Rongeurs

2 248 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau ou dans le côlon, certaines une chirurgie d'imagerie sous anesthésie sans réveil, pour analyser la réponse immunitaire et le mode d'action d'immunothérapies anticancéreuses. Le porteur indique attendre peu d'effets de la tumeur sous-cutanée et fixe la mise à mort au dépassement d'un volume tumoral limite. Les bénéfices avancés pour les patients sont renvoyés au moyen et long terme, tandis que les souris reçoivent d'emblée des cellules tumorales et ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de s’appuyer sur l’imagerie d’animaux entiers afin (1) d’analyser l’organisation de la réponse immunitaire anti-tumorale et (2) d’identifier le mode d'action des traitements cancéreux ainsi que de leurs répercussions sur l’organisme. Pour cela nous tenterons d'identifier le rôle de chacune des populations cellulaires retrouvées au sein d'une tumeur (ex. les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes T). Nous tenterons d'évaluer leur contribution directe ou indirecte sur l’efficacité de l’immunothérapie. Enfin, nous souhaitons mettre en lumière les limitations de ces thérapies afin d’apporter de nouvelles hypothèses de travail pour l’amélioration des traitements. En résumé, ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’utilisation des immunothérapies dans les cancers primaires de la peau et du colon pour ainsi contribuer, au moyen/long terme, à l’amélioration de la prise en charge des patients en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettra d’apporter des connaissances essentielles sur le mode d’action d’immunothérapies actuellement utilisées en clinique ou en cours de développement pour le traitement des cancers solides (ex : cancer du sein, de la peau, du colon, lymphome de la peau etc) et pour lesquelles une majorité des patients rechutent ou ne répondent pas. Comprendre les raisons pour lesquelles ces immunothérapies guérissent seulement une petite fraction des patients est alors primordial afin d’en générer des nouvelles de plus grande efficacité ou d’identifier les patients à même de répondre positivement au traitement. A court terme, ce projet offrira des pistes de travail pour générer des immunothérapies capables de contourner les limitations que nous aurons identifiées et donc avec une meilleure efficacité. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles thérapies pour traiter la majorité des patients atteint de cancer solide et améliorer leur espérance de vie.

Procédures

La greffe de la tumeur consistera à une injection de quelques secondes au début de l’expérience. Les animaux seront ensuite manipulés quotidiennement pour mesurer la pousse de la tumeur. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30minutes pour effectuer de l’imagerie et seront ensuite maintenus endormis pendant 2 à 3h mais cette procédure sera sans reveil.

Impact sur les animaux

Notre projet propose d’étudier les immunothérapies anti-tumorales et nécessite donc la greffe de tumeur aux souris en sous-cutanée au niveau du flanc et aussi au niveau du colon. Le bien-être de chacune des souris sera contrôlé fréquemment. Notre connaissance précédente suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables causés par la pousse tumorale sous-cutanée. La localisation (le flanc) de la tumeur ne semble pas impacter leur mobilité, elles ne perdent pas de poids, leur pelage reste soyeux et leur comportement demeure inchangé. L’injection des thérapies que nous proposons d’étudier dans ce projet pourra ne pas causer d’effets indésirables ou avoir un effet à court terme (24-72h) par exemple sur la température corporelle de l’animal liée à l’élimination des cellules tumorales. Des mesures pour soulager l’inconfort des animaux seront mises en place et sont décrites plus loin dans ce protocole.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales.

Remplacement

De nombreuses expériences seront validées au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires 2D ou des organoïdes (Structures 3D mimant les certains aspects des tumeurs solides in vivo) et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier le mode d’action de la thérapie in vivo. Différentes doses seront utilisées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier le mode d’action de la thérapie in vivo. Une telle approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieues in vivo. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action de certaines thérapies.

Réduction

L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dès que possible, les expériences de cytométrie et de dosage protéiques (ou d’imagerie multiplex) seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation. D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. Selon les procédures, les paramètres évalués seront variables, cela entraine des nombres de groupes variables que nous avons optimisés et réduits au maximum pour obtenir des résultats significatifs tout en prenant en compte la variabilité de la croissance tumorale. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de cancer et auront reçu un traitement anti-tumoral.

Raffinement

Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (poil ébouriffé, prostration, taille de la tumeur) sont établis pour raffiner les procédures et soulager les animaux à l’aide d’analgésique ou de les mettre à mort si la souffrance persiste. Pour la pousse de tumeur sous-cutanée, la tumeur sera mesurée 3 fois par semaine afin de contrôler la pousse tumorale et de mettre à mort l’animal si le volume de la tumeur atteint 1500mm2. Ce volume est calculé selon la formule longueur x largeur x hauteur. La hauteur est difficile à mesurer et une approximation en est faite. On considère la hauteur comme étant la longueur divisée par deux. La formule finale est donc : Longueur x largeur x (largeur/2). Cette limite est idéale pour limiter l’impact de la tumeur sur le bien-être de l’animal qui n’aura aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Après l’administration de l’immunothérapie, la température corporelle de l’animal sera mesurée afin de s’assurer d’une bonne tolérance au traitement. Concernant l’intervention chirurgicale pour la greffe de tumeur au niveau du colon, l’animal sera administré en amont de l’opération avec une dose d’antalgique afin de minimiser la douleur et sera anesthésié sur plaque thermo contrôlée pour limiter la perte de chaleur corporelle. La cage sera supplémentée avec du dietget et la litière pourra être remplacée par une litière en cellulose en post-chirurgie.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain. Les souris sont l’espèce la plus appropriée pour nous éclairer sur les mécanismes d’action des immunothérapies pour le traitement des cancers chez l’humain. Par ailleurs, l’imagerie intravitale en temps réel peut être réalisée relativement facilement sur des souris. Tous les animaux utilisés dans ce projet de recherche seront adultes (>5 semaines). Notre étude s’effectue sur un système immunitaire adulte afin de se rapprocher au mieux de la clinique et des patients porteurs de ces cancers.

4 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues du croisement de deux lignées génétiquement modifiées, elles sont pesées puis soumises à des tests d'agrippement et de rotarod, le porteur prévoyant de les laisser atteindre les points limites pour évaluer un éventuel gain de survie dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique. Il indique que l'atteinte de ces points limites peut occasionner des effets indésirables et une difficulté à se nourrir en fin de vie. Sur le remplacement, il décrit des modèles in vitro qu'il juge seulement "complémentaires" de l'approche in vivo.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou maladie de Charcot est une maladie caractérisée par une dégénérescence des neurones commandant les muscles. La SLA survient pendant la vie adulte et conduit à une paralysie fatale. Aucun traitement n'est disponible pour cette maladie. La plupart des études se sont focalisées sur les périodes symptomatiques ou pré-symptomatiques et non sur les mécanismes initiaux conduisant fort probablement à la survenue de la SLA. La présente DAP est basée sur nos récents travaux montrant que la transmission synaptique inhibitrice est réduite aux stades périnataux au niveau des neurones moteur de la moelle épinière de souris modèle de la maladie SLA. Notre projet est donc basé sur l’hypothèse que les premières dérégulations liées à la SLA débutent dès le développement du système nerveux central et sont accompagnées de mécanismes de compensation. L'effondrement tardif de ces mécanismes de compensation conduirait à l'apparition des symptômes de la SLA. Nos travaux montrent un déficit dans la transmission synaptique inhibitrice à des stades précoces de développement. Nous proposons donc d’augmenter la transmission synaptique inhibitrice chez la souris en utilisant une approche génétique et nous émettons l’hypothèse que cette augmentation aura des répercussions positives sur le développement de la maladie chez la souris adulte.

Bénéfices attendus

Le présent projet a pour but de mettre en évidence un défaut d'inhibition chez une souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA). Cette démonstration pourra être bénéfique aux patients SLA qui pourraient être traités par des molécules agissant sur l'inhibition synaptique.

Procédures

Aucune procédure chirurgicale n'est prévue dans le présent projet. Les souris seront pesées de manière hebdomadaire, soumises au test d'agrippement (grip-test) et au test du rotarod (locomotion sur un cylindre mobile). La survie des souris sera également évaluée. Enfin, certaines souris seront euthanasiées afin de collecter les tissus nerveux (moelle épinière).

Impact sur les animaux

Notre projet prévoit de laisser les souris atteindre les points limites afin d'évaluer l'éventuelle amélioration de leur durée de vie après croisement avec des souris ayant un niveau d'inhibition accru. L'atteinte des points limites, bien que ces derniers soient controlés, peut occasionner des effets indésirables sur les animaux. Certaines souris seront enthanasiées en vue de prélever des tissus nerveux pour étude immunohistochimique à posteriori. Là encore, bien que réduits au maximum par des injections de produits anesthésiants, des effets indésirables sur les animaux sont à considérer.

Devenir

Les souris modèle de sclérose latérale amyotrophique ayant atteint les points limites et les animaux contrôles du même âge seront euthanasiés afin de prélever des tissus nerveux et réaliser à postériori des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Les souris utilisées dans notre projet sont des souris transgéniques modèles murins de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) et des souris génétiquement modifiées afin d'augmenter le niveau d'inhibition au sein du système nerveux. Les deux souris seront croisées pour obtenir des animaux doublement génétiquement modifiés. Des animaux contrôles de la même lignée (et même portée) seront utilisés. Les modèles murins de la maladie SLA sont les animaux les plus utilisés pour tenter de comprendre les mécanismes de développement de cette maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs. Des modèles in vitro ont été développés pour l'étude du dysfonctionnement des motoneurones issus de patients SLA mais ces modèles restent complémentaires aux approches in vivo. Il est donc logique que le modèle murin de la SLA soit utilisé dans le cadre de la présente DAP.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, notre projet basé sur des méthodes variées permet d'utiliser au maximum tous les embryons et animaux néonataux disponibles issus d'une portée. Concernant les expériences réalisées chez l'adulte, un nombre minimum d'animaux est programmé en accord avec les tests statistiques qui seront réalisés à posteriori.

Raffinement

Les souris sont élevées avec un enrichissement. Des points limites sont établis afin de réduire au maximum la souffrance des animaux liée à leur difficulté à se nourrir en fin de vie.

Choix des espèces

La souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) que nous utilisons reproduit les symptômes de la maladie de manière fiable et reproductive. L'autre souris présente un taux d’inhibition accru. Ces deux souris seront croisées afin d'obtenir des souris SLA ayant un niveau plus élevé d'inhibition (souris présentant une double modification génétique). Ces souris et leur contrôles non génétiquement modifiés seront testées chez des mâles puis femelles, au niveau comportemental à l'âge de 8 semaines jusqu'à l'âge de 20 semaines environ (= âge moyen de fin de vie de nos souris modèles de SLA).

400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre proposée à l'adoption. Ils sont placés en cage individuelle pendant 48 heures pour recueillir urines et fèces, subissent des prélèvements sanguins à la queue et une injection d'un traceur avant la mise à mort, pour mesurer la qualité nutritionnelle de différentes sources de protéines à la demande de la FAO. Le porteur indique que l'isolement en cage peut provoquer un stress car les rats vivent habituellement en groupe. Sur le remplacement, il affirme que les données in vitro ne sont pas comparables et que le recours à l'animal reste "nécessaire" pour obtenir des données fiables.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la qualité nutritionnelle de différentes sources de protéines à destination de l’alimentation humaine. Il répond notamment à une demande de l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) de produire une base de données sur la digestibilité et la qualité de l’ensemble des sources protéiques. La caractérisation de la qualité de ces nouvelles sources de protéines permettra également de promouvoir certaines sources de protéines ou de recommander l’association de différentes sources de protéines pour répondre aux besoins de populations spécifiques.

Bénéfices attendus

De très nombreuses études montrent que le niveau de consommation des protéines animales des pays les plus riches ne pourra pas se généraliser à l’échelle planétaire en l’état actuel des ressources. Dans ce contexte, le maintien de la part des protéines dans l’alimentation nécessite de développer de nouveaux régimes et pratiques alimentaires qui viseront à augmenter la part relative des produits végétaux et inclure de nouvelles sources de protéines plus durables. L’évaluation de la qualité des protéines durables issues de ressources alternatives est une étape essentielle lors du développement d’ingrédients protéiques à haute valeur ajoutée. Ce projet permettra d’obtenir ces données. La caractérisation de la qualité de ces nouvelles sources de protéines permettra également de promouvoir certaines sources de protéines ou de recommander l’association de différentes sources de protéines pour répondre aux besoins de populations spécifiques.

Procédures

Afin de collecter leurs urines et fèces, les rats sont placés durant une durée limitée (48h) dans des cages individuelles spécifiquement conçues pour ces recueils. Lors de la procédure 3, Des prélèvements sanguins de 0,5mL de sang sont collectés à la veine de la queue des rats vigiles. Trois prélèvements sont réalisés par animal (avant, 1h après et 3h après l’ingestion du repas contenant la protéine à tester). Du matériel spécifique est utilisé pour limiter le temps et le stress engendrés par ce geste ; la durée ne dépasse pas 5 minutes par prise. Un anesthésique local est également appliqué sur la queue avant la prise de sang afin de minimiser la douleur. Des pesées quotidiennes sont réalisées pour lesquelles les rats sont emmaillotés dans une lingette afin de les habituer à être emmailloté. Ce même emmaillotage est également réalisé lors de la prise de sang pour contenir le rat. 30 minutes avant la mise à mort des animaux, l’injection d’un marqueur permettant d’évaluer la formation des protéines dans différents organes et tissus est réalisée sous anesthésie gazeuse en moins de 3 minutes.

Impact sur les animaux

La qualité nutritionnelle des protéines est évaluée en déterminant la consommation alimentaire individuelle des rats et en collectant les urines et fèces ponctuellement. Ceci permet de calculer plusieurs indices de qualité connus pour être transposables à l’homme. Il est donc nécessaire de les héberger en cage individuelles. Le placement en cage individuelle peut induire un stress lié à l’isolement car les rats sont des animaux vivant habituellement en groupe. Les prélèvements sanguins sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré.

Devenir

Selon les critères de qualité des protéines évalués, la mise à mort des animaux n’est pas nécessaire. Ainsi, les animaux pourront soit être placés pour l’adoption, soit être mis à mort à la fin de l’étude en fonction des critères de qualité à mesurer.

Remplacement

Un protocole de digestion des protéines in vitro a été harmonisé via un réseau international ces dernières années. Cependant les données obtenues in vitro ne sont pas complétement comparables avec les données obtenues chez l’animal. Le recours à des modèles animaux est donc aujourd’hui encore nécessaire pour obtenir des données fiables de digestibilité des acides aminés et donc des données sur la qualité des sources protéiques. Aussi, il n’y a pas de modèle n’utilisant pas d’animaux actuellement sur les effets des sources de protéines sur les concentrations d’acides aminés dans le sang ainsi que sur la formation de protéines dans les différents organes.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux par groupe a été calculé à 8 rats/groupe à partir de données comparables déjà publiées afin de garantir qu’avec ce nombre d’animaux les résultats soient interprétables. Afin de limiter le nombre d’animaux, les rats pourront être ré-utilisés pour évaluer un ou plusieurs critères de qualité des protéines. Les résultats pour chaque groupe sont comparés entre à l’aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles sont enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque. Les animaux sont regroupés (entre animaux de même sexe et de même lot), deux fois par semaine durant 2 heures dans des espaces spécialement conçus, appelés parcs. Les parcs sont des espaces de 1 m² environ, avec des tunnels suspendus, des zones où se cacher et des zones à escalader. Ces périodes de regroupement permettent aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Lors des prises de sang, un anesthésique local est appliqué sur la queue. L’animal est également habitué à l’emmaillotage dans un tissu lors des pesées quotidiennes afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Lors des injections du traceur permettant la mesure de la formation des protéines, les rats sont anesthésiés. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

LLe régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. Ainsi, l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) recommande l’utilisation de l’être humain, ou des modèles animaux que sont le porc et le rat pour l’évaluation de la qualité des protéines. Le critère de qualité des protéines se basant sur la capacité de la protéine à soutenir la croissance se mesure chez de très jeunes rats mâles et femelles, après le sevrage (3 semaines, ~50 g) . Le critère de qualité des protéines évaluant l’utilisation et la digestibilité de la protéine en collectant les fèces et les urines se mesure chez de jeunes rats mâles et femelles encore en phase de croissance (8 semaines, ~250 g). Le critère de qualité des protéines évaluant la digestibilité des acides aminés au niveau de l’intestin se mesure chez des rats mâles et femelles encore en phase de croissance (10 semaines, ~300 g).

Infectées par voie intranasale sous anesthésie avec des souches mutantes de Mycobacterium bovis, l'agent de la tuberculose bovine, les souris reçoivent aussi une puce télémétrique et subissent une prise de sang chaque semaine. 264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes, afin de préciser le rôle de trois gènes de virulence de la bactérie. Le porteur part de groupes de 24 souris pour en garder 6 au dernier jour, les autres étant mises à mort au fil du protocole quand elles atteignent les points limites, en général entre J21 et J35, avec perte de poids rapide et prostration. Il annonce une mise à mort "dès l'apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite", sans chiffrer ce seuil.

Objectifs

La tuberculose bovine est une pathologie majeure en santé animale. L'espèce mycobactérienne adaptée aux animaux, Mycobacterium bovis (Mb), est le principal agent pathogène responsable de la tuberculose bovine en Europe et au Royaume-Uni. C'est un pathogène zoonotique multi-hôtes capable d'infecter les ruminants (bovins, caprins, ovins), la faune sauvage et l'homme. Les programmes de surveillance et d’éradication, basés sur des campagnes de tests et l'abattage systématiques des bovins réactifs, n'ont pas permis d'éradiquer la tuberculose bovine (bTB). La bTB représente donc un risque direct pour les économies agricoles, la santé animale et humaine et la biodiversité dans les pays touchés. Il existe une hétérogénéité dans la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par Mb, ce qui influence directement le risque de transmission par les bovins infectés et la faune sauvage. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections à Mb est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Le projet a pour objectif de comprendre comment Mb interagit avec le système immunitaire de l’hôte et comment cette bactérie module la progression et la transmission de la maladie. Pour cela, nous souhaitons identifier les gènes de Mb essentiel pour sa persistance et sa dissémination. Pour cela nous souhaitons i) Comparer la virulence de mutants de Mb (ii) Suivre la réponse immunitaire et le développement du granulome en réponse aux différents mutants.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous mettrons au point pour la première fois la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur pour raffiner nos points limites (détection plus précoce de comportements). La validation du matériel, son installation, et de la méthode d’analyse permettra de proposer ce suivi pour nos prochains projets. Les résultats permettront de caractériser le rôle de 3 gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination de Mb. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés par les différentes souches.

Procédures

Pose de la puce d’identification et télémétrique : 1 fois et 1min/animal. Anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale + infection par voie intranasale : 1 fois et 15 min/animal. Prise de sang : 1 fois par semaine et 3 min/animal/prélèvement. Pesée : bi hebdomadaire et 1min/pesée/animal. Les prises de sang peuvent engendrer un hématome et la contention peut engendrer du stress pour l’animal.

Impact sur les animaux

Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourraient être observés. Nous savons par expérience que les souris sont sensibles aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec la souche M.bovis de référence. Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire.

Devenir

L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, cerveau, ganglion médiastinal) et fluides biologiques (sang, urine et fèces). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, des lésions, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test statisitique. Pour obtenir un groupe de 6 souris au dernier jour du protocole, nous savons qu’il nous faut partir d’un groupe de 24 animaux. En effet, tous les animaux ne réagissent pas pareil à l’infection, certains la contrôlent en formant des granulomes pulmonaires matures (25% des animaux), et les autres doivent être sacrifiés au fur et à mesure du protocole car ils atteignent les points limites (entre J21 et J35 classiquement). Chez ces animaux sensibles, des lésions désorganisées sont observables dans le poumon. En résumé, nos protocoles comprennent 24 souris, nous analysons les réponses immunitaires de deux groupes : les animaux résistants (5-6 souris) et sensibles (18-19 souris). Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes et la vidéosurveillance sera mise en place pour mieux suivre les souris. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. les animaux seront habitués en amont à la cellule d’expérimentation, une semaine avant le début de l’expérimentation Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruités ou rondelle de banane séchée ou popcorn sera réalisée.

Choix des espèces

Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. De plus le modèle murin permet une manipulation en animalerie A3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce. Le modèle murin nous offre la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour les voies de signalisation ou cytokines impliquées dans les réactions immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 semaines (sexe indifférent). Pour ce projet, il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Placées dans un dispositif générant des ondes 5G, elles subissent des dépilations et des anesthésies générales répétées pour des mesures cutanées, dont une exposition de la patte à une chaleur montant jusqu'à 44 degrés, afin d'évaluer l'effet des ondes de 3,5 et 26 GHz sur la peau saine et vieillissante. Le porteur qualifie les techniques de non invasives et indolores, la principale nuisance étant le risque de détresse respiratoire lié à la répétition des anesthésies. Il situe l'étude dans un contexte où "les enjeux commerciaux et financiers de la 5G sont importants" et où les autorités "souhaitent une mise en œuvre rapide".

Objectifs

La téléphonie mobile est en perpétuelle évolution pour répondre à une demande croissante des usagers. La cinquième génération (5G) d’infrastructures de communication est en phase de déploiement en France malgré un certain nombre de questions auxquelles la communauté scientifique tarde à apporter des réponses. Alors que la bande de 26 GHz couvrira les besoins de communication pour les objets connectés, ou des « hot spots » à très haut débit (arrêt de bus, quai de métro …), c’est la bande de fréquence autour de 3,5 GHz qui assurera la couverture en téléphonie mobile 5G (contre 2,6 GHz pour la 4G). L’effet sur les systèmes biologiques de ces fréquences de 3,5 GHz reste très mal connu et il n’est pas possible d’extrapoler de façon rigoureuse les résultats d’études scientifiques menées dans d’autres gammes de fréquence. L’augmentation de fréquence lors du passage de la téléphonie 4G à la 5G pourrait en théorie moduler d’éventuels effets biologiques. En effet, si la pénétration de l’onde dans les tissus est d’autant plus superficielle que sa fréquence est élevée, la puissance associée à l’onde augmente avec sa fréquence. Il est donc nécessaire d’évaluer précisément les conséquences biologiques d’une augmentation de fréquence sur les tissus exposés. Il est nécessaire d’étudier les effets des ondes électromagnétiques (OEMs) sur la peau, premier organe touché par les stress environnementaux et dont la fonction barrière est essentielle au maintien de l’intégrité de l’organisme. De plus, pour les fréquences à partir de quelques GHz, l’énergie des OEMs est presque entièrement absorbée dans les premières couches cutanées, notamment dans l’épiderme, et pénètre très peu en profondeur. Les données ne sont pas non plus suffisantes pour conclure à l’existence ou non d’effets sanitaires dans la bande de 26 GHz, aucune donnée d’exposition n’étant disponible à ce jour car les applications de type objets connectés sont encore à l’état de projet. L’objectif de ce projet est d’étudier les conséquences sur la peau d’une exposition chronique aux OEMs de 3,5 GHz, associée à une exposition ponctuelle aux OEMs de 26 GHz afin de mimer la situation que pourront rencontrer les populations utilisant la téléphonie mobile 5G dans leur vie quotidienne ainsi que, plus ponctuellement, des objets connectés dans leur vie professionnelle ou des stationnements sous la couverture de « hot spots ».

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de l’exposition aux OEMs 5G dans la population générale, y compris chez des personnes dont la peau est fragilisée par le vieillissement, ce qui représente une part importante et croissante de la population française. Les enjeux commerciaux et financiers de la 5G sont importants et les autorités souhaitent une mise en œuvre rapide pour offrir des débits bien supérieurs à ceux actuellement disponibles avec le réseau 4G. Dans un contexte général de grande défiance des populations vis-à-vis des nouvelles technologies et d’inquiétude concernant leur potentiel impact sur la santé, l’attente de la société est forte envers les experts. Nous devons donc répondre à l’attente des populations en évaluant de façon rigoureuse et avec des modèles pertinents les effets biologiques de ces nouvelles fréquences. Il est donc d’un grand intérêt à la fois scientifique et de santé publique d’étudier les effets des OEMs, en particulier dans la gamme de fréquences de la 5G.

Procédures

Après une période d’acclimatation d’une semaine minimum dans une cage standard avec un enrichissement adapté à leurs besoins, les souris seront hébergées en groupe à l’intérieur d’un dispositif capable de générer des ondes de type 5G. Une période d’habituation à leur nouvel environnement (dispositif éteint sans ondes) sera ajustée à l’âge des souris (1 semaine minimum). Pour étudier les effets des ondes sur la peau, une dépilation de la partie basse du dos sera réalisée sous anesthésie générale induite par un gaz (1 à 3 min) 1 à 3 jours précédant les mesures fonctionnelles nécessitant une nouvelle anesthésie générale (anesthésie par injection pour une durée de 30 à 45 min). Afin de limiter le nombre d’animaux, ces 2 anesthésies consécutives seront répétées une deuxième fois pour dépiler à nouveau la zone si besoin et réaliser une 2ème série de mesures en respectant un minimum de 3 semaines entre les deux séries de mesures. L’anesthésie générale par injection (30-45 min) permettra de prélever du microbiote cutané en frottant un écouvillon sur les faces interne et externe des 2 oreilles (moins de 1 min/oreille) puis de réaliser séquentiellement des mesures non invasives pour évaluer la fonction barrière (moins de 1 min), les propriétés viscoélastiques (moins de 1 min), la perfusion sanguine (moins de 2 min) et la capacité des vaisseaux à se dilater en réponse à l’application locale d’une drogue vasodilatatrice (20 à 30 min) de la peau au niveau du dos. En même temps que la mesure vasculaire au niveau dos, une autre mesure vasculaire sera réalisée lors d’une exposition à une chaleur croissante (33 à 44°C ; +1°C/minute) au niveau d’un coussinet arrière pour évaluer les capacités de thermorégulation. Toutes les techniques utilisées sont indolores ; elles sont également utilisées chez l’homme. Afin de comparer l’effet des OEMs de type 5G sur la peau saine ou fragilisée par le vieillissement chronologique, nous étudierons des souris à l’âge jeune (15 mois). La principale nuisance est liée à la répétition d’anesthésies générales, qui pourrait augmenter le risque de détresse respiratoire au réveil. Pour cela, chaque souris aura au maximum 2 séries qui nécessitent 1 anesthésie à l'isoflurane (dépilation environ 2 min) et 1 au thiopental (mesures fonctionnelles 45 min au maximum). Les deux anesthésies au thiopental seront espacées au minimum de 3 semaines.

Impact sur les animaux

Toutes les techniques envisagées sont non invasives et utilisées dans les études cliniques. Aucune douleur n’est attendue. Sous anesthésie générale, l’exposition à un chauffage local (augmentation de la température de la peau de 33 à 44°C à +1°C/min) sur 1 coussinet (patte arrière) ne représente pas de nuisances particulières d’après notre expérience. Les souris prévues dans cette étude ne sont pas des souris transgéniques (pas de phénotype dommageable). Au cours du vieillissement, les souris peuvent perdre du poids et baisser leur température interne. Ces deux paramètres seront suivis au minimum 1 fois par semaine pour les souris âgées de 15 mois et plus.

Devenir

Mise à mort. En effet, plusieurs prélèvements terminaux seront réalisés à différentes durées d’exposition pour permettre des analyses tissulaires et moléculaires approfondies.

Remplacement

L'objectif de ce projet étant d'étudier les effets des OEMs sur plusieurs aspects fonctionnels de la peau (fonction barrière, fonction vasculaire, propriétés viscoélastiques), il est nécessaire de travailler sur un organisme entier, car il est actuellement impossible de reproduire l’intégrité fonctionnelle dans un modèle de peau in vitro, en particulier la réactivité vasculaire cutanée qui repose sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 288 afin d'étudier 16 souris à 3 types d'expositions, des 2 sexes, à 3 âges différents. Ce nombre maximal inclut la possibilité d’étudier un âge intermédiaire. L’étude débutera en comparant les effets des OEMs entre les souris âgées et les souris jeunes. En absence de différences, les souris d’âge intermédiaire ne seront pas utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux, 5 mesures (4 sur le dos et 1 sur une patte arrière) seront réalisées au cours d’une seule anesthésie et 2 séries de mesures par souris. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles. Nous avons prévu d’utiliser des tests statistiques adaptés aux petits groupes pour évaluer les différences intra- ou inter-individuelles pour toutes les mesures. Nos expériences précédentes nous ont amené à conclure que 8 mesures au minimum étaient nécessaires pour chaque phase étudiée.

Raffinement

Une période d’habituation à leur changement d’environnement lié au dispositif qui va générer les ondes 5G sera respectée et adaptée en fonction de l’âge des souris (1 sem pour les souris jeunes, 2 sem pour les souris matures, et 3 sem pour les souris âgées). Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum et pesées une fois par mois avant 15 mois puis plus régulièrement pour les animaux vieillissants (pesée et mesure de la température rectale hebdomadaires). Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Toutes les interventions et les mesures sur la peau seront réalisées sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste largement utilisée pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède en effet une physiologie cutanée proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les mêmes approches techniques (laser Doppler, iontophorèse) ainsi que les autres explorations cutanées (propriétés viscoélastiques, perte insensible en eau, perfusion sanguine, microbiote), tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 10 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé. Afin d’étudier l’impact des OEMs sur la peau saine ou fragilisée par le vieillissement chronologique, les souris seront utilisées à 3 âges différents : à l’âge jeune (15 mois). La durée maximale de la procédure sera de 20 semaines, et l’âge des souris les plus âgées ne dépassera pas 22 mois en fin de procédure.

144 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à vingt-trois instillations intranasales d'allergène sous anesthésie et deux injections intra-péritonéales, avant des mesures respiratoires par trachéotomie, pour tester si le blocage d'une enzyme du métabolisme des acides gras réduit le remodelage bronchique dans un modèle d'asthme chronique. Le porteur indique que la sensibilisation peut provoquer une inflammation des voies respiratoires et une dyspnée. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'évolution du remodelage bronchique et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couvert dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend entre autres l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique. La taille du muscle lisse bronchique est une valeur très importante, car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. L’objectif de ce travail est d’étudier si le blocage du métabolisme des acides gras par un fragment d’anticorps contre une des molécules de cette chaine métabolique à un moment où tous les signes de l’asthme sont bien développés peut réduire les symptômes de la maladie dans le modèle murin de l’asthme chronique allergique.

Bénéfices attendus

Ce projet montrera si le blocage d’une des molécules qui jouent le rôle important de régulation du métabolisme énergétique dans les muscles lisses bronchiques permet de diminuer les symptômes d’asthme et notamment de remodelage du muscle lisse bronchique chez les animaux de laboratoire. Les données ainsi obtenues ouvriront la voie pour la nouvelle thérapie de cette pathologie respiratoire.

Procédures

Les animaux seront soumis aux vingt-trois (maximum) instillations intranasales sous anesthésie gazeuse (durée jusqu’à 2 minutes) et les deux injections intra-péritonéales de l’allergène (2 injections). Les mesures de paramètres respiratoires d’une durée de 10 minutes seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés dans la procédure sans réveil.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir un léger stress suite aux contentions pour l’injection/l’instillation des allergènes et un bref placement dans une boîte en plexiglass. Les souris ressentiront une légère douleur des piqûres pendant l’injection. L’anesthésie sous isoflurane induit également un léger stress. La sensibilisation aux allergènes induit des symptômes asthmatiques chez l’animal : l’inflammation des voies respiratoires et éventuel remodelage bronchique. Ces symptômes peuvent survenir après l’instillation de l’allergène et éventuellement provoquer une dyspnée (un essoufflement).

Devenir

L’objectif de ce projet est d’estimer l’efficacité de traitement contre le remodelage bronchique dans l’asthme. Suite au développement des symptômes d’asthme, les animaux recevront le traitement et les paramètres respiratoires seront réalisés. Puis les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés et analysés au laboratoire.

Remplacement

En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. Grace au modèle animale, nous testerons les hypothèses apparues après nos résultats in-vitro sur les lignées cellulaires. Il est bien que l'asthme bronchique chez l’homme est une maladie multifactorielle, où les facteurs génétiques, l'âge, les conditions environnementales, l'ontogenèse et l'anamnèse de la maladie jouent un rôle important. Le contrôle de ces facteurs dans nos expériences avec des souris de laboratoire nous permettra de révéler l'effet physiologique réel du blocage du métabolisme des acides gras sur le développement des symptômes de la maladie. L’utilisation du modèle murin d’asthme chronique allergique dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes et à terme de proposer des traitements plus efficaces pour la prise en charge des personnes asthmatiques.

Réduction

Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Nous allons comparer les organes des groupes de souris asthmatiques avec ceux des animaux témoins qui recevront ou non le traitement pouvant diminuer les symptômes d’asthme. Chez une partie des souris de chaque groupe, les paramètres du système respiratoire seront mesurés par pléthysmographie invasive. Comme il a été déjà démontré par nos travaux précédents, les groupes de souris doivent être composés de 10 souris minimum afin de mettre en évidence une différence significative sur les différents paramètres analysés grâce à la pléthysmographie invasive notamment la résistance bronchique dont la variabilité est importante. Dans la deuxième partie des souris de chaque groupe, nous étudierons les processus inflammatoires dans le lavage broncho-alvéolaire (BAL). Dans ce but, nous avons besoin 6 souris dans chaque groupe. Le nombre de souris à inclure a été réduit au maximum selon les tests statistiques définis.

Raffinement

Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, frisottis et bâtonnets), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés sont des femelles. La majorité des études sur l’asthme est menée sur les souris femelles. L’utilisation des femelles permet de rapprocher le modèle murin de la maladie humaine car la sévérité de l’asthme est plus fréquente chez la femme que chez l’homme. Les animaux utilisés pour commencer le protocole sont des jeunes souris âgés de 5 à 10 semaines. La plupart des études scientifiques dans le domaine pneumologique sont réalisées sur les animaux de cet âge.

2 000 souris, 1 500 rats et 100 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un composé à tester puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang en vingt-quatre heures et des séjours en cage à métabolisme en isolement, certains portant un dispositif chirurgical pour recueillir la bile, pour mesurer le devenir de molécules candidates. Le porteur reconnaît un stress lié à la contention et à l'isolement ainsi que des douleurs et des lésions internes possibles aux sites de prélèvement. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la diffusion d'un produit dans l'organisme entier, ce qui rendrait le recours à l'animal "indispensable".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir conduire différents protocoles dans lesquels différents éléments d'essai seront testés (classe thérapeutique anti inflammatoire, anti cancéreux, antibiotique, neurologie principalement) ainsi que l'évaluation des excipients et des produits exploratoires. Suite à ces différentes études, l'objectif est de pouvoir identifier de nouveaux éléments qui pourront pas la suite peut être donner lieu à de nouveaux médicaments. Il peut s'agir de conduire des études de PK simple: suivre les paramètres de l'élément testé dans les matrices plasma/serum principalement. Il peut s'agir de conduire des études PK/PD: suivre les paramètres de l'éléments testés dans les matrices plasma/serum principalement mais également de suivre les effets de ces éléments test en suivant certains paramètres biologiques. Il peut s'agir de conduire des études pour mettre en avant les phases Administration, Distribution, Métabolisme et Elimination. Dans ce cas les éléments test peuvent être suivis dans les urines, fécès, bile ...

Bénéfices attendus

L'intéret de ce projet est de pouvoir mener différentes études en testants différents éléments d'essai sur des rongeurs. Cela permettra d'identifier les composés intéressants qui pourront peut être déboucher sur de nouveaux médicaments humain ou vétérinaires. Les différents protocoles entrant dans le scope de ce projet (études PK, études PK/PD, études ADME) seront primordiaux pour avoir des données sur les paramètres phamacocinétiques et pharmacodynamiques des éléments testés pour pouvoir déterminer les relations dose/effet.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d'intervention - Premièrement l'administration de l'élément test. Cela sera fait sur animal vigile par un personnel formé pour éviter tout stress à l'animal -Puis des prélèvements de sang seront réalisés. En fonction de l'espèce animale les volumes et le nombre pourront varier. Pour les rats et les cobayes, 9 prélèvements maximum sur 24h, volume prélevé environ 60 μL Pour les souris, 9 prélèvements maximum sur 24h , volume prélevé environ 30 μL. La durée d'un prélèvement est inférieur à la minute. Les animaux pourront être placés en cage à métabolisme pour des recueils d'excrétas si demandés. La durée de l'hébergement dans ces cages à métabolisme sera réduite au maximum. Jusqu'à 7 jours maximum pour le recueil d'urine ou de fecès et jusqu'a 72h maximum pour le recueil de bile. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux.

Impact sur les animaux

Suite aux différentes administrations et durant les prélèvements sanguins, les animaux peuvent ressentir du stress, de la peur à la contention. Les prélèvements sanguins seront réalisés à différents sites de prélèvements, mais il peut y avoir de la douleur, des lésions internes. Lors des recueils de bile, de fécès ou d'urine, les animaux seront hébergés en cage à métabolisme. Cela signifie un hébergement individuel. Cela peut également occasionner du stress pour l'animal. Si l'animal a subit une chirurgie pour un recueil de bile, ou une administration duodénale cela necessite que l'animal porte un dispositif particulier qui peut influer sur sa liberté de mouvements. Tous ces gestes seront réalisés par un personnel expérimenté pour éviter au maximum toutes ces nuisances

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort. Cela sera pratiqué par un personnel expérimenté conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux ni d'évaluer les effets d'une molécule sur un ou plusieurs paramètres pharmacodynamiques au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.

Réduction

Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 1500 rats, 2000 souris, 100 cobayes sur 5 ans. Ce sont des chiffres approximatifs pour une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux inclus dans chaque étude entrant dans le scope de ce projet sera réduit au minimum pour avoir des résultats interprétables. Par exemple en utilisant la technique du micro sampling ( prélèvement de 30 µL de sang par animal) ou en utilisant des animaux cathétérisés cela permettra de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés car 9 points de pK pourront être réalisés sur le même animal.

Raffinement

Une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu. Animaux hébergés en groupe autant que possible avec présence d'enrichissement au maximum au niveau des hébergements ( présence de buchettes, cachettes, tunnels ...) Les animaux seront observés quotidiennement pour une prise en charge rapide. Pour préserver les sites de prélèvement au maximum, un point de compression sera réalisé aprés chaque prélèvement avec la possibilité d'appliquer de la glace afin d'éviter la formation d'hématome. Les sites seront alterner autant que possible et le nombre de prélèvement de sang par site sera réduit au minimum.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les espèces majoritairement utilisées dans ces études. Ces espèces sont bien décrites et caractérisées dans la littérature et leur utilisation est conseillée (OCDE) pour les essais de produits pharmaceutiques. Le cobaye est minoritairement utilisé mais peut permettre d'identifier des métabolites absents chez les deux précédentes espèces, par exemple. Nouveau nés, jeunes, adultes. Le stade de développement sera justifié pour chaque étude. Cela dépendra de la cible concernée pour le produit testé.

794 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intraveineuse des cellules de myélome puis des lymphocytes T modifiés, avec jusqu'à douze séances d'imagerie et des prélèvements de sang, pour comprendre les rechutes d'une immunothérapie. Le porteur indique que le cancer peut provoquer une perte de mobilité puis une paralysie des pattes arrière et une perte de poids, l'euthanasie intervenant avant ces signes quand l'imagerie le permet. Il affirme que l'évaluation à long terme de ces cellules rend "indispensable" le recours à un "organisme vivant entier".

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est caractérisé par le développement incontrôlé (prolifération) d'un type particulier de cellules sanguines de la famille des globules blancs appelées plasmocytes. Ces plasmocytes, cellules productrices d’anticorps, s’accumulent dans la moelle osseuse. Les traitements actuels du MM reposent sur la chimiothérapie et la greffe de moelle osseuse. Bien que ces traitements aient amélioré la survie des malades, certains patients répondent mal aux traitements conventionnels. Une nouvelle stratégie thérapeutique, ayant déjà fait ses preuves dans le traitement d'autres cancers du sang, vise à forcer les défenses immunitaires à reconnaitre et à détruire les cellules cancéreuses. Ainsi il est possible de modifier génétiquement une population de cellules du système immunitaire (les lymphocytes T) afin qu'ils reconnaissent spécifiquement les cellules tumorales et les éliminent. Le but ultime étant d'améliorer la prise en charge des patients résistants aux traitements classiques. Les plasmocytes tumoraux ont à leur surface des molécules qui vont être reconnues par les lymphocytes T modifiés entrainant l’élimination des cellules cancéreuses avec des taux de réponse de l’ordre de 80% chez des malades ayant reçu différentes stratégies de traitement. Cependant des rechutes surviennent encore et la survie reste au mieux de l’ordre de 2 ans. Dans notre projet, nous cherchons à mettre en évidence les mécanismes liés à ces rechutes et parmi eux le défaut de persistance des cellules thérapeutiques (lymphocyte T modifié) in vivo.

Bénéfices attendus

Cette étude va apporter des informations importantes pour la thérapie du MM où actuellement il n’y a pas de thérapie curative. En effet le défaut de persistance des cellules thérapeutiques est une des causes de rechute chez les patients atteint de cancer soigné avec l’immunothérapie, approche thérapeutique qui agit sur le système immunitaire d’un patient pour lutter contre sa maladie. La découverte de gènes influençant la persistance et l’efficacité des cellules thérapeutiques ciblant spécifiquement des molécules à la surface des cellules tumorales du MM pourraient ouvrir des portes pour le traitement d’autres cancers où l’immunothérapie est utilisée ou dans les études de nouvelle stratégie immuno-thérapeutique qui sont actuellement en phase de test préclinique ou clinique.

Procédures

Les modèles murins de MM consistent en l’injection par voie intraveineuse de cellules tumorales de MM humain ou murin à des souris éveillées (durée 1 min). Après 14 jours, notre stratégie thérapeutique sera injectée (par voie intraveineuse sur souris éveillées ; durée 1 min). Le développement de la tumeur et l'efficacité de nos cellules thérapeutiques seront suivis par imagerie in vivo sous anesthésie générale et ce une fois par semaine pendant toute la durée de l'étude (durée de la session : 10 min). Dans le cas où la prolifération des cellules cancéreuses serait rapide, nous Pourrions faire deux acquisitions d'imagerie par semaine. Sur toute la durée du protocole, chaque souris aura eu au maximum 12 séances d'imagerie. Nous réaliserons également des prélèvements de sang hebdomadaire (au niveau de la veine de la joue, sur souris éveillée; durée 30s; 5 prélèvements au maximum) afin de détecter les cellules tumorales circulantes. Ce type de suivi ne concernera qu'un petit nombre de souris pour lesquelles les cellules tumorales utilisées ne peuvent pas d'être détectées par imagerie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant être observés sont liés au développement du cancer du sang. Dans le modèle de MM humain, les cellules tumorales se multiplient dans la moelle osseuse. Ceci entraine fréquemment, quand le traitement n’est pas efficace, l’apparition d’une perte de mobilité qui dans la plupart des cas est suivi par une paralysie des pattes inférieures, s’accompagnant d’une perte de poids. Il est à noter que des tumeurs au niveau du crane sont également des évènements susceptibles d’être attendus sur ce modèle, néanmoins ces tumeurs apparaissent à long terme à environ 2 mois post injection des cellules tumorales. Dans le modèle de MM murin, les cellules tumorales s’accumulent au niveau de la rate, pouvant générer une douleur abdominale. Les souris pourront donc ressentir un stress lié à leur manipulation (anesthésie/imagerie répétée), des douleurs liées au développement de la maladie. Etant donné que les lignées utilisées n'ont pas de système immunitaire pour se défendre contre les microbes, un environnement non adapté (absence de barrière sanitaire) pourrait entraîner une mortalité précoce.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Nous analyserons à partir de la moelle osseuse et de la rate prélevées en post-mortem, les cellules thérapeutiques présentes afin d’identifier les gènes responsables de leur persistance sur le long terme.

Remplacement

Nous avons réalisé le maximum d'expériences in vitro afin de valider l'efficacité de nos cellules thérapeutiques. Cependant ces tests ne nous permettent pas d'évaluer à long terme ces cellules thérapeutiques. L’utilisation d’un organisme vivant entier est donc indispensable afin de reproduire les conditions observables chez l’Homme dans le cadre de leur utilisation en thérapie. De plus, il est nécessaire de vérifier ces résultats dans un modèle in vivo, car celui-ci intègre la plupart des caractéristiques de ces pathologies humaines telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, l’existence de tissus sains, la présence de barrières limitant l'efficacité des traitements

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisés au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Plusieurs groupes de souris seront analysés simultanément permettant de n’avoir qu’un seul groupe d’animaux « contrôle ». L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. Ce suivi clinique sera réalisé une fois par semaine. De plus la mesure hebdomadaire voire bi-hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle si devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple).

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles de MM humains et murins sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales) qui est l’âge de référence utilisé dans de nombreux modèle expérimentaux sur souris adultes.