Rongeurs

Ce projet remplit une obligation réglementaire : un test de biocompatibilité exigé par la norme ISO avant toute implantation chez l'humain du BRAIN-GUIDE, un implant cérébral censé favoriser la régénération après un traumatisme crânien. 40 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse histologique de leur cerveau. Chacun subit une chirurgie de 30 minutes sous anesthésie générale pour la pose de l'implant dans le cerveau, puis reste suivi 7 ou 91 jours, avec des risques de douleur, d'infection, d'inflammation et d'œdème. L'objectif annonce une "analyse comportementale", que les procédures ne mentionnent plus et dont aucun test n'est nommé.

Objectifs

Évaluer la réponse tissulaire locale et la biocompatibilité induite par l’implantation d'un implant régénératif dans le cerveau de rat en comparaison avec un matériau de référence contrôle à court-terme, 7 jours, et à long-terme, 91 jours, avec une analyse comportementale et histologique, selon les exigences de la norme ISO et du règlement européen en vigueur. Essai obligatoire avant toute implantation chez l'homme.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche propose une approche thérapeutique innovante destinée à favoriser la régénération cérébrale à la suite d’un traumatisme crânien. L’évaluation de la biocompatibilité du dispositif selon les exigences des normes en vigueur, permettra d’envisager son potentiel de transposition clinique. Une régénération cérébrale pourrait diminuer le handicap chez ces patients.

Procédures

L'ensemble des animaux impliqués sera soumis à 1 chirurgie sous anesthésie générale pour la pose de l'implant (durée 30 min) au niveau cérébral. La mise à mort sera réalisée pour la récupération des tissus cérébraux.

Impact sur les animaux

Nuisances inhérentes à la chirurgie : risque de douleur et de complications, inconfort, complications post-opératoires avec inflammations locales / œdèmes, risque d'infection.

Devenir

La procédure se termine par une mise à mort des animaux pour effectuer l'analyse histologique.

Remplacement

Nous n’avons pas pu trouver de tests in vitro permettant le remplacement de cette expérimentation. Les tests in vitro et in vivo d'ores et déjà réalisés sur le BRAIN-GUIDE ont servi à montrer la non-cytotoxicité, la non-irritabilité, la non-sensibilisation cutanée, la non-pyrogénicité et l'absence d'endotoxines.

Réduction

Comme l’exige le principe de Réduction, nous utilisons des petits groupes de 10 individus. La norme exige n=8 par groupe. Afin d'être sûr d'attendre ce nombre (mortalité, tumeurs spontanées), n=10 rats par groupe sont prévus. Les tests statistiques sont adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

Le principe fondamental des 5 libertés est respecté sur toute la durée de l’étude. L'alimentation est disponible en permanence, sans jeûne ni restriction alimentaire. Le suivi de l'état de santé général des animaux est assuré par le personnel de zootechnie régulièrement. Les chirurgies se font sous anesthésie, analgésie, et gel oculaire. Une attention particulière est portée aux animaux opérés, qui font l'objet d'une surveillance quotidienne par le personnel compétent. Au besoin, cette surveillance inclut l'observation de la plaie, du poids corporel, de la mobilité, de l'état du pelage et du comportement des animaux et fait l'objet d'un scoring clinique en supplément de l'évaluation prévue à 1 jour, 7 jours post-transplantation et une fois par mois jusqu’à 91 jours. La valeur du score détermine l'action à réaliser sur l'animal pour une prise en charge de la douleur, une notification de surveillance accrue, une exclusion de l'étude ou une mise à mort. La prise en charge de la douleur est mise en place avec des protocoles stricts validés, prenant en compte le principe de douleur et son impact sur les animaux et les résultats de l'étude. Un enrichissement environnemental est intégré au protocole, comprenant divers éléments pour stimuler cognitivement les rats (tunnels, boule de fouille, boule traversante), ainsi qu'une composante sociale.

Choix des espèces

Les rats adultes sont un modèle privilégié pour l'étude de la récupération fonctionnelle après lésion et greffe d’implants. Ils présentent une organisation cérébrale comparable à celle de l’humain, permettant de reproduire certains mécanismes impliqués dans diverses affections neurologiques telles que les maladies neurodégénératives, l’AVC et le traumatisme crânien : déficits sensorimoteurs handicapant les patients dans la vie de tous les jours. Ce modèle permet une évaluation des effets biologiques, qui ne peuvent être appréhendées par des méthodes in vitro.

Pour étudier le rôle du récepteur AhR dans l'appétit et la vulnérabilité à l'obésité, 420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet emploie des lignées AhR +/- et AhR -/-, et un régime riche en graisses de 15 semaines qui peut provoquer obésité, résistance à l'insuline, diabète et difficultés à se déplacer. Les souris passent des tests comportementaux sur l'émotion, la cognition et la sociabilité, avec, selon le porteur, une restriction alimentaire temporaire ou un isolement ponctuel. Comme procédure, il ne déclare pourtant qu'une prise de sang terminale, et ne nomme aucun des tests.

Objectifs

Le récepteur nucléaire d’aryl hydrocarbone (AhR) à des substances étrangères et propres à l’organisme, participe dans la régulation du métabolisme énergétique et des réponses immuno-inflammatoires, mais reste plutôt méconnu d’un point de vue comportemental. L’activité d’AhR au niveau oral a été liée à des modifications de la prise alimentaire, et semblerait influencer l’appréciation des aliments et en particulier des lipides. Ce projet vise à étudier la contribution de ce récepteur à la perception des récompenses alimentaires et à l’appétit afin de mieux comprendre son rôle dans la vulnérabilité à l'obésité. L’AhR est ainsi porposé comme une cible prometteuse dans la lutte de cette maladie, dans la perspective d’ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet devraient permettre (1) d’établir les rôles d’AhR au niveau cérébral et intestinal pour mieux comprendre son implication dans des troubles comme l’anxiété ou la dépression, provoqués par une alimentation trop riche en graisses ; et (2) de déterminer comment des polluants environnementaux influençant l’activité d’AhR participent à la vulnérabilité à l’obésité.

Procédures

Un prélèvement sanguin en terminal sera effectué sous analgésie et anesthésie, et durera moins d’une minute, sur 420 animaux.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux permettent d’étudier les aspects émotionnels, cognitifs et sociaux des animaux. Bien qu’ils puissent causer un stress léger (lié à une restriction alimentaire temporaire ou à un isolement ponctuel pendant les tests), toutes les précautions sont prises pour limiter cet impact : habituation progressive des animaux aux manipulations, environnement contrôlé (température, luminosité, bruit réduit). La durée du régime (15 semaines) qui sera appliquée permet de mettre en place une obésité et potentiellement de provoquer une insulino-résistance et un diabète chez les animaux (temporalité variable et variabilité individuelle importante). Les animaux en régime hyperlipidique peuvent également avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Une surveillance continue permettra détecter tout signe de détresse. De plus, les animaux sous régime riche en graisses bénéficieront d’un accès facilité à la nourriture et à l’eau pour limiter les inconforts, et l’ajout d’enrichissement dans les cages permettra d’améliorer leur qualité de vie. En fin de l’étude, les animaux seront mis à mort de manière indolore (en moins d’une minute), sous anesthésie et analgésie, conformément aux normes éthiques européennes.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Ce projet est couplé à une approche en culture cellulaire (méthode in vitro sans recours aux animaux) pour étudier finement le mécanisme d’action d’AhR, ainsi qu’une approche sur modèle souris, indispensable pour analyser des processus physiologiques complexes impliquant plusieurs organes (cerveau, langue, intestin, tissu adipeux, foie, rate et pancréas). Bien que la culture cellulaire permette de réduire l’utilisation d’animaux, le modèle souris reste nécessaire pour une approche intégrée, notamment pour évaluer les interactions entre ces organes et déterminer l’implication d’AhR dans la vulnérabilité à l’obésité.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au strict nécessaire, tout en permettant d’obtenir des résultats fiables et scientifiquement valables. Pour définir cet effectif, un outil en ligne gratuit a été utilisé afin d’aider à concevoir l’étude de manière rigoureuse. Par ailleurs, des travaux antérieurs ont montré qu’un groupe de 15 animaux permettait d’obtenir des résultats statistiquement pertinents. Les données seront analysées au fur et à mesure de l’étude, afin de pouvoir arrêter les expérimentations dès que le nombre d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables sera atteint, limitant ainsi l’utilisation d’animaux au minimum indispensable.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes afin de préserver les interactions sociales naturelles, dans des cages transparentes adaptées et enrichies pour favoriser leur bien-être. Leur état général sera contrôlé quotidiennement. Dans le respect de la règle des 3R et des principes éthiques de l’expérimentation animale, des méthodes non invasives et des tests comportementaux sont privilégiés. Les animaux seront habitués progressivement à une manipulation douce afin de limiter le stress. En cas de signes de détresse ou de dégradation de l’état général, les animaux seront immédiatement retirés de l’étude, replacés dans leur cage de vie avec un accès libre à l’eau et à la nourriture, et surveillés quotidiennement. Si leur état venait à se détériorer de manière irréversible et à atteindre un seuil limite prédéfini, ils seraient retirés définitivement des expérimentations et mis à mort afin d’éviter toute souffrance inutile. Toutes les interventions seront réalisées par un personnel formé et qualifié, en nombre limité, garantissant un suivi attentif et individualisé des animaux.

Choix des espèces

De nombreuses études portant sur la thématique du projet ont déjà été réalisées chez la souris, qui constitue un modèle de référence largement utilisé pour l’étude de l’obésité et des organes associés. Le modèle AhR +/- et AhR -/- permet de comparer les résultats obtenus avec ceux déjà disponibles dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, car les systèmes biologiques étudiés doivent être pleinement développés. Cet âge permet d’éviter à la fois la période de puberté et les altérations physiologiques liées au vieillissement.

Injection de cellules cancéreuses, chimiothérapie, sept injections d'immunothérapie, dix jours de thérapie ciblée par la bouche, puis ablation chirurgicale de la tumeur : 448 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le protocole reproduit le parcours de patientes et patients atteints de cancer du sein triple négatif ou du poumon, pour étudier la rechute métastatique après chirurgie. Après l'opération, les métastases peuvent provoquer dyspnée, douleurs osseuses, paralysie ou détresse respiratoire progressive. La dyspnée ou la paralysie déclenche la mise à mort, le porteur parlant de "point final strict".

Objectifs

Les traitements néoadjuvants à base d’immunothérapie sont désormais couramment utilisés pour les cancers du sein triple négatif (CSTN) et le cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) de stade II/III. Le projet vise à développer deux modèles précliniques murins permettant d’évaluer l’efficacité et les mécanismes d’action des combinaisons chimiothérapie‑immunothérapies administrées avant chirurgie, puis en traitement adjuvant, afin de mieux reproduire le parcours clinique des patients et d’étudier la rechute métastatique post‑exérèse. Le laboratoire dispose déjà des modèles 4T1 (CSTN) et CMT‑167 (CBNPC), capables de générer des métastases après injection mammaire ou sous‑cutanée. Ces modèles permettent d’administrer un traitement néoadjuvant sur tumeur établie, de procéder à son ablation, puis de suivre l’impact d’un traitement adjuvant sur la survenue métastatique. Le critère principal d’évaluation est la survie sans progression métastatique. L’équipe maîtrise l’administration des traitements et l’analyse des réponses immunitaires, mais doit désormais intégrer une étape chirurgicale standardisée pour modéliser la prise en charge clinique et étudier la maladie résiduelle minimale. Le premier objectif consiste à développer, optimiser et valider une procédure d’exérèse complète de la tumeur primaire dans des modèles immunocompétents, condition essentielle pour étudier les mécanismes de rechute après traitement néoadjuvant. Le deuxième objectif est d’évaluer l’impact de différentes combinaisons thérapeutiques néoadjuvantes à base d’immunothérapie sur la dynamique de la rechute métastatique après chirurgie, grâce à un suivi longitudinal de la charge métastatique et de la survie sans rechute. Le troisième objectif vise à caractériser les réponses immunitaires induites par les traitements et modulées par la chirurgie, via des analyses multiparamétriques des tumeurs, organes lymphoïdes et sites métastatiques, afin d’identifier les mécanismes associés à la rechute ou à la protection. Enfin, le projet ambitionne d’identifier des biomarqueurs prédictifs de rechute ou de réponse durable pour guider le développement de futures stratégies néoadjuvantes et renforcer la translation clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer deux modèles précliniques particulièrement pertinent pour étudier l’impact réel des traitements néoadjuvants/adjuvants sur la dynamique métastatique, en intégrant dans un même protocole : une phase de chimiothérapie‑immunothérapie néoadjuvante, une chirurgie d’exérèse de la tumeur primaire, une immunothérapie adjuvante et un suivi post‑opératoire permettant d’évaluer la rechute métastatique. Ces modèles reproduisent de manière fidèle le parcours thérapeutique des patients atteints de cancers du sein triple négatif ou de cancers du poumon présentant des cancers localement avancés, deux pathologies caractérisées par un risque élevé de dissémination tumorale et de récidive métastatique. L’un des bénéfices majeurs attendus est une compréhension des mécanismes biologiques et immunologiques qui déterminent la réponse ou la résistance aux traitements néoadjuvants et d’évaluer l’intérêt de poursuivre ou non une immunothérapie adjuvante. Les analyses multiparamétriques réalisées sur les tumeurs primaires, les tissus métastatiques et les organes lymphoïdes permettront d’identifier les populations immunitaires modulés par les traitements et impliquées dans les mécanismes d’échappement favorisant la progression métastatique après chirurgie. Ces données sont essentielles pour optimiser les combinaisons thérapeutiques et mieux cibler la maladie résiduelle minimale, principal moteur des rechutes. Le projet permettra également d’identifier des biomarqueurs prédictifs de réponse ou de rechute métastatique, qu’ils soient immunologiques, transcriptomiques ou histologiques. Ces biomarqueurs pourront être transposés à la clinique pour améliorer la stratification des patients, guider le choix des traitements néoadjuvants et affiner les indications des thérapies adjuvantes. L’évaluation de la survie sans rechute métastatique (SSRM), rarement étudiée dans les modèles précliniques, constitue un autre bénéfice important, car elle reflète directement l’efficacité des stratégies thérapeutiques sur la dissémination tumorale. Enfin, ces modèles permettront de tester de nouvelles combinaisons thérapeutiques basées sur des immunothérapies néoadjuvantes. Il contribuera à accélérer le développement de stratégies innovantes visant à réduire la rechute métastatique, principal facteur de mortalité dans ces cancers agressifs.

Procédures

- Injection sous-cutanée des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 10 minutes - Traitements par chimiothérapie (intrapéritonéal i.p.) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 20 secondes - Traitements par immunothérapie (i.p.) : - Geste réalisé sur animal vigil - 7 injections par animal - Durée : 20 secondes - Traitements par thérapie ciblée (p.o) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une administration quotidienne pendant 10 jours consécutifs par animal - Durée : 20 secondes - Traitements par chirurgie (p.o) : - Geste réalisé sur animal anesthésiés - Durée : 20 minutes - Suivi à l’IVIS : - Geste réalisé sur animal vigil : injection i.p de luciférine (substrat luciférase) 20 secondes - Geste réalisé sur animal anesthésiés : analyse à l’imageur IVIS Durée : 5 minutes

Impact sur les animaux

Le projet utilise deux modèles murins métastatiques (4T1 et CMT‑167) associés à des traitements néoadjuvants, une chirurgie d’exérèse et un suivi de la progression métastatique. Ces étapes peuvent entraîner des nuisances dont l’intensité varie selon la phase expérimentale. 1. Implantation tumorale et croissance de la tumeur primaire L’injection orthotopique (4T1‑Luc) ou sous‑cutanée (CMT‑167‑Luc) peut provoquer une douleur transitoire, un stress léger, un faible risque d’hématome ou d’inflammation. La croissance tumorale (J0–J16) peut induire douleur locale, inflammation, sensibilité cutanée, réduction d’activité et gêne locomotrice lorsque la tumeur augmente de volume. Le modèle 4T1‑Luc présente une croissance rapide et inflammatoire ; le modèle CMT‑167‑Luc entraîne une gêne mécanique plus progressive. 2. Effets indésirables des traitements néoadjuvants Les chimiothérapies et immunothérapies (J9–J16) peuvent induire : – Toxicités hématologiques : leucopénie, anémie, thrombopénie, immunosuppression, fatigue et susceptibilité accrue aux infections. – Toxicités digestives : anorexie, baisse de prise hydrique, perte de poids (

Devenir

À l’issue de chaque procédure, le sort des animaux est déterminé en fonction des objectifs scientifiques, des critères d’arrêt prédéfinis et du respect strict du bien‑être animal. Dans ce projet, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de leur participation, car les modèles utilisés (4T1 et CMT‑167) impliquent une progression tumorale et métastatique incompatible avec un maintien en vie sans souffrance. Les analyses prévues nécessitent également la collecte d’organes (poumons, foie, rate, ganglions, tumeur résiduelle) pour l’étude de la maladie résiduelle minimale, de la réponse immunitaire et de la dissémination métastatique, ce qui impose une euthanasie programmée. Les animaux atteignant un critère d’arrêt clinique avant la fin de la procédure (perte de poids, altération de la locomotion, détresse respiratoire, score métastatique critique) seront euthanasiés immédiatement afin d’éviter toute souffrance prolongée. Cette euthanasie anticipée est intégrée dans le plan expérimental et ne modifie pas les effectifs prévus. Aucun animal ne pourra être réutilisé, réhabilité ou replacé, car les traitements anticancéreux, la chirurgie et la progression métastatique entraînent des altérations physiologiques majeures incompatibles avec une réutilisation dans un autre protocole ou une adoption. L’ensemble des euthanasies sera réalisé par surdosage d’anesthésique, conformément aux recommandations réglementaires, garantissant une mort rapide et indolore.

Remplacement

Aucune alternative in vitro ou in silico ne reproduit la complexité tumorale, les interactions immunitaires ni la dynamique métastatique. Malgré leur apport, ces approches ne remplacent pas un organisme entier, indispensable pour étudier métastases, immunité, traitements, chirurgie et assurer la pertinence translationnelle.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux repose sur une planification précise, l’usage maximal de données existantes, la standardisation des procédures et des approches longitudinales. Les modèles alternatifs sont utilisés dès que possible, et des critères d’arrêt stricts limitent toute utilisation inutile.

Raffinement

Le raffinement repose sur la compétence du personnel, l’optimisation des procédures, un hébergement enrichi et un suivi clinique strict. Anesthésie, analgésie, gestes maîtrisés et surveillance continue réduisent douleur, stress et complications, garantissant un bien‑être maximal. Nous aurons aussi recours à des points limites spécifiques et précoces.

Choix des espèces

Les modèles murins choisis reposent sur une expertise solide et de longue date du laboratoire, qui maîtrise parfaitement les lignées BALB/c et C57BL/6 ainsi que leurs modèles tumoraux syngéniques associés. La souris est l’espèce la plus pertinente pour ce projet, car elle permet de travailler dans un système immunitaire pleinement fonctionnel, indispensable pour évaluer l’impact des immunothérapies, des thérapies ciblées et de la chirurgie sur la maladie résiduelle minimale et la rechute métastatique. Les modèles 4T1 et CMT‑167 sont parmi les plus robustes et les mieux caractérisés pour reproduire respectivement le cancer du sein triple négatif et le cancer du poumon métastatique. Leur cinétique tumorale, leur microenvironnement immunitaire et leur comportement métastatique sont connus du laboratoire, garantissant une interprétation fiable des résultats et une réduction maximale de la variabilité expérimentale. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 8 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Âgées de 20 à 25 jours, elles reçoivent sous anesthésie une injection de virus dans le cerveau, au cours d'une chirurgie d'une heure à une heure trente, puis sont mises à mort vers 40 à 45 jours pour découper leur cerveau en tranches. Ces tranches servent à étudier le rôle du claustrum dans les ondes lentes du sommeil, avec des retombées sur l'épilepsie ou la mémoire renvoyées au long terme. Le porteur affirme que l'étude, menée post-mortem, "évite toute souffrance pour l'animal", alors qu'il liste lui-même douleur opératoire ou post-opératoire, dépression respiratoire et risque d'infection liés à la chirurgie.

Objectifs

Le sommeil lent, caractérisé par des ondes lentes et de grande amplitude, est essentiel à la consolidation de la mémoire et à la régulation des fonctions cérébrales. Le claustrum, structure cérébrale connectée à l’ensemble du cortex, est suspecté de jouer un rôle clé dans la coordination de ces ondes lentes, mais les mécanismes neuronaux sous-jacents restent à élucider. La réalisation de notre projet implique de mesurer et contrôler l’activité neuronale avec une résolution spatiale et temporelle qu’il n’est pas possible d’atteindre avec les méthodes non invasives classiquement utilisées chez l’homme. Nous souhaitons donc utiliser le cerveau murin et plusieurs stratégies complémentaires pour étudier l’activité neuronale du cortex et des structures cérébrales profondes à plusieurs échelles allant du neurone unique, jusqu’aux réseaux de neurones. Ces différentes techniques sont appliquées sur des réseaux neuronaux réduits, maintenus ex vivo. En effet, les approches in vivo actuelles chez la souris rencontrent des limites pour disséquer les interactions neuronales fines impliquant le claustrum, qui est une structure cérébrale particulièrement petite et difficile d’accès. Pour pallier à cette difficulté, nous avons développé une approche en tranches de cerveau ex vivo chez la souris qui permet de rejouer les activités du sommeil lent hors de l’animal, et ce pour la première fois simultanément dans le claustrum et le cortex cérébral. Jusqu’à ce jour, nous identifions la localisation anatomique du claustrum dans la tranche grâce aux atlas de cerveau de rongeurs mais une confirmation plus précise est nécessaire et demande une injection intracérébrale chez l’animal vivant. Cette approche permettra de réaliser deux objectifs : 1) confirmer la localisation anatomique du claustrum à l’intérieur des tranches de cerveau de souris ex vivo 2) utiliser ces mêmes outils afin de mesurer et contrôler l’activité de neurones du claustrum projetant vers le cortex et ainsi étudier les interactions claustrocorticales dans le cadre de la génération des rythmes lents du sommeil. La compréhension de ces mécanismes physiologiques permettra également à terme de mieux comprendre des états altérés comme l’épilepsie et l’anesthésie.

Bénéfices attendus

Bénéfices à court terme : Nos travaux ont permis de mettre en évidence une activité cérébrale impliquée dans le sommeil jusqu'à présent inconnue dans une région du cerveau appelée le claustrum. Ce projet permettra de valider une nouvelle approche expérimentale qui réduit fortement le nombre d'interventions réalisées sur les animaux. Des tissus prélevés feront l’objet de l’étude, ce qui limite les manipulations sur les animaux vivants tout en permettant d'obtenir des résultats fiables. Cette approche permettra : • D’identifier avec précision certains neurones du claustrum grâce à des marqueurs fluorescents qui les rendent visibles au microscope. • D’identifier les neurones du claustrum en contrôlant leur activité à l'aide de stimulations lumineuses ce qui permettra de mieux comprendre leur fonctionnement. Bénéfices à long terme : L'objectif principal du projet est de mieux comprendre la physiologie du cerveau pendant le sommeil, en particulier la participation du claustrum dans la genèse des oscillations du sommeil lent et dans la mémorisation. Nous étudierons comment ces mécanismes sont altérés dans des situations telles que : l'épilepsie, l'anesthésie ou durant l'action de médicaments. Ce travail réunit des experts en neurophysiologie et en modélisation et cela pour développer des modèles informatiques du cerveau entier intégrant les connaissances acquises dans notre projet. Ces modèles permettront de mieux comprendre comment le claustrum participe à la coordination de l'activité cérébrale pendant le sommeil. Retombées scientifiques et médicales : Les connaissances obtenues pourront ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques, notamment sur l’épilepsie et les troubles de la mémoire. Elles amélioreront les modèles informatiques du cerveau utilisés pour mieux comprendre ces maladies et à plus long terme, favoriseront le développement d’approches thérapeutiques ciblées novatrices. Diffusion des résultats : Les résultats seront diffusés sous la forme d'articles publiés dans des revues scientifiques et présentés lors de congrès nationaux et internationaux. Des rencontres scientifiques seront également organisées pour promouvoir les échanges entre les équipes de recherche travaillant sur cette région du cerveau. Soutenu par l'Agence nationale de la recherche, ce projet contribuera au développement de collaborations interdisciplinaires et à une meilleure compréhension du fonctionnement du cerveau.

Procédures

Dans ce projet chaque animal recevra une injection intracérébrale sous anesthésie générale. La durée totale de l’intervention sera de 1h à 1h30 maximum.

Impact sur les animaux

La seule procédure expérimentale utilisée dans ce projet est une chirurgie permettant l’injection stéréotaxique de virus qui peut, en théorie, avoir quelques effets indésirables sur le bien-être des animaux. Les principaux effets indésirables identifiés sont les suivants : 1) Risques liés à l’anesthésie : Dépression respiratoire ou cardiaque, hypothermie, impact sur le tractus digestif ; 2) Douleur opératoire ou post-opératoire ; 3) Suture qui s’ouvre et/ou infection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vue de prélèvement pour des expériences Ex Vivo.

Remplacement

Notre projet vise à étudier le fonctionnement des neurones du claustrum au cours d’oscillations globales de l’activité du réseau cérébral. A part l’injection stéréotaxique préalable, cette étude est entièrement réalisée post-mortem sur des réseaux neuronaux isolés maintenus In Vitro, ce qui évite toute souffrance pour l’animal. En effet, les expériences sont menées sur des tranches de cerveau maintenues en conditions physiologiques, sans intervention invasive sur l’animal vivant. Alternatives non animales en neurosciences : • Approches computationnelles (simulations par ordinateur) et in vitro (culture cellulaire, organoïdes cérébraux) existent, mais elles ne permettent pour l’instant pas de reproduire fidèlement la complexité des réseaux neuronaux du claustrum. • Approche In Vitro : Bien que nécessitant la mise à mort d’un animal, cette approche permet d’étudier le claustrum en maintenant la complexité des interactions neuronales et donc une fidélité biologique supérieure aux modèles de neurones en cultures In Vitro. Justification de l’utilisation d’animaux : • Nécessité technique : Il n’est pas possible de cibler spécifiquement les neurones de projection du claustrum sans l’utilisation d’animaux vivants, seul système permettant la migration du matériel génétique injecté vers les neurones d’intérêt qui seront ainsi visualisables au bout de 3 semaines. • Intégration dans des modèles computationnels : Ce qui justifie nos travaux en électrophysiologie sur des réseaux biologiques intacts est que ces derniers permettent d’obtenir des données expérimentales robustes en conditions physiologiques réelles. Ces données seront ensuite utilisées comme base pour paramétrer le plus fidèlement possible le fonctionnement du claustrum dans des travaux de modélisation à grande échelle (modèle de cerveau virtuel) qui représenteront une alternative de remplacement.

Réduction

Notre projet claustrum comprend déjà des mesures pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans nos expériences qui seront maintenues dans le cadre de cette demande d’autorisation de projet. Ainsi lors de nos expériences, les tranches de claustrum prélevées sur un animal, sont partagées pour une utilisation en parallèle par deux chercheurs utilisant chacun leur propre poste expérimental d’électrophysiologie In Vitro. Ceci nous permet de réduire le nombre de souris utilisées en maximisant ainsi l’obtention des résultats. Par ailleurs, la reproduction des souris transgéniques utilisées pour ce projet n’étant pas complètement contrôlable, nous obtenons parfois des portées plus larges que nécessaire pour notre expérimentation. Dans ce cas, avant de mettre à mort les animaux en surnombres, ces derniers sont plutôt proposés pour une utilisation dans d’autres protocoles expérimentaux. Enfin, l’utilisation de notre technique d’enregistrement extracellulaire multiples (64 enregistrements en parallèles) reste plus facile à mettre en œuvre que les enregistrements intra-cellulaires et autorise de ce fait, une utilisation d’animaux qui peuvent être plus âgés. Cette stratégie, même si elle a ses limites, permet donc d’utiliser une portée beaucoup plus longtemps et d’avoir moins d’animaux en accouplement, ce qui réduit le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

• Utilisation d’une anesthésie gazeuse contrôlée et d’une analgésie locale est systémique pour minimiser la douleur pendant et après l’injection de virus. • Protection oculaire avec du gel ophtalmique (Ocry-gel) pendant l’injection de virus pour éviter le dessèchement. • Aide à la régulation thermique : tapis chauffant avec thermostat pendant la chirurgie et lampe chauffante au réveil. • Administration d’un bolus de NaCl 0,9 % tiédi (10 mL/kg, voie sous-cutanée) en post-opératoire pour compenser les pertes hydriques après la chirurgie. • Surveillance rigoureuse de la température corporelle, de la respiration, et du comportement postopératoire et suivi quotidien du bien-être des animaux par un personnel qualifié. • Enrichissement environnemental (matériel de nidification, lampe chauffante) pour réduire le stress. • Hébergement social avec congénères (sauf en cas de comportement de dominance agressive) dans la limite du nombre maximum d’individus par cage, pour éviter l’isolement.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est la souris car le projet requiert un modèle animal possédant une structure neuroanatomique proche de celle du cerveau humain. En particulier, le claustrum et les zones corticales qui en sont la cible (ex : cortex insulaire, cortex rétrosplénial). Les souris doivent recevoir l’injection de virus entre 20 et 25 jours après la naissance ce qui permet le prélèvement de leur cerveau pour les expériences ultérieures In Vitro vers 40 à 45 jours soit, après la vingtaine de jours nécessaire à l’expression du matériel génétique injecté. Les injections de virus ne seront pas réalisées sur les animaux de plus de 30 jours.

1 100 souris mâles âgées de 15 à 18 mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Chacune subit une chirurgie du crâne pour recevoir une injection de protéine Tau, puis un traitement quotidien, une prise de sang par mois et des tests comportementaux du troisième au quinzième jour, isolée en cage individuelle pendant cette phase. Ces tests doivent mesurer des déficits de mémoire, sans que le résumé dise lesquels. La protéine injectée peut provoquer pertes de mémoire et agressivité, et le recours à des souris âgées peut augmenter la mortalité. Le porteur écrit qu'il paraît "indispensable de développer de nouveaux médicaments", et les bénéfices tiennent en une phrase : le projet "pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre la MA".

Objectifs

Dans le monde, les maladies neurodégénératives touchent 55 millions de personnes avec plus de 10 millions de nouveaux cas par an. Elles sont la 7ème cause de décès et la première cause d’invalidité et de dépendance chez les personnes âgées. Parmi elles, la maladie d’Alzheimer (MA) représente 60 à 70% des cas. La MA, est une maladie du sujet âgé, dont le premier facteur de risque est le vieillissement. Actuellement, seuls des traitements à visée symptomatique sont disponibles ; c’est-à-dire qu’ils ne traitent pas la maladie mais masquent certains déficits comportementaux. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre la MA.

Procédures

L'ensemble des animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du crâne afin de pouvoir injecter la protéine pour induire la maladie d’Alzheimer. Cet acte chirurgical durera 15 minutes sous anesthésie générale. Un traitement quotidien sera administré sur animaux vigiles. Un prélèvement sanguin au maximum une fois par mois sera réalisé sur animaux vigiles. Des séries de tests comportementaux, s'étalant de J3 à J15 post-induction de la MA, seront réalisés pour une durée totale de 30 minutes maximum par jour, afin de mesurer les déficits de mémoire liés à la MA. Enfin, à la fin du projet, le cerveau sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

L’hébergement en cage individuelle des animaux durant la phase d'évaluation comportementale peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes. L’induction de la pathologie Alzheimer peut conduire à une perte de mémoire et une agressivité. La chirurgie peut conduire à une légère perte de poids transitoire (de 48 à 72h). La mortalité peut se trouver légèrement augmentée de par le recours à des souris âgées pour mimer au mieux la MA. Les séries de prélèvements sanguins s’effectueront sur souris vigiles en moins d’une minute tout au long de l’étude.

Devenir

Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin de l’étude, c’est-à-dire à la fin de la procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale), afin de récupérer le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

La MA est une pathologie qui touche de façon très intégrée le système nerveux central et altère les fonctions cognitives et comportementales des patients. L’hypothèse que nous posons vise à identifier le potentiel thérapeutique de certains produits pouvant conduire à l’amélioration des troubles cognitifs et comportementaux. A ce niveau d’intégration, seuls des tests in vivo sur animaux vigiles peuvent répondre à cette question. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in vitro et in silico ne permettent pas à l’heure actuelle de prédire l’efficacité d’un traitement sur l’amélioration de troubles cognitifs. De plus, le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux dans la propagation des protéines altérées dans le cerveau ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez la souris. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Sur la base de notre expérience de ce modèle, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations neuroanatomiques post-mortem (propagation de la protéine notamment). Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles et isolés de tous bruits extérieurs, avec plusieurs enrichissements (tunnel, brique d’Aspen et papier kraft), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie pré-opératoire, anesthésie générale, maintien de la température corporelle, désinfection, anesthésie locale du site d’incision, gel ophtalmique pour prévenir de la déshydratation de la cornée) ainsi qu’après (analgésie post-opératoire). Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une grande résistance et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant l’intégralité du projet : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des souris mâles C57BL6J âgées de 15 à 18 mois à l’arrivée au laboratoire. La souris est l’espèce animale qui a été et est encore la plus étudiée dans le domaine des maladies neurodégénératives notamment dans le cadre de développement de médicaments. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les performances de mémoire et les effets d’un médicament sur le développement dans la MA. Il est admis que l’âge est un élément crucial dans le développement de la MA, dans ce contexte, l’utilisation de souris âgées de 15 à 18 mois afin de prendre en compte le facteur vieillissement est primordial.

Une dose unique de rayonnements allant jusqu'à 17 Gy, sous anesthésie, sert à provoquer une fibrose des poumons, suivie d'une instillation dans la trachée et d'injections abdominales trois fois par semaine jusqu'à la huitième semaine. 330 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leurs organes. Le résumé évoque ailleurs des "séances fractionnées de radiothérapie", alors que les procédures décrivent une dose unique, et affirme qu'elles "n'induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal". Le porteur présente la fibrose pulmonaire humaine comme "irréversible et mortelle", et ne décrit aucun effet de la fibrose induite chez les souris, suivies pendant douze semaines.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une pathologie irréversible et mortelle. Récemment, il a été retrouvé une augmentation significative du taux de mutations dans le poumon des patients atteints de FPI par rapport à des témoins appariés selon l'âge et les antécédents tabagiques. Nous faisons l’hypothèse que ces mutations pourraient jouer un rôle actif dans la progression de la maladie. À cette fin, nous proposons d'utiliser les radiations comme méthode contrôlée pour induire une instabilité génétique et des mutations somatiques dans les tissus pulmonaires. La fibrose pulmonaire murine induite par irradiation est un modèle prometteur validé pour étudier la fibrogenèse pulmonaire. Ce modèle reproduit plusieurs caractéristiques observées dans la FPI, en termes de sénescence de profil inflammatoire tout en induisant une instabilité génomique. Ce modèle est particulièrement bien valide chez les souris C57BL/6. Leur prédisposition génétique à la fibrose, combinée à la capacité du modèle à mimer la maladie humaine les rend particulièrement adaptées à la recherche dans ce domaine. L’objectif général de ce projet est d’explorer l'impact des radiations sur les signatures transcriptomiques cellulaires dans les conditions fibreuses et à identifier les motifs de mutations somatiques associés à ces modifications.

Bénéfices attendus

Ce projet a le potentiel de faire progresser de manière significative la compréhension et le traitement de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) en élucidant la relation entre l’instabilité génomique induite par irradiation et la fibrogenèse pulmonaire. Grâce à notre système analytique avancé, nous visons à caractériser les interactions dynamiques entre l’instabilité génomique et les changements au sein des sous-populations cellulaires qui contribuent à la fibrose, fournissant ainsi des informations cruciales sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la progression de la maladie. De plus, en combinant un modèle de maladie robuste avec des analyses génomiques de pointe, ce projet augmente la probabilité d’identifier des mutations clés, des biomarqueurs et des cibles thérapeutiques pouvant être validés dans des cohortes de patients. À terme, ce travail vise à réduire l’écart entre les modèles expérimentaux et la réalité clinique, facilitant la découverte de nouveaux biomarqueurs et interventions susceptibles d’améliorer la prise en charge et le traitement de la FPI. En cas d’identification d’une cible thérapeutique innovante un nouveau bras sera inclus pour tester et comparer son efficacité au groupe placebo et au traitement de référence. Toutes les données générées au cours du projet seront mises à disposition de manière ouverte.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Irradiation (sous anesthésie générale) : 17 Gy maximum en une unique dose : 10 minutes maximum par animal. - Injection intrapéritonéale de traitemant anti fibrosant (animal vigile) : 3 fois par semaine, 7 jours après l’irradiation et jusqu’à la semaine 8 -Instillation intratrachéale (sous anesthésie générale) : 1 fois au temps du traitement : 10 minutes maximum par animal.

Impact sur les animaux

Les séances fractionnées de radiothérapie et les séances d’imagerie n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal, un autre point limite est ainsi défini par une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations / min lors de l’irradiation. S’il est atteint, le pourcentage d’anesthésique sera légèrement diminué et si la fréquence n’augmente pas à nouveau, la procédure sera arrêtée. Cette fréquence est mesurée en continu par un ballonnet abdominal, ce qui nous permet d’être très réactif. Ces nuisances sont très courtes de moins d’une minute. La nuisance est considérée comme modérée. Les instillations intratrachéales seront effectuées sous anesthésie. La pesée de l’animal sera effectuée pour un dosage adéquat des traitements à administrer et pour le suivi postopératoire. Une source de chaleur (tapis chauffant, lampe) sera mise en place pour éviter l’hypothermie. Les fréquences respiratoires et cardiaques seront surveillées afin de suivre la profondeur d’anesthésie. Une injection de morphinique sera réalisée 20 minutes avant l’instillation. La nuisance est considérée comme modérée. Le traitement anti fibrosant est validé dans le cadre d’essai contrôle randomisé chez l’homme et qui a l’avantage de présenter un très bon profil de tolérance.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer des organes pour analyses post-mortem.

Remplacement

L’utilisation des souris dans cette étude est essentielle en raison des défis importants liés à l’obtention de tissus pulmonaires humains et des limitations des méthodes alternatives. Les échantillons pulmonaires humains sont rares, proviennent souvent de patients atteints de maladies à un stade terminal, et ne permettent pas des études longitudinales contrôlées nécessaires pour examiner la progression de la fibrose pulmonaire ou le rôle des mutations somatiques. Bien que les modèles in vitro offrent des informations précieuses, ils ne peuvent reproduire les interactions systémiques et immunitaires complexes indispensables à une compréhension complète de la progression de la fibrogènèse. Le modèle murin constitue une alternative fiable et cliniquement pertinente, reflétant de manière rapprochée les réponses physiologiques et pathologiques humaines à l’irradiation ionisante. Il permet l’étude des mécanismes génétiques et moléculaires, ainsi que l’évaluation préclinique de thérapies potentielles, dans un environnement standardisé et reproductible.

Réduction

Grâce à l'utilisation au préalable de tests statistiques appropriés et à l'utilisation de techniques d'investigation non invasives (scanner thoracique), le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une puissance des résultats sera réduit au minimum. Chaque animal subira ces examens non invasifs de façon séquentielle (suivi longitudinal pendant 12 semaines post-irradiation), ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, pour analyser les résultats de l'étude, des tests statistiques et des corrélations entre les paramètres mesurés seront réalisés. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculé est un nombre maximal. Ainsi, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront mis en groupe sociaux (4 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes Européennes. Ils auront un temps d’adaptation (au minimum 7jours) avant toute expérimentation et ils bénéficieront également d’enrichissement via des stimulations sensorielles par différents objets disposés dans les cages. Tout au long du protocole, un personnel compétent surveillera les animaux afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée au maximum 3 fois par semaine. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriées et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle idéal pour étudier la fibrose pulmonaire induite par les radiations (RIPF) en raison de leur prédisposition génétique à développer une fibrose après une exposition aux radiations ionisantes . Leur susceptibilité est bien documentée, des études montrant une augmentation du dépôt de collagène et des niveaux élevés de cytokines liées à la fibrose, après exposition aux radiations. Il est important de noter que leur capacité à reproduire étroitement la progression de la maladie humaine et la réponse aux traitements renforce encore leur pertinence dans ce domaine. De plus, les souris présentent des réponses inflammatoires et immunitaires robustes, essentielles dans la pathogenèse de la fibrose. Dans l’ensemble, ces caractéristiques font des souris un modèle cliniquement pertinent et reproductible pour étudier les mécanismes de la RIPF.