintenus en normothermie (système de chauffage asservi à la température rectale) pendant toutes les procédures avec une attention particulière lors des examens IRM - où un accès visuel à l'animal n'est pas possible – par un suivi complémentaire du rythme respiratoire afin d’évaluer la qualité de l’anesthésie. Le suivi régulier des animaux sera réalisé afin de s'assurer que les points limites adaptés à l'étude ne sont pas atteints. Afin de réduire l’inconfort de l’animal un dépôt de gel ophtalmique sur la cornée sera effectué à chaque phase des protocoles.

Choix des espèces

La lignée tumorale de cancer du poumon étant humaine, des souris nude (mâle et femelle) seront utilisées, cette espèce est retenue car le modèle ainsi obtenu est un modèle de référence. Les animaux inclus dans l’étude sont des animaux adultes âgés de 8-10 semaines ayant attient la maturité sexuelle.

656 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent deux gavages d'une minute espacés de vingt jours, une biopsie d'oreille au sevrage, et pour une partie d'entre elles une chirurgie du cou ou de l'abdomen pour recevoir une injection de virus dans le ganglion plexiforme ou dans l'estomac. Le porteur cherche à savoir comment un régime gras et sucré reçu autour de la naissance modifie durablement le nerf vague, qui relie l'intestin aux circuits cérébraux du plaisir. La mise à mort permet de récupérer le cerveau, l'intestin et les ganglions pour suivre le trajet du virus dans les fibres nerveuses.

Objectifs

Notre projet de recherche consiste à comprendre comment une alimentation occidentale (grasse et sucrée), reçue dès la période périnatale, peut modifier de façon durable la communication entre l’intestin et le cerveau. Pourquoi est-ce important ? Parce que le surpoids et l’obésité augmentent rapidement et posent un gros problème de santé publique. Ils nécessitent des actions précoces et variées pour limiter leurs effets nocifs, de l’enfance jusqu’à l’âge adulte. De plus, il est maintenant établi qu’un environnement nutritionnel riche en gras et en sucres dès le plus jeune âge augmente le risque d’obésité. Des recherches chez l’Homme et l’animal ont montré une relation entre l’obésité, une forte attirance pour des aliments très savoureux et des changements dans le « circuit de la récompense » du cerveau, régulant le plaisir et la motivation. Des études récentes soulignent aussi l’importance du nerf vague, qui relie l’intestin à ces zones cérébrales du plaisir. Les neurones du nerf vague participent aux mécanismes du plaisir et de la motivation. Il est donc crucial de mieux comprendre cette communication intestin-cerveau via le nerf vague, en particulier pendant la période périnatale, un moment décisif pour le développement. Dans un premier temps, nous allons donc analyser comment un régime occidental donné en période périnatale peut perturber l’axe intestin-nerf vague-cerveau à l’âge adulte. Pour y parvenir, nous utiliserons des souris transgéniques, nous permettant de manipuler et tracer, par génie génétique, les fibres du nerf vague connectant l’intestin au cerveau. Ce modèle nous permettra d’identifier exactement les neurones de l’axe intestin cerveau activés par le gras et le sucre chez les souris, et cela à différents âges (enfance jusqu’à l’adulte). Ensuite, nous vérifierons si ces modifications du nerf vague, induites par cette exposition précoce à un régime occidental, entraînent une altération fonctionnelle au niveau du tronc cérébral (zone de projection et d’intégration des informations transmises par le nerf vague). Pour cela, nous utiliserons ce même modèle transgénique, couplé à des techniques de pointe en neurosciences (expression virale de récepteurs, enregistrement des activités électriques des neurones cérébraux…). L’ensemble de ces expériences nous permettra de comprendre comment et par quels mécanismes le nerf vague contribue à moduler les circuits cérébraux contrôlant la prise alimentaire et ainsi participer à l’épidémie d'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera de nouvelles connaissances essentielles à une meilleure compréhension de l’axe intestin-nerfs vague-cerveau en étudiant l’altération des neurones vagaux sensitifs et la connexion entre les neurones vagaux et le NTS (Noyau du tractus solitaire),zone de projection et d’intégration des informations transmises par le nerf vague au niveau du tronc cérébral. De plus, ce projet pourrait avoir une contribution significative à la santé publique en offrant des pistes pour de nouvelles stratégies préventives aux maladies métaboliques, pendant la période délicate de la nutrition périnatale.

Procédures

Les souris recevront un gavage oral sur animal vigile, d’une durée d’une minute, réalisé deux fois, espacé de 20 jours. Une injection de virus AAV, virus infectant localement les cellules, sera réalisée sur le ganglion plexiforme (au niveau du cou) ou dans l’estomac, sur une partie des animaux, sous anesthésie générale et sous anti-douleurs (analgésiques et AINS ou Anti-inflammatoire non-stéroïdien). Pour l’entretien des lignées, les petits auront une biopsie d’oreille à 3 semaines (sevrage) pour le génotypage.

Impact sur les animaux

Pour le gavage, les animaux pourraient ressentir un stress et un inconfort de courte durée. Pour l’entretiens des lignées, la biopsie d’oreille pour le génotypage pourrait entrainer un stress et une légère douleur de courte durée. Les animaux subiront différentes opérations chirurgicales au niveau du cou ou de l’abdomen. Suite à ces interventions, d’éventuels signes d’inflammation et/ou de gonflement au niveau des zones de chirurgie (cou et abdomen) pourraient apparaitre. Ils pourraient présenter une modification dans leur comportement témoignant d’un inconfort, de stress, d’hypo- ou hyperthermie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin d’étudier le remodelage de l’axe intestin-nerf vague-cerveau suite à une alimentation périnatale riche en lipides et en sucres. Cela requiert une quantification de paramètres biologiques au sein de différents organes tels que l’intestin, les ganglions plexiformes et le cerveau. L’administration d’un virus infectant localement les neurones nécessite que l’on récupère le cerveau afin de mettre en lumière la communication entre les fibres afférentes vagales et certaines régions du cerveau. Cette procédure nécessite alors la mise à mort des animaux.

Remplacement

Il s’agit d’une étude in-vivo étudiant les interactions complexes de l’axe intestin-cerveau ce qui nécessite des modèles vivants, notamment pour observer les réponses physiopathologiques liant l’intestin au cerveau via le nerf vague, justifiant l’utilisation de souris. Il n’existe pas encore d’alternatives permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiopathologiques soutenant l’interaction de l’intestin avec le cerveau via le nerf vague. L’étude animale ne peut donc pas être remplacée par un modèle in-vitro, ex-vivo ou in-silico dans cette étude.

Réduction

Un effort particulier est fait pour optimiser le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse des résultats. Des outils statistiques avancés ainsi que l’expérience du laboratoire sont employés pour calculer la taille minimale d’échantillon nécessaire, prenant en compte la variabilité intragroupe et intergroupe inhérente à l’expérimentation in-vivo. En effet, il sera utilisé un effectif de 8 à 10 souris mâles et 8 à 10 souris femelles pour chaque groupe. De plus, les protocoles expérimentaux sont conçus pour permettre plusieurs niveaux d’analyses sur le même animal (ex : combiner des évaluations physiologiques et moléculaires sur différents organes comme le cerveau et l’intestin), réduisant ainsi le besoin d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Toutes les procédures respectent les normes éthiques les plus strictes pour minimiser la douleur, le stress et les inconforts des animaux. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé, et les techniques légères (gavage) ou modérées (injections dans les ganglions plexiformes) utilisées sont déjà maitrisées. Les animaux bénéficient également d’un enrichissement social (minimum 2 par cage) ainsi que d’un tunnel opaque et des matériaux de nidification (frisotis) pour se cacher, construire un nid, et ainsi maintenir leur bien-être psychologique tout au long des expériences. Lors des injections, les animaux seront suivis en post-opératoire quotidiennement afin de s’assurer de leur parfaite récupération, et de détecter d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance (inflammation ou inconfort au niveau du cou ou abdomen). L’évaluation des points limites et de l’état des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique, pelage, posture, activité, comportement, fréquence respiratoire). La présence de plusieurs signes notables ou d’un signe clinique sévère conduira à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Nous utilisons deux modèles de souris transgéniques, sélectionnés pour leur capacité unique à marquer de façon permanente et spécifique les populations neuronales activées par des stimuli nutritionnels. Le premier modèle, déjà établi au sein du laboratoire (hétérozygote), est actuellement en usage. Le recours au second modèle permet, quant à lui, de réduire le nombre d’animaux utilisés (homozygote). En effet, tous les petits seront homozygotes à la différence du premier modèle, utilisé en hétérozygote, où la moitié des petits n’ont pas le génotype désiré. Le projet vise à étudier le remodelage de l’axe intestin-nerfs vague-cerveau durant la période périnatale donc les animaux seront utilisés dès le premier jour de gestation (G0) jusqu’à 70 jours post-natal (P70) correspondant au début de l’âge adulte.