Rongeurs

Une prise de sang sous anesthésie après quatre heures de jeûne, puis jusqu'à cinq injections dans la veine de la queue sans anesthésie, deux injections dans l'abdomen et, pour 144 d'entre elles, des administrations par la bouche. 384 souris vont être utilisées ainsi pour évaluer la toxicité d'un peptide anticancéreux, seul ou associé à des immunothérapies et des thérapies ciblées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce fatigue, perte de poids et stress des manipulations répétées, effets que la combinaison des traitements peut aggraver. Un second jeûne de quatre heures précède la mise à mort de toutes les souris, avec une prise de sang dans le cœur, pour examiner leurs organes. Sur le remplacement, il invoque en une phrase "l'organisme entier et les interactions entre organes".

Objectifs

Le cancer reste une cause majeure de mortalité et de nouveaux traitements sont encore nécessaires, en particulier pour les formes résistantes aux thérapies actuelles. Ce projet a pour objectif d’étudier un nouveau traitement expérimental basé sur une petite molécule (appelée peptide), conçue pour agir sur l’environnement des tumeurs. Ce traitement vise à bloquer une interaction entre deux protéines qui joue un rôle important dans la croissance des tumeurs et leur capacité à échapper au système immunitaire. En agissant sur ce mécanisme, le traitement pourrait ralentir le développement des tumeurs et favoriser l’action des défenses naturelles de l’organisme. Des résultats obtenus lors d’études précédentes suggèrent déjà un effet positif sur la croissance tumorale. L’objectif principal de ce projet est de vérifier la sécurité d’utilisation de ce traitement, notamment lorsqu’il est administré de manière répétée, seul ou en association avec d’autres traitements anticancéreux déjà utilisés chez les patients (comme certaines immunothérapies ou thérapies ciblées). L’étude permettra également de comparer ses effets à ceux d’autres traitements connus afin de mieux situer son profil de tolérance. Ces travaux sont nécessaires pour confirmer que ce traitement peut être utilisé de manière sûre avant d’envisager son développement chez l’humain.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la tolérence de l’organismes à un nouveau traitement contre le cancer, d’identifier d’éventuels effets secondaires, notamment lorsqu’il est combiné à d’autres traitements et d’optimiser les stratégies thérapeutiques pour les patients. À terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de traitements plus efficaces et plus sûrs contre les cancers solides.

Procédures

Les animaux seront soumis à 5 types d’interventions : - Injection en intraveineuse dans la veine de la queue en condition vigile, 384 souris concernées, pour un maximum de 5 fois durant la période de traitement, temps de manipulation estimé à moins de 5 min - Injection intrapéritonéale, 384 souris concernées, pour un maximum de 2 fois pendant la période de traitement, temps de manipulation estimé à moins de 5 min - Administration per os, 144 souris concernées, pour un maximum de 5 fois pendant la période de traitement de 1 semaine, temps de manipulation estimé à moins de 2 min - Prélèvement sanguin dans une veine saphène sous anesthésie, 384 souris sont concernées, une fois avant la période de traitement, pour un temps de manipulation estimé à 5 min. - Deux mises à jeûn de 4 heures, une avant le prélèvement sanguin dans une veine saphène, une deuxième au préalable de l’euthanasie et du prélèvement sanguin intracardiaque. 384 souris sont concernées.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir un stress lié aux manipulations répétées, une légère douleur ponctuelle lors des injections ou prélèvements, de la fatigue ou une perte de poids liée aux traitements. Dans certains cas, la combinAIson de plusieurs traitements peut augmenter ces effets.

Devenir

L’ensemble des animaux (384) seront euthanasiés afin de pouvoir réaliser une analyse de la toxicologie éventuelle des traitements par anatomopathologie des tissus post-mortem.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer totalement les animaux, car l’étude nécessite d’observer les effets d’un traitement sur l’organisme entier et les interactions entre organes.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire grâce à une planification précise et des méthodes statistiques adaptées.

Raffinement

Les animaux sont surveillés quotidiennement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance (comportement anormal, perte de poids…). Si nécessaire, des mesures sont prises immédiatement pour limiter la douleur, pouvant aller jusqu’à mettre fin à la procédure.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée dans la recherche sur le cancer car son organisme présente des similitudes avec celui de l’humain. Les animaux sont utilisés à un âge jeune adulte, ce qui correspond à une situation biologique adaptée pour étudier les effets des traitements.

Ouverture du crâne pour y implanter un hydrogel chez des rats, implants sous la peau du dos chez des souris, puis pour les rats une chirurgie du thorax en fin de protocole, décrite comme "une procédure douloureuse" : 234 rongeurs, 192 rats et 42 souris, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever les implants et les os du crâne. Le gel associe de l'astaxanthine à des vésicules issues de cellules souches, testées pour la réparation osseuse chez les personnes diabétiques. Rats et souris passent aussi cinq séances d'imagerie sous anesthésie. Les rats portent un diabète d'origine génétique avec obésité et sont étudiés entre 16 et 20 semaines, à un stade où, selon le porteur, "plusieurs complications liées au diabète sont présentes".

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie très fréquente qui touche environ 4 millions de personnes en France. En plus de ses nombreuses complications, cette maladie fragilise les os, ralentit la guérison des fractures et rend la réparation osseuse plus difficile. De plus en plus de patients diabétiques doivent subir des opérations chirurgicales des os. Chez ces patients, les complications après l’intervention sont plus fréquentes, ce qui représente également un coût important pour le système de santé et la société. Aujourd’hui, réparer correctement un os chez une personne atteinte de diabète reste un véritable défi médical. De nouvelles recherches sont donc nécessaires pour trouver des traitements plus efficaces Dans ce projet, nous voulons tester une nouvelle approche qui combine : des petites vésicules produites par les cellules souches, qui favorisent la réparation des tissus, et un antioxydant naturel, l’astaxanthine, qui aide à limiter les effets nocifs du stress oxydatif ( phénomène lié à une production excessive de molécules nocives appelées radicaux libres, qui endommagent les cellules et les tissus). Les deux seront intégrés dans un gel spécial qui inséré dans la fracturé se dégrade en libérant les substances utiles. L’objectif est de recréer un environnement favorable à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et à la formation de l’os. Pour cette étude, nous utiliserons un modèle de rat diabétique et obèse qui reproduit plusieurs caractéristiques du diabète de type 2 humain, et présente des difficultés de réparation osseuse. Il permet donc d’évaluer de manière fiable l’efficacité du traitement, avant d’envisager l'application chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en biothérapie. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes de réparation osseuse chez le diabétique de type 2. Par ailleurs, il fournira des informations sur l’effet bénéfique ou pas du contrôle du stress oxydatif dans la réparation de l’os diabétique. À long terme un tel projet permettra de mettre sur pied des stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients diabétiques qui présentent des accidents du squelette avec une perte osseuse importante ou nécessitant la pose d’implants.

Procédures

Pour les souris: 1-Implantations sous cutanées d'hydrogels : animal sous anesthésie générale (AG) ( 1X ; durée 30 min) ; 2-Imagerie sur animal vivant : AG (5X ; durée 15 min) ; 3- Injection en sous cutanée (SC) d’un médicament antidouleur : animal vigile (AV) (6X ; durée 2 min) ; 4- injection intrapéritonéale (IP) d’anesthésiques chimiques : AV (1X; durée 2 min) ; 5- inhalation d’un anesthésique gazeux : AV ( 5X ; durée 15 min). Pour les rats : 1- Craniotomies avec implantation d’un hydrogel : AG (1X ; durée 30 min) ; 2- Imagerie sur animal vivant : AG (5X ; durée 15 min) ; 3- Chirurgie du thorax suivie d’une infiltration du réseau vasculaire par un agent qui permet de voir les vaisseaux sanguins : AG (1X ; durée 10 min) ; 4-Injection en sous-cutanée d’un médicament antidouleur: AG (7X ; durée 2 min) ; 5- Injection IP d’anesthésiques chimiques : AG (2X ; durée 2 min) ; injection IP d’un antidote à un des produits anesthésiques : AG (2X ; durée 2 min) ; 6- inhalation d’un anesthésique gazeux : AV (10X ; durée 15 min).

Impact sur les animaux

L’implantation sous- cutané chez les souris peut entrainer des effets indésirables tels que : douleur, saignement, stress, œdème. La chirurgie sur le crâne de rat peut entrainer aussi un comportement anormal. Ces effets indésirables seront susceptibles d’être observés pendant l’intervention chirurgicale et au cours des trois jours suivant l’intervention. Une complication éventuelle est l’infection cutanée, susceptible d’entrainer de la douleur et de la souffrance chez les animaux. Elle constitue un point limite de l’étude car pouvant être l’origine de faux positifs (un des critères d’étude étant l’inflammation locale). L’anesthésie chez les souris et les rats, nécessaire à l’imagerie non invasive va également entrainer du stress au moment de la perte de conscience, mais n’entraine aucune séquelle après le réveil.La chirurgie du thorax est une procédure douloureuse.

Devenir

Les souris seront toutes mises à mort et les explants retirés pour évaluer la réponse tissulaire (formation osseuse, inflammation et angiogenèse) en site sous cutané (ectopique) afin d’identifier les conditions pertinentes à tester en site osseux (orthotopique). Les rats seront tous mis à morts aux temps terminaux et les calvarias seront prélevées pour l’étude de la formation osseuse, de la vascularisation et de l’inflammation au niveau des défauts osseux. Justification de la mise à mort : prélèvement des implants pour évaluer la réponse tissulaire et la formation de l’os autour de ces implants.

Remplacement

La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel, orchestré et complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnants tels que le périoste ou le tissu musculaire. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoïde, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages, ostéoblastes/ cellules endothéliales par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Cependant, ces modèles sont dénués de système vasculaire. Or, la formation d’un hématome au tout début de la cicatrisation osseuse joue un rôle essentiel dans celle-ci. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier l’apport de cellules souches et du sécrétome dans la cicatrisation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été calculé avec soin afin d’obtenir des résultats scientifiques fiables tout en respectant le principe des « 3R » : réduire le nombre d’animaux utilisés, améliorer leurs conditions de vie et remplacer l’animal lorsque cela est possible. Les résultats de nos précédentes études montrent qu’un minimum de 6 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir des données solides. Afin de prendre en compte d’éventuelles pertes liées aux interventions ou aux analyses, ce nombre a été porté à 8 animaux par groupe. Plusieurs mesures ont été mises en place pour limiter autant que possible le nombre total d’animaux utilisés : (i) chez les souris, quatre implants seront placés sur un même animal afin d’étudier plusieurs conditions simultanément. Cela permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en conservant une bonne qualité scientifique. (ii) certaines analyses, comme l’étude de l’inflammation et celle de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, seront réalisées sur les mêmes animaux. Cette approche permet d’obtenir davantage d’informations à partir d’un même individu et d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires. Dans le même objectif de réduction, seules les approches de traitement les plus prometteurs chez la souris— c’est-à-dire celles favorisant le mieux la réparation osseuse tout en provoquant peu d’inflammation, seront ensuite testées chez le rat. Enfin, plusieurs techniques d’analyse (analyses biologiques et méthodes d’imagerie) seront combinées chez un même animal afin de maximiser les informations scientifiques obtenues. De cette manière, chaque animal contribue au maximum à l’avancée des connaissances scientifiques tout en limitant le nombre total d’animaux nécessaires au projet.

Raffinement

Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. Au cours des chirurgies (avec champs et instruments stériles) les animaux recevront une goutte de gel oculaire dans les yeux pour éviter le dessèchement et seront placés sur tapis chauffant pour limiter les pertes thermiques. Pour les implantations sous-cutanées, une médication antidouleur (analgésique) préventive sera mise en place 30 minutes avant la chirurgie. Les animaux seront ensuite anesthésiés, puis le dos sera rasé et nettoyé avec une solution antiseptique. Une analgésie post-opératoire se fera pendant 3 jours après l’opération. Pour les implantations intra-osseuse, une analgésie pré- et post-opératoire se fera ainsi qu’une antibiothérapie préventive. Après chirurgie, les animaux seront hébergés en cage seul jusqu’au lendemain matin dans une pièce « Post-op » réglée à 26 °C, puis remis par 3 en conditions standards d’hébergement avec en plus de l'aliment standard un gel nutritif de récupération pendant 3 jours. Pour l’imagerie microscanner, les souris et les rats seront anesthésiés et seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’injection de l’agent de contraste intracardiaque en point terminal nécessite une chirurgie du thorax qui est un geste douloureux. En conséquence, les rats recevront une prémédication contre la douleur 20 min avant l’anesthésie. Une surveillance post-chirurgicales des points limites spécifiques sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques à la procédure permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal au moins deux fois par jour pendant les 3 premiers jours postopératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. Une observation quotidienne des animaux par le personnel de l’animalerie sera effectuée.

Choix des espèces

Des souris âgées de 9 semaines seront utilisées pour évaluer, chez l’animal, la capacité d’un antioxydant associé à de petites vésicules produites par des cellules souches à favoriser la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et la formation d’os. Ce modèle de souris est bien connu et déjà utilisé au laboratoire. Il permet notamment de vérifier que les traitements sont compatibles avec le bon fonctionnement général de l’organisme. À cet âge, leur croissance est terminée, ce qui permet d’éviter que la croissance naturelle de l’animal n’interfère avec les résultats de l’étude. Pour étudier les conséquences du diabète de type 2, nous utiliserons également un modèle de rat présentant un diabète d’origine génétique. Ce modèle est couramment utilisé pour reproduire certaines caractéristiques du diabète de type 2 observées chez l’être humain. Les rats seront étudiés entre 16 et 20 semaines, période correspondant à un stade avancé de la maladie, au cours duquel plusieurs complications liées au diabète sont présentes. Des études précédentes utilisant ce même modèle ont montré que les animaux pouvaient vivre jusqu’à un âge avancé dans les conditions habituelles de l’animalerie, sans nécessiter de soins supplémentaires particuliers. Chez les rats diabétiques, le diabète entraîne des modifications de la structure de l’os, ralentit sa réparation et diminue le nombre de vaisseaux sanguins présents dans les tissus osseux. Ces changements sont particulièrement visibles après 20 semaines de vie. Ce modèle permet donc d’étudier les difficultés de réparation osseuse associées à un diabète avancé et d’évaluer de nouvelles approches susceptibles de favoriser la réparation de l’os. Des rats sains seront utilisés comme groupe témoin. Ils ne présentent pas la modification génétique responsable du diabète et ne développent pas spontanément cette maladie. Ils permettront ainsi de comparer les effets du diabète sur l’os avec ceux observés chez des animaux sains.

Isolées socialement de façon chronique ou nourries d'un régime hyperlipidique, des souris reçoivent une fibre optique implantée dans le cerveau par une chirurgie stéréotaxique d'une heure trente, parfois une pompe sous la peau, et des injections abdominales de tamoxifène cinq jours de suite. 1 040 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses histologiques. Le projet teste si des métabolites bactériens, moins abondants chez des personnes atteintes de troubles psychiatriques, atténuent les effets de l'isolement et de l'obésité sur la neurotransmission dopaminergique. Hormis un conditionnement opérant, qui maintient les souris à 90 % de leur poids par restriction alimentaire, les tests comportementaux ne sont pas nommés, alors que le porteur indique que certains provoquent un stress.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de depression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, qui controle l'inflammation dans le cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents métabolites d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces métabolites a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels les métabolites influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques. Parmi les facteurs de risques des maladies psychiatriques l'isolation sociale chronique AINSI QUE L’OBESITE ONT été démontréS comme délétère pour la santé mentale que soit dans des études chez l'animal ou l'humain. L'objectif est donc de tester si les métabolites bactériens sélectionnés pourraient diminuer les effets délétères de l'isolation sociale ET DE L’OBESITE sur la neurotransmission dopaminergique et le comportement chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment les métabolites bactériens qui sont diminués chez les sujets atteints de maladies psychiatriques pourraient protéger des altérations comportementales et de neurotransmission dans un modèle validé de pathologies psychiatriques chez la souris.

Procédures

Les animaux subiront des interventions chirurgicales visant à implanter des fibres optiques dans le cerveau et potentiellement des pompes sous cutanées. La chirurgie stéréotaxique dure 1h30 avec une phase de réveil de 2 heures. L'implantation de pompes sous cutanée quant à elle dure au maximum 15 minutes. Cette dernière sera réalisée en même temps que l'implantation pour les souris concernées. MODIFICATION 2: "DES INJECTIONS ABDOMINALES SERONT REALISEES SUR ANIMAL VIGILES UNE FOIS PAR JOUR PENDANT 5 JOURS POUR L'ADMINISTRATION DU TAMOXIFENE."

Impact sur les animaux

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum). Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Le modèle de pathologie psychiatrique reposant sur l'isolation sociale qui induira, d'après la littérature scientifique un phénotype anxieux chez les souris. LA CONSOMMATION DU REGIME HYPERLIPIDIQUE INDUIRA UN GAIN DE POIDS QUI PEUT ETRE ASSOCIE A DES TROUBLES METABOLIQUES (DIABETE) ET UN PHENOTYPE ANXIEUX CHEZ LES SOURIS. Pour les injections ou les tests comportementaux, les animaux subiront des préhensions et contentions. Les souris de la procédure 1 réaliserons des tests comportementaux dont certains induisent un stress de courte durée. Enfin dans le cas ou les métabolites ne pourraient être administrés par l'eau de boisson ou la nourriture (pour des raisons organoleptiques conduisant à la non consommation par la souris), une chirurgie visant à implanter des pompes osmotiques sous-cutanées sera réalisée. MODIFICATION 2: L'INJECTION ABDOMINALES DE TAMOXIFENE INDUIT AUSSI DES EFFETS DE DOULEURS LEGERES A MODEREES CHEZ L'ANIMAL. LA DUREE DANS LE TEMPS SERA LIMITEE A QUELQUES MINUTES APRES CHAQUE INJECTION A RAISON D'UNE PAR JOUR PENDANT 5 JOURS.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (1040).

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons des mâles et des femelles. Le nombre d'animaux (1040) nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes ayant subis un stress chronique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement ultra-enrichi (carré de coton, maison en carton, pièce en plastique pour se cacher et jouer) même en cas d'isolation sociale. Ce stress chronique a été sélectioné par rapport au stress chronique de défaite sociale, modèle de référence en psychiatrie, car il induit des altérations comportementales similaires sans induire de potentielles blessures à l'animal. Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage (en annexe): - Perte de poids anormale (10-20% score 1, score 3 si supérieur à 20%) - état du pelage - site de chirurgie - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...). Si le score est supérieur ou égal à 3 une mise à mort immédiate aura lieu. Un suivi du bien être animal sera effectué sur tous les animaux de manière quotidienne pendant le protocole de stress et l'étude comportementale en utilisant une fiche de suivi du bien être (en annexe). Le poids, le comportement général, l'apparence et les signes neurologiques seront scorés. Si un animal présente un score supérieur à 3 dans une des 4 rubriques il sera mis a mort. Sinon si un mal être est détecté il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson, la nourriture ou l'implantation d'une mini pompe sous cutanée par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Ce modèle d'étude chez la souris âgée de 8 semaines (jeune adulte) est la référence dans les pathologies psychiatriques et les métabolites d'intérêt dans ce projet sont naturellement présent chez la souris.

Rendues immunodéficientes pour qu'une tumeur humaine de cancer du sein triple négatif prenne chez elles, 132 souris de cinq à six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après l'injection des cellules tumorales, elles sont opérées pour retirer la tumeur et recevoir sous la peau une puce microfluidique, le dispositif testé, puis mesurées au pied à coulisse et pesées trois fois par semaine pendant six semaines, avec une imagerie hebdomadaire et une prise de sang toutes les deux semaines. Les métastases peuvent provoquer perte de poids, détresse respiratoire et troubles de la mobilité, et la peau sur la tumeur peut s'ulcérer ou se nécroser. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs poumons et leurs ganglions. Pour la première procédure, le porteur indique n'avoir pas pu justifier statistiquement l'effectif de 36 souris.

Objectifs

Le cancer du sein triple négatif est un sous-type particulièrement agressif du cancer du sein. Représentant environ 10 à 15 % de l’ensemble des cancers du sein, le cancer du sein triple négatif touche plus fréquemment des patientes jeunes et présente une forte propension à métastaser précocement, en particulier vers les poumons, le cerveau et les os. Malgré les avancées réalisées en oncologie, ce cancer demeure l’un des sous-types les plus difficiles à traiter en raison de sa grande hétérogénéité, du nombre limité d’options thérapeutiques ciblées et de l’apparition fréquente de résistances aux chimiothérapies conventionnelles. Au cours de la dernière décennie, de nombreux efforts ont été consacrés au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, afin d’améliorer le pronostic des patientes. Parallèlement, les progrès réalisés dans les modèles précliniques, notamment grâce a de nouveaux modèles et à l’imagerie en temps réel, ont permis d’évaluer l’efficacité de traitements expérimentaux dans des contextes biologiquement pertinents. Dans ce contexte, le présent projet vise à explorer une nouvelle approche thérapeutique ciblant ce type de cancer. L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité thérapeutique d’un nouveau dispositif médical implantable sous-cutané (puce microfluidique) dans un modèle xénogreffe de cancer du sein métastatique triple négatif. Le modèle sera suivi à l’aide d’un système d’imagerie afin d’évaluer la réponse globale au dispositif.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’efficacité d’un potentiel nouveau traitement anticancéreux plus efficace chez des patientes atteintes de cancer du sein triple négatif, étant peu ou non réceptives aux traitements de référence.

Procédures

Implantation de cellules tumorales par injection (1min). Chirurgie de résection et implantation de la puce microfluidique (10min) Mesures tumorales au pied à coulisse 3x/sem et pesées 3x/semaine (quelques secondes) jusqu’à 6 semaines après implantation. Imagerie par fluorescence (10min, 1x/semaine) Administration d’analgésique pendant quelques secondes pouvant être réalisée jusqu’à 4 fois. Prélèvements sanguins une fois toutes les deux semaines (3min).

Impact sur les animaux

Une perte de poids, une détresse respiratoire et une altération de la mobilité peuvent être envisagés suite au développement des métastases, mais les animaux seront surveillés de manière adéquate. Les animaux vont subir une intervention chirurgicale sous anesthésie afin de réséquer la tumeur et d’implanter la puce microfluidique en sous-cutané qui peut entrainer un stress. La tumeur peut à un certain volume gêner à la locomotion, et la peau au niveau de la tumeur peut potentiellement ulcérer voire nécroser. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress pendant plusieurs semaines lors de la contention et éventuellement une gêne, sensibilité au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever en post-mortem les poumons et les ganglions lymphatiques pour les analyser.

Remplacement

Plusieurs études préliminaires ont été menées in vitro pour s’assurer de l’efficacité prometteuse du traitement sur des lignées cancéreuses en culture ainsi que plusieurs étapes de vérification de caractéristiques valides pour un candidat médicament, cependant les interactions entre le métabolisme, les cellules du système immunitaire et le microenvironnement tumoral sont complexes et impactées par différents organes, ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Même si nous cherchons à développer nos modèles en impression 3D, tout ceci n’étant encore qu’à un stade très précoce et ne représentant pas totalement le microenvironnement tumoral et sa complexité, l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur métastatique ne peut, pour le moment, se faire que sur organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de mener le but de la procédure à bien. Pour la première procédure, il n’a pas été possible de justifier statistiquement les effectifs au vu de la portée exploratoire de ce développement, cependant nous nous sommes appuyés sur une revue extensive de la littérature et notre expérience pour déterminer que nous aurions besoin de 36 souris. Dans la 2e procédure, pour la comparaison des volumes tumoraux, nous utiliserons un test statistique approprié et nous avons donc besoin de 96 animaux, ce qui fait un total de 132 animaux pour les deux procédures.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet qui les pèseront plusieurs fois afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures.

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec la souris car c’est une espèce sur laquelle de nombreux modèles de cancer ont été développés, et qui permet de manipuler facilement le système immunitaire en induisant une déficience pour une meilleure prise de nos tumeurs humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Une injection d'agent mutagène, une greffe de cellules cancéreuses dans la rate ou dans la paroi du tube digestif, cinq prises de sang en 42 jours : 2 481 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements. Une partie boit un produit qui enflamme le côlon et provoque diarrhées et perte de poids d'environ 10 %, d'autres portent des tumeurs greffées sous la peau qui, selon le porteur, "généralement ne gênent pas les animaux". Le projet étudie une protéine nucléaire, Ki-67, dans les cancers du sein, colorectal et le mélanome, et renvoie d'éventuelles thérapies "à terme". Pour l'espèce, le porteur invoque des lignées génétiquement modifiées pour ce gène qui "existent uniquement chez la souris".

Objectifs

Malgré des avancées dans la prise en charge des patients, les cancers restent la première cause de mortalité prématurée. Ce projet a pour but de décrypter les rôles dans les cancers d’une protéine et à apporter une preuve de concept pour son ciblage thérapeutique. Les cellules cancéreuses doivent s’adapter pour survivre dans un environnement en dehors de leur tissu d’origine. Interférer avec leur capacité d’adaptation, présente une opportunité thérapeutique potentielle. Ceci repose sur la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents. Nos travaux récents suggèrent que notre protéine d’intérêt en est un élément clé. Nos études précédentes ont démontré qu’elle facilite plusieurs étapes de la carcinogénèse, et pourrait représenter une nouvelle classe de cible thérapeutique. Il est nécessaire de mieux comprendre ses fonctions normales et son rôle dans des cancers différents, et tester les effets de son élimination. Notre projet, qui sera réalisé chez la souris, comporte 4 volets. Nous allons : 1) Déterminer si l’élimination du gène chez la souris interfère avec (a) l’équilibre du système immunitaire, comme suggéré dans la littérature scientifique; (b) le vieillissement (un facteur de risque dans les cancers); (c) la tumorigénèse intestinale, induite de différentes façons. 2) Déterminer si l’ablation du gène directement dans les cellules cancéreuses affecte la tumorigénèse et les réponses aux traitements (chimiothérapie ou immunothérapie) dans trois modèles de cancers différents: mélanome, cancers du sein et colorectal. 3) Identifier des protéines partenaires qui affectent aussi la tumorigénèse. 4) Apporter une preuve de concept thérapeutique via une molécule qui permet d’induire la destruction d’une protéine génétiquement modifiée. A terme, ce projet pourrait permettre de développer des nouvelles stratégies thérapeutiques contre les cancers.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses s’adaptent à leur environnement, aux réponses immunitaires anti-tumorales et aux traitements, et pourrait à terme permettre le développement de nouvelles thérapies.

Procédures

Les interventions sur animaux vigiles prévues sont : 1) des injections . Celles-ci seront uniques, pour injecter un agent mutagène afin d’initier la tumorigénèse, un médicament qui agit sur des cellules cancéreuses, ou un agent qui induit la perte transitoire des cellules immunitaires. Elles durent environ 5 secondes. 2) des piqûres pour prélèvement sanguins. Celles-ci seront effectuées un total de 5 fois sur 42 jours, espacés d’au moins une semaine. Elles durent environ 1 seconde. Les procédures chirurgicales prévues sont uniques, et se font sous anesthésie général. Elles consistent en la greffe des cellules soit dans la rate, soit dans la paroi du tube digestif. La procédure dure environ un quart d’heure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont: 1) L’inflammation intestinale provoquée par la prise dans l’eau de boisson d’un produit qui induit une inflammation transitoire dans le colon. Ceci peut provoquer des diarrhées et induit également une perte de poids d’environ 10% entre les jours 6 et 9 de la procédure. Ensuite les souris reprennent très vite du poids pour revenir à leur poids initial en 3-4 jours. 2) La greffe de cellules sous la peau. Il est possible que les tumeurs, qui généralement ne gênent pas les animaux, deviennent irritantes. Si c’est le cas nous appliquerons des crèmes cicatrisantes et anti-douleur aux animaux concernés. 3) Pour les animaux greffés dans la rate ou dans la paroi du tube digestif, la chirurgie peut entraîner de la douleur ou de l’inconfort liés à l’incision et à la manipulation des organes internes, ainsi que des complications possibles telles qu’une infection, un saignement ou une inflammation locale. Les injections dans la rate peuvent parfois provoquer des lésions ou hémorragies internes, tandis que les injections dans le tube digestif peuvent fragiliser l’intestin et entraîner une infection abdominale ou des troubles digestifs. Enfin, si la suture est arrachée avant cicatrisation, il pourrait y avoir une plaie non-fermée et/ou infectée. Ces souris seront surveillées quotidiennement pour détecter des signes précoces de mal être (pelage non nettoyé, manque de vivacité, perte de poids supérieure à 10%, sur-vascularisation des tumeurs, mauvaise cicatrisation des sutures). Les animaux montrant l’un de ces signes seront suivis quotidiennement et évalués selon une échelle standard de la nuisance afin de prévoir des adaptations, et la mise à mort de l’animal sera effectuée si la nuisance est excessive.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort pour prélèvement d’échantillons.

Remplacement

Un large travail en amont pour étudier les rôles cellulaires de la protéine d’intérêt a préalablement été réalisé dans les cellules en culture. Il n’existe aucune méthode alternative au recours aux animaux pour suivre son éventuel rôle dans la production cellules sanguines, le vieillissement et la tumorigénèse.

Réduction

Nos études précédentes permettent d’estimer avec précision le nombre de souris nécessaires pour générer des données statistiquement robustes. Pour chaque procédure, une étude statistique préalable a été réalisée afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Notre pratique régulière nous permet de réduire au maximum le temps de contention et d’injection. Pour minimiser la douleur de la piqûre, l’aiguille utilisée sera très fine. Pour les prélèvements sanguins, nous utiliserons des lancettes qui possèdent une pointe fine pour une pénétration sans douleur et permettent une collecte de sang facilitée et une cicatrisation rapide. Les cages restent sous surveillance 20 minutes après toute injection pour détecter les éventuels signes de douleurs. Les animaux seront pesés une fois par semaine. Un anesthésique et un analgésique seront utilisées lors des chirurgies pour réduire la douleur. En post-chirurgie de la nourriture et de l'eau gélifiée seront posé à même le sol afin de leur permettre de se nourrir facilement. LA PRODUCTION DE MEF NÉCESSITE L'ISOLEMENT DES SOURIS MÂLES AU MAXIMUM UNE SEMAINE AVANT UN ACCOUPLEMENT. ET LES FEMELLES GESTANTES SERONT ALORS MAINTENUES SÉPARÉMENT JUSQU'AU STADE 13,5J. UN SUR-ENRICHISSEMENT EST PRÉVU POUR CES ANAIMAUX AVEC DU COTON, UN IGLOO EN CARTON ET UN BOUT DE BOIS PERMETTANT UNE MEILLEURE NIDIFICATION POUR LES FEMELLES ET EN EVITANT L'ENNUI POUR DES MÂLES. L'ENRICHISSEMENT SERA COMPLÉTÉ EN AJOUTANT DES ODEURS D'AUTRES CONGÉNÈRES (LITIÈRE LÉGÈREMENT SOUILLÉE) DANS LES CAGES DES ANIMAUX ISOLÉS. Enfin, la comparaison des observations quotidiennes des animaux avec une échelle de nuisance pré-établie permettra de prendre des décisions objectives pour soigner les animaux ou, le cas échéant, leur euthanasie si la souffrance est excessive.

Choix des espèces

Les lignées cellulaires de cancer de souris que nous avons choisi reproduisent au mieux les cancers humains. Les animaux génétiquement modifiés pour le gène de Ki-existent uniquement chez la souris, et permettent d’analyser les rôles physio-pathologiques de Ki-67. Les animaux seront utilisés à partir de 2 mois d'âge selon les protocoles établis dans la littérature, lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g. Cet âge tient compte de la maturité sexuelle nettement dépassée pour les animaux, compatible avec la description des âges des patients atteints de cancer du sein, colorectal ou mélanome.