Rongeurs

8 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Achetés déjà cathétérisés, ils reçoivent l'Enniatine B, une mycotoxine des céréales, par voies orale et intraveineuse, avec des prélèvements sanguins répétés et un séjour en cage à métabolisme, pour valider un modèle mathématique censé remplacer ensuite l'expérimentation. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale pour reproduire la cinétique plasmatique, qu'il juge "indispensable" à la validation du modèle. La mise à mort est justifiée par le fait que leur cathétérisation les rend inutilisables ensuite.

Objectifs

Les Enniatines sont des mycotoxines produites par des souches de champignons Fusarium et appartiennent à la classe la plus courante de contaminants des céréales. L’Enniatine B est la molécule la plus prévalent parmi les 28 homologues identifiés dans cette famille de molécules et par conséquent nos concitoyens peuvent être exposés à de faible doses de manière chronique dans leur alimentation quotidienne. Malgré le nombre considérable de propriétés pharmacologiques et toxicologiques et la prévalence de cette mycotoxine dans les aliments à base de céréales il est éthiquement impossible d’étudier in vivo sa toxicologie et donc sa toxicocinétique (et notamment son devenir plasmatique) chez l’humain. Ainsi ce projet de recherche se propose d’utiliser des méthodes alternatives permettant de pallier ce manque de données toxicocinétiques chez l’humain. Ces alternatives reposent sur 3 étapes: a) la génération in vitro (à partir d’essais de laboratoires sur cellules) de données essentiellement de métabolisme qui constituent l’élément principal des différences inter-espèces dans la pharmacocinétique de la molécule étudiée puis b) par l’extrapolation vitro/vivo permettant de prendre en compte le changement d’échelle de la cellule à l’organe et enfin c) par une autre modélisation mathématique dite « pharmacocinétique basée sur la physiologie » permettant d’intégrer ces données cellulaires et tissulaires au fonctionnement de l’organisme (animal ou humain) entier. Les essais in vitro ont déjà été réalisés en incubant l’Enniatine B avec des cultures primaires d’hépatocytes humains et de rats. Il s’agit désormais de valider les extrapolations des cellules a l'organisme faites pour le rat en générant des données in vivo du devenir plasmatique et en les intégrant au modèle mathématique. Le rat a donc été choisi car la comparaison avec l’humain aura été préalablement réalisée à partir d’expérimentations in vitro réalisées sur des hépatocytes primaires de ces deux espèces.

Bénéfices attendus

D’une manière globale, ce projet vise à déterminer les paramètres métaboliques quantitatifs de l’enniatine B: clairances in vivo et in vitro. Ces nouvelles données permettront de développer un modèle mathématique humain de l’enniatine B basé sur l’extrapolation de l’in vitro vers l’in vivo et permettront d’estimer les concentrations plasmatiques en enniatine B en fonction des scénarios d’exposition. Parallèlement, nous déterminerons les réponses moléculaires induites par l’enniatine B après exposition aigüe et répétée sur des hépatocytes primaires de rat et d’humain. Ces réponses permettront de définir les concentrations effectrices de toxicité. Ces concentrations effectrices pourront être comparés aux concentrations plasmatiques déduites du modèle mathématique et ainsi déterminer un risque de toxicité de l’enniatine B pour l’Homme.

Procédures

Le design de prélèvements se fera en deux séquences. Lors de la première séquence 4 rats seront choisis aléatoirement et recevront l’administration par voie iv (en moins de 10 secondes) et seront placés en cage à métabolisme afin de recueillir l’ensemble de leurs urines (recueil continu de l'ensemble des urines grâce à la cage à métabolisme). Deux rats se verront prélevés 0,1ml de sang 0min, 10min, 20min, 45min, 2h et 6h après l’administration tandis que les deux autres rats se verront prélevés 0,1ml de sang 5, 15min, 30min, 1h, 4h et 8h après l’administration. Lors de cette même séquence les quatre autres rats recevront l’administration par voie orale (en moins de 10 secondes). Deux rats se verront prélevés 0,1mL de sang 0h, 1h, 4h, 7h, 9h et 11h après l’administration tandis que les deux autres rats se verront prélevés 0,1ml de sang 1/4h, 2h, 6h, 8h, 10h et 12h après l’administration. L’ensemble des prélèvements de sang pour chaque rat sur cette première séquence est de 0,6 mL soit si l’on approxime le volume total individuel de sang à 30 mL, un prélèvement de 2% de ce total. Entre chaque administration, un temps suffisant pour permettre l’élimination de la molécule et la reconstitution d’une partie du sang des rats, sera respecté. Ce temps de récupération sera de 1 jour. Lors de la seconde séquence, le principe des séquences veut que les 4 premiers rats recevront cette fois-ci l’administration par voie orale et à l’inverse les 4 derniers rats recevront cette fois-ci l’administration par voie iv. Les prélèvements de sang réalisés sur chaque individu ont été limités à 6 prélèvements de chacun 100 μl par rat et par séquence. Ce qui fait pour chaque rat un prélèvement total de 4% du volume de sang individuel.

Impact sur les animaux

Pour réaliser la cinétique plasmatique, les rats seront achetés cathétérisés au fournisseur. A l’aide du cathéter, les prélèvements de sang seront totalement indolores et sans contention particulière. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention ferme (1 gavage par animal) mais la contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus d’une à deux minutes. De plus l’inconfort due au maintien en cage à métabolisme nécessaire au recueil de l’ensemble des urines, sera réduit à son strict minimum vis-à-vis de toute la durée d’hébergement (qui lui se fera en cage individuel), c’est-à-dire la phase de prélèvement de 8 heures après l’administration par voie intraveineuse (sur 4 rats lors de la première séquence et sur les 4 autres rats lors de la seconde séquence).

Devenir

Chaque rat sera mis à mort à l’issue de la seconde séquence de prélèvement de la procédure dans des conditions éthiques, étant donné qu'ils ne seront ni réutilisés, ni replacés ni adoptés du fait de leur cathétérisation.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternative non-animale pertinente actuellement permettant de reproduire la cinétique plasmatique et urinaire (avec la variabilité interindividuelle existante) des molécules chez des animaux vivants, indispensable à la validation des modèles mathématiques (qui une fois validés permettent de remplacer des expérimentations animales par simulation d’autres scénarii d’exposition).

Réduction

Dans un effort de réduction, le nombre d’animaux est calculé de manière à obtenir la quantité de prélèvements sanguins suffisante. Nous utiliserons 8 rats au total. La subdivision des groupes de 4 rats en deux sous-groupes permet de couvrir l’ensemble des échéances de cinétique et leur exploitation par une approche de population garantie ainsi une estimation de la variabilité interindividuelle des paramètres pharmacocinétiques de la population et de chaque individu. En outre, le design en séquences permet d’utiliser les mêmes animaux entre 2 administrations, en garantissant la fiabilité des données grâce à l’instauration d’un temps de récupération.

Raffinement

Concernant le raffinement, des points limites ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux. La douleur, le stress ou les contraintes seront atténués par des méthodes ou médications appropriées. Une analgésie sera mise en place si nécessaire. La contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Les prises de sang répétées seront effectuées par le cathéter permettant ainsi une récolte de sang non-douloureuse et limitant le stress. Les cathéters seront nettoyés à chaque utilisation avant fermeture avec un désinfectant à base de Chlorhexidine et une surveillance sera effectuée afin de détecter d’éventuels signes d’infection au niveau de cette ouverture sensible sur le système veineux. La procédure expérimentale est conçue pour limiter autant que possible la souffrance animale, en minimisant les interventions sur les animaux au strict nécessaire. Les animaux seront hébergés sur litières dans des boites en polypropylène, en respectant les normes (dimensions notamment) du bien-être animal et avec, à disposition, des enrichissements appropriés (hamac, igloo, jouets tels que des balles...). Les rats seront seuls par cage afin de limiter les risques d'arrachement du cathéter. L’hébergement en cage à métabolisme plus stressant pour l’animal mais nécessaire à un recueil rigoureux de l’ensemble des urines, sera limité à une période de 8 h par animal.

Choix des espèces

Sur la base de connaissances acquises sur l’Enniatine-B lors d’étude in vitro à partir de matériel biologique relevant des rats Sprague-Dawley, il convient de générer des données in vivo chez cette espèce afin de pouvoir les comparer aux données in vitro pour valider cette extrapolation et pouvoir la poursuivre avec le modèle mathématique. Les rats utilisés seront des rats Sprague-Dawley males d’environ 200-250 g (6-8 semaines). Ce stade a été choisi pour limiter la quantité d’Enniatine-B nécessaire tout en maximisant la possibilité d’obtenir des échantillons sériés de plasma. L’étendue indiquée ici dans leur stade de développement est due aux éventuelles contraintes du fournisseur en charge de la pose chirurgicale de cathéter.

Une partie des 288 souris porte des mutations parmi les plus fréquentes du cancer de la prostate humain, et à 5 mois, après un traitement au tamoxifène à 8 semaines de vie, les souris présentent selon le porteur des lésions précancéreuses et des adénocarcinomes. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : cinq injections intrapéritonéales quotidiennes, une chirurgie de 45 minutes pour implanter une mini-pompe qui diffuse pendant six semaines le composé GC7 ou une solution saline, puis une seconde chirurgie pour la retirer. Le porteur écrit avoir choisi la mini-pompe afin d'"améliorer le bien-être animal en évitant les injections quotidiennes", un choix qui impose deux opérations. Toutes sont tuées par lots, de trois semaines après le début du traitement jusqu'à un mois après sa fin, pour le prélèvement d'échantillons.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier les effets d'inhiber une forme de modification post-traduction de protéine qu'on appelle "hypusination" sur le développement du cancer de la prostate dans un modèle de souris. Nos résultats préliminaires démontrent qu'inhiber cette voie par un composé disponible commercialement bloque la multiplication des cellules cancéreuses de prostate. Afin de valider ces résultats chez la souris, nous traiterons les souris avec ce composé en diffusion continue grâce à l’utilisation de mini-pompes couramment utilisées en expérimentation animale. La diffusion est gérée par la mini-pompe qui envoie durant une période de 6 semaines une concentration régulière du traitement afin de traiter l’animal en continue en maitrisant la dose délivrée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si la voie de l’hypusination est impliquée dans la tumorigenèse du cancer de la prostate. Si c’est le cas, cette étude ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate qui dans ses formes résistantes à la castration possède actuellement un pronostic très sombre pour les patients avec une médiane de survie n'excédant pas 15 mois.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale par jour pendant 5 jours, soit 5 x 1 minutes, puis à une procédure chirurgicale sous inhalation d'isoflurane durant 45 minutes, temps d'implantation de la mini-pompe puis d'une seconde intervention chirurgicale à son retrait. L'administration du composé a lieu en continu pendant 6 semaines. A la fin du traitement, les pompes seront retirées sous anesthésie générale par inhalation d'isoflurane (30 minutes). Aucun prélèvement ne sera fait sur l'animal vigile.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir une éventuelle douleur post-opératoire ou une infection post-opératoire. Cependant, toutes les mesures seront prises pour éviter ces nuisances, avec une prise en charge sous aseptie et une administration systématique d'antalgiques, ainsi que surveillance et réévaluation rapprochée dans les suites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 1 mois après la fin de la procédure. La mise à mort est nécessaire pour le prélèvement des échantillons et leur analyse. Par ailleurs, un temps d'observation de 1 mois est nécessaire pour laisser le temps au composé d'agir et d'avoir un effet sur la croissance des tumeurs, ce qui justifie d'attendre un mois.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

En raison de l'hétérogénéité des tumeurs, et pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, il est nécessaire d'inclure 18 souris par groupe par génotypage et par temps (5 souris pour les analyses histologiques, 8 souris pour les analyses immunophénotypiques et 5 souris pour l'analyse des transcrits soit 2 génotypes x 18 souris x 2 conditions x 4 temps, donc 288 souris. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques. Nous aurons les génotypes des souris contrôle et des souris mutantes, et les 2 conditions eau saline et GC7. Pour évaluer l'effet du composé, nous sacrifirons un lot d'animaux 3 semaines après le début de l'administration, à 6 semaines après le début de l'administration, ce qui correspondra à la fin du traitement, puis 2 semaines plus tard et enfin à 1 mois après la fin du traitement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec protection du cycle veille/éveil par des systèmes de lampes programmées. Une nourriture adaptée aux rongeurs ainsi que des biberons d'eau seront disponible à volonté. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’implantation de la pompe avec surveillance des points de suture et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, de la buprénorphine sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Enfin, il a été fait le choix de l'implantation des mini-pompes afin d'améliorer le bien-être animal en évitant les injections quotidiennes en intra-péritonéales du composé qui peuvent causer des nuisances. La surveillance générale sera visuelle, avec un suivi de l'aspect global de l'animal, sa posture et son comportement. Si l'animal presente un dos voute, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave (blessure importante par exemple), l'animal sera mis à mort immédiatement. De la naissance à la mort et afin de favoriser le bien-être animal, les groupes sociaux des animaux seront respectés et aucun animal ne sera laissé seul. Nous mettrons aussi dans chaque case de la cellulose afin que les souris puissent se constituer un nid. Une nourriture enrichie sous forme de nourriture gelifiée sera mise dans les cages durant toute la durée du traitement par mini-pompe afin de favoriser une bonne alimentation des animaux.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le cancer prostatique humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de cancer de la prostate afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux seront injectés au Tamoxifène à 8 semaines de vie, puis les mini-pompes seront implantées 3 mois plus tard, soit à 5 mois de vie. A ce stade, les souris présentent des lésions prénéoplasiques et des adénocarcinomes. Pour évaluer l'effet du composé, nous sacrifirons un lot d'animaux 3 semaines après le début de l'administration, puis un lot à 6 semaines après le début de l'administration, ce qui correspondra à la fin du traitement, puis 2 semaines plus tard et enfin à 1 mois après la fin du traitement.

264 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation corporelle totale puis une greffe de cellules humaines, parfois leucémiques, et développent une réaction du greffon contre l'hôte ou des tumeurs, pour évaluer un sous-type de lymphocytes censé limiter cette réaction. Le porteur indique que les souris présentent une perte de poids d'environ 20 %, des diarrhées et une altération de l'état général, et ne seront pas conservées au-delà de 80 jours. Sur le remplacement, il affirme que ce modèle murin est "indispensable" à toute étude préclinique de thérapie cellulaire dans la greffe de moelle.

Objectifs

Ce projet de recherche concerne les lymphocytes NKT invariantes (iNKT), qui sont des cellules importantes dans notre système immunitaire qui ont la capacité de réguler les réponses immunitaires et de tuer les cellules cancéreuses. Lorsqu'une personne subit une greffe de moelle osseuse pour traiter une leucémie, les cellules du donneur peuvent attaquer les tissus sains du receveur, causant des dommages graves appelés "réaction du greffon contre l'hôte" (GVH). L'ajout d'iNKT au greffon pourrait aider à réguler la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé associés à la GVH tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour cela, il est important d'étudier comment les iNKT régulent la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé et déterminer la quantité d'iNKT nécessaire pour obtenir un effet bénéfique. Il est également essentiel de vérifier que l'ajout d'iNKT n'empêchera pas l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour atteindre ces objectifs, des modèles animaux seront utilisés pour étudier les effets de différentes quantités et sous-types d'iNKT sur la réponse immunitaire. Les interactions entre les iNKT et d'autres types de cellules immunitaires seront également examinées pour mieux comprendre leur rôle dans la régulation de la réponse immunitaire. Enfin, il sera étudié si l'ajout d'iNKT au greffon empêchera l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Les résultats de cette étude pourraient améliorer les traitements de greffe de moelle osseuse et réduire les risques associés à la GVH, tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe.

Bénéfices attendus

Dans le contexte de la greffe de moelle osseuse, les cellules humaines intégrées dans le greffon détruisent les cellules leucémiques du receveur mais peuvent également reconnaitre et attaquer les tissus sains du receveur (réaction du greffon contre l'hôte appelée GVH). La GVH est responsable de la mortalité de 20% des patients greffés. Par ailleurs, l’effet anti-leucémique ne se développe pas chez tous les patients et le taux de rechute de la leucémie survient chez environ 30% des patients greffés. Ce projet vise à valider un sous type particulier de cellules humaines (les iNKT) qui favorisera l’effet anti-leucémique, avec un moindre effet sur les tissus sains. L’utilisation de ces cellules pourrait par conséquent améliorer le devenir des patients greffés. Les résultats de ce projet pré-clinique sont indispensables à la poursuite du développement de ce traitement innovant en vue de mettre en place des études cliniques chez l’homme.

Procédures

Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 264 souris pendant 40 secondes par carrousel (6 à 8 souris). -Une injection intraveineuse (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 216 souris, et trois injections pour 48 souris, pendant 1 minute par injection. -Une injection intra-péritonéale (IP) sur animal vigile, au maximum 4 fois pendant 8 semaines sur 76 souris, pendant 1 minute par injections. -Un prélèvement de sang sur animal vigile sur 188 animaux, et cela à 21, 28 et 35 jours après la greffe de cellules humaines, pendant 2 minutes par prélèvement..

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress modéré lors de la procédure de radiothérapie à faible dose préalable à l’injection dans la veine caudale des cellules humaines. Ils développeront des signes cliniques de GVH à partir de 3 à 4 semaines après la greffe. Ces signes cliniques sont une perte de poids (-20% par rapport au poids pré-greffe) avec ou sans diarrhée et des signes de fatigue et d’altération de l’état général : voussure, perte de brillance du pelage, hérissement des poils, inflammation des yeux et diminution de l’activité dans les cas sévères. Ces signes sont gradés par le même expérimentateur selon le score de GVH. Le niveau de souffrance sera modéré. Dans les expériences où seront injectées des cellules leucémiques, les animaux présenteront à partir de 3 semaines après l’injection des signes de croissance tumorale avec prise de poids et développement de masses abdominales qui pourront altérer leur état général (augmentation du score clinique utilisé pour grader le degré de GVH). Le niveau de souffrance sera modéré.

Devenir

Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines plus ou moins avec des cellules leucémiques, une GVH ou une progression tumorale vont pouvoir se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ou en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences in vitro pour valider la fonctionnalité des cellules humaines de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé in vitro, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques : ainsi, l’expérimentation s’arrêtera dès l’obtention d’une différence significative entre les groupes (minimum 8 souris totales par groupe), et ne sera pas poursuivie en l’absence de différence statistiquement significative observée à 12 souris receveuses par groupe. Par ailleurs, les différentes étapes du projet seront conditionnées par les résultats obtenus dans les précédentes. Ainsi, au maximum 264 souris seront utilisées.

Raffinement

Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage de 500 cm2, dans un portoir ventilé, dans un secteur spécifique pour les animaux immunodéprimés en animalerie EOPS avec contrôle de la température (22+/-1°C), de l'humidité (55 +/-10%), du cycle jour de 7h à 19h. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évalution sera utilisé. Des points limites sont mise en place.

Choix des espèces

La souris NSG permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines car cette souris, ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans la greffe de moelle osseuse. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur la GVH et l’effet anti-leumique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 15 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.

200 souris "nude" vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de cancer du sein triple négatif dans le flanc et la glande mammaire, puis des injections de peptides trois fois par semaine pendant trois semaines, pour évaluer l'effet anti-tumoral de ces molécules. Le porteur indique qu'une perte de poids et une gêne à la locomotion liée au volume tumoral peuvent survenir. Sur le remplacement, il affirme n'avoir "pas d'autres choix" que le modèle animal, la culture in vitro ne recréant pas l'environnement tumoral.

Objectifs

Depuis plus de 10 ans, le cancer est la première cause de mortalité en France. Or il a été démontré qu’une protéine de la matrice extracellulaire est surexprimée et sécrétée par les cellules cancéreuses au sein du microenvironnement tumoral sous une forme immature. Cette protéine est considérée comme un marqueur de mauvais pronostic et de récurrence dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, cancer le plus fréquent chez les femmes en France, ce qui en fait une cible thérapeutique d’intérêt et notamment dans le cancer du sein triple négatif, un sous type pour lequel la plupart des stratégies thérapeutiques proposées sont déficientes. Il a été montré qu’une accumulation anormale de cette protéine stimule la prolifération des fibroblastes (cellules saines autour de la tumeur) qui vont à leur tour stimuler et entrainer la multiplication des cellules cancéreuses. C’est donc dans ce contexte que différents peptides ont été synthétisés afin de répondre à un besoin thérapeutique non satisfait notamment dans le cancer du sein triple négatif (TNBC). Ce projet permettra de déterminer l’effet anti-tumoral des différents peptides développés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus par ce traitement sont une diminution de la croissance tumorale liée à une diminution de la prolifération fibroblastique. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de valider les résultats obtenus in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée aux peptides dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo.

Procédures

- Injection de cellules tumorales au niveau du flanc droit (1 fois, moins de 5 minutes) - Injection de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire (1 fois, moins de 5 minutes) - Injection de traitement par voie intra-péritonéale, 3 fois par semaine pendant 3 semaines (2 min) - Identification des souris par tatouage au niveau des oreilles (durée moins d’une minute – 1 fois)

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être observée suite à l’injection des cellules tumorales et doit être prise en considération. Une gêne à la locomotion due au volume tumoral ainsi qu’à la localisation de la tumeur peut être observée.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de limiter la douleur et/ou l’inconfort liés au développement des tumeurs.

Remplacement

Une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. En effet, il est notamment très difficile de recréer exactement, in vitro, l’environnement tumoral. Ainsi, nous n’avons pas d’autres choix que d’utiliser le modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique des peptides « LBC ».

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Une observation à raison de trois fois par semaine des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Une attention particulière sera portée à l’observation des points limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera euthanasié. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance trois fois par semaine). En ce qui concerne les souris nude, elles seront hébergées dans des cages homologuées sur portoir ventilé, dans une litière en cellulose. Des outils d’imagerie non invasifs seront utilisés.

Choix des espèces

Les cellules MDA-MB-231 et Hs578T sont des lignées de cancer mammaire triple négatif humain. Des souris Balb/c nude (immunité réduite) seront donc utilisées pour l’injection de ces cellules afin qu’elles ne soient pas rejetées par le système immunitaire et qu’une tumeur puisse se développer. Des travaux antérieurs ont été réalisés sur ce modèle murin dans le cadre de l’évaluation de nouveaux agents thérapeutiques dans le traitement de différents cancers. La protéine étudiée est la même chez l’Homme et chez la souris. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte (jusqu’à environ 1 an chez la souris).