Rongeurs
Nouvelle stratégie pour la thérapie génique cérébrale dans un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectés dès la naissance, biopsiés à vif pour génotypage, puis pour une partie d'entre eux soumis à cinq séries de tests de réaction à la nouveauté, d'exploration, d'anxiété et de mémoire avant une chirurgie sans réveil, 1 800 souris vont être utilisées et toutes tuées. 164 relèvent d'un niveau de souffrance léger, 1 227 d'un niveau modéré et 409 d'un niveau sévère. Une partie porte un phénotype dommageable qui provoque un retard de croissance, des anomalies musculaires et comportementales, une pousse dentaire anormale gênant l'alimentation et une espérance de vie réduite, dans un projet qui teste une thérapie génique cérébrale contre la dystrophie myotonique de type 1. Les reproducteurs sont tués lorsque leur fertilité décline, les autres en fin de procédure, et le porteur décrit ces souris génétiquement modifiées comme "indispensables" aux essais précliniques.
Objectifs
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie rare qui affecte plusieurs partie du corps à la fois, avec un large éventail de symptômes cliniques affectant des patients de tous âges et des deux sexes. La DM1 est l'une des formes les plus courantes de dystrophie musculaire. Bien qu'elle ait été initialement caractérisée par des symptômes musculaires tels que la faiblesse musculaire, la myotonie, les défauts de conduction cardiaque; elle est hautement multisystémique. Les manifestations neuropsychologiques sont très invalidantes et particulièrement prononcées dans les formes précoces de la DM1. Afin d'étudier cette maladie au cours du développement et dans différents tissus, un modèle de souris transgéniques porteuses du gène muté responsable de la DM1 a été développé. Ces souris transgéniques reproduisent certaines caractéristiques de la maladie. Actuellement, il n'existe pas de traitement pour cette maladie, mais de nombreuses approches thérapeutiques sont évaluées en laboratoire et dans des essais cliniques chez l'Homme, avec pour le moment aucun traitement efficace pour le système nerveux central. Notre programme de recherche teste une nouvelle méthode pour corriger les anomalies au niveau du cerveau.
Bénéfices attendus
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la forme la plus fréquente de dystrophie musculaire chez l'adulte. Sa prévalence mondiale est estimée à 1 personne sur 8000, avec des variations selon les régions. Une étude récente suggère une prévalence globale pouvant atteindre 1 cas sur 2400 individus. La DM1 est une maladie chronique, évolutive et multisystémique, ainsi la prise en charge mobilise de nombreuses ressources médicales, sociales et familiales. Les soins de santé actuels se concentrent sur la réduction des incapacités grâce à des approches médicales multidisciplinaires, entraînant des coûts substantiels atteignant en moyenne 50 000 euros par patient par an. Ces dépenses peuvent s’élever à 1,5 million d’euros au cours des deux premières années de vie dans les cas congénitaux les plus sévères. Par conséquent, la recherche de traitements efficaces n’est pas seulement une nécessité médicale, mais également un impératif socio-économique essentiel pour améliorer la qualité de vie des patients, favoriser leur intégration socio-économique et réduire les coûts des soins de santé. Les efforts de recherche et de thérapie sur la DM1 se sont principalement concentrés sur les symptômes musculaires, tandis que la recherche sur la physiopathologie cérébrale a commencé plus tard et reste non résolue. Les bénéfices du projet à court et moyen terme : nous démontrerons la faisabilité d’une nouvelle stratégie thérapeutique et ouvrirons pour la première fois de nouvelles voies pour la thérapie génique dans le contexte de la DM1, axées sur le système nerveux central. Ceci favorisera la recherche préclinique visant à atténuer les manifestations neuropsychologiques invalidantes de la DM1 chez les patients. A long terme : les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre d’autres affections humaines ayant des mécanismes similaires (la dystrophie myotonique de type 2, l’ataxie spinocérébelleuse de type 8, l’ataxie de Friedreich et d’autres formes) pour lesquelles les études sur la DM1 sont des références.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : une injection de l'agent à tester (animal anesthésié, 1 fois, 3 minutes) puis une biopsie pour génotypage (animal vigile, 1 fois, 1minute). Une partie des animaux aura un prélèvement sanguin (animal vigile, 1 fois, 1 minute). L'autre partie suivra des tests comportementaux simples permettant d'évaluer la réaction à la nouveauté, l'exploration, l'anxiété et la mémoire (animal vigile, 5 fois, 30 minutes à 2 jours) puis une chirurgie sans réveil (animal anesthésié et analgésié, 1 fois, 10 minutes).
Impact sur les animaux
Une partie des animaux utilisés lors de ce projet présentent un phénotype dommageable qui induira un retard de croissance, des anomalies musculaires et des anomalies du comportement. Le phénotype pourra induire également une réduction de l'espérance de vie des animaux. Le phénotype pourra aussi induire une pousse anormale des dents qui peut géner la prise alimentaire et qui peut nécessiter une taille des dents qui pourra engendrer un léger stress chez l'animal. Une injection précoce sera réalisée chez les nouveaux-nés, elle pourra induire une douleur légère de courte durée et le rejet du petit par la mère. Une biopsie pour génotypage sera également réalisée chez les nouveaux-nés, elle pourra induire une douleur légère de courte durée. Un prélèvement sanguin à l'âge adulte sera réalisé sur certains animaux, ce prélèvement pourra induire une douleur légère de courte durée ainsi qu'un hématome. A l'âge adulte les animaux réaliseront des tests comportementaux simples qui pourront induire un léger stress à cause de l'environnement nouveau. Enfin, une chirurgie sans réveil sera effectuée sur certains animaux, l'anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire : les reproducteurs lorsque leur fertilité sera en déclin, les autres animaux en fin de procédure afin de pouvoir réaliser des prélèvements et faire des analyses biologiques.
Remplacement
Le projet se concentre sur une maladie humaine rare : la dystrophie myotonique de type 1 (DM1). Des études prélimaires in vitro seront réalisées au préalable du projet afin de pré sélectionner des traitements. Mais bien que certains mécanismes cellulaires puissent être étudiés dans des modèles de culture cellulaire artificiels, l'utilisation d'un modèle animal permet d'étudier les mécanismes spécifiques aux tissus et aux cellules. L'évaluation de la thérapie ou de la correction génétique in vitro sur des cultures primaires (neurones et astrocytes), bien qu'importante, ne peut malheureusement pas être prédictive de l'effet in vivo. L'utilisation de souris génétiquement modifiées est nécessaire pour étudier les composants neurodéveloppementaux et neurodégénératifs de la maladie cérébrale de la DM1. Ces modèles sont indispensables aujourd'hui pour les tests précliniques avant de passer aux tests cliniques chez les patients.
Réduction
1800 animaux seront utilisés dans ce projet. Afin de REDUIRE et d’optimiser le nombre d’animaux, le protocole d’étude a été développé avec une réduction du nombre d’animaux utilisés dans la mesure où tous les animaux issus des croisements (sans distinction de sexe) seront utilisés. Les souris n’ayant pas le génotype d’intérêt seront utilisées comme contrôles négatifs dans les différentes expériences. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, biologie moléculaire, histologie et ce, sur plusieurs tissus. Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation des animaux prévus dans la seconde étape, et ainsi de suite.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum (nidification et mastication) et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Les animaux sont déjà acclimatés à l'environnement car l'élevage est dans l'établissement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. En effet, tout sera mis en place pour limiter l'expression du phénotype dommageable (vérification de la dentition, ajout d'aliment hydraté facilement accessible). Les souriceaux seront délicatement manipulés et ils seront séparés de leur mère sur une courte durée (quelques minutes) pour limiter leur stress. Pour les tests comportementaux les animaux seront manipulés dans une pièce dédiée au calme. Une anesthésie et une analgésie est mise en place dès que nécessaire (injections, chirurgie sans réveil). Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Notre projet a pour but de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Si certains mécanismes cellulaires peuvent être étudiés en culture, seule l'utilisation d'un modèle animal permet d'étudier les mécanismes tissu-spécifiques. Ces modèles sont indispensables aujourd'hui pour les tests précliniques avant de passer aux tests cliniques chez les patients. Nous utilisons un modèle murin car nous disposons d'un modèle, que nous avons développé, de la dystrophie myotonique de type 1. Ce modèle développe des phénotypes multisystémiques comme chez l'Homme et est donc un modèle de choix dans ce projet, en particulier pour étudier l'aspect cérébral de la pathologie. Dans ce projet, les animaux seront utilisés dès la naissance car c'est à ce moment là que les cellules ciblées par la thérapie peuvent être modifiées. Les analyses se dérouleront entre 30 jours et 60 jours de vie car les modifications seront optimales à partir de cet âge et que les effets sur les animaux seront visibles.
Etude des effets de l’hormone de la libération des gonadotrophines hypophysaires (GnRH) sur la connectivité cérébrale chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
Tuées à la sortie de l'IRM parce que l'huile déposée dans leur conduit auditif ne peut pas être retirée et détruit leur système auditif, 45 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie générale, sans reprise de conscience. Chaque animal reçoit cette injection dans l'oreille, deux cathéters posés sur le dos et le ventre, puis un examen d'IRM de trente à quarante minutes pendant lequel l'hormone GnRH est administrée en continu. Le porteur qualifie l'IRM d'indolore et non invasive, tout en indiquant que la pose des cathéters et l'insertion de l'huile seraient douloureuses si l'animal se réveillait. Il retient une lignée génétiquement modifiée qu'il déclare "indispensable" pour activer les neurones à GnRH, dans un projet dont la finalité est d'appuyer un passage de cette molécule en clinique.
Objectifs
L’ hormone de libération des gonadotrophines hypophysaires (GnRH) et les neurones qui la sécrètent sont connus pour orchestrer la fonction de reproduction (la puberté, la fertilité, la libido…). Des études suggèrent que le rôle de cette molécule s’étendrait à d’autres paramètres tels que la régulation des fonctions de cognition et le comportement alimentaire. Dans ce cadre, il s’agit d’élucider l’intérêt d’un traitement à la GnRH pour la prise en charge des troubles alimentaires et la régulation de fonctions cognitives dans les pathologies où il est connu que cette hormone ne fonctionne pas bien et dont les patients présentent des altérations cognitives ou métaboliques. Restaurer un fonctionnement optimal de la GnRH pourrait aider à améliorer le confort de vie et diminuer voir éradiquer des symptômes pour un assez vaste spectre de pathologies. Pour exemples, l’obésité, l’anorexie mentale, le syndrome de Prader Willi qui sont des maladies métaboliques mais aussi la trisomie 21, la démence fronto-temporale ou encore la maladie d’Alzheimer présentent des caractéristiques communes bien que leur fonctionnement, leurs causes et leurs conséquences puissent être éloignées. Dans toutes ces maladies, nous pouvons noter des altérations de la fonction de reproduction associée à des altérations du comportement alimentaire, du poids et de la dépense énergétique mais également des altérations cognitives ou tout du moins des risques d’en développer. Notre hypothèse repose sur le point commun du mauvais fonctionnement de la GnRH dans toutes ces maladies. En vue d’un passage de la molécule en clinique pour ces indications, nous avons besoin de montrer que la GnRH peut en effet, bien moduler positivement l’activité cérébrale pour mieux comprendre son fonctionnement et mode d’action et justifier son intérêt et utilité. Pour répondre à cette hypothèse, nous souhaitons utiliser l'imagerie par résonance magnétique (IRM) qui est la meilleure technique pour imager le cerveau vivant de manière indolore, non invasive et longitudinale. L’examen d’IRM nous permettra notamment de démontrer : si certaines zones du cerveau présentent un changement d'activité (i) après le relargage de la GnRH par les neurones qui la produisent ou (ii) après un traitement à la GnRH. Le but est d’estimer si la GnRH peut bien agir sur le cerveau et de déterminer ses zones d’action pour soutenir son utilisation chez l’humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet seraient de s’assurer de la pertinence d’un usage en clinique de cette molécule pour des indications de soin dans le cadre des troubles de l’alimentation et d’amélioration des fonctions cognitives pour un large spectre de pathologies combinant ces symptômes.
Procédures
Les souris recevront un antidouleur et une anesthésie générale avant toute intervention. Afin d’éviter les artéfacts liés à la présence d’air dans le conduit auditif de la souris et pour pouvoir correctement analyser les images d’IRM dans nos zones d’intérêt, il est nécessaire d’injecter une substance dans le conduit auditif de la souris, l’exécution du geste est de l’ordre de 2 minutes. La pose d’un cathéter sur le dos est nécessaire pour administrer en continu l’anesthésiant durant toute l’intervention, et sur le ventre pour administrer la GnRH durant l’unique examen IRM qui dure de 30 à 40 minutes. Après l’IRM la souris sera euthanasiée pour ne pas subir les effets néfastes persistant de l’huile qui a été déposée dans l’oreille et que nous ne pouvons pas retirer.
Impact sur les animaux
La procédure et toutes les manipulations seront réalisées sous anesthésie générale, après administration d’antidouleurs et les souris seront euthanasiées après l’examen IRM. Toutefois, l’insertion d’huile dans l’oreille et les poses de cathéter peuvent être douloureuses si l’animal se réveille au cours de l’intervention et toutes les mesures sont prises (contrôle de nombre de respiration et du degré d’anesthésie de la souris) pour éviter à tout prix que cela se produise.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées après l’examen IRM afin de pallier toute douleur et répercussion liée à la procédure. En effet, tout le système auditif de la souris est altéré et détruirait son confort de vie, une euthanasie est prévue à la sortie de l’IRM alors que l’animal est encore anesthésié.
Remplacement
La stratégie expérimentale a été planifiée en tenant compte de la règle des 3R. L’objectif de l’étude est d’appuyer un passage en clinique de la GnRH pour la prise en charge de troubles cognitifs et métaboliques. L’impact du traitement sur le cerveau doit être étudié chez l’animal puisqu’il est mesurable uniquement avec des acquisitions sur un cerveau vivant et physiologiquement actif. Il n’est donc pas possible de substituer le modèle animal par des expériences in vitro. De ce fait nous avons besoin d’un animal vivant pour étudier l’effet du traitement de manière intégrative et de comprendre ses mécanismes d’action pour un appui de son utilisation en clinique.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre d’animaux en fonction des nécessités d’effectifs pour réaliser des tests statistiques significatives. Cela a été possible grâce à des expériences préliminaires réalisées sur un autre modèle de souris en IRM . Ces expériences nous avaient permis d’obtenir des résultats significativement exploitables à partir de 15 souris par groupe ce qui nous laisse penser qu’il faudrait un nombre identique pour des expériences dont le fonctionnement méthodologique est identique. Nous avons tenu compte des éventuelles possibilités de décès liés à l’anesthésie durant l’IRM. Nous avons choisi l’IRM qui est une méthode indolore et non invasive et permet de regarder de nombreux paramètres sur un même animal. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux et le nombre d’expériences à réaliser pour obtenir ces mêmes informations que si nous n’avions pas recours à l’IRM.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe. Un enrichissement avec des balles de papiers pour réaliser un nid et une maisonnette en plastique sera prévu pour chaque cage. Un temps de 15 jours sera laissé pour leur permettre de s’habituer à l’animalerie. Une IRM sera réalisée par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen. L’IRM n’est ni invasive, et se déroulera sous anesthésie générale. Si un animal se réveille durant l’IRM et présente le moindre signe de douleur (points limites adaptés) il sera retiré du protocole et euthanasié pour les mêmes raisons que les animaux restant dans le protocole.
Choix des espèces
Le protocole d’étude du traitement de la GnRH a été développé chez la souris, nous gardons cette espèce pour permettre une reproductibilité du protocole. Le traitement est étudié chez un modèle génétiquement modifié qui permet d’obtenir une activation des neurones à GnRH que nous ne pourrions pas obtenir autrement. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est donc indispensable à l’étude du traitement en phase pré-clinique. Le jeune âge comme le vieillissement agissent sur la fonction de reproduction, les fonctions cognitives et la régulation de la prise alimentaire, c’est pourquoi nous étudions les souris à l’âge adulte pour ce projet.
Evaluation de l’activité antitumorale de traitements thérapeutiques innovants sur des lignées cellulaires implantées chez des modèles murins
- Recherche appliquée
- Cancers
Des tumeurs greffées sous la peau servent à trier des molécules candidates au traitement du cancer, greffe après greffe et lignée cellulaire après lignée cellulaire. 4 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées ou immunocompétentes selon la lignée tumorale à implanter, elles reçoivent la greffe sous anesthésie générale, un marquage à l'oreille ou par puce, puis un traitement administré chaque jour et jusqu'à quatre prélèvements de sang, avec pour effets attendus des douleurs post-opératoires, un risque d'infection, des diarrhées et une perte de poids par cachexie ou anorexie. Le porteur reconnaît l'existence de méthodes in vitro et de prédictions informatiques qui réduisent le nombre de tests, et affirme qu'elles ne relient pas les effets d'un traitement au métabolisme d'un organisme complexe.
Objectifs
L’augmentation des chances de succès de la mise sur le marché d’un médicament efficace, notamment en oncologie, passe par l’amélioration des systèmes permettant de tester le potentiel thérapeutique de ce médicament avant de le tester chez le patient. Pour cela, il est nécessaire de mettre au point des modèles d’étude mimant la pathologie d’intérêt. Les cellules tumorales (lignées) sont largement utilisées dans le domaine de l’oncologie, elles ont l’avantage de pouvoir être manipulées en culture (in vitro) pour la réalisation de tests préliminaires, afin d’identifier les médicaments ayant le plus de chances de succès. Suite à ces tests préliminaires, l’analyse de l’efficacité, de l’éventuelle toxicité et des mécanismes d’action des médicaments sur un organisme complexe, comme la souris (in vivo), est une étape nécessaire. Dans ce contexte, les cellules tumorales sont greffées chez la souris dans le but de générer des tumeurs pour étudier l’effet antitumoral des médicaments d’intérêts. Ces modèles tumoraux sont des outils précieux pour la recherche visant à étudier les effets des médicaments puisqu’ils reproduisent des caractéristiques moléculaires et histologiques des tumeurs observées chez les patients, et leurs particularités ont été largement étudiées. Le choix des modèles de cellules utilisées est réalisé en fonction des particularités de ces cellules et des propriétés des médicaments à tester (type tumoral, mutation d’un gène d’intérêt…). L’évaluation de l’efficacité antitumorale de nouvelles thérapies sur des greffes de cellules tumorales chez la souris est un enjeu majeur pour relever les défis actuels rencontrés dans la lutte contre le cancer, afin d’identifier des traitements adaptés, efficaces, et d’anticiper des mécanismes de résistance et de toxicité aux traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif la greffe de lignées cellulaires tumorales chez la souris pour la détermination de l'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques développées ou en cours de développement. Dans le cadre du développement de médicaments ciblant des types de tumeurs avec des caractéristiques très spécifiques et bien identifiées (présence d’une molécule particulière à la surface des cellules cancéreuses, cellules avec des mutations d’intérêt,…) il est indispensable d’évaluer ces traitements sur des modèles de tumeurs reproduisant ces caractéristiques, au sein d’un organisme complexe (souris), avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Parmi un grand nombre de molécules à tester, incluant de nouvelles molécules ou des molécules développées ou en cours de développement, les études précliniques sur la souris sont une première étape vers l’identification des traitements plus efficaces ou avec des effets secondaires moindres.
Procédures
Avant la greffe, les souris sont anesthésiées (anesthésie générale) et désinfectées. Les cellules tumorales sont implantées sous la peau. Les souris sont identifiées au niveau des oreilles ou avec une puce. La procédure a une durée globale de 30 minutes maximum par souris. Les animaux sont manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée (mesure de la tumeur et pesée de l’animal), la durée de la manipulation est inférieure à 1 minute par animal. Durant la phase de traitement, l’administration de la ou des molécules est réalisée quotidiennement ou moins fréquemment selon le schéma de traitement associé. Le temps de manipulation est de maximum 1 minute par administration. En cas de prélèvement de sang la manipulation des animaux, vigiles ou anesthésies, a une durée inférieure à 2 minute. Dans le cas d’un prélèvement sanguin terminal, l’animal est euthanasié à la fin de l’intervention. Le nombre de prélèvement maximal par animal est de quatre.
Impact sur les animaux
Stress dû à la préhension (suivi du poids et de la taille tumorale, administration de molécules): nuisance transitoire de classe légère ; Douleurs post-opératoires: nuisance transitoire de classe modérée ; Risque d’infection: nuisance transitoire de classe modérée ; Perte de poids (cachexie, anorexie ou perte d’appétit): nuisance transitoire de classe modérée ; Diarrhées: nuisance transitoire de classe modérée
Devenir
Compte tenu des interventions que les animaux ont subi (greffe de cellules tumorales, traitement médicamenteux), l'ensemble des animaux de ce projet sera euthanasié à l'issue de la procédure.
Remplacement
La production de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests précliniques afin de valider leur absence de toxicité et leur efficacité sur la croissance tumorale, avant une application chez l’Homme. Il existe des méthodes alternatives et préalables à la réalisation de tests sur les animaux (in vitro, prédictions informatiques…), permettant de réduire la quantité de tests à effectuer en nombres de traitements et en détermination de doses. Cependant, elles n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec une activité du métabolisme d’un organisme complexe pour l’étude de la distribution et de l’efficacité thérapeutique. Ce projet a pour objectif de réaliser des greffes des cellules tumorales chez la souris pour tester l’efficacité et la toxicité de traitements développés ou en cours de développement. Ces cellules sont bien caractérisées, hautement documentés, et représentent les diversités des cancers, et ce dans un organisme complexe. Elles permettent d’augmenter les chances de succès dans le développement de traitements efficaces et spécifiques (médecine personnalisée), avant un transfert en étude clinique chez l’Homme.
Réduction
La greffe de cellules tumorale et les tests d’efficacité thérapeutiques sur les souris sont standardisés. La parfaite connaissance des modèles permet de mettre en place une stratégie expérimentale utilisant un nombre d’animaux réduit au minimum pour obtenir des résultats pertinents. Grâces aux données de la littérature, nous estimons que toutes les lignées cellulaires implantées permettront la réalisation de tests thérapeutiques. Les tests préalables en culture (in vitro) contribuent à la réduction du nombre d’animaux utilisés en éliminant les molécules sans effet antitumoral. Le juste nombre d’animaux nécessaire pour pouvoir conclure sur l’effet antitumoral de chaque molécule a été déterminé grâce à un test statistique.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement pour monitorer leur bien-être général et leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Pour chaque animal, tout signe clinique observé susceptible de causer une douleur, une souffrance ou une angoisse, sera immédiatement enregistré pour une surveillance accrue et conserver un historique. Si une douleur, une souffrance ou une angoisse est observée de manière répétée ou cumulée, les dispositions adéquates seront prises. L'implantation de cellules se fera sous anesthésie générale, et, sur un tapis chauffant pour éviter le risque d’hypothermie. De l’antiseptique sera appliqué sur la peau des animaux et le matériel utilisé sera stérilisé pour éviter les risques d’infection. Le réveil des animaux sera surveillé jusqu’à 24h après l'anesthésie. En cas d’une perte de poids, une supplémentation alimentaire sera proposé à l'animal. Si une sécheresse oculaire est observée, un protecteur oculaire sera administré à l’animal. Les prélèvements de sang seront réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés. L'ensemble de ces mesures permet d'anticiper et de réduire une éventuelle souffrance de l'animal.
Choix des espèces
Nous utilisons des souches murines immunodéprimés qui sont classiquement utilisées pour des greffes de cellules tumorales humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux, en fin de période d'acclimatation, âgés entre 5 et 13 semaines pour augmenter nos chances de succès. Nous utilisons des souches murines immunocompétentes pour l'implantation de lignées cellulaires tumorales murines puisque ce sont dans ces souches que les lignées ont été développées. Ces souches murines immunocompétentes permettent également d’étudier l’impact de traitements antitumoraux sur le système immunitaire de la souris. Afin d'homogénéiser les conditions de croissance entre les différentes études, nous utiliserons des animaux en fin de période d'acclimatation, âgés de maximum 13 semaines.
Etude de la pénétration et de la pathogénicité des auto-anticorps anti HMGCR et anti SRP dans un modèle murin de myopathies nécrosantes auto-immunes (souris SJL)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
Injectées chaque jour pendant sept jours avec des anticorps prélevés sur des malades, 55 souris subissent trois microprélèvements de sang et deux tests de force par traction. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme que l'atteinte musculaire n'a eu, lors de protocoles antérieurs, aucune répercussion visible en termes de souffrance ou de perte de poids, tout en décrivant une échelle de gravité graduée jusqu'à la paralysie du train arrière, une évaluation quotidienne de la douleur par deux observateurs et un traitement analgésique préventif dès la veille de la première injection. Le muscle gastrocnémien est prélevé après une mesure de force réalisée sous anesthésie, ce qui exclut de garder les souris en vie.
Objectifs
Au sein des myopathies inflammatoires, les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) sont définies histologiquement par la présence d'une importante destruction des fibres musculaires sans inflammation. La nature auto-immune des myopathies nécrosantes a été suggérée par leur association fréquente à la présence d'autoanticorps (aAc) et la corrélation de leur quantité avec la destruction du muscle. Notre laboratoire a établi un modèle murin de MNAI par injection à des souris d’anticorps de malades. Ce transfert induit une myopathie clinique avec diminution de la force musculaire associée à un dépôt d’anticorps et de complément à la surface des fibres musculaires, démontrant le caractère directement pathogène des aAc. Cependant, aucune étude (in vitro ou in vivo) n'a démontré que les aAcs pénétraient dans les fibres musculaires et avaient un rôle direct sur leur cible intracellulaire. L'objectif général de notre programme est de déterminer si les aACs sont capables de pénétrer dans les fibres musculaires d'une souris (souche spécifique choisie car déficiente pour une molécule qui la rend plus susceptible de laisser pénétrer les anticorps) et d'évaluer la pathogénicité des anticorps sur leur cible. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires.
Bénéfices attendus
La mise en évidence de la pénétration des anticorps dans les fibres musculaires permettrait de mettre à jour un nouveau mécanisme d'action des autoanticorps et de développer de nouvelles thérapies ciblées.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à 3 microprélèvements de sang, d'une durée de moins de 5 secondes chacun. Les souris seront injectées quotidiennement en IP durant 7 jours soit 7 injections d'une durée de moins de 10 secondes chacun. 2 grip test seront réalisés pour chacune des souris à 8 jours d'intervalle, durée moins de 10 secondes. Les gastrocnémiens de tous les animaux seront prélevés sur les souris euthanasiées en fin de protocole.
Impact sur les animaux
L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux autorisés avec ce modèle animal a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercution visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids.
Devenir
Le prélèvement du muscle gastrocnémien (postérieurement à la mesure de la force in situ) pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.
Remplacement
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de la pathogénicité des anticorps de malades dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisé que chez l'animal.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autres protocoles expériementaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'aAcs chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis par un calcul de puissance de déterminer exactement les effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum (déterminé par une approcha statistique) en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologiques obervées lors de ces protocoles.
Raffinement
L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement : température (23°C), hygrométrie (50%), cycle jour/nuit (12/12), change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de cellose (cello dome) et des fibres de coton (Nestlets). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite (score 2) dans l’ensemble des expériences. Cette échelle est définie de la façon suivante : Score 0 : condition physiologique (pas de signe clinique) ; Score 1 : faiblesse du train arrière, queue trainante ; Score 2 : diminution de l’activité locomotrice des pattes arrières, courbure du dos significative ; Score 3 : paralysie du train arrière. Une évaluation quotidienne de la douleur par deux personnes indépendantes sera également mise en place par une observation des changements des expressions faciales des animaux et l’apparition de signes comme le léchage et le grattage d’une zone douloureuse, l’automutilation, la déshydratation, l’agressivité, les yeux clos, les postures anormales (dos voussé…), l’activité réduite, la diminution du toilettage, la respiration anormale, ou encore la perte de poids (mesurée par pesée). Un traitement préventif quotidien de la douleur sera mis en place 24 heures avant la première injection d''anticorps pour les animaux de tous les lots par un analgésique sous forme de gélose, remplacée tous les jours, à raison de ¼ de gélose (de la taille d’un glaçon) par souris. Lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes sera atteint ou que le traitement préventif ne sera plus suffisant, un anti-inflammatoire sera administré par voie sous cutanée jusqu'à disparition de la douleur. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. De plus, lors de la mesure de la force musculaire in situ, un analgésique sera administré 30 minutes avant le début de l’intervention.
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques ou largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.
Rôle du cortex insulaire dans les altérations de l’anxiété induites par l’obésité
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rendues obèses par douze semaines de régime hyperlipidique pour la moitié d'entre elles, opérées deux heures trente pour l'implantation d'un dispositif d'enregistrement cérébral, laissées quatre semaines à récupérer, puis soumises à sept tests comportementaux en deux semaines : 2 880 souris vont être utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 384 d'entre elles et modéré pour les 2 496 autres. Deux de ces tests provoquent un stress anxieux que le porteur qualifie d'effet qu'on ne peut ni ne veut réduire. Il annonce des logiciels d'intelligence artificielle pour tirer le maximum de données de chaque animal, sans détailler le calcul qui aboutit à 2 880 souris. Elles sont tuées à la fin du projet pour prélever leur cerveau.
Objectifs
L’obésité, majoritairement conséquente à la surconsommation d’aliments à haute densité énergétique comme le régime hyperlipidique (HL), est un des défis de santé public les plus sérieux du 21ème siècle. En plus d’être un facteur de risque de maladies métaboliques et cardiovasculaires, le surpoids et l’obésité affectent les fonctions cérébrales et ont été associés à une haute prévalence de troubles anxieux par rapport à la population générale. L’anxiété amplifiant la menace que représente l’obésité, le besoin d’identifier des interventions thérapeutiques appropriées est imminent. Tout comme chez l’humain, les modèles rongeurs d’obésité induite par régime HL présentent des comportements anxieux accrus. De manière intéressante, l’obésité ainsi que les troubles anxieux sont associés dans les études cliniques à un dysfonctionnement du cortex insulaire (ou insula). Cependant, il n’est pas encore clair si le dysfonctionnement de l’insula pourrait contribuer à l’anxiété induite par l’obésité. Nous proposons donc d’évaluer chez la souris l’impact du régime HL sur la fonction de base de l’insula et au cours de comportements anxieux, et de manipuler l’activité de l’insula afin d’atténuer l’anxiété induite par le régime HL.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet comprennent : 1- Compréhension accrue des mécanismes neurobiologiques : L’obésité ainsi que les troubles anxieux sont associées dans les études cliniques à un dysfonctionnement d’une région cérébrale nommée le cortex insulaire (ou insula). Cependant, il n’est pas encore clair si le dysfonctionnement de l’insula pourrait contribuer à l’anxiété induite par l’obésité. Nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes sous-jacents afin d’améliorer le diagnostic et le traitement de patients obèses anxieux. 2- Développement de nouvelles stratégies thérapeutiques : L’obésité est un facteur de risque de maladies métaboliques et cardiovasculaires et de plus affectent les fonctions cérébrales. L’obésité et le surpoids ont été associés à une haute prévalence de troubles anxieux par rapport à la population générale. Ce projet constitue une étape nécessaire pour un meilleur diagnostique et une meilleure prise en charge des patients souffrants d’obésité et d’anxiété. 3- Amélioration des interventions préventives : Mieux comprendre l'impact d'un régime obésogène sur l'anxiété pourrait aider à développer des stratégies de prévention pour réduire l'anxiété chez les patients obèses. 4- Avancées dans les techniques de recherche : Le projet utilisera des techniques de pointe telles que l’imagerie par photométrie, la chémogénétique, le séquençage à haut débit du transcriptome, l’électrophysiologie ex-vivo ce qui pourrait également contribuer à l'avancement des méthodes de recherche en neurobiologie et en psychiatrie.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis à un régime hyperlipidique à 8 semaines et durant 12 semaines. A l’âge adulte (semaine 9), ils subiront une chirurgie d’un maximum de 2h30 suivie d’une période de 4 semaines de récupération. La totalité des animaux seront ensuite soumis à une batterie de tests comportementaux (7 au maximum d’une durée comprise entre 10 et 30 minutes) étalés sur 2 semaines à raison d’un test par jour. Deux des tests comportementaux induisent spécifiquement un stress lié à l’anxiété, que l’on ne peut/ne veut réduire.
Impact sur les animaux
Il est important de prendre en compte les potentielles nuisances ou effets indésirables sur les animaux lors de la conduite de ce type de recherche. Certains effets indésirables potentiels sur les animaux pourraient inclure : 1. Faim/soif/malnutrition Les souris soumises à un régime hyperlipidique (HL) développent une obésité, caractérisée par une augmentation significative de la masse corporelle et de la masse adipeuse. Cette modification métabolique peut induire des perturbations de l'homéostasie énergétique, nécessitant une surveillance accrue de leur statut nutritionnel pour éviter les effets délétères associés à la surcharge pondérale. 2. Peur/détresse : Les manipulations peuvent générer une forme de peur ou de détresse chez l'animal, résultant d'une modification de son environnement ou de son interaction avec l'humain. 3. Stress physique/thermique : Les procédures expérimentales elles-mêmes, telles que la manipulation des animaux, les tests comportementaux et les injections de substances, peuvent induire du stress et de la détresse chez les souris de laboratoire. Il est essentiel de concevoir les protocoles expérimentaux de manière à minimiser ces facteurs de stress et à garantir le bien-être des animaux autant que possible. 4. Douleur/lésion/maladie Les procédures chirurgicales, comme l'implantation de dispositifs pour l'enregistrement neuronal, comportent un risque de complications telles que des infections ou des réactions inflammatoires. 5. Environnement non adapté/isolement : un isolement après une peut nuire au bien-être de l'animal, entraînant un inconfort physique ou psychologique. Ces effets indésirables doivent être pris en compte et minimisés pour garantir le bien-être des animaux en respectant les principes des 5 libertés.
Devenir
A l’issu du projet, les souris seront euthanasiées pour prélèvement du cerveau.
Remplacement
L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral est permise uniquement grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle souris par des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous adopterons une approche statistique rigoureuse permettant d'obtenir des résultats fiables avec un minimum d'animaux. Le nombre d'animaux nécessaires a été soigneusement calculé pour garantir la robustesse des résultats tout en limitant leur utilisation. Nous utiliserons également des techniques avancées de neurosciences computationnelles pour maximiser les données comportementales extraites de nos souris. Des logiciels utilisant l’intelligence artificielle seront employés pour analyser ces comportements et constituer une base de données détaillée. Ces méthodes permettent de tirer le maximum d'informations de chaque animal tout en minimisant leur nombre.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages collectives enrichies en nids de coton afin de limiter le stress dû à l’isolement. La température, l’hygrométrie et le cycle jour/nuit seront régulés dans l’animalerie agréée. Les animaux auront à disposition de la nourriture et de l’eau à volonté. Ils seront surveillés quotidiennement par les animaliers tout au long de leur vie, et bénéficieront d’une surveillance plus particulière par les expérimentateurs en période expérimentale. L’état général des animaux (état du pelage, sociabilité, posture, mobilité, …) sera inspecté. En cas de signe de mal-être, l’animal sera isolé et soigné. Les éventuelles agressions entre congénères seront stoppées par l’isolement de l’agresseur, et la victime sera soignée (désinfection des plaies, aide à la cicatrisation). En l’absence d’amélioration significative de l’état de l’animal, il sera euthanasié dans les 48h. Une médication pré-chirurgicale sera systématique afin d’éviter la souffrance post-opératoire. Des points limites suffisamment prédictifs sont mis en place pour éviter la souffrance tout au long de la vie de l’animal.
Choix des espèces
Les souris sont un modèle largement utilisé pour l’étude des circuits impliqués dans la peur et les troubles anxieux. Les traitements nutritionnels et l’induction de l’obésité sont faciles à conduire et l’équipe Ferreira dispose d’une expérience de longue date pour conduire des approches nutritionnelles chez cette espèce. De plus, la région cérébrale d’intérêt de notre étude possède la même structure chez la souris que chez l’humain. Notre étude repose sur une procédure unique qui utilise plusieurs techniques génétiques avancées. Pour cela, nous utiliserons différentes lignées transgéniques comme la lignée VGAT afin d’étudier le rôle des interneurones dans l’hyperexcitabilité induite par l’obésité/anxiété ainsi que la lignée 5HT2CR KO afin d’étudier le rôle d’un des récepteurs à la sérotonine. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de travailler sur des neurones et circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées matures. Le régime alimentaire hyperlipidique sera suivi à partir de 8 semaines, et les chirurgies seront réalisées à 16 semaines.
Modèle de rhabdomyosarcome chez la souris immunodéprimée : approche thérapeutique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris utilisées sont immunodéprimées par construction, choisies pour laisser se développer des tumeurs humaines sans réaction de rejet. 1 440 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Réceptionnées à quatre semaines, elles reçoivent une injection de cellules de rhabdomyosarcome dans un muscle ou dans la veine de la queue, puis trois injections de traitement par semaine pendant huit semaines au maximum, avec un développement tumoral qui peut atteindre 2 000 mm3, se nécroser en fin d'expérience et faire perdre du poids. Le porteur affirme que les traitements ne provoquent aucun effet indésirable et que le déficit immunitaire n'entraînera pas de nuisance, dans un projet qu'il classe lui-même en gravité sévère.
Objectifs
Le rhabdomyosarcome (RMS) est un cancer pédiatrique qui à pour origine les cellules musculaires. La tumeur primaire qui se développe localement peut se propager à d’autres organes, souvent les poumons. Malheureusement, les formes métastatiques se soignent difficilement et dans ce contexte, le taux de survie des patients est faible. L’objectif de ce projet est 1) d’étudier l’efficacité de nouveaux traitements identifiés suite aux projets de recherche fondamentale du laboratoire, et 2) d’étudier l’efficacité de ces nouveaux traitements sur la réponse aux traitements classiques de chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de déterminer la pertinence de ces nouveuax traitement et si ils optimisent les traitements de classiques de chimiothérapie. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminants dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
Une injection intramusculaire des cellules tumorales d'une durée de 30 secondes ou une injection intraveineuse au niveau de la queue d'une durée de 30 secondes. Traitement des souris par voie intrapéritonéale, intraveineuse et orale : trois injections par semaine pendant un maximum de 8 semaines (30 secondes pour chaque injection).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables observés sont ceux liés aux injections intramusculaires (et intraveineuses) des cellules tumorales et ceux liés au développement de tumeurs en site musculaire ou le développement des métastases pulmonaire, tels qu'une perte de mobilité lié à la masse tumorale qui ne dépassera jamais 2000 mm3. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Une perte de poids peut également être observée. Les différents traitements sont non toxiques aux doses utilisés et ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris. Leur administration entrainera un léger stress lié à la contention et une légère douleur de courte durée liée à l'injection intrapéritonéale et orale. Compte tenu des conditions d'hébergement en portoirs ventilés, le caractère immunodéficient (système immunitaire moins puissant) des animaux n’entrainera pas de nuisance.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Pour analyser les effets sur la réponse anti-tumorale de plusieurs traitements de chimiothérapie dans un modèle de rhabdomyosarcome, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu et les effets sur la croissance tumorale, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris. Les expériences in vitro ne permettent pas de mimer un micro environnement tumoral complexe (muscle et tumeur). Néanmoins, les molécules connues et en développement sont systématiquement testées in-vitro pour étudier la cytotoxicité éventuelle.
Réduction
Compte-tenu d’études comparables déjà publiées, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique. Des tests statistiques seront utilisés pour comparer les volumes tumoraux entre deux groupes à un temps donné. Ainsi le nombre d’animaux sera réduit au minimum mais satisfaisant pour pouvoir conclure de façon statistiquement significative.
Raffinement
Afin de raffiner les procédures expérimentales, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter le plus précocement possible tout signe de douleur. Les animaux anesthésiés seront placés sur un tapis chauffant lors de la réalisation des gestes techniques, une analgésie sera appliquée dès que nécessaire et des points limites strictes et suffisament prédictifs seront établis. Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Les souris recevront une période d’acclimatation suffisante, avant l’entrée en projet. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de mal-être. En cas d'atteinte de mobilité, de la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage.
Choix des espèces
L’utilisation de souris immunodéprimées est choisie afin d’étudier le développement de nouvelles thérapies sur des tumeurs humaines dans un environnement in vivo complexe ( muscle et tumeur). Nous utilisons de jeunes souris afin de mimer au mieux les tumeurs qui se développent chez l’enfant, l’adolescent ou le jeune adulte chez les patients. Réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 semaines).
Mise en place, chez la souris, de deux modèles techniques pour imager des événements cinétiques dans des tumeurs intrapéritonéales dans le temps
- Recherche fondamentale
- Oncologie
L'expérience s'arrête si la fenêtre d'imagerie se détache de l'abdomen ou s'enflamme, sinon les souris sont tuées au plus tard seize jours après la pose. 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et l'autre moitié d'un niveau sévère. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales, pour certaines dans le foie après incision, puis une fenêtre souple fixée sur l'abdomen à la colle chirurgicale et des séances d'imagerie de quarante-cinq minutes sous anesthésie. Le porteur classe en stress sévère l'isolement de huit à seize jours qu'impose cette fenêtre, et situe l'objet du projet dans la comparaison de deux techniques d'observation, la fenêtre souple et la transparisation optique de la peau.
Objectifs
La microscopie intravitale permet d’observer en temps réel, à l’échelle des cellules, des événements dans les tissus vivants d’animaux anesthésiés. Cette technique est particulièrement utile pour étudier comment les cellules tumorales interagissent avec leur environnement ou pour mieux comprendre la réponse du système immunitaire, en suivant les interactions entre cellules directement dans l’animal. La microscopie intravitale est la seule méthode qui permet de suivre ces interactions en temps réel et de les observer sur plusieurs heures dans un même tissu. Cependant, pour réaliser ces observations, il est souvent nécessaire de faire une intervention chirurgicale lourde afin d'exposer le tissu, ce qui limite l’imagerie à quelques heures et ne permet pas d’observer le même animal sur plusieurs jours. Une alternative consiste à implanter une fenêtre d’imagerie permanente, permettant de suivre les changements dans le même animal sur plusieurs jours ou semaines, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires. Pour les cancers abdominaux, il existe deux types de fenêtres pour la souris : une fenêtre rigide avec un anneau métallique fixé à la peau par des sutures, et une fenêtre souple fabriquée en un matériau flexible, maintenue par de la colle chirurgicale. Une autre solution récente consiste à utiliser une méthode de transparisation optique, qui permet de voir les tissus profonds sans chirurgie en appliquant des molécules spéciales sur la peau. Cette technique permet de visualiser la structure et les fonctions des tissus sans aucune chirurgie, mais elle reste limitée par la diffusion de la lumière dans les tissus, ce qui réduit la qualité de l’image et la profondeur de l’observation. De plus, elle ne fonctionne bien que dans une partie du spectre visible. Le but de ce projet est de mettre en place un modèle de fenêtre souple pour observer le développement des tumeurs chez la souris à l’échelle cellulaire (comme la croissance, la migration ou l'invasion de cellules) sur plusieurs jours, et de comparer cette méthode avec la transparisation optique sans chirurgie. L’objectif est de déterminer laquelle de ces techniques offre la meilleure qualité d’image, la meilleure sensibilité et la meilleure stabilité pour le suivi des tumeurs tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires pour la recherche.
Bénéfices attendus
Observer le comportement des cellules tumorales et immunitaires dans leur environnement réel est essentiel pour mieux comprendre comment les cancers et le système immunitaire fonctionnent et s'adaptent aux traitements. Cela permet de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur ces observations. Seule la microscopie intravitale permet cela à l'échelle de la cellule. Cependant,cela nécessite une chirurgie qui limite l'imagerie à une seule fois. Proposer un outil permettant de réaliser cette imagerie intravitale dans un même animal au cours du temps et avec le moins de chirurgie possible permettra de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés et d’alléger la sévérité des expériences.
Procédures
Les souris subiront une injection sous anesthésie (2-3 minutes). Ces mêmes animaux seront anesthésiés pour être soumis à une séance d’imagerie durant en moyenne 45 minutes. Préalablement,certains de ces animaux auront une chirurgie : soit pour permettre une injection (durée 15 minutes), soit pour poser une fenêtre abdominale (durée 30 minutes) permettant de réaliser l’imagerie.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales peut induire du stress et une douleur au site d'injection. Pour les cellules injectées dans le foie, l’incision, l’injection et la fermeture de l’incision, peuvent induire du stress et une douleur modérée du fait de la chirurgie et de l’injection. Le développement tumoral dans le foie et le pancréas peut causer des douleurs et une dégradation de l’état des animaux. La pose de la fenêtre abdominale peut induire une douleur modérée du fait de la chirurgie et un stress sévère du fait de l'isolement prolongé. L’injection du marqueur fluorescent sous anesthésie peut générer un stress et une douleur au site d'injection chez l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort après la dernière séance d’imagerie pour des prélèvements de tumeurs et des comparaisons histologiques entre les deux modèles développés.
Remplacement
Les procédures réalisées sur l’animal ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. Il n’est pas possible à l’heure actuelle de mimer in vitro la dynamique des cancers et de la réponse immunitaire associée de façon satisfaisante.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque lignée de souris a été déterminé afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour chaque type d’imagerie et comparer les deux modèles (transparisation versus fenêtre souple) par des tests statistiques. Le développement des modèles de chambre abdominale et de transparisation in vivo permettra de réaliser l’imagerie intravitale dans un même animal au cours du temps, réduisant ainsi considérablement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
L’injection des cellules et du marqueur, l’application du gel, et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie. Avant l’injection du marqueur, un analgésique sera appliqué. La pose de la fenêtre ventrale et l’injection des cellules dans le foie seront réalisés sous anesthésie. Un analgésique sera administré avant et après la chirurgie. En complément, un anesthésique local sera appliqué sur la peau, au lieu d’incision et un anti-inflammatoire administré. Le suivi des animaux, après l’injection des cellules tumorales et la pose de la fenêtre ventrale, se fera tous les jours par surveillance accrue et mise en place de points limites précoces. L’expérience sera arrêtée si la fenêtre se détache, l’animal présente une inflammation de la fenêtre, ou s'il y a dégradation de l'état général des animaux, sinon, les souris seront mises à mort au plus tard 16 jours après la pose. Les animaux seront hébergés individuellement à partir de la pose de la fenêtre (de 8 à 16 jours) pour éviter qu’ils ne se blessent entre eux, mais avec les autres animaux visibles et à proximité dans les autres cages.
Choix des espèces
La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. De plus, les lignées de cellules tumorales et de souris transgéniques utilisées dans ce projet le sont pour servir d’autres projets déjà menés chez la souris avec ces mêmes lignées. Des souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature. De plus, il s’agit des stades de développement communément utilisés dans notre laboratoire pour les projets amenés à utiliser ces méthodes, donc pour développer ces modèles, nous souhaitons utiliser des animaux dans la même tranche d’âge.
Réponse électrophysiologique du tronc cérébral et du striatum ventral à la qualité et la quantité de protéines ingérées chez le rat anesthésié
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Mis à jeun quinze heures, puis anesthésiés pour une exploration chirurgicale de quatre heures, 192 rats reçoivent des perfusions de protéines animales et végétales directement dans l'intestin pendant qu'on enregistre l'activité de leurs neurones. Tous subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Parmi les effets indésirables prévus, le porteur ne retient que le stress du jeûne et la douleur des injections d'anesthésiques, sans mentionner l'ouverture chirurgicale elle-même. Les rats sont tués à la fin de l'enregistrement pour prélever leur cerveau et leur tube digestif, dans un projet présenté comme un appui à la transition alimentaire des êtres humains vers les protéines végétales.
Objectifs
Pour accompagner la transition alimentaire des êtres humains vers des régimes sains et durables, il faut comprendre les mécanismes qui président à la sélection et à la digestion des aliments. Les politiques de santé mondiale recommandent une transition alimentaire vers une consommation moindre de protéines et un rééquilibrage vers les protéines végétales. Au laboratoire, les rongeurs sont capables de distinguer les aliments sur la base de la quantité de protéines qu’ils contiennent, et adaptent leur alimentation en conséquence. Le nerf vague relie anatomiquement le tube digestif au cerveau. Il apporte au cerveau des informations sur la quantité et la qualité des aliments ingérés. Dans le système nerveux central, le tronc cérébral est le premier relai du nerf vague. L’objectif du projet est de mieux comprendre quelles informations relatives aux protéines ingérées le tronc cérébral reçoit par le nerf vague, et comment il les transforme. Pour y parvenir nous réaliserons des enregistrements de l’activité des neurones du tronc cérébral durant la perfusion intestinale de solutions de protéines animales et végétales chez le rat anesthésié. Si le tronc cérébral est capable de coder la quantité des aliments ingérés, en revanche ce sont d’autres structures du cerveau qui permettent de mieux qualifier ce qui a été ingéré : par exemple celles qui jouent un rôle dans l’apprentissage et la mémoire, dans l’évaluation du potentiel énergétique du repas, dans la récompense. Nous réaliserons des enregistrements de l’activité des neurones du striatum ventral pour rechercher et comparer la valeur positive de récompense de protéines animales et végétales. Dans le tronc cérébral et dans le striatum ventral, la transmission des informations nerveuses est modulée par la présence de substances chimiques, les neuromédiateurs. Nous chercherons à mettre en évidence le rôle de neuromédiateurs dans l’activité des neurones du tronc cérébral et dans celle des neurones du striatum ventral à l’aide de produits mimant (agonistes) ou bloquant (antagonistes) leurs effets. Dans l’ensemble le projet vise à fournir des preuves de l’activation du tronc cérébral et du striatum ventral par l’ingestion de protéines. Il proposera des molécules candidates à la modulation de cette activation nerveuse, une étape importante pour envisager des modèles de modification du comportement alimentaire, que ce soit dans le cadre de transition alimentaire ou de troubles du comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui, la réduction de la consommation de protéines animales et un rééquilibrage en faveur des protéines végétales sont des messages largement diffusés pour des raisons environnementales et de santé. Les sociétés occidentales sont ainsi au début d’une réorientation des préférences alimentaires. Toutes les conséquences de ces réorientations ne sont pas élucidées notamment d’un point de vue de la physiologie et du comportement alimentaire. Il est donc nécessaire de les étudier en amont sur un modèle d’étude, le rat, dont la physiologie et le comportement alimentaire en relation avec la consommation des protéines est proche de l’Humain. En étudiant l’impact des apports protéiques chez le rat, ce projet permettra de fournir des données expérimentales solides pour anticiper les conséquences d’une transition alimentaire chez l’Humain et contribuer à l’établissement des recommandations pour la santé humaine notamment en termes de qualité et quantité des protéines ingérées. Le projet fournira des données de neurobiologie fondamentale sur les mécanismes par lesquels le système nerveux central détecte et intègre la nature et la quantité de protéines ingérées. Complété par des études comportementales menées chez le rat (un autre projet du laboratoire), il fournira un corpus de connaissances qui pourront être utilisées, en prenant en compte les différences physiologiques et comportementales, pour anticiper les conséquences d’une transition alimentaire chez l’Humain et contribuer à l’établissement des recommandations pour la santé humaine notamment en termes de qualité et quantité des protéines ingérées
Procédures
Les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale d’exploration fonctionnelle, sous analgésie et anesthésie générales, après une mise à jeun de 15 heures. La procédure dure 4 h, et concerne tous les animaux. A l’issue de la procédure ils sont mis à mort.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont le stress dû au jeun de 15 heures précédant l’anesthésie générale, les douleurs liées à l’administration de produits vétérinaires par injection d'analgésiques et d'anesthésiques.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte de différents tissus : le cerveau et le tube digestif.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier les signaux nerveux qui, partant du tube digestif, modulent la prise alimentaire chez un animal. Ces signaux déclenchent des réponses dans un réseau complexe de neurones répartis dans plusieurs structures. En plusieurs endroits leur action est modulée par les hormones digestives. L’emploi d’un modèle in vivo permet de conserver l’ensemble des structures mises en jeu par la stimulation du tube digestif. Ainsi les modèles in vitro (tranches de bulbe rachidien, de cerveau antérieur) ne gardent pas le lien anatomique et fonctionnel avec le tissu cible, dans notre cas le tube digestif. De plus le système hormonal intervient à plusieurs niveaux (tube digestif, complexe vagal dorsal, striatum ventral) pour moduler leur activité. Or aucun modèle in vitro ou in silico ne peut intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions. Le modèle rat est bien établi et couramment employé par les laboratoires de référence dans ce domaine de recherches.
Réduction
Le nombre minimum d'animaux par groupe a été calculé à 16 rats (8 mâles et 8 femelles) / groupe à partir de tests statistiques afin de garantir qu'avec ce nombre d'animaux les données soient interprétables.
Raffinement
A leur arrivée dans l'animalerie, les rats ont une période d'acclimatation de 7 jours à leur nouvel environnement. Notre projet n'incluant que la mesure de l'activité du cerveau sous anesthésie après chirurgie, les mesures que nous prenons pour prendre en charge ces aspects sont : maintien de la température corporelle en plaçant le rat sur un tapis chauffant, analgésie puis anesthésie générales, anesthésie locale des plans chirurgicaux, monitoring du rat durant toute la durée de l'exploration et réhydratation. La mise à mort est réalisée à la fin de l'exploration fonctionnelle sans réveil de l'animal. Des points limites seront mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Le rat présente un tube digestif et un comportement alimentaire proches de ceux de l'Homme. Il fait plusieurs repas séparés et son goût et son attraction pour les protéines, sont comparables à ceux de l'Homme. Le rat est un modèle reconnu et utilisé par les laboratoires étudiant les mécanismes régulateurs du comportement alimentaire. Chez le rat, un régime riche en protéine provoque rapidement l'arrêt du repas, alors qu'un régime pauvre en protéines provoque un excès de consommation. Chez le rat, les aires du cerveau qui reçoivent des informations en provenance du tube digestif sont connues et dans ces aires, la présence de plusieurs substances chimiques, les neuromédiateurs, intervenant potentiellement dans le contrôle des informations digestives a été démontrée. La petite taille des rats facilite leur manipulation sans être un obstacle à la chirurgie. Les animaux employés sont des rats de 6 à 8 semaines. Cela correspond à un stade de jeune adulte. A ce stade de développement, les besoins en protéines des rats sont les plus élevés pour assurer leur croissance. Cette période cruciale est donc idéale pour étudier l'activité cérébrale en lien avec la consommation de protéines. Ce stade de développement correspond aussi aux populations humaines visées par les recommandations de santé publique, qui sont les adultes jeunes, représentant la cible privilégiée en termes d'apprentissage de l'alimentation, des transitions alimentaires et de troubles du comportement alimentaire.
Isolement de cellules du foie de rat par perfusion
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Cinq minutes séparent l'incision de la paroi abdominale de la mise à mort. 120 rats vont être utilisés dans ce protocole, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil, pour prélever leur foie et en isoler des hépatocytes. Ces cellules alimenteront une biobanque et serviront à cribler des molécules, lipides, médicaments mitotoxiques ou pesticides, au sein des autres projets du laboratoire. Le porteur indique que les échantillons de foie humain disponibles sont rares et de qualité variable, et retient le rat parce qu'une perfusion en fournit environ 500 millions de cellules contre 50 millions chez la souris.
Objectifs
Nous souhaitons isoler de manière routinière des hépatocytes et cellules non parenchymateuses de rat pour servir de modèles d'études au sein des projets du laboratoire. Notamment les cellules isolées pourront servir à des fins de screening in vitro de molécules (lipides, médicaments mitotoxiques, pesticides...) ou de modèles pour la culture 2D et 3D. Les cellules seront isolées puis distribuées fraichement isolées en fonction des besoins des chercheurs et doctorants ; l'excédant produit sera congelé pour réaliser une biobanque de cellules qui seront caractérisées avant chaque mise à disposition.
Bénéfices attendus
Le projet permettra aux chercheurs de l'unité d'avancer sur leurs études en l'absence de cellules humaines en optimisant le nombre d'animaux et en réduisant la variabilité due à l'opérateur ou aux réactifs. Cela permettra aussi de sélectionner des milieux de congélation qui pourront servir pour l'établissement d'une biobanque de cellules congelées de rat, humaines ou éventuellement issues d'autres espèces.
Procédures
Tous les animaux (120) sont soumis à une anesthésie générale de courte durée pour permettre d’inciser la paroi abdominale et accéder au foie. Une injection d'anticoagulant (héparine) par voie intraveineuse en début de chirurgie permettra de limiter le risque d'échec de la perfusion dû aux caillots sanguins formés pendant la mobilisation du foie ; elle sera réalisée sous anesthésie pour ne pas générer de stress à l'animal. La mort est induite pendant l’anesthésie dans les 5 minutes suivant l’incision, juste avant l’isolement des cellules par perfusion.
Impact sur les animaux
Un protocole d'anesthésie générale adapté est mis en place pour supprimer la douleur associée à l'incision de la paroi abdominale pour accéder au foie.
Devenir
L'isolement des cellules implique le prélèvement du foie après mise à mort de l'animal sous anesthésie générale.
Remplacement
Le foie isolé et les cellules du foie de rat et humain sont des modèles alternatifs très utilisés en recherche fondamentale et pour l'évaluation réglementaire des médicaments en phase préclinique. Ces modèles permettent de remplacer le test des molécules sur les animaux vivants tout en permettant d’augmenter grandement le nombre de tests par échantillon. Les échantillons de foie humain disponibles pour la recherche sont rares et de qualité variable ce qui limite leur utilisation à des fins de criblage ; de plus l’ischémie imposée aux tissus humains génère des altérations supplémentaires qui limitent les rendements cellulaires. Le recours à l’utilisation des rats est donc nécessaire et permettra d’identifier les réactifs permettant d’augmenter le rendement et la qualité des cellules isolées chez le rat pour une application future sur des échantillons de foie humain.
Réduction
La technique de perfusion de référence est maîtrisée par l'équipe et permet d'obtenir un grand nombre de cellules par animal pour réaliser des tests in vitro. Les animaux utilisés pour la sélection des réactifs et formation aux gestes techniques (n=20) permettront d'optimiser les isolements de routine. 50 lots de 2 animaux (n=100) seront utilisés pour réaliser environ 1 session d'isolement par mois pendant 5 ans ; ce nombre a été déterminé comme minimal pour permettre l'utilisation des cellules dans les projets, tout en prenant en compte le risque d'échec de la perfusion.
Raffinement
L'environnement des rats est enrichi (cage avec couvercle surélevé permettant aux animaux de se mettre debout ; bâtonnets de bois et carré de coton sont ajoutés dans la cage) et l'étude est organisée de manière à maintenir le contact social des rats au cours de leur hébergement. Si toutefois un animal présente des signes de maladie ou d'anxiété (absence de prise de poids au cours de l'hébergement, troubles du comportement, signes d'agressions), il est retiré de l'étude et mis à mort pour limiter sa souffrance. Le maintien d'une anesthésie générale tout au long de la procédure permet de supprimer la douleur causée par l’incision de la paroi abdominale. En cas de signes de douleur au cours de l'anesthésie (mouvement de la peau), la procédure est suspendue et l'anesthésie est réadaptée. Si le rat présente toujours des signes de douleur 5 min après l'adaptation de l'anesthésie, la procédure s'arrête et le rat est mis à mort pour limiter sa souffrance. Une injection intraveineuse d'anticoagulant (héparine) permettra d'améliorer le taux de réussite des perfusions en évitant la formation de caillots sanguins au cours de la chirurgie. Le choix de cette voie d'injection permettra une action immédiate de l'anticoagulant, ce qui permettra de réaliser l'administration sous anesthésie sans générer de stress à l'animal. Tous les prélèvements et la perfusion du foie sont réalisés post-mortem pour n’occasionner aucune douleur.
Choix des espèces
L'optimisation des conditions d'isolement des hépatocytes est historiquement faite chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats avec la littérature. Les hépatocytes primaires de rat sont un modèle d’étude répandu en pharmacologie préclinique, les perfusions de foie de rat permettent d’obtenir une quantité suffisante de cellules afin de réaliser des tests (environ 500 millions/rat) contrairement à la souris (environ 50 millions/souris). Les rats Sprague Dawley sont commandés à 5 semaine (110-200g) et utilisés à 6 semaines (180-230g), poids standard d'utilisation pour l'isolement des hépatocytes.
Etude sur l’impact des microplastiques dans un modèle de rectocolite hémorragique
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Une perte de poids supérieure à 15 %, un dos voûté, des poils hérissés ou une déshydratation déclenchent la mise à mort. 123 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour mesurer l'inflammation de leur colon et de leur intestin. Gavées une fois avec un microbiote humain, sain ou prélevé chez des personnes atteintes de rectocolite hémorragique, elles reçoivent ensuite pendant quatre semaines une alimentation additionnée de microplastiques, une partie recevant en fin d'étude une molécule pro-inflammatoire dans l'eau de boisson pendant cinq jours. Le porteur attend des signes d'inflammation digestive, une perte de poids et des saignements, et compte extrapoler des données fécales de souris une estimation de l'exposition alimentaire humaine aux microplastiques.
Objectifs
Les humains sont exposés aux Microplastiques (MP) tous les jours. Ces particules (1-5000 μm) sont omniprésentes dans nos aliments, y compris l'eau et les boissons, et l'air. Les MP sont détectés dans les selles humaines de la naissance à l'âge adulte : des études pilotes ont en effet détecté des MP dans le méconium et dans les matières fécales d'adultes sains. Des résultats préliminaires et plusieurs études ont montré que l'ingestion de MP favorise l'inflammation intestinale et le déséquilibre de la flore intestinale chez la souris. La rectocolite hémorragique (RCH) est une maladie intestinale inflammatoire persistante causée par des facteurs génétiques et environnementaux. Notre hypothèse est que les microplastiques (MP) sont des éléments responsables de la RCH. Les principaux objectifs du projet lié à cette saisine sont : - Évaluer les effets des MP sur l'apparition de l'inflammation (effets sur la réponse immunitaire, la perméabilité intestinale, le microbiote fécal) en tant que déclencheur favorisant la colite sur un modèle de souris colonisées par un microbiote humain sain ou un microbiote issu de patient avec RCH, et qui seront exposées à un régime contenant des MP via l’alimentation. - Etant donné que la fragmentation des MP entraîne la génération de nanoplastiques (NP, d'une taille inférieure à 1 μm), caractériser les MP et des NP dans les matières fécales de souris grâce à des méthodes analytiques. Le modèle de souris à microbiote humanisé à l’avantage d’être plus proche du microbiote humain que les rongeurs conventionnels et donc faciliter l’extrapolation future des résultats de cette étude à l’Homme.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet serviront au profit de la santé humaine, afin de mieux comprendre le rôle et l’impact de contaminants environnementaux comme les MP sur l’intestin et le microbiote intestinal. Plus précisément, ce projet apportera des connaissances essentielles à propos de leur impact sur l'équilibre intestinal notamment dans la rectocolite hémorragique. La caractérisation des MP dans les fèces de souris à microbiote humanisé permettra de comparer les caractéristiques des MP ingérées avec les caractéristiques des MP fécales, et de calculer la proportion de MP ingérées par rapport à celle des MP fécales. En appliquant ce facteur aux données quantifiées dans des échantillons de selles humaines, nous serons en mesure d'estimer les quantités d'exposition alimentaire aux MP dans la population adulte. Ceci est essentiel pour une évaluation précise des risques pour la santé. De plus, les différences que nous identifierons entre les patients atteints de colite ulcéreuse et les sujets sains permettront de mettre en évidence les MP les plus problématiques et donc ceux à bannir en priorité de notre alimentation.
Procédures
Les animaux ne subiront qu’un seul gavage qui ne durera qu’1 min maximum. Des échantillons de matières fécales (1 à 2 crottes) seront prélevés chez les souris environ 1 fois par semaine depuis leur arrivée jusqu'à la fin de l’étude. En fin d'étude, une anesthésie générale (10 minutes) sera réalisée pour prélever du sang (1 prise de sang). Une partie des animaux sera traités en fin d'étude (5 jours) avec une molécule pro-inflammatoire mélangée à l'eau de boisson (pas de gavage) pour s'assurer de l'apparition d'une colite.
Impact sur les animaux
Le gavage qui pourrait constituer une source de stress pour les animaux, sera réalisé par un opérateur expérimenté, afin de s’assurer de la sécurité des animaux et de réduire l’inconfort lors de la contention. En outre une phase d’entrainement sur 3 souris conventionnelles est prévue en amont afin de s’assurer du geste dans les conditions d’un isolateur. Le gavage sera réalisé sur animaux vigiles (durée quelques secondes) et ne sera réalisé qu’une seule fois pour l’inoculation du microbiote d’origine humaine. L’administration des microparticules de plastique sera faite via l’alimentation pendant toute la durée du protocole (soit 4 semaines) après inoculation du microbiote (sauf pour les animaux contrôles). Elle ne devrait pas induire de nuisances pour les animaux et ne pas provoquer de perturbation au niveau de la faim et de la soif des animaux. Les animaux avec un microbiote issus de patients atteints de recto-colite et les animaux traités avec la molécule pro-inflammatoire pourront présenter des signes d’inflammation du système digestif, avec potentiellement une perte de poids pendant la durée du traitement et également avoir des saignements. Cependant, la dose administrée et la durée de cette administration sont tout à fait conforme avec ce qui est fait dans la littérature scientifique. C’est un modèle maîtrisé depuis longtemps. Il est à noter que la sévérité de la réponse au traitement est aussi très dépendante de l’environnement de l’animal mais que les opérateurs sauront rapidement repérer les symptômes afin de limiter la souffrance des animaux.
Devenir
En fin de procédure, les animaux sont mis à mort afin de mesurer de nombreux paramètres d'intensité de l'inflammation colique ou intestinale, afin de démontrer l'intensité de la capacité des micro et nanoplastiques à aggraver l'inflammation. Les organes des animaux conventionnels renforceront l'étude comparative.
Remplacement
A ce jour, les maladies intestinales ne peuvent pas être entièrement reproduites par des modèles cellulaires. En effet, la physiologie intestinale est complexe car elle implique plusieurs systèmes distincts notamment le système digestif, le système immunitaire et la flore intestinale. Concernant les polluants environnementaux, malgré le développement de méthodes in vitro de plus en plus intégratives, il reste nécessaire d'évaluer leurs effets in vivo, afin d'intégrer l'ensemble des processus intervenant dans l'effet d'un polluant ingéré et dans la physiopathologie des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, à savoir la digestion, le microbiote, le système immunitaire muqueux et systémique.
Réduction
Nous avons réduit au minimum le nombre de souris par groupe, à savoir 20 souris (10 mâles et 10 femelles) réparties dans 2 groupes, eux-mêmes subdivisés en 3 sous-groupes soit un total de 20 x 2 x 3 = 120 souris nécessaires à cette étude pour obtenir la puissance statistique suffisante en tenant compte de la variabilité des données liés à l’analyse du microbiote, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux. L’impact du sexe souvent négligé dans les études sera là bien pris en compte avec une répartition égale entre mâles et femelles. Pour le nombre de souris conventionnelles, il a été réduit au minimum afin de permettre un entrainement sur le geste technique pour l'ensemble des applicateurs impliqués au projet en condition d’isolateur.
Raffinement
Le transport des animaux axéniques se fera grâce à un transporteur agréé assurant la bonne condition des animaux. A l’arrivée dans nos locaux, les animaux seront hébergés par groupe de 5 animaux (mâles/femelles séparés) et trois pour les souris conventionnelles, dans des cages à l’intérieur d’un isolateur avec une ventilation adéquate. Les animaux auront à disposition litière de bois, de hamac pour se cacher et grimper, des tunnels suspendus et autres matériaux d’enrichissement tout au long du protocole. Une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée. Le point limite est fixé selon un score défini au préalable et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids de plus de 15%, déshydratation, yeux et abdomen creux) suffisamment prédictifs et spécifiques à ce projet. Les symptômes sévères sont repérés rapidement afin de limiter la souffrance des animaux et intervenir sans délai. En fin de protocole, les animaux recevrons une anesthésie générale gazeuse afin de prélever le sang et suite à la mise à mort, les organes seront prélevés pour permettre des analyses biologiques. Cette mise à mort se fera en dehors de l’isolateur, dans une pièce isolée loin des autres souris.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix dans l’étude des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. Le modèle choisi est très largement publié, en raison de sa simplicité d’administration (dans l’alimentation) de la facilité de contrôle du dosage (pour déterminer la gravité) et de la durée (pour étudier le processus inflammatoire et de « récupération »). Concernant l’axénie, il s’agit d’un modèle reconnu pour l’étude du microbiote humain. Enfin la 1ere partie de ce projet (qui ne fait pas l’objet de cette saisine) a porté sur des souris conventionnelles (même race), il s’agit donc d’une continuité dans le modèle animal utilisé. Les souris utilisées auront 5 semaines à l’arrivée puis 8 à 9 semaines lors du début du protocole. Ce stade correspondant au passage à la maturité sexuelle chez la souris soit au passage au stade « Jeune Adulte », ce qui correspond aux besoins du projet, les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin touchant majoritairement de jeunes adultes.
La thérapie matricielle pour le traitement de la tauopathie tel que la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Issues d'un élevage interne, réparties en sous-groupes de quinze maintenus vivants deux, quatre, six puis huit mois avant d'être tués, 2 164 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue sept jours après la naissance, puis des injections ou des administrations orales deux fois par semaine pendant huit semaines, suivies d'analyses comportementales. L'objectif déclaré est de tester deux classes de molécules sur un modèle de tauopathie exprimant une protéine tau humaine mutée, en vue de premiers dossiers cliniques. Les souris nées du croisement sans le génotype menant à la tauopathie sont réaffectées à l'étude du devenir des molécules dans l'organisme, ce que le porteur présente comme une réduction du nombre d'animaux mis à mort.
Objectifs
Les tauopathies, auxquelles appartiennent la maladie d’Alzheimer et les démences fronto-temporales, se caractérisent par une perte neuronale due à l’accumulation de la protéine tau sous une forme anormale (= tauopathie) dans le cerveau des patients. À ce jour, aucun traitement curatif de ces pathologies n’existe sur le marché. Dans le but de développer un traitement pour ces pathologies, l’efficacité de la thérapie matricielle dans un modèle de tauopathie sera évaluée dans ce projet. De précédents travaux ont déjà montré qu’il était possible de diminuer le développement de la tauopathie en utilisant des mimétiques de certains sucre complexes dans des modèles de tauopathie qui miment certains aspects de la pathologie (modèles cellulaires et de poisson zèbre). Des résultats préliminaires chez la souris, obtenus dans des modèles de tauopathie et dans d’autres modèles de maladie neurodégénératives, ont également permis de montrer la capacité de ces molécules à protéger et régénérer les neurones atteint dans ces pathologies. Ainsi en poursuivant l’étude de ces molécules dans notre modèle souris de tauopathie qui reproduit plusieurs aspects de la maladie (modification de la tau, mort des neurones et troubles cognitifs aux âges avancés…), nous espérons avoir des preuves solides de l’efficacité de cette stratégie thérapeutique pour débuter de premières études chez l’homme. En effet, il est nécessaire d'un point de vue réglementaire de démontrer que notre concept est efficace dans un modèle se rapprochant de l'homme pour débuter des essais cliniques.
Bénéfices attendus
Aucun traitement curatif n'existe actuellement pour le traitement des tauopathies auxquelles appartiennent la maladie d'Alzheimer et les démences fronto-temporale. Le développement de nouvelles thérapies pour ces pathologies nécessite d'explorer de nouvelles approches, les anciennes cibles n'ayant montré que peu d'effet lors des essais cliniques. Ce projet permettra de mieux caractériser l'effet de deux nouvelles classes de composés thérapeutiques sur les tauopathies et de définir la localisation cérébrale des meilleurs composés sélectionnés dans les procédures suites à leur administration chez la souris, afin de pouvoir initier les premiers dossiers cliniques.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie de la queue 7 jours après leur naissance pour connaitre leur génotype. Les animaux seront pesés et recevrons des traitements deux fois par semaine pendant 8 semaines (injection de solution de molécule ou administration orale de solution de molécule). Ils seront ensuite soumis à la fin des traitements à des analyses comportementales.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont liés à la biopsie de la queue 7 jours après leur naissance, à l’élevage en captivité des animaux, la manipulation répétée des animaux et les injections de composés pendant plusieurs mois : contention pour les changes et les expériences de comportement, injections répétées dans le temps des composés (2 fois / semaines pendant 2 mois). Pour information, aucune toxicité n’a été identifiée avec les molécules aux doses utilisés.
Devenir
Les animaux de l’ensemble des procédures seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les analyses nécessaires à la quantification de nos paramètres biologiques dans le cerveau.
Remplacement
Réglementairement parlant il n’est pas possible d’aller en clinique (ni même chez le primate non humain) avec uniquement des résultats cellulaires ou in silico. Les modèles de référence pré-clinique pour la tauopathie sont développés dans des espèces rongeur (souris, rat).
Réduction
Pour les études chez l'animal, nous avons optimisé le nombre d’animaux par sous-groupe (n=15) afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et réaliser des analyses avec un nombre d’animaux réduit au strict nécessaire. L’évolution de la pathologie sera étudiée dans les régions du cerveau touchées dans la maladie d'Alzheimer. Ainsi, chaque groupe sera subdivisé en sous-groupe de 15 animaux, selon leur âge, qui seront maintenus vivants dans les conditions standard d’animalerie pendant 2, 4, 6 et 8 mois. Aux temps correspondants, les différents groupes d’animaux seront mis à mort afin d’étudier l’évolution de la maladie dans le cerveau ainsi que sa corrélation avec notre cible. Pour répondre à ces objectifs au maximum, 2 164 souris seront nécessaires (sur 5 ans). Les différentes lignées de souris utilisées dans le projet seront disponibles par un élevage en interne. De plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux mis à mort, les animaux générés lors du croisement des lignées parentales ne possédant pas le génotype menant au développement de la tauopathie seront utilisés pour étudier le devenir des molécules chez la souris (concentration des molécules dans les régions touchées dans la maladie après administration de la molécule).
Raffinement
Afin de détecter et de limiter la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux, nous surveillerons leur état général et leur comportement. Une liste de vérifications contenant l’ensemble de points définis pour identifier la douleur ou la détresse de l’animal est établie : -L’évolution du poids de la souris -L’état de ses poils : est-ce que son poil est hérissé ? -Sa posture, sa démarche et comportement : est-ce que la souris a le dos voûté ? Léthargie ou réticence à se déplacer ? état défensif ? grattage ou morsure ? -On explore son environnement : absence de toilettage ? redressement sur ses pattes arrière ? diminution de la quantité de nourriture et d’eau ingérée ? L’ensemble permet d’identifier si les animaux souffrent. Les animaux sont observés 2 fois/jour jusqu’à leur mise à mort. En cas de douleur : Les souris souffrantes seront transportées dans des cages isolées. Une injection d'un anti-douleur sera réalisée et l’état de l’animal sera suivi. Durant la période d’hébergement, l’eau de boisson sera changée chaque jour et un régime alimentaire normal sera fourni. En cas de non-récupération observée nous allons consulter le personnel vétérinaire du laboratoire afin d’obtenir leur expertise en matière de signes cliniques de la douleur ou de la détresse. Pour information, les animaux sont utilisés avant l’apparition des phénotypes dommageables (c’est à dire avant l’âge de 8 mois). Pour information, aucune toxicité n’a été identifié avec les molécules aux doses maximales utilisées dans le projet.
Choix des espèces
Notre objectif est de valider l’intérêt de la thérapie matricielle dans un modèle mammifère de tauopathie afin de poursuivre le développement de ces molécules jusqu’en clinique. L’expérimentation sur le rongeur reste une étape indispensable avant toute expérimentation sur des modèles plus proche de l’homme (primate). Les rongeurs sont adaptés aux études scientifiques : 98% des gènes partagés avec l’homme, faibles tailles, grandes fécondités, courtes durées de vie, accessibilité et disponibilité d’outils biologiques. De plus, la souris est la seule espèce mammifère actuellement modifiée pour exprimer la protéine tau humaine avec la mutation qui induit la tauopathie (modèle reconnu par la communauté scientifique). Les souris qui développent la tauopathie sont utilisées à l'âge adulte à partir de 2 mois et jusqu'à 8 mois (mise à mort à 2, 4, 6, 8 mois), c'est à dire jusqu'à l'âge ou la tauopathie commence à se développer (2 mois) jusqu'au début de l'apparition des signes cliniques moteurs (8 mois). Les souris "contrôle" de même fond génétique ne possédant pas la mutation, servant de référence à ces études sont utilisées aux mêmes âges. Pour les études de pharmacocinétique, nous utiliserons des souris portant un fond génétique proche des souris mutées. Des souris de génotype sauvage générées par le croisement des lignées parentales, seront également utilisées afin de limiter le nombre de souris générées et mises à mort pour l'étude tout en conservant un modèle pertinent. Les organes périphériques des souris traitées avec les molécules seront également utilisés pour étudier les effets secondaires périphériques possibles des molécules. Ces souris seront utilisées à l'âge adulte (2-4 mois).
Etude de la biodistribution de nanoparticules chez des souris saines
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pour savoir dans quels organes se logent des nanoparticules d'imagerie et par quelle voie elles sont éliminées, 1 200 souris saines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés et imagés. Chacune reçoit une injection sous la peau, dans l'abdomen ou dans la veine, puis dix séances d'imagerie de cinq minutes sous anesthésie. Le porteur signale une douleur légère au site d'injection et la possibilité d'une réaction de type allergique aux sondes. L'effectif de 1 200 souris est rapporté à une "application dédiée", sans autre justification, pour un projet qui porte sur des souris saines et sur une question de circulation et d'élimination.
Objectifs
Le développement et l’utilisation de nanoparticules pour l’imagerie rencontrent un fort engouement. La question principale est de savoir où vont les nanoparticules une fois injectées dans l'organisme, dans quels organes vont-elles ? En combien de temps et par quelle voie sont-elles éliminées ? Ces informations sont importantes afin d'envisager l'utilisation de ces nanoparticules chez l'homme pour le diagnostic et/ou le traitement d'une maladie.
Bénéfices attendus
Evaluer le devenir et le temps de circulation dans l’organisme d’une sonde d’imagerie. Serait-il envisageable d’utiliser cette sonde comme un agent de diagnostic et/ou de thérapie si la sonde circule suffisamment longtemps dans l’organisme ?
Procédures
Injection sous la peau sur animal anesthésié : durée inférieure à 1 minute, geste réalisé 1 fois. Injection dans le ventre sur souris vigile : durée 10 secondes, geste réalisé 1 fois. Injection dans la veine sur animal anesthésié : durée inférieur à 1 minute, geste réalisé 1 fois. Imagerie : sur animal anesthésié, 10 séances de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances peuvent provenir de l’injection de la sonde d’imagerie où une légère douleur peut être ressentie au site d’injection. Une mauvaise réaction, type allergie, peut survenir suite à l’injection des sondes d’imagerie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés car leurs organes seront prélevés et imagés.
Remplacement
Nous souhaitons développer de nouvelles nanoparticules qui pourraient être utiliser in fine en clinique afin d’améliorer le diagnostic et/ou la thérapie chez l’homme. Une fois injectée dans l'organisme, le devenir des nanoparticules ainsi que leur comportement est diffèrent en fonction de leur structure. Même si le potentiel thérapeutique, la validité de la nanoparticule et son absence de toxicité seront testés en amont sur des modèles in vitro (comme des cultures cellulaires ou des organoides quand cela est possible) la finalité est le test sur des animaux avant d’envisager un passage en clinique. En effet il est à ce jour impossible de reproduire un organisme entier, sa physiologie, in vitro qui permettrait de répondre aux questions suivantes : quel est le temps de circulation de la sonde ? Comment et en combien de temps est-elle éliminée ?
Réduction
Les nanoparticules seront préalablement testées et validées in vitro avant d’être injectées à l’animal. Seules les nanoparticules validées seront utilisées. Le suivi se fait par une technique d'imagerie non invasive permettant de faire un suivi du début à la fin sur un même animal. Chaque animal est son propre contrôle. Des études statistiques seront ensuite réalisées. Le nombre d’animaux a été déterminé en utilisant l’application dédiée.
Raffinement
Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie pour leur permettre de s'habituer à leur nouvel environnement. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant. Les actes expérimentaux sont réalisées sur animal anesthésié quand cela est nécessaire et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix avec la technique d'imagerie utilisée de par sa petite taille. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation et l’imagerie.