Rongeurs
Rôle d’une protéine de stress dans l’inflammation du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Comprendre le rôle d'une protéine de stress dans l'inflammation du foie conduit à utiliser 1 260 souris génétiquement modifiées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sur ce total, 756 reçoivent une injection unique de cinq secondes, et les 504 autres une injection par jour pendant quatre jours. Le porteur annonce une gêne abdominale transitoire et une réaction de type état grippal, avec baisse d'activité et diminution de l'appétit, et prévoit la mise à mort des souris chez lesquelles ces signes persistent. Leur foie et leurs macrophages péritonéaux sont prélevés après la mise à mort, et l'effectif de 1 260 est présenté comme issu d'une "méthode mathématique reconnue" que le porteur ne nomme pas.
Objectifs
La maladie du foie gras touche de plus en plus de personnes et peut évoluer vers une inflammation chronique du foie, une fibrose et un cancer du foie. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine présente en grande quantité dans le foie des personnes atteintes par cette maladie métabolique, et impliquée dans la manière dont les cellules du foie réagissent lorsqu’elles sont soumises à des situations de stress, comme l’accumulation excessive de graisses. Pour mieux comprendre son rôle, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées afin d’étudier comment cette protéine influence l’accumulation de graisses et l’inflammation dans le foie, en particulier dans les cellules immunitaires. Ces travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et de déterminer si cette protéine peut être un candidat important comme future cible thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à l’accumulation de graisses et à l’inflammation dans le foie. Les résultats pourront contribuer au développement de nouvelles stratégies pour prévenir, ralentir ou inverser la progression de la maladie du foie gras et de ses complications.
Procédures
Une injection unique (environ 5 secondes) sera réalisée sur 756 animaux. Quatre injections consécutives (une injection par jour pendant 4 jours, environ 5 secondes par injection) seront réalisées sur 504 animaux.
Impact sur les animaux
Les modèles utilisés chez la souris peuvent entraîner un léger inconfort lié aux injections (réalisées en quelques secondes), une gêne abdominale transitoire ainsi qu’une réaction temporaire de type état grippal pouvant se traduire par une baisse d’activité, une diminution de l’appétit et un comportement plus calme. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter ces signes le plus tôt possible. Des seuils d’alerte ont été définis pour permettre une prise en charge rapide et éviter toute souffrance prolongée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs tissus : le foie pour étudier l’inflammation, le métabolisme et certains mécanismes de mort cellulaire, et les macrophages péritonéaux pour analyser leur fonctionnement.
Remplacement
Avant de recourir aux animaux, des expériences sont réalisées sur des cellules cultivées en laboratoire afin d’étudier certains mécanismes impliqués dans l’inflammation et le fonctionnement du foie. Ces méthodes sont utilisées chaque fois qu’elles permettent de répondre aux objectifs scientifiques et de sélectionner les conditions expérimentales les plus pertinentes. Cependant, les interactions entre le foie, le système immunitaire et le reste de l’organisme sont très complexes et ne peuvent pas être reproduites avec des cellules cultivées seules. Pour les étudier correctement, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal. La souris est l’espèce la plus adaptée, car son fonctionnement biologique est proche de celui de l’être humain.»
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé a été déterminé à l'aide d'une méthode mathématique reconnue permettant de calculer le plus petit effectif nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques fiables. Chaque animal permettra de recueillir plusieurs types d'informations à partir des mêmes prélèvements, ce qui limite le recours à des animaux supplémentaires. Les expériences seront réalisées par étapes : certaines ne seront engagées que si les résultats des précédentes le justifient. Cette stratégie permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés tout en répondant aux objectifs du projet.
Raffinement
Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de malaise. Une grille d’évaluation permettra au personnel formé de suivre leur état de santé et d’agir si nécessaire. Toute modification visible de leur apparence ou de leur comportement sera notée. Les animaux concernés seront alors suivis et peuvent éventuellement recevoir un traitement contre la douleur. Si certains signes de mal-être persistent, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté pour cette étude car son fonctionnement biologique est proche de celui de l’être humain. De nombreux outils génétiques et moléculaires ont été développés chez la souris, permettant de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses maladies. Les expériences seront réalisées sur des souris dont les principaux systèmes étudiés, notamment le foie et le système immunitaire, ont atteint une maturité fonctionnelle et un fonctionnement stable, afin d’obtenir des résultats fiables et représentatifs des mécanismes biologiques étudiés.
Développement d’un modèle Murin pour l’étude de l’hypertension pulmonaire dans le syndrome d’overlap 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Privées d'oxygène huit heures par jour ou jusqu'à vingt-quatre heures par jour pendant seize semaines, et pour certaines nourries d'un régime riche en graisses pendant la même durée, 270 souris vont toutes être tuées à l'issue. Les procédures vont d'un niveau de souffrance léger à modéré, la mesure de pression intracardiaque étant faite sous anesthésie sans reprise de conscience, et comprennent six prélèvements de sang en deux heures par incision de la queue, une hypoglycémie provoquée, une échographie cardiaque et un électrocardiogramme. L'objectif est de mettre au point une méthode d'induction du syndrome d'overlap chez la souris, association d'une bronchopneumopathie obstructive et d'apnées du sommeil, pour explorer des pistes thérapeutiques dans de futurs projets. Le porteur écrit que le cumul de l'obésité et des deux formes de privation d'oxygène "peut augmenter les effets mais c'est le but de l'étude".
Objectifs
Développer un modèle original et innovant reproduisant certains mécanismes du syndrome d’overlap. Ce syndrome est défini par une bronchopneumopathie chronique obstructive liée à un manque d’oxygène dans le sang couplé à un syndrome d’apnées obstructives du sommeil. Ce syndrome d’overlap sera mis au point avec ou sans obésité, afin d’identifier les déterminants biologiques de l’hypertension pulmonaire et d’explorer des pistes thérapeutiques ciblées dans de futurs projets.
Bénéfices attendus
Perspective d'application ou de développement éventuel de ce travail et incidences éventuelles sur la santé respiratoire : La mise au point de ce modèle murin inédit, combinant spécifiquement un manque d’oxygène chronique et intermittent, ainsi que l'obésité induite par régime, ouvrira des perspectives significatives tant sur le plan scientifique que clinique. Ce modèle permettra une caractérisation fine et détaillée des voies biologiques clés impliquées dans le développement de l'hypertension pulmonaire et des complications cardiaques du syndrome d’overlap. Grâce au développement de ce modèle préclinique robuste (en cas de succès du projet), il sera par exemple possible de tester de manière pertinente des stratégies thérapeutiques ciblées, actuellement utilisées dans l’hypertension artérielle pulmonaire, et qui pourraient être transposées dans le syndrome d’overlap pour lequel aucun traitement spécifique n’a démontré son efficacité actuellement, comme en témoigne notamment l’échec récent de l’essai clinique utilisant le tréprostinil inhalé. Ainsi, le modèle murin que nous développons permettra non seulement d’explorer et comparer l’efficacité des différentes voies thérapeutiques potentielles dans le contexte spécifique du syndrome d’overlap, mais aussi de mieux identifier les approches thérapeutiques les plus prometteuses pour de futurs essais cliniques chez l’homme. Bien que l’évaluation directe de traitements dépasse les objectifs immédiats du présent projet, elle constitue une perspective importante de notre recherche à venir.
Procédures
Les animaux seront soumis à un manque d’oxygène intermittent (8h/jour) et/ou chronique (16 à 24h/j) pendant 16 semaines. Certains animaux pourront également recevoir un régime riche en graisses durant 16 semaines pour induire une obésité. Afin de suivre leur glycémie et voir comment le glucose ou l’insuline sont régulés dans le sang, les animaux seront injectés avec du glucose ou de l'insuline (temps d’injection = 20 secondes) puis une goutte de sang sera prélevée de façon répétée 6 fois durant 2h. Une échographie du coeur associée à un électrocardiogramme seront réalisés sous anesthésie générale (15-20min). Juste avant la mise à mort de l’animal, sous anesthésie et analgésie, la pression à l’intérieur du cœur sera mesurée durant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus au manque d'oxygène. Une augmentation de la fréquence respiratoire avec essoufflement et perte de poids s'observent les premiers jours d'exposition. Par la suite les animaux s'adaptent à ce changement d'ambiance. Les tests pour mesurer la régulation du taux de sucre dans le sang (= tests métaboliques) étant induits par une injection, une douleur minime peut se produire au site d'injection. Les animaux étant mis à jeun avant les tests métaboliques, cela peut induire un stress léger et de l'inconfort. Aussi, le suivi de la glycémie pendant ces tests se faisant à l'extrémité de la queue après une légère incision, une légère douleur et du stress peuvent être observés à ce moment-là. Un des tests métaboliques provoque une hypoglycémie transitoire contrôlée. Enfin l'obésité induite par le régime peut provoquer des mouvements plus compliqués pour l'animal mais aucune gêne majeure n'a été observée dans les précédentes études. Un stress légé peut-être associé à l'anesthésie nécessaire à l'échographie du coeur, l'électrocardiogramme et le transfert des animaux entre les deux animaleries. Le cumul de l'obésité et de l'exposition à l'hypoxie intermittente et stationnaire peut augmenter les effets mais c'est le but de l'étude.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire, cellulaire et histologique) du coeur et des poumons (nécessité de prélever les organes). Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.
Remplacement
L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement du syndrome d'overlap. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque, la réactivité des vaisseaux, l'étude des tissus des poumons dans un contexte physiologique et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une hypertension pulmonaire puis d'une altération du cœur à droite chez l'humain qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
Lorsque les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation après le cathétérisme pour évaluer la fonction du coeur et des vaisseaux, les tissus prélevés (coeur et poumons) seront stockés pour une utilisation directe mais aussi ultérieure, pour des études mécanistiques plus poussées (surplus de tissu) Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Les calculs de puissance ont été faits en utilisant le logiciel GPower en amont de la manipulation pour réduire au maximum le nombre d'animaux inclus dans l'étude et les tests statistiques ad hoc seront utilisés pour analyser les résultats et identifier les différences attendues le cas échéant.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Toutes les procédures seront pratiquées sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptées aux actes pratiqués. Des points limites spécifiques ont également été mis en place. Les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations posteuthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Pour les tests de cathétérisme, des animaux de réutilisation pourront être utilisés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est oriente vers la souris car c’est le modèle actuellement le plus utilisé pour modéliser le syndrome d'apnées obtructives du sommeil dans notre laboratoire. Nous avons donc des données robustes associées à celui-ci. Aussi, notre dispositif d'exposition à l'hypoxie ne permet que l'utilisation des rongeurs. Nous utliserons pour ce projet des souris qui répondent également bien au régime induisant une obésité utilisé dans ce projet. Les données de la litérature montrent également que ce modèle est pertinent pour le projet.
Etude de la circulation pulmonaire et du remodelage dans un modèle d’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) induite par de l’hypoxie chronique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont maintenues quatre semaines en caissons hypoxiques pour développer une hypertension pulmonaire, reçoivent une injection sous-cutanée par jour pendant ces quatre semaines et subissent des mesures de pression cardiaque sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur écrit que les souris deviennent un peu amorphes pendant les premières vingt-quatre heures puis "s'acclimatent ensuite très bien", et qu'aucune méthode ne permet d'étudier autrement les mécanismes de cette maladie, dont la survie humaine à cinq ans atteint 36 % dans les formes sévères. Une nécrose cutanée au point d'injection quotidien entraîne la mise à mort de la souris concernée.
Objectifs
L’hypertension pulmonaire est une maladie vasculaire qui mène régulièrement à la mort du patient. La greffe cœur/poumons est l’ultime recours pour les patients car pas ou peu de traitements pharmacologiques permettent d’améliorer les conditions de vie des malades atteints d’hypertension pulmonaire. Il est ainsi nécessaire d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de cette maladie pour établir de nouvelles molécules thérapeutiques. Ainsi, notre objectif est d’évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules sur l’hypertension pulmonaire
Bénéfices attendus
Actuellement, aucun traitement efficace ne permet de soigner l’hypertension pulmonaire. Pour cette maladie, 36% de survie des patients à 5 ans pour les formes sévères. Identifier des molécules permettant de soigner l’hypertension pulmonaire est donc une priorité
Procédures
- Hypoxie en continue pendant 4 semaines, - 1 injection quotidienne de 30 sec en sous-cutané, - Mesures de pression cardiaque sous anesthésie (1 minute/mesure)
Impact sur les animaux
- L’induction de l’HTAP nécessite d’héberger les animaux dans des caissons hypoxiques. Le changement d’environnement peut induire un stress sur les animaux. L’induction de l’HTAP rend les souris un peu « amorphe » sur les premières 24h, le temps qu’elles s’adaptent. Elles s’acclimatent ensuite très bien. - Toutes les molécules sont préalablement testées pour éviter des effets indésirables majeurs chez la souris. Seules les molécules montrant pas ou peu d’effets indésirables (toxicité, solubilité, bonne biodisponibilité de la molécule…) seront testées in vivo. - Stress induit par contention quotidienne pour injecter les molécules en sous-cutané pendant 4 semaines. Si une nécrose cutanée apparait, l’animal sera alors mis à mort.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements d’organes et pour analyses fonctionnelles et histologiques
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative permettant d’étudier les mécanismes de développement de l’HTAP. Le modèle murin d’hypoxie chronique est décrit pour se rapprocher de la pathologie humaine. Cette approche expérimentale permet ainsi d’étudier, dans un système intégré, les mécanismes impliqués dans le développement de la pathologie et également d’évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules.
Réduction
Nous avons fait une sélection in vitro des molécules à tester pour réduire l’expérimentation animale. Comme toutes les molécules sélectionnées sont solubles, le solvant sera identique pour tous les tests. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les groupes contrôles. Nous utiliserons un test statistique ANOVA (Prism, GraphPad) pour interpréter nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours par des personnes expérimentées afin d’assurer le bien-être des animaux et détecter toute souffrance. Les cages des animaux sont enrichies avec des frisottis et des bâtonnets en bois. Les traitements dureront 4 semaines avec des injections quotidiennes en sous-cutanée par contention douce. Nous injecterons à différents endroits pour éviter l’apparition de lésions cutanées.
Choix des espèces
Le modèle murin soumis à une hypoxie chronique est décrit pour se rapprocher le plus de la pathologie humaine. Les souris seront utilisées à l’âge adulte. Pour étudier le potentiel thérapeutique des molécules, nous devons travailler avec un système pulmonaire et hémodynamique mature.
Évaluation de l’immunogénicité et de l’efficacité d’un vaccin nasal contre l’infection au virus influenza dans un modèle préclinique murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
4 712 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant recevoir deux vaccinations sous anesthésie, une infection grippale intranasale et quatre ponctions du sinus submandibulaire à l'état vigile. Les procédures vont d'un niveau de souffrance léger à sévère, cette dernière classification portant sur l'infection grippale, que le porteur décrit avec une perte de poids, une prostration, une anorexie et un pelage hirsute entre le deuxième et le neuvième jour, et une mortalité possible chez les souris non vaccinées, le suivi comportemental annoncé après l'infection restant sans détail. Aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne leur est administré, le porteur indiquant que ces traitements modifieraient les résultats de l'étude. Les retombées annoncées, des formulations "transposables à l'Homme" et un renforcement des stratégies prophylactiques, sont renvoyées à l'issue du projet, quand la mortalité et les pertes de poids, elles, sont attendues dès les premières semaines.
Objectifs
Malgré la disponibilité de vaccins prophylactiques, les infections virales respiratoires restent insuffisamment contrôlées à l’échelle mondiale. L’efficacité limitée des stratégies actuelles s’explique notamment par la grande diversité antigénique des virus, leur capacité à franchir la barrière d’espèce, la durabilité restreinte de l’immunité induite par l’infection ou la vaccination, ainsi que par une réponse vaccinale souvent suboptimale chez les populations vulnérables. À cela s’ajoutent des facteurs sociétaux tels que l’hésitation vaccinale. Ces limites soulignent la nécessité de développer des approches antivirales alternatives et/ou complémentaires. Dans ce contexte, notre projet vise à développer une plateforme innovante dédiée à la prévention des infections virales respiratoires, avec un focus particulier sur le virus de l’influenza A (grippe). S’appuyant sur des données préliminaires solides et sur l’expertise conjointe de spécialistes en vaccination et en administration par voie respiratoire, ce projet ambitionne de concevoir de nouvelles stratégies d’immunoprophylaxie ciblant directement les muqueuses respiratoires. L’objectif principal est de concevoir et d’évaluer des candidats vaccins par la voie respiratoire, afin d’optimiser la réponse immunitaire locale et systémique. Ces approches seront administrées par voie nasale ou pulmonaire, dans le but d’induire une protection rapide, efficace et durable au niveau du site d’entrée des pathogènes. Ce projet vise ainsi à répondre à des enjeux scientifiques et cliniques majeurs, en proposant des solutions mieux adaptées à la prévention des infections respiratoires, notamment dans des contextes d’émergence virale ou chez des populations à risque.
Bénéfices attendus
Le projet vise à développer et évaluer une vaccination nasale contre le virus influenza A (grippe), ciblant directement les muqueuses respiratoires pour limiter l’infection initiale et la transmission. Il permettra de caractériser les réponses immunitaires locales et systémiques, d’analyser leur durabilité et d’évaluer l’intérêt d’un rappel nasal en complément des vaccins classiques par exemple. Les résultats contribueront à valider des formulations transposables à l’Homme et à renforcer le développement de stratégies prophylactiques innovantes contre les infections respiratoires.
Procédures
Au maximum, chaque souris pourra être soumise à deux vaccinations, réalisées soit par instillation intranasale, soit par administration oro-trachéale, sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Chaque intervention durera environ 2 à 5 minutes, incluant l’induction anesthésique et le geste technique. Une semaine après la dernière vaccination, les animaux des procédures concernées pourront être soumis à une infection intranasale par le virus Influenza, sous anesthésie gazeuse, d’une durée d’environ 2 à 5 minutes. Tout au long de l’expérimentation, une prise de sang hebdomadaire pourra être réalisée (4 prélèvements maximum au total selon la durée du protocole), chaque prélèvement durant quelques secondes à 1 minute maximum. Pour les animaux soumis à l’infection influenza (procédures concernées), un suivi clinique post-infection sera réalisé, comprenant pesée, observation comportementale et score clinique, en quelques minutes par animal. La fréquence et le nombre exacts d’interventions dépendront de la procédure expérimentale concernée.
Impact sur les animaux
La vaccination intranasale a été administrée, dans notre laboratoire, chez des souris BALB/c et K18-hACE2 sans effet secondaire observé. Classée légère, cette procédure implique une manipulation respiratoire et une anesthésie ; toutes les précautions sont prises pour limiter gêne et stress. La vaccination oro-trachéale (intrapulmonaire) permet une délivrance reproductible de la solution dans les poumons. Réalisée sous anesthésie gazeuse à l’aide d’un cathéter, elle est classée modérée en raison de son caractère invasif et des risques respiratoires potentiels. Le prélèvement sanguin, classé léger, est effectué par ponction du sinus submandibulaire sur animal vigile. La douleur est limitée à la piqûre, le stress est généralement très bref. Cependant ce geste, peut entrainer un hématome au site de ponction. Le nombre de prélèvements est limité à 1 ponction maximum par semaine et par animal, en respectant les volumes sanguins autorisés (100μL de sang maximum). Les infections respiratoires sont généralement peu douloureuses car le poumon n’est pas un organe nociceptif. Toutefois, elles entraînent une inflammation et une gêne respiratoire pouvant devenir douloureuse selon l’intensité. Dans le modèle d’infection grippale chez la souris, les signes cliniques apparaissent entre J2 et J5 post-infection selon la dose et l’effet vaccinal, avec un pic entre J7 et J9. Ils incluent une perte de poids liée à une altération des comportements (prostration, anorexie, réduction de la prise d’eau, pelage hirsute). L’amélioration survient progressivement entre J10 et J12 avec retour au poids initial. Cette procédure est classée comme sévère en raison du stress physiologique et d’une mortalité possible chez les animaux non vaccinés.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.
Remplacement
L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, etc.). Cependant, nous investiguerons au maximum possible la mise en place d’étude in vitro complémentaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum nécessaire. Avant toute expérimentation chez l’animal, les candidats vaccins sont d’abord testés en laboratoire sur des modèles in vitro. Seuls les candidats les plus prometteurs sont ensuite évalués chez l’animal. Le protocole expérimental a été conçu de manière à obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux. Plusieurs types d’analyses sont réalisés à partir d’un même animal (réponse immunitaire, analyses des tissus, présence du pathogène), et les organes prélevés sont utilisés pour différentes études. Cette approche permet de maximiser les informations obtenues sans augmenter le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe ainsi que l’organisation des expériences ont été soigneusement calculés afin d’assurer la validité scientifique des résultats tout en évitant toute utilisation excessive. Les deux sexes sont inclus dans l’étude afin de prendre en compte les différences biologiques éventuelles entre mâles et femelles. Chaque groupe comprend un nombre équilibré d’animaux des deux sexes. Les résultats sont analysés à l’échelle du groupe, avec la possibilité d’examiner également l’influence du sexe si nécessaire. Dans l’ensemble, ce projet vise à trouver un équilibre entre la qualité scientifique des résultats et la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages enrichies (matériaux de nidification et éléments favorisant leur comportement naturel). Tout au long de l’étude, leur état de santé est surveillé plusieurs fois par jour par du personnel formé, afin de détecter rapidement tout signe de gêne ou de souffrance. Une attention particulière est portée dans les jours suivant l’infection, période durant laquelle les effets sont les plus susceptibles d’apparaître. Des mesures sont mises en place pour faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau, notamment pour les animaux les plus affectés (par exemple, mise à disposition de nourriture adaptée directement dans la cage). L’utilisation de traitements antidouleur ou anti-inflammatoires n’est pas possible dans ce modèle, car ils pourraient modifier les résultats de l’étude. Toutefois, des critères d’arrêt stricts sont appliqués afin de prévenir toute souffrance excessive et garantir le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Ce projet est réalisé avec des souris adultes, dont le système immunitaire est pleinement développé. La souris est un modèle couramment utilisé pour l’étude des réponses immunitaires et du développement de vaccins. Elle présente des similitudes importantes avec l’Homme, ce qui permet d’obtenir des informations pertinentes pour la recherche en santé. Différents types de souris sont utilisés afin d’étudier de manière complémentaire les différentes composantes de la réponse immunitaire. Cela permet d’évaluer à la fois la production d’anticorps et les réponses immunitaires plus complexes. L’utilisation de l’animal est nécessaire dans ce projet, car la réponse immunitaire implique de nombreux mécanismes et interactions entre différents organes, notamment les voies respiratoires. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits entièrement en laboratoire sur des modèles non animaux. Ce modèle permet également de suivre l’évolution de l’infection et de la réponse immunitaire dans le temps, dans un organisme entier. Enfin, les expériences sont conçues de manière à optimiser les données obtenues à partir de chaque animal, notamment en réalisant plusieurs analyses à partir des mêmes échantillons, afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés.
Etude des séquelles métaboliques de la malaria cérébrale par imagerie 1/2
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à huit examens d'imagerie sous anesthésie gazeuse, dont quatre de quatre-vingt-dix minutes, dix injections intrapéritonéales quotidiennes et six gouttes de sang prélevées à la queue : 84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Celles qui sont infectées développent une perte de poids, des poils hérissés, une léthargie, une chute de la température corporelle, une faiblesse musculaire et des troubles de la conscience, et une partie d'entre elles est tuée après un unique examen, sans traitement. Il s'agit de mesurer par imagerie comment le cerveau utilise le glucose après guérison d'une malaria cérébrale, et de chercher une inflammation résiduelle. Le porteur retient la souris parce que les déficits neurologiques y ressemblent à ceux des enfants, et parce que le parasite employé, spécifique de cette espèce, a selon lui l'avantage "de ne présenter aucun risque pour l'expérimentateur humain".
Objectifs
La malaria, aussi appelée paludisme, est une maladie parasitaire grave transmise par les moustiques. En 2024, elle a touché 282 millions de personnes et causé plus de 610 000 décès, surtout en Afrique, selon l’Organisation mondiale de la santé. Les enfants de moins de 5 ans sont les plus vulnérables, en particulier lorsqu’ils développent une complication sévère touchant le cerveau appelée malaria cérébrale. La malaria cérébrale provoque des convulsions, une altération de la conscience pouvant aller jusqu’au coma et entraîner le décès. Même après guérison, certains enfants gardent des séquelles : troubles de la mémoire, difficultés à marcher ou à parler, crises d’épilepsie, ou problèmes de concentration. Ces séquelles, souvent ignorées, peuvent handicaper leur développement et leur scolarité, avec des conséquences durables pour eux et leur famille. Pour étudier les séquelles cérébrales à court et moyen termes, nous utilisons des souris comme modèle. Nous les infectons avec un parasite similaire à celui qui provoque la malaria chez l’humain, puis nous les soignons avec un médicament antipaludéen dès qu’elles montrent des signes de complication cérébrale. Grâce à des techniques d’imagerie médicale aussi utilisées chez l’humain, nous avons déjà observé des anomalies persistantes plusieurs mois après la guérison. Par exemple, le cerveau semble avoir des difficultés à utiliser correctement le sucre (glucose), qui est sa principale source d’énergie. Cela pourrait être dû à une inflammation cachée qui persisterait même après la disparition du parasite. Notre objectif est de mieux comprendre ces anomalies pour développer des traitements qui pourraient limiter les séquelles. Nous allons étudier comment le cerveau des souris ayant eu la malaria cérébrale utilise le sucre et s’il existe une inflammation résiduelle. Nous espérons que ces recherches permettront un jour d’améliorer la prise en charge des enfants touchés par la malaria cérébrale, afin qu’ils puissent grandir et s’épanouir sans les conséquences de cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les séquelles de la malaria cérébrale, une forme grave de la maladie qui touche principalement les jeunes enfants, notamment en Afrique. Pour cela, nous utilisons des souris comme modèle d’étude, car leur maladie ressemble beaucoup à celle des enfants. Grâce à des techniques d’imagerie médicale modernes, nous pouvons observer en détail ce qui se passe dans leur cerveau, de manière non invasive et avec des méthodes similaires à celles utilisées pour les humains. Des recherches antérieures par imagerie chez la souris ont déjà montré que la malaria cérébrale provoque un gonflement du cerveau, ce qui réduit l’apport en oxygène au cerveau, et représente la cause du décès chez les enfants. Ces observations ont été confirmées par la suite chez des enfants africains atteints de la maladie. Notre objectif principal est d’identifier les séquelles qui persistent chez les souris ayant survécu à la malaria cérébrale après avoir été traitées avec un médicament antipaludéen. Nous allons nous concentrer sur deux aspects importants : d’une part, les perturbations dans la manière dont le cerveau utilise le sucre, qui est sa principale source d’énergie, et d’autre part, la présence éventuelle d’une inflammation cachée qui pourrait persister même après la guérison et continuer à endommager le cerveau. Le sucre est essentiel au bon fonctionnement du cerveau, et un dysfonctionnement dans son utilisation pourrait expliquer certains troubles neurologiques observés, comme des difficultés d’apprentissage ou des crises d’épilepsie. Si nous parvenons à établir un lien entre ces perturbations métaboliques et une inflammation résiduelle, cela pourrait permettre de tester, dans de futures études, l’efficacité de traitements anti-inflammatoires pour réduire les séquelles chez les enfants. À plus long terme, cette étude pourrait aider à développer des outils pour mieux diagnostiquer les enfants à risque de complications après une malaria cérébrale, améliorer leur suivi médical en identifiant des signes précoces, et tester de nouveaux traitements pour limiter les dommages au cerveau. En somme, ce projet a pour but d’améliorer notre compréhension des effets durables de la malaria cérébrale afin de rechercher des traitements pour améliorer la vie des enfants touchés par cette maladie.
Procédures
Les animaux induits pour la malaria recevront une injection intrapéritonéale de globules rouges parasités. Ils subiront 2 prélèvements d’une goutte de sang espacés de 3 jours en moyenne, sur une période de 7 jours. Les animaux avec malaria qui seront traités par un médicament antipaludéen subiront deux prélèvements supplémentaires d’une goutte de sang chacun, effectués à 4 jours d’intervalle en moyenne, durant la période de traitement. Les animaux contrôles sains et les animaux avec malaria qui seront traités recevront au total 10 injections intrapéritonéales à l’état vigile (une injection quotidienne pendant 10 jours en alternant chaque jour le côté). Les animaux avec malaria non traités subiront un seul examen clinique par imagerie sous anesthésie gazeuse d’une durée de 45 minutes environ. Les autres animaux subiront, selon les groupes, soit une seule session de 4 examens cliniques par imagerie sous anesthésie gazeuse étalés sur une période de 10 jours, soit deux sessions de 4 examens (8 au total), chacune étalée sur une période 10 jours, le délai entre les 2 sessions d’imagerie étant de 60 jours. Pour chaque session d’imagerie, les deux premiers examens auront une durée d’environ 90 minutes et les 2 autres de 30 minutes. Deux des quatre examens d’imagerie de chaque session nécessiteront la mise à jeun des animaux pendant 4 heures ainsi que le prélèvement d’une à deux gouttes de sang pour mesurer la glycémie (3 gouttes au total pour une session d’imagerie, et 6 gouttes au total pour 2 sessions). Les animaux subiront 3 injections intrapéritonéales et une injection intraveineuse d’agents de contraste ou de traceurs sous anesthésie gazeuse, étalées sur 10 jours pour la réalisation de 4 examens d’imagerie (1 session). Pour 8 examens (2 sessions), ils subiront 6 injections intrapéritonéales et 2 injections intraveineuses effectuées sur une période de 3 mois.
Impact sur les animaux
Pendant cette étude, les souris pourraient subir plusieurs sources d’inconfort et de stress, bien que tout soit mis en œuvre pour limiter leur souffrance. D’abord, elles recevront des injections quotidiennes pendant 10 jours, alternativement sur chaque côté du corps, ce qui peut provoquer une gêne locale ou une légère douleur. Certaines souris subiront jusqu’à quatre injections différentes (médicaments, produits de contraste ou traceurs pour l’imagerie) selon les examens prévus. Les examens d’imagerie, bien que nécessaires, imposent aussi des contraintes : les souris seront placées sous anesthésie gazeuse à plusieurs reprises, ce qui peut causer un stress ou une désorientation au réveil. Certaines devront jeûner 4 heures avant certains examens, ce qui peut entraîner une sensation de faim ou d’inconfort. De plus, des prélèvements de sang (2 à 4 gouttes) seront effectués au niveau de leur queue, une procédure qui, bien que rapide, peut être légèrement douloureuse. Les souris infectées par le parasite de la malaria développeront des symptômes graves : perte de poids, poils hérissés, léthargie, puis une baisse dangereuse de leur température corporelle, une faiblesse musculaire et des troubles de la conscience. Certaines ne recevront pas de traitement et seront euthanasiées après un seul examen, tandis que d’autres, traitées avec un médicament, pourront malgré tout, souffrir d’une infection persistante.
Devenir
Les animaux utilisés en procédure 1 seront tous euthanasiés. Ces animaux atteints d’une forme mortelle de malaria ne peuvent survivre. Leur cerveau sera prélevé après le décès afin de collecter des informations sur le métabolisme du glucose et l’inflammation pendant la maladie afin de compléter les données d’imagerie in vivo. Les animaux utilisés en procédure 2 seront aussi tous euthanasiés. Leur cerveau sera prélevé après le décès afin de collecter des informations sur le métabolisme du glucose et l’inflammation après guérison de la malaria afin de compléter les données obtenues par imagerie in vivo. Ces données seront comparées à celles des souris contrôles de même âge.
Remplacement
Le recours à l’animal est incontournable car la détection des séquelles cérébrales et le suivi de leur évolution au cours du temps ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico. Notre projet a pour objectif d’étudier à court et moyen terme l’évolution du neurométabolisme et de l’inflammation cérébrale. Le suivi des animaux sur plusieurs mois devrait permettre d’identifier les anomalies immédiates et/ou plus tardives, les éventuelles récupérations/compensations, ainsi que les effets combinés de l’âge.
Réduction
L’utilisation de techniques d’imagerie non invasives permettra de réduire le nombre d’animaux, grâce au suivi longitudinal de chaque individu. Un grand nombre de données sera recueilli sur un même animal dans des conditions de stress minimal, l’examen clinique par imagerie étant réalisé sous anesthésie gazeuse. La taille des groupes a été calculée à partir de données antérieures en utilisant un test statistique. Les données seront analysées au moyen d’une analyse statistique adaptée aux petits échantillons. Nous devrions ainsi générer des données robustes en utilisant le minimum d'animaux permettant de vérifier les hypothèses scientifiques du projet.
Raffinement
Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress, l’angoisse et la douleur. En ce qui concerne l’induction de la malaria cérébrale et son traitement par la chloroquine, un examen clinique quotidien ou biquotidien permettra de déceler sans retard des signes d’aggravation neurologiques qui nécessiteraient de recourir à l’euthanasie en accord avec les points limites prédéfinis. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec monitoring physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels.
Choix des espèces
L’inoculation du parasite de la malaria chez la souris est un modèle validé et reconnu de la malaria cérébrale pédiatrique. De plus, les déficits neurologiques et cognitifs décrits dans ce modèle après guérison sont très proches de ceux rapportés chez l’Humain. Enfin, le parasite spécifique de la souris possède l’avantage de ne présenter aucun risque pour l’expérimentateur humain.
Evaluation de la réponse immunitaire de différents types de nanoparticules chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Trois injections intramusculaires dans la cuisse, échelonnées sur quatre semaines, sont administrées à chacune des 32 souris utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur assimile ces injections à celles de n'importe quel vaccin et n'en attend que des "nuisances très superficielles", hématomes légers, contractures passagères et inflammation locale. Il annonce vérifier si ses nanoparticules peptidiques induisent une réponse immunitaire au même niveau que les vaccins à ARN messager du marché, tout en rapportant que l'étude précédente leur avait donné 20 à 66 % de réponses positives, contre 100 % pour la formulation commerciale. Toutes les souris sont tuées au trente-cinquième jour, le sang total étant prélevé pour obtenir des "volumes de serum conséquents".
Objectifs
Ce projet vise à améliorer les vaccins à ARN messager (ARNm), comme ceux utilisés contre la COVID‑19. Aujourd’hui, ces vaccins doivent être conservés à des températures très basses (entre –20 °C et –80 °C), car leur formulation est fragile et perd rapidement en efficacité. Nous développons une solution alternative à partir de petites molécules naturellement présentes dans le corps. Ces molécules permettent de transporter efficacement différents types d’ARN, de les conserver stables plusieurs semaines à 4 °C facilitant grandement le stockage et la distribution des vaccins. Des premiers tests montrent que ces molécules peuvent déclencher une réponse immunitaire. Nous allons donc comparer, chez l’animal, des vaccins formulés avec les deux formulations puis vérifier si les anticorps produits protègent bien contre une infection virale.
Bénéfices attendus
L’évaluation de l’efficacité des nanoparticules peptidiques à induire une réponse immunitaire au même niveau que celle générée par les vaccins à ARN messager actuels sur le marché permet d'ouvrir des perspectives intéressantes pour le développement de vaccins présentant une formulation, un transport et une conservation grandement simplifiés. Ce nouveau type de formulation pourrait permettre de réduire les couts de production des préparations vaccinales en allégeant fortement les contraintes pratiques associées à l’usage de nanoparticules lipidiques. Les résultats de ces études seront publiés et accessibles à la communauté scientifique et médicale.
Procédures
Le nombre d’intervention prévu chez les animaux sont au nombre de quatre. Une première injection intramusculaire d’une dose vaccinale est programmée le premier jour de l'étude. Une deuxième injection identique se déroulera au 14eme jour de l’expérimentation et une dernière injection réalisée le 28eme jour assurera un « rappel vaccinal ». Chacune des injections sera réalisée en moins d'une minute. L’animal sera euthanasié au 35eme jour et son sang collecté pour réaliser de analyses ultérieures.
Impact sur les animaux
LLes différents groupes recevront intramusculairerement dans la cuisse trois doses vaccinales d'un volume de 50 microlitres échelonnées sur 4 semaines (J0, J14, J28). Ces injections peuvent être considérées comme de simples injections réalisées pour n'importe quel type de vaccin (COVID19, Tétanos, DTPolio...). Elles ne devraient occasionner que des nuisances très superficielles (légers hématomes, contractures musculaires passagères, inflammation locale). Lors de la première phase, aucun signe n'a été observé pour les différents groupes traités
Devenir
Pour obtenir des volumes de serum conséquents, toutes les souris seront euthanasiées et le sang total sera prélevé afin de procéder aux dosages d’anticorps correspondants aux types de vaccins utilisés.
Remplacement
Ce projet a pour objectif de caractériser les réponses immunitaires induites par la plateforme vaccinale testée. Bien qu’il soit possible de réaliser des études in vitro avec des lignées cellulaires, il est impossible à l’heure actuelle de recréer in vitro la complexité des interactions entre les acteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans le fonctionnement du système immunitaire d’un mammifère. Le modèle murin (souris) dont la physiologie est proche de l’homme permet d’étudier les réponses immunitaires induites par la vaccination. Ce modèle permet donc de générer des données indispensables avant d'envisager de tester dans le futur un vaccin sur des sujets humains.
Réduction
Nous nous efforçons de maximiser le nombre d'expériences réalisées tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. Pour établir la signification de la réponse immunitaire induite par nos préparations vaccinales, nous avons déterminé que des groupes de 10 animaux sont suffisants. En effet, les vaccins commerciaux actuellement sur le marché affichent des taux de réponse immunitaire d'environ 95%. Ainsi, nous avons obtenu dans l'étude précédente 100% de réponses positives à la vaccination dans le groupe ayant reçu les doses commerciales. Les groupes traités avec nos nanoparticules ont montré des taux de réponses de l'ordre de 20 à 66% seulement, ce qui constitue un écart clairement significatif. Le nombre d'animaux choisi (10 animaux par groupe) nous permet donc ainsi d'avoir un effet attendu significatif avec un écart-type acceptable.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être, tout en limitant le stress et la souffrance des animaux. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluations et points limites) sera strictement respecté, et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie. Notre projet ne nécessite pas la mise en place de mesures de raffinement plus spécifiques.
Choix des espèces
Il s’agit de souris particulièrement adaptées à des études générales incluant des études de toxicologie, de pharmacologie ou de physiologie. Les choix de cette espèce animale reposent sur des résultats probants obtenus dans une étude préliminaire. Nous souhaitons ainsi confirmer une méthodologie alternative de préparations vaccinales pour induire une réponse immunitaire équivalente. Nous recevrons les animaux âgés de 2 mois et ils seront suivis pour une durée de 6 semaines. L’âge de deux mois pour les souris traitées correspond à l’âge auquel le système immunitaire est pleinement développé. Nous maintenons ce critère afin de reproduire au mieux les résultats antérieurs qui s’étaient montrées positifs.
Evaluation de l’effet analgésique et du traitement de l’inconfort oculaire chez le lapin et le rongeur.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Rats : 2100
Lapins : 2100
6 300 animaux non-humains vont être utilisés, 2 100 souris, 2 100 rats et 2 100 lapins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des instillations oculaires répétées plusieurs fois par jour, maintenus immobiles à chaque application, puis subissent des examens de la sensibilité cornéenne à l'esthésiomètre de Cochet-Bonnet, des mesures de la fente palpébrale à la règle et des observations comportementales que le porteur ne détaille pas. Provoquer chez eux un inconfort et une douleur oculaires, rougeurs et irritations comprises, est l'objet même du projet, qui vise ensuite à évaluer des traitements candidats. Environ 90 % sont tués pour des analyses histologiques de la rétine, de la choroïde et de la sclère, les 630 autres, écartés avant l'induction ou en cours de protocole, pouvant être réutilisés ailleurs. Le porteur affirme mener ces inductions dans le "strict respect des principes du bien-être animal".
Objectifs
L’objectif du projet est de développer et de mettre en œuvre, dans le strict respect des principes du bien‑être animal, des modèles expérimentaux induisant un inconfort léger à modéré chez l’animal. Ces modèles ont pour finalité de mieux comprendre les mécanismes de l’inconfort oculaire et de permettre l’identification, la caractérisation et l’évaluation de traitements candidats susceptibles de le prévenir ou de le réduire. L’ensemble des procédures est conçu de manière à minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux, notamment par le recours à des méthodes non invasives, des durées d’exposition limitées et une surveillance régulière des paramètres de bien‑être. Les modèles expérimentaux utilisés représentent un compromis nécessaire entre la pertinence scientifique et l’application rigoureuse des principes des 3R (Remplacement, Réduction et Raffinement), afin de garantir une utilisation responsable et éthique des animaux à des fins de recherche biomédicale.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet résident dans l’identification, la caractérisation et la sélection de nouveaux traitements susceptibles d’améliorer la prise en charge clinique de l’inconfort et de la douleur oculaires. Les résultats obtenus pourraient contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées, visant à soulager les patients présentant des affections oculaires associées à une altération du confort visuel et du bien‑être. À terme, ce projet pourrait ainsi participer à l’amélioration de la qualité de vie des patients, en favorisant l’accès à des options thérapeutiques innovantes et mieux adaptées aux besoins cliniques, tout en répondant aux exigences actuelles de sécurité, d’efficacité et de tolérance.
Procédures
Tous les animaux recevront des instillations oculaires conformément au protocole expérimental. Ils seront maintenus immobile pendant quelques secondes pour permettre l'application topique. Ces administrations sont répétées plusieurs fois par jour et étalées sur un ou plusieurs jours selon la procédure choisie. Les examens réalisés dans le cadre des évaluations sont non invasifs et ne durent que quelques minutes. Ils reposent principalement sur des observations comportementales, sur l’évaluation de la sensibilité cornéenne à l’aide d’un esthésiomètre de Cochet‑Bonnet, la mesure de la fente palpébrale avec une règle et l'apparence de la surface oculaire. Ces examens, conçus pour limiter au maximum toute gêne ou contrainte pour l’animal, peuvent être répétés plusieurs fois au cours de la même journée en fonction du plan expérimental, sans impact significatif sur le bien‑être animal, il dure chacun quelques secondes à quelques minutes. L'animal est alors maintenu afin qu'il reste immobile pour permettre l'évaluation. L'ensemble de ces interventions seront étalées sur une journée.
Impact sur les animaux
Le projet a pour but de trouver des traitements à la douleur ou à l'inconfort oculaire. Les animaux vont sur une courte période ressentir un inconfort ou une douleur modérée. Des rougeurs et des irritations ponctuelles et réversibles pourront aussi apparaitre.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux ayant suivi la totalité du protocole pourront être euthanasiés de manière éthique et conforme à la réglementation, afin de permettre les analyses ex vivo nécessaires. Ces analyses pourront comprendre notamment : des études histologiques des structures oculaires (rétine, choroïde, sclère), des dosages biochimiques ou moléculaires, ainsi que des évaluations morphologiques complémentaires indispensables à la validation scientifique des résultats. En revanche, les animaux non inclus dans l’intégralité de la procédure, estimés à environ 10 % (hors exclusions pour atteinte d’un point limite), pourront être réutilisés dans d’autres protocoles compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Il en va de même pour les animaux retirés avant l’induction pour une anomalie anatomique ou physiologique, un défaut oculaire préexistant. Ces individus n’auront subi ni induction, ni administration de traitement expérimental. Ils n’auront été exposés qu’à des examens non invalidants, sans conséquences durables. Dans ces conditions, leur réutilisation éventuelle s’inscrit pleinement dans les principes des 3R, en permettant une réduction du nombre total d’animaux utilisés tout en garantissant la protection du bien‑être animal et le respect des exigences scientifiques du projet.
Remplacement
L’œil est un organe sensoriel d’une grande complexité, constitué de structures anatomiques et physiologiques étroitement interconnectées (cornée, cristallin, rétine, choroïde, sclère, nerf optique), jouant un rôle central dans la perception sensorielle et la réponse aux stimuli irritatifs ou nociceptifs. Le maintien du confort oculaire repose sur des équilibres mécaniques, physicochimiques et biologiques précis, ainsi que sur une innervation et une vascularisation fonctionnelles. Toute perturbation de ces équilibres peut conduire à l’apparition d’inconfort ou de douleur oculaires. Bien que des approches alternatives telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modélisations in silico aient progressé ces dernières années, elles demeurent insuffisantes pour reproduire l’ensemble des interactions structurelles, fonctionnelles et pharmacocinétiques impliquées dans la genèse et la modulation de l’inconfort et de la douleur au sein d’un œil vivant. Ces modèles ne permettent notamment pas de simuler de manière fiable les réponses tridimensionnelles des tissus oculaires, l’intégration des signaux sensoriels et nociceptifs, ni les réponses cliniques et comportementales associées. Dans ce contexte, l’étude in vivo reste indispensable pour atteindre les objectifs du projet. Elle permet d’observer de manière intégrée et dynamique les mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’apparition de l’inconfort et de la douleur oculaires, d’évaluer l’efficacité et la tolérance de traitements administrés par voie oculaire ou systémique, et d’étudier leurs effets à court et à long terme sur les différents tissus oculaires au sein d’un environnement physiologique complet, intégrant innervation, vascularisation et régulations neurosensorielles.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les modèles expérimentaux présentés sont largement utilisés et décrits sur le lapin et le rongeur dont les publications de référence citées sur lesquelles le projet est basé. Le lapin sera choisi pour la taille de son œil. Les observations des paramètres observées en sont facilités. Si la quantité de produit à évaluer est limitée (difficulté à synthétiser, coût), le rongeur sera alors choisi. Il le sera aussi si des analyses histologiques spécifiques sont nécessaires, le catalogue d’anticorps par exemple y est plus développé. Enfin le choix de l’espèce, sera guidé aussi par les données existantes sur le produit à évaluer (spécificité d’action, données historiques sur l’espèce choisie). C’est pour ces raisons que des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux seront de jeunes adultes : les rongeurs auront un minimum de 6 semaines au début de l’étude et les lapins environ 8-12 semaines, ces âges correspondent à la maturité visuelle.
Production d’ascite sarcome TG180 chez la souris
- Production de routine
- Tests réglementaires
10 831 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune servant à fabriquer environ 1 100 tests de diagnostic, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection de cellules de sarcome TG180, puis développe pendant quatorze jours une ascite abdominale qui lui fait prendre jusqu'à 50 % de son poids initial, avant d'être tuée pour que ce liquide soit prélevé. Le porteur compare cet état à une gestation, indique que les souris continuent à se toiletter, à se déplacer et à se nourrir, et écrit que la méthode ne demande pas d'analgésie du fait de son caractère "peu invasif". Douze références de réactifs marqués CE dépendent de cette production, et le porteur écrit que certaines ont déjà pu être produites in vitro, ce qui a divisé par deux le nombre de souris utilisées, l'arrêt complet restant conditionné au rythme des autorisations de commercialisation des nouveaux produits.
Objectifs
L’ascite de souris sarcome TG 180 est utilisée dans la production de 12 références de tests de diagnostic in vitro de pathologies humaines à forte mortalité ou graves conséquences parmi lesquelles nous retrouvons la toxoplasmose, les troubles thyroïdiens, différents cancers, l’anémie, des bilans hormonaux, des marqueurs d’allergies respiratoires… Tous les réactifs concernés sont marqués CE conformes à la directive européenne.
Bénéfices attendus
Ces tests de diagnostics sont basés sur une méthode immuno-enzymatique, reposant sur la capacité d’un anticorps à reconnaître et à se lier spécifiquement à une molécule appelée alors antigène. Ces principes immunologiques sont exploités pour révéler une molécule d’intérêt présente dans l’échantillon du patient grâce à un/des anticorps spécifique(s) présent(s) dans le réactif. Une souris permet la fabrication d’environ 1100 tests de diagnostic. L’ascite TG180 de souris est utilisée pour éliminer des réactions non-spécifiques éventuellement dues à la présence d’anticorps anti-souris dans l’échantillon du patient et pouvant amener à un faux résultat.
Procédures
Une injection sur souris vigile d’une durée 15 secondes maximum Un prélèvement sur animal préalablement euthanasié.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules à des souris de 30g, provoque la production d’ascite après 14 jours d’incubation, avec une prise de poids n’excédant pas 50% du poids initial. Cette production provoque un inconfort comparable à une gestation. Toutefois les souris continuent à se toiletter, à se déplacer, à se nourrir, à boire ou à interagir.
Devenir
L’ensemble des animaux est euthanasié en vue de prélever leur ascite. En aucun cas ce prélèvement s’effectue sur animal vigile.
Remplacement
Le redéveloppement de ces tests de diagnostic nécessite de définir les matières de substitution, sans compromis aucun sur la qualité des tests, en maintenant donc les performances des tests à leur niveau actuel. Il s’agit là d’un programme d’innovation s’étendant sur des années. La réduction de l’utilisation du nombre de souris sera donc progressive et fonction du rythme d’obtention des autorisations de commercialisation des nouveaux produits dans les pays où ils seront commercialisés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste suivant les besoins nécessaires pour la fabrication de l’ensemble des kits dans lesquels rentrent le produit. Dans le passé un gros travail de sélection des souches, visant à sélectionner des souches les plus productives avec un niveau de qualité supérieur, a été effectué permettant d’avoir aujourd’hui une productivité optimisée et constante. Ce travail a permis, au fil du temps de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour le même volume de produit. L’ascite entre dans la composition de nombreux kits de dépistage de maladie humaine. Aujourd’hui certaines références ont pu être produites in-vitro permettant de s’affranchir de l’utilisation de ce produit. Cette avancée a permis de diviser par deux le nombre d’animaux utilisés. Les essais vont continuer dans cette voie afin de diminuer voire arrêter cette production dans le futur.
Raffinement
Les souris réceptionnées sont acclimatées à leurs nouvelles conditions d’hébergement pendant 14 jours Les animaux sont hébergés sur litière sciure. Des lanières cartons sont introduites dans chaque caisse permettant aux souris de construire un nid. Un tunnel en PVC est également placé dans les caisses permettant aux souris de se cacher. Tous ces éléments assurent l'enrichissement du milieu. Un suivi quotidien et individuel permet en cas d’apparition de signe clinique lors du protocole, l’application de points limites prédictifs adaptés afin de limiter toute souffrance animale. Cette méthode ne nécessite pas de recours à l’analgésie du fait de son caractère peu invasif. Une observation attentive des animaux n’a pas montré d’altération significative du comportement des animaux, mais plus un inconfort lié à la prise de poids du fait de la production d’un volume conséquent d’ascite, comparable à un état de gestation.
Choix des espèces
La spécificité d’espèce est requise car la fonctionnalité de ces anticorps est de neutraliser les interférences anti souris présentes dans les échantillons humains. Les animaux utilisés sont des souris de 21-39g. La spécificité d’espèce est requise car la fonctionnalité de ces anticorps est de neutraliser les interférences anti souris présentes dans les échantillons humains.
Comparaison des effets de différents extraits de Rosmarinus officinalis sur la cardioprotection et la cytoprotection suite à un stress
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un extrait de romarin par voie orale pendant dix jours, ce qui peut selon le porteur provoquer des douleurs modérées, puis, aux jours huit et neuf, une injection dans le péritoine d'une molécule qui déclenche un stress cardiaque et peut accélérer leur rythme cardiaque. Le bénéfice avancé, une prévention de l'infarctus pour les patients qui ne peuvent pas pratiquer d'activité physique, dépend d'abord de savoir laquelle des formulations comparées protège le mieux du stress oxydant. Le porteur écrit que des expérimentations sur cellules ont déjà été conduites et conclut que le recours à l'expérimentation animale est "nécessaire" pour évaluer le passage de la molécule dans le sang.
Objectifs
Explorer le rôle protecteur cardiaque des extraits de Romarin (Rosmarinus officinalis), sera déterminant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde. Notre objectif sera de comparer des effets protecteurs et anti-oxydants de différents extraits et différentes formulation de R. Officinalis sur des rongeurs, suite à une injection de molécule mimant un stress cardique modéré.
Bénéfices attendus
Explorer le rôle cytoprotecteur des phytonutriments issus d'extraits de Romarin, sera donc déterminant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde (IdM). Notre approche permettra de déterminer quelle formulation est la plus efficace pour protéger du stress oxydant dans le coeur. Des stratégies préventives cardio-vasculaires sont peu nombreuses et sont très attendues pour certains patients ne pouvant pas réaliser le traitement préventif de référence (activité physique).
Procédures
Les animaux subiront chacun un traitement par voie orale pendant 10 jours (intervention évaluée à moins de 15 minutes). Puis dans l'heure suivant cette prise orale, aux jours 8 et 9, une injection de molécule entraînant un stress cardiaque modéré sera injectée.
Impact sur les animaux
Le traitement oral peut être à l’origine de douleurs modérées ou de stress pour l’animal. Il n'y a pas d'effets toxique attendus à ces doses. Nous n'attendons pas d'effets délétères pour les animaux à la dose utilisée par voie orale. Les deux doses de molécules entrainant un stress cardiaque modéré aux jours 8 et 9 du protocole par voie intra-péritonéale peuvent entrainer des rougeurs au point d'injection. De plus, la molécule entrainant un stress cardiaque modéré (une tachycardie peut être observée), donc dans l'heure suivant l'injection les animaux seront sous surveillance. L'ensemble des prélèvements sera réalisé post-mortem après pré-anesthésie puis anesthésie léthale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement d'organes cibles.
Remplacement
Des expérimentations sur cellules ont été conduites pour évaluer les différents mécanismes qui impactent la fonction des cellules cardiaques et vasculaires. Cependant la question posée ici est complexe et l’évaluation de l’effet des molécules, de leurs extractions et de leurs formulations sur modèle animaux vivants est nécessaire afin d’évaluer la biodisponibilité (importance du passage de la molécule active dans la circulation sanguine) et l’efficacité biologique. L’intégration de l’expérimentation animale apparait donc nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.
Réduction
Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables. Ceci en se basant sur des résultats de la littérature scientifique et une analyse statistique permettant de déterminer le nombre minimum d'animaux à inclure pour démontrer une différence entre nos groupes. Les tests statistiques apropriés seront ensuite réalisés.
Raffinement
Le protocole a été conçu pour limiter au maximum le stress subit par les animaux. Les animaux seront acclimatés 7 jours après leur arrivé à l’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les souris sont hébergés en cages de 5 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum (à volonté) et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélèvements seront réalisés post mortem suite à une anesthésie et une euthanasie. Durant toute la procédure expérimentale, les animaux seront suivis et en cas de douleur une injection d'analgésique est prévue. Afin d’éviter tout stress ou douleur, l’ensemble des prélèvements seront réalisés postmortem suite à une anesthésie et une euthanasie appropriée. Par ailleurs, durant toute la période d'hébergement des animaux, le bien-être des animaux sera évaluée par une grille de score présente en annexe. Il est prévu d'enrichir le milieu ainsi que l'alimentation. Lors de l'administration de la dose orale : les procédures seront réalisées par des personnels expérimentés ; et les animaux auront été au préalable habitués. Les animaux seront surveillés tout au long de la procédure pour s’assurer de leur bien-être. De plus, dans l'heure suivant l'injection de la molécule entraînant un stress cardiaque modéré, une surveillance accrue sera mise en place avec une grille de score adaptée présente en annexe.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la physiologie cardiovasculaire des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in-vivo. L’utilisation du même animal pour différentes analyses permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. De plus, notre équipe est spécialisée dans l’étude des effets cardiovasculaires ce qui facilitera nos expériences et nos analyses biochimiques. Afin d’éviter des modifications liées au développement des animaux, les souris seront utilisés à un stade mature pour être représentatif d’une population adulte.
Evaluation pharmacologique d’un composé sur un modèle de rats rendues obèses par une alimentation enrichie en graisses
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Le protocole est mené pour le compte d'un laboratoire pharmaceutique client, dont la direction scientifique a validé la justification du projet, afin de trier des molécules candidates avant d'éventuels essais chez l'humain. 81 rats rendus obèses et diabétiques par une alimentation enrichie en graisses vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est hébergé seul, pesé 23 fois, traité 10 fois et piqué 16 fois pour des prélèvements de sang, le porteur précisant que le rat a été préféré à la souris à cause du nombre de prélèvements et des volumes sanguins voulus. L'intérêt affiché est d'optimiser la recherche et développement du client et de limiter la suite du développement aux molécules les plus prometteuses, la mise à mort finale servant des analyses pharmacocinétiques et des prélèvements d'organes.
Objectifs
Le présent projet sera mené pour le compte d’un laboratoire pharmaceutique dans le cadre d’une recherche privée. Le présent projet vise à explorer le profil pharmacologique du médicament X administrées chez le rat rendu obèse et diabétique par une alimentation enrichie en graisses, dans le but d'optimiser leur développement. La justification scientifique du projet a en outre été validée par la direction scientifique et par les chefs de projet de la société cliente.
Bénéfices attendus
Si les résultats obtenus sont positifs, les formulations du médicament X pourront entrer en phase d'étude clinique et être ensuite autorisé à être mis sur le marché en tant que traitements anti-obésité et anti-diabétiques, et dont la posologie serait bien moins contraignante pour les patients traités que le médicament actuel. Par ailleurs, un meilleur contrôle de la biodistribution du médicament X pourrait également améliorer l'efficacité des traitements actuels.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (23 mesures au cours de l'étude ; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration des composés (10 administrations ; durée : 1 minute); 3) Prélèvements sanguins pour mesure de la glycémie (2 prélèvements ; durée du prélèvement : 1 minute) ; 4) Prélèvements sanguins pour analyses pharmacocinétiques (14 prélèvements ; durée du prélèvement : 1 minute) 5) Anesthésie générale avant mise à mort (durée : 5 minutes).
Impact sur les animaux
L'hébergement en cage individuelle sera source de stress du fait d'un isolement partiel des animaux qui garderont néanmoins des contacts visuels et olfactifs. Les mesures de poids corporel, les administrations des traitements et les prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations des traitements et les prélèvement d'une goutte de sang à la pointe de la queue occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Enfin, le caractère obèse des rats sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
A l'issue de l'étude, l'ensemble des animaux sera mis à mort pour des analyses pharmacocinétiques et/ou des prélèvements d'organes.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la glycémie dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de rat obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 16 ou 17 animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les mesures de poids corporel, les administrations des traitements et les prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. L'administration des traitements sera réalisée par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation d'une semaine sera prévue afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages glycémiques (une seule goutte de sang prélevée en bout de queue). Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
Le rat a été préféré à la souris compte tenu du nombre de prélèvements et des volumes sanguins nécessaires à l'étude. La même étude sur la souris aurait nécessité de limiter drastiquement le nombre de prélèvements par animal, ce qui aurait eu pour conséquence d'augmenter considérablement les effectifs de l'étude. Par ailleurs à ce stade, les études sur animaux non rongeurs n'ont pas été envisagées par soucis de Remplacement (Règle des 3Rs). Il nous apparait que les études sur les mammifères non murins devraient être limitées aux études règlementaires sur des leads (molécules actives) déjà sélectionnés. Or dans le cas présent il s'agit d'une étude de sélection de leads, permettant d'optimiser la R&D du client et de limiter le développement ultérieur aux leads présentant les meilleurs propriétés pharmacocinétiques.
Expression de la CCK (cholécystokinine) dans le tissu rénal de rats mâles Sprague-Dawley traités à la streptozotocine.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
Pour vérifier chez le rat un résultat obtenu chez la souris et jugé incertain, la présence dans le rein diabétique d'une substance impliquée dans la digestion, 22 rats Sprague-Dawley mâles reçoivent une injection de streptozotocine dans la veine de la queue. Le diabète ainsi provoqué s'installe pendant huit semaines, avec augmentation de la soif, de la faim et du volume d'urine, perte de poids modérée, déshydratation, altération du pelage et baisse d'activité, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois prélèvements sanguins suivent l'évolution, et deux rats ont été ajoutés au groupe traité pour absorber un décès éventuel. Tous sont tués à huit semaines pour prélever les reins et une partie de l'intestin grêle, le porteur écrivant que ces prélèvements sont "indispensables" et qu'ils ne peuvent pas être réalisés sur des rats maintenus en vie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les effets du diabète de type 1 sur le rein. Le diabète de type 1 est une maladie dans laquelle l’organisme ne produit plus d’insuline, ce qui entraîne une augmentation du sucre dans le sang et peut endommager plusieurs organes, notamment les reins. Les chercheurs s’intéressent ici à une substance produite naturellement par l’organisme, appelée cholécystokinine. Cette substance est normalement impliquée dans la digestion des aliments, mais des travaux récents suggèrent qu’elle pourrait aussi être présente dans le rein chez les personnes atteintes de diabète. Cependant, ces premiers résultats restent incertains et doivent être confirmés avec des méthodes plus fiables. Le projet vise donc à vérifier si cette substance est effectivement présente dans le rein en situation de diabète, et à mieux comprendre son rôle. Cela permettra de déterminer si elle participe aux mécanismes liés aux atteintes rénales observées dans cette maladie. Les premières observations ayant été réalisées chez la souris, cette étude sera menée chez le rat, un modèle bien connu et largement utilisé, permettant d’obtenir des résultats plus robustes. À terme, ces travaux pourraient améliorer les connaissances sur les complications du diabète et contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour le suivi ou le développement de futurs traitements.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra de vérifier de manière fiable des résultats scientifiques récents suggérant qu’une substance naturellement produite par l’organisme, la cholécystokinine, pourrait être présente dans le rein en cas de diabète de type 1. Les données obtenues contribueront à confirmer ou à remettre en question ces observations, et ainsi à améliorer la solidité des connaissances dans ce domaine. À plus long terme, une meilleure compréhension du rôle éventuel de cette substance dans le rein pourrait apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes impliqués dans les complications rénales du diabète. Ces complications étant fréquentes et importantes, toute avancée dans leur compréhension est susceptible d’avoir un intérêt scientifique et médical. Les résultats de ce projet pourraient également orienter des recherches futures visant à identifier de nouveaux indicateurs biologiques utiles pour suivre l’évolution de la maladie, ou de nouvelles pistes d’étude pour le développement de stratégies thérapeutiques. Toutefois, ces applications potentielles nécessiteront des travaux complémentaires avant toute utilisation concrète.
Procédures
Les animaux recevront une seule injection intraveineuse à la queue (durée maximum de 3 minutes) destinée à provoquer un diabète expérimental permettant l'étude de la maladie. Ils feront ensuite l'objet de trois prélèvements sanguins (durée maximale de 1 minute par prélèvement) au cours de l'étude (après 1, 4 et 8 semaines) afin de suivre l'évolution du diabète. La durée totale de suivi sera de huit semaines.
Impact sur les animaux
L'injection destinée à induire le diabète peut entraîner une augmentation durable du taux de sucre dans le sang. Les animaux concernés peuvent présenter une augmentation de la consommation d'eau et de nourriture, une production accrue d'urine, une perte de poids modérée ainsi qu'une diminution de l'activité. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un inconfort bref au moment de leur réalisation. Une surveillance régulière est prévue afin d'identifier rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les mesures nécessaires.
Devenir
À la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des organes nécessaires aux analyses scientifiques, notamment les reins et une partie de l’intestin grêle. Ces prélèvements sont indispensables pour atteindre les objectifs du projet et ne peuvent pas être réalisés sur des animaux maintenus en vie.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet actuellement de répondre pleinement à l'objectif de cette étude. L'expression de la cholécystokinine (CCK) dans le tissu rénal doit être étudiée dans le contexte d'un organisme vivant présentant un diabète induit et conservant l'ensemble des interactions physiologiques entre le pancréas, le système endocrinien, le système cardiovasculaire, le rein et les différents mécanismes métaboliques. Des approches in vitro telles que les cultures cellulaires ou les organoïdes rénaux ont été considérées. Toutefois, elles ne permettent pas de reproduire l'état diabétique systémique ni ses conséquences endocriniennes et métaboliques complexes. Les outils de modélisation informatique disponibles ne permettent pas non plus de prédire de façon fiable les modifications de l'expression tissulaire de la CCK dans ce contexte. L'utilisation d'animaux demeure donc nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre d'animaux a été limité au minimum compatible avec l'obtention de résultats scientifiquement exploitables. Le projet comprend deux groupes expérimentaux : un groupe traité par streptozotocine développant un diabète (12 animaux) et un groupe contrôle (10 animaux). Le dimensionnement des groupes repose sur les données disponibles dans la publication de référence et sur l'expérience acquise avec ce modèle expérimental. Chaque animal contribue à plusieurs critères d'évaluation au cours de la même procédure (suivi glycémique, prélèvement terminal de plasma et collecte des reins), ce qui permet de maximiser les informations obtenues à partir de chaque individu. L’ajout de 2 animaux supplémentaires dans le groupe traité permet de s’affranchir d’un éventuel décès et de garantir la robustesse des résultats. Par ailleurs, les prélèvements terminaux permettront la valorisation maximale des tissus récoltés afin d'éviter la réalisation d'études complémentaires nécessitant de nouveaux animaux lorsque cela sera scientifiquement pertinent.
Raffinement
La durée d’acclimatation sera d’une semaine minimum. Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge, avec enrichissement et manipulation selon les bonnes pratiques. Après évaluation de la douleur potentielle (paliers définis avec l’équipe vétérinaire et la SBEA), une analgésie pourra être administrée si nécessaire (signes de douleur, inconfort ou absence de fèces). Une observation quotidienne de l’état général est réalisée tout au long de la procédure, avec soins adaptés en cas de signes cliniques (traitements, soins locaux, enrichissement, réhydratation, réchauffement, ajout d’aliments et/ou gels hydratants, facilitation de l’accès à l’eau). Des points limites sont définis et ajustés selon les observations, avec traçabilité via grilles de score et documents qualité. L’induction du diabète par streptozotocine peut entraîner des symptômes du diabète : hyperglycémie, polyurie (augmentation de la quantité d'urine), polydipsie (augmentation de la consommation d'eau), polyphagie (augmentation de la consommation de nourriture), perte de poids, déshydratation, altération du pelage et baisse d’activité. Les animaux diabétiques feront l’objet d’une surveillance renforcée incluant le suivi du poids, de l’hydratation, du pelage, de la mobilité, des consommations alimentaire et hydrique et de la glycémie. La fréquence des observations sera augmentée dès l’apparition de signes compatibles. Des mesures de soutien (réhydratation, aliments accessibles ou humidifiés, gels hydratants, enrichissement complémentaire) seront mises en place précocement afin de limiter l’impact du modèle et prévenir toute aggravation. Pour l’injection intraveineuse de streptozotocine, les animaux seront habitués à la manipulation via des tunnels dans la cage. L’administration sera réalisée avec un tunnel de contention adapté afin de réduire le stress. Une vasodilatation préalable par réchauffement modéré facilitera l’accès veineux et limitera les tentatives. Les injections seront effectuées par du personnel formé afin de minimiser la durée et les complications.
Choix des espèces
Les rats sont couramment utilisés dans l’étude du diabète, car leur organisme présente de nombreuses similitudes avec certains mécanismes observés chez l’Homme pour cette maladie. De plus, ce modèle est bien connu et largement documenté, ce qui permet de comparer les résultats obtenus avec de nombreuses données scientifiques déjà disponibles. Des rats jeunes adultes seront utilisés. Les animaux seront transférés en zone d’expérimentation à l’âge de 4 semaines afin de bénéficier d’une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant le début de l’étude. L’induction du diabète sera réalisée à l’âge de 5 semaines, puis les animaux seront suivis pendant 8 semaines. Le choix de cet âge est directement lié aux objectifs du projet. Lorsque la substance utilisée pour induire le diabète est administrée à des animaux très jeunes, elle conduit à un modèle présentant des caractéristiques proches du diabète de type 2. En revanche, une administration réalisée à partir de 5 semaines d’âge permet d’obtenir un modèle bien caractérisé et largement utilisé du diabète de type 1, qui correspond à la maladie étudiée dans ce projet. Par ailleurs, le projet vise à étudier une substance naturellement produite par l’organisme, la cholécystokinine. Chez le rat, la production de cette substance évolue fortement au cours des premières semaines de vie avant de se stabiliser. L’utilisation d’animaux âgés d’au moins 5 semaines permet donc de limiter l’influence du développement normal de l’animal sur les résultats et d’obtenir des données plus fiables concernant les effets du diabète.
Impact de la modification du cytosquelette sur le développement de la tauopathie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des groupes de souris sont tués à deux, quatre, six, huit et dix mois, à mesure qu'apparaissent chez elles les signes d'une neurodégénérescence programmée par modification génétique. 2 739 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont une partie atteint le niveau de souffrance sévère, pour éprouver le rôle du cytosquelette des neurones dans la maladie d'Alzheimer et d'autres tauopathies. Celles qui deviennent paralysées trouvent nourriture et eau gélifiée au fond de la cage et sont observées une à trois fois par semaine. La description des procédures tient en deux phrases et celle des effets néfastes en une seule, sans que soit précisé ce qui déclenche la mise à mort d'une souris avant l'échéance prévue.
Objectifs
Les tauopathies, dont la maladie d’Alzheimer, sont des maladies neurodégénératives, dans lesquelles une protéine, la protéine tau, s’agrège, ce qui provoque la mort de neurones du cerveau. Ces maladies sont aujourd’hui incurables et ont un impact important sur les patients, leur proches et toute la société. Ce projet a la vocation d’explorer une piste jusqu’alors ignorée : l’effet de l’état du cytosquelette des neurones dans le développement de ces maladies. Le cytosquelette est un réseau de fibres présents dans toutes nos cellules, et donc aussi dans les neurones, qui sert à organiser l’intérieur des cellules, notamment en servant de « routes » sur lesquelles sont transportés les différents éléments des cellules. Ce transport est très important pour emmener ces éléments aux bons endroits dans les cellules. Pendant la vie des cellules, la surface des fibres du cytosquelette peut être altérée pour influencer ce transport. Dans les neurones sains, la protéine tau interagit avec le cytosquelette et ainsi le stabilise. Le changement de la surface des fibres du cytosquelette pourrait donc contribuer au détachement de tau du cytosquelette et à son agrégation toxique dans les neurones. A ce jour, les recherches se sont surtout concentrées sur les changements de la protéine tau elle-même dans la pathologie. Notre projet cherche donc à mettre en lumière un nouveau mécanisme en jeu dans les tauopathies, et notamment dans la maladie d’Alzheimer, les perturbations du cytosquelette. Ces perturbations pourraient un jour devenir la cible des thérapies contre ces maladies aujourd’hui incurables.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’étudier les mécanismes jusqu’alors inexplorés responsables du développement et de la progression de maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer ou la démence frontotemporale. Ces maladies sont à ce jour incurables et présentent un poids économique et sociétal considérable dans notre société. Nos résultats permettront le développement d’approches diagnostiques, qui pourront mener à une prise en charge précoce de la pathologie, ce qui augmentera la qualité de vie des patients et de leurs familles. A plus long terme, cette étude permettra également le développement de thérapies dans le but d’empêcher l’apparition de symptômes et prévenir la perte définitive de neurones.
Procédures
Les animaux génétiquement modifiés seront générés, et l’apparition des signes cliniques de la neurodégénérescence sera observée. A des âges définis, des groupes d’animaux seront mis à mort
Impact sur les animaux
Les animaux modifiés génétiquement dans cette étude vont développer les symptômes de neurodégénérescence.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les maladies neurodégénératives affectent la survie de cellules du cerveau, les neurones. La particularité de ces cellules est leur interconnectivité : les neurones de différentes parties du cerveau sont branchés d’une manière très précise pour transmettre les signaux nécessaires pour un bon fonctionnement du cerveau et de l’organisme. La mort de certaines populations de neurones, comme c’est le cas dans les maladies neurodégénératives, perturbe cette connectivité précise et mène à l’apparition de symptômes. Pour ces raisons, l’étude de ces pathologies requiert l’utilisation d’organismes modèles, dans lesquels les effets de neurodégénérescence peuvent être évaluée au niveau de l’organe et l’organisme entier. Pour cette raison les approches sur cellules, ou in vitro, ne sont pas compatibles avec ce type de recherche. Cela dit, notre projet a de solides bases établies dans ces modèles de remplacement : culture cellulaire et système in vitro (système reconstitué avec les protéines purifiées). Malgré cela, la partie in vivo est nécessaire pour la validation de nos hypothèses dans le contexte complexe de l'organisme entier. Sans utilisation de ces approches in vivo, il n’est pas possible aujourd’hui de confirmer la pertinence de nos approches dans le contexte de la maladie.
Réduction
Nos collaborateurs ont mené une étude pilote, qui a permis de mettre en évidence l’existence d’une relation entre la présence de tau mutée et la modification de cytosquelette. Ces résultats nous permettent donc de précisément cibler le temps d’apparition de symptômes dans les animaux d’intérêt, limitant ainsi leur nombre. Pour permettre une analyse statistiquement valable, nous analyserons 8 animaux venant d’au moins deux portées différentes par âge et par génotype. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé grâce à l’utilisation d’outils statistiques
Raffinement
Étant donné que les animaux d’intérêt développent une neurodégénérescence se traduisant par une paralysie, ces souris seront observées une à deux fois par semaine. Une surveillance renforcée, 3 fois par semaine sera mise en place dès le début d’apparition de la neurodégénrescence. Cette fréquence pourra être ré-adaptée selon la vitesse d’apparition des signes cliniques, et une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau (en forme d’eau gélifiée) au fond de la cage (facilitation d’accès à la nourriture). Les souris seront perfusées sous analgésie et anesthésie profonde.
Choix des espèces
La souris possède un système nerveux assez développé pour permettre les analyses de maladies neurodegeneratives. De plus, nous avons montré précédemment une forte ressemblance entre les symptômes des patients humains et ceux des souris présentant la même perturbation du cytosquelette, ce qui prouve que le modèle souris est parfaitement adapté pour l’exploration de ces maladies. Ce projet analyse la progression d’une neurodégénérescence, qui intervient chez les animaux adultes. Les animaux seront donc mis à mort pour analyse d’apparition de changements pathologiques (phénotypes) à 2 mois (jeune adulte), puis 4, 6, 8 et 10 mois (âge d’apparition de symptômes les plus sévères). Ces temps sont choisis par rapport aux temps d’apparition connus de phénotypes dans la lignée décrite précédemment.