Rongeurs

24 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée d'organoïdes cérébraux humains, puis une ouverture de la cage thoracique et une exsanguination sous anesthésie, avant le prélèvement des greffons. Le porteur avance que valider ces organoïdes vascularisés pourrait à terme "réduire fortement l'utilisation d'animaux" pour l'étude des tumeurs cérébrales, un bénéfice conditionné à la réussite du modèle. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour vérifier la vascularisation, faute de circulation sanguine hors d'un animal vivant.

Objectifs

Les organoïdes cérébraux sont composés de différents types de cellules (neurones et cellules gliales) d’origine humaine constituant le cerveau. Nous développons une nouvelle génération d’organoïdes cérébraux qui sont pourvus également de vaisseaux sanguins, car la vascularisation joue un rôle essentiel dans la physiopathologie du cerveau. En particulier, dans le contexte de tumeurs cérébrales, la vascularisation favorise la survie et la croissance tumorale. Ce projet a pour but de valider que la vascularisation de ces nouveaux organoïdes est fonctionnelle. Cette validation sera obtenue par transplantation des organoïdes à des animaux. Ce nouveau modèle permettra d’étudier les mécanismes de la croissance des tumeurs cérébrales et de développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de vérifier que notre modèle d’organoïde comporte une vascularisation fonctionnelle. La présence de vascularisation est importante dans le cadre des études des tumeurs cérébrales car elle joue un rôle important dans le développement tumoral. Si la vascularisation des organoïdes est fonctionnelle, de nombreuses expériences sur les cancers cérébraux et, en particulier, les tests des médicaments anticancéreux ne nécessiteront plus l’utilisation d’animaux. Ce modèle réduira donc fortement l’utilisation d’animaux ; en particulier dans le cadre des études sur les tumeurs cérébrales comme le glioblastome.

Procédures

L’opération de greffe sous-cutanée des organoïdes cérébraux comporte 4 étapes (injection d’un antalgique, une anesthésie gazeuse, une incision cutanée et un point de suture) pour une durée totale de moins de 15 min/souris. Un mois après la greffe, un produit fluorescent sera administré sous anesthésie afin de colorer les vaisseaux sanguins. Cette opération comporte 5 étapes (injection d’un antalgique, injection d’anesthésique, ouverture de la cage thoracique, perfusion de la solution fluorescente et exsanguination) cette opération est suivie de la mort de l’animal. L’opération dure 15-20 min (sans compter la période de 30 min après l’injection d’antalgique);

Impact sur les animaux

Les opérations de greffe sous-cutanées ne sont pas très invasives et devraient n’entraîner que des perturbations physiologiques et cliniques mineures. Néanmoins, un stress opératoire et une douleur post-opératoire sont attendus mais cette dernière sera limitée par une pharmacologie adaptée. L’anesthésie pourrait entraîner une détresse respiratoire voire un arrêt cardio-respiratoire et ceux-ci seront surveillés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les organoïdes afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’existe pour vérifier que la vascularisation des organoïdes est effective. Les expériences de transplantation permettront à la vascularisation de l’organoïde de se « connecter » à la vascularisation de l’hôte grâce à une néo-vascularisation. En revanche, cette dernière ne peut être obtenue que si l’animal est vivant et permettre une circulation sanguine dans l’organoïde.

Réduction

La procédure sera réalisée sur un total de 6 lots d’animaux afin d’analyser des organoïdes d’âges différents obtenus avec deux lignées de cellules souches pluripotentes. Les analyses histologiques révèlent que la grande majorité des organoïdes que nous avons obtenus à ce jour présentent des structures ressemblant à des vaisseaux dès un mois. Ainsi, nous testerons deux groupes d’âge : organoïdes jeunes (1 mois) et organoïdes âgés (4-6 mois) pour les 2 lignées dont nous disposons. Par ailleurs, nous avons estimé qu’un nombre de quatre animaux par lot d’organoïdes serait suffisant pour appréhender la variabilité expérimentale. Ainsi, un maximum de vingt-quatre souris devra être utilisé pour ce projet (6 lots x 2 ages x 2 lignées). Les expériences seront réalisées de façon séquentielle afin d’arrêter le protocole si cela est suggéré par les premiers résultats.

Raffinement

Un protocole d’anesthésie/analgésie sera mis en place pour les greffes d’organoïdes. Par la suite, une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier l’état clinique des animaux et les critères d’arrêt de souffrance sont prédéfinis.

Choix des espèces

De nombreuses études ont montré la néovascularisation de greffons ou d’organoïdes humains lorsqu’ils sont greffés chez la souris adulte. Les xénogreffes seront réalisées chez des souris adultes âgées de 2 mois. La formation de nouveaux vaisseaux sanguins, ou néovascularisation, est toujours observée chez la souris adulte.

10432 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie gardée en vie comme modèles d'étude, les autres tués après l'imagerie pour prélever le cerveau. Ils subissent une à deux chirurgies stéréotaxiques, une anesthésie terminale pouvant durer six heures pour l'imagerie et des microdialyses répétées, afin de développer des techniques de microscopie de l'espace extracellulaire cérébral. Le porteur ramène les atteintes à un "stress de l'anesthésie", des infections de sutures et des douleurs chirurgicales, pour l'un des plus gros effectifs du lot. Il indique que la caractérisation de cet espace "nécessite" des modèles animaux mimant la complexité des maladies humaines.

Objectifs

La recherche sur le cerveau a fait d'énormes progrès au cours des dernières décénnies dans presque tous les domaines à l'exception de l'exploration de l'espace extracellulaire (EEC). C'est pourtant un compartiment élémentaire qui permet la communication entre les cellules cérébrales, grâce aux nombreuses molécules qui y transitent. L'espace extracellulaire est un système de compartiments interconnectés et limités par des membranes cellulaires. Il est composé par le fluide interstitiel et un échanfaudage dynamique connu comme la matrice extracellulaire (MEC). Environ 20% du volume cérébral est occupé par l'espace extracellulaire qui sert de microenvironnement pour le cerveau et forme un canal de communication chimique intercellulaire (appelé transmission de volume). Cette trasmission en volume peut être modulée par les propriétés biophysique de l'EEC, en particulier les paramètres de diffusion. Il a été montré que la structure et la diffusion de l'eec sont hétérogènes et qu'elles dépendent de conditions internes et externes à l'organisme. De plus, l'EEC est un reservoir pour les ions impliqués dans l'activité électrique des neurones et joue un rôle clé dans la transmission de substances neuro-actives entre les cellules. Ainsi, l'EEC n'est pas seulement le siège de toutes sortes d'intercations cellules-cellule, mais peut également jouer un rôle important dans des fonctions neuronales cruciales, telles que la mémorisation ou la formation de circuits neuronaux. Déterminer comment les molécules se déplacent dans l'espace extracellulaire est un défi très important, non résolu, qui freine l'étude des mécanismes cérébraux pathologiques et thérapeutiques. Le manque de connaissances résulte de l'absence de technologies spécifiques, permettant l'étude résolutive in vivo du microenvironnement.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’utiliser deux nouvelles approches de microscopie super résolutive développées dans nos laboratoires pour fournir une description détaillée de l’EEC et du réseau structurel de la MEC dans le tissu sain et pathologique : (i) technique de Shadow imaging (SUSHI) qui est une méthode de marquage où un fluorophore est injecté localement dans le cerveau afin de visualiser l’EEC avec une résolution nanométrique, (ii) technique d’imagerie de nano-objets uniques (suivi des nanotubes/nanoparticules de carbone). Ces approches permettront de composer, à une échelle nanométrique, une carte de l’espace extracellulaire et de sa matrice dans les régions d’intérêt. C’est pourquoi, nous proposons à travers cette étude qui regroupe quatre laboratoires phare en neurosciences à Bordeaux, de caractériser l’EEC via des technologies nouvelles et inédites de microscopie de super-résolution

Procédures

Chirurgie stéréotaxique (1h maximum), au maximum deux chirurgies stéréotaxiques pour les modèles pathologiques Anesthésie pendant la chirurgie (1h) et en terminal pour l'imagerie (jusqu'a 6 h), une fois par animal Imagerie (6h) une fois par animal Collecte d'échantillon par microdialyse sur animaux vigiles et non contraints, 4 fois espacées au minimum d'une semaine.

Impact sur les animaux

Ils sont représentés par l’utilisation de la chirurgie : stress de l'anesthésie, infection des points de suture, douleurs chirurgicales, déshydratation, perte de poids.

Devenir

Les animaux issus des procédures représentent la fabrication des modèles d'études seront gardés en vie. Les animaux issus de l'imagerie seront euthanasiés afin de récupérer les cerveaux pour une analyse histologique.

Remplacement

L'étude de l'espace extracellulaire a connu des avancées récentes, grâce au développement de techniques comme la microscopie en super résolution appliquée aux modèles ex vivo. Pour compléter les connaissances sur le sujet il est nécessaire d'obtenir des données sur l'animal sain et pathologique, à travers des modèles animaux réalisés chez le rongeur. Nous souhaitons caractériser l’espace extracellulaire sain et pathologique, nécessitant l’utilisation de modèles animaux pouvant mimer la complexité des maladies chez l’humain.

Réduction

Cette étude concerne un consortium composé de 4 laboratoires français qui à la fin de l’étude récupèreront des échantillons afin d’effectuer des études histologiques, complétant ainsi les études in vivo et ainsi la base de données scientifiques, limitant l’expérimentation animale à cette seule étude.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité.

Choix des espèces

L'utilisation de rongeur dans le développement d'outil de microscopie en super résolution est pertinente dans cette première phase de notre projet. En effet, la taille réduite de l'animal, son cycle de vie court et la disponibilté des modèles pathologiques permettent d'optimiser le développement d'outils pour l'imagerie in vivo de l'environnement extracellulaire. Souris : les animaux seront utilisés à l'âge de 2 mois et jusqu'a 4 mois, pour permettre de travailler avec des animaux sains et pathologiques adultes. Rats : les animaux seront utilisés au stades post nataux de P1 et jusqu'a P60 (2 mois) pour les animaux sains et pathologiques, qui correspond à un stade de jeune adulte, qui est la période où des troubles psychotiques peuvent apparaître

3840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales sous la peau, puis des vecteurs viraux AAV et des anticorps, avec des prélèvements de sang répétés, pour tester une stratégie censée stimuler une réponse immunitaire contre la tumeur. Le porteur reconnaît que les tumeurs peuvent former des métastases "causant de la souffrance animale" et une perte de poids importante. Il affirme que "seuls les modèles animaux" permettent de tester cette approche et envisage une production des vecteurs pour l'humain.

Objectifs

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, comme en témoigne le succés des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients bénificiant de ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie considérablement entre les différents cancers. Alors que les mécanismes de résistance primaires et secondaires ont été identifiés au cours des dernières années, il est devenu évident que pour les tumeurs faiblement immunogènes et/ou avec un faible infiltrat immunitaire, de nouvelles stratégies ont besoin d'être développées afin de stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. Dans ce contexte, les vecteurs viraux ciblant les cellules tumorales et/ou immunitaires semble être un outil idéal. L'objectif du projet est de développer une approche basée sur l'utilisation de vecteurs viraux de type AAV afin de cibler spécifiquement les cellules tumorales et/ou les cellules suppressives du microenvironnement tumorale afin de stimuler les réponses immunitaires dirigées contre la tumeur. Ces AAV ont montré des résultats intéressants in vitro avec l'induction d'une mort cellulaire et d'une inflammation qui nous semble favorable à l'induction des réponses immunitaires in vivo. Nous pensons que l'injection intratumorale entrainera l'induction d'une réponse immunitaire, ce qui entrainera une diminution de la croissance tumorale, voire un rejet. Avec cette approche, nous introduisons une capacité lytique des cellules tumorales par les différents AAV, qui n'est normalement pas présente naturellement dans les AAV.

Bénéfices attendus

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, comme en témoigne le succés des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients bénificiant de ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie considérablement entre les différents cancers. De nouvelles thérapies innovantes ont donc besoin d'être mise en place. Pour ce faire, nous attendons que l'injection intra-tumorale des AAV codants pour les différentes morts cellulaires immunogéniques (pyroptose et nécroptose) induise un rejet de la croissance tumorale avec l'induction d'une réponse immunitaire permettant l'augmentation de la survie des animaux traités. De plus, l'utilisation de nos vecteurs codants pour les protéines inductrices de mort cellulaire immunogénique seule mais aussi en combinaison de différentes cytokines apporte des effets à long terme chez nos animaux avec la mise en place d'une réponse immunitaire de longue durée permettant le contrôle voire le rejet à long terme des différents modèles tumoraux. L'association avec des immunothérapies connues permettrait d'amplifier ces phénomènes et donc d'obtenir un meilleur contrôle de la croissance tumoral (médié par le système immunitaire). Les vecteurs AAV possèdent de nombreux avantages et ont déjà été approuvés en clinique en Europe et aux états-unis. Il est donc envisageable de produire ces vecteurs pour une utilisation chez l'homme si nos stratégies se montrent convaincantes.

Procédures

Injections de cellules tumorales : injection en sous-cutanée sur le flanc, sur animal anesthésié. Les souris seront injectées deux fois maximum pour les protocoles de vaccination et une seule injection pour les autres protocoles. Chaque injection dure moins de 10 secondes. Prélèvement de sang sur animal anesthésié. Les souris seront prélevées maximum 3 fois à une semaine d'intervalle entre les prélévements et en phase terminale. Les prélevements de sang durent moins de 10 secondes. Injections pour l'administration d'anticorps thérapeutiques : injection en intrapéritonéale (IP) sur animal vigile. Ces injections IP seront répétées 4 fois maximum avec un intervalle d'injection de 2 jours entre les administrations. Les injections durent moins der 10 secondes.

Impact sur les animaux

Il est possible que l'injection en sous-cutanée sois mal réalisée et entraine une injection de cellules tumorales dans des tissus non souhaités. Cependant, ce problème est contrebalancé par l'expérience que nous avons dans le laboratoire sur ce type d'injection. Une fois injectées, les cellules tumorales peuvent former des tumeurs secondaires (métastases) dans différents tissus causant de la souffrance animale. Pour limiter cet ecueil, le nombre des cellules tumorales à injecter est bien documenter dans littérature limitant de ce fait ce phénomène. Les modèles tumoraux peuvent induire aussi une perte de poids importante et un mauvais état global de l'animal. De plus, l'injection d'AAV codant pour des formes de mort inflammatoires pourrait induire une inflammation systèmique si les différents AAV vont transduire différents organes ou tissus de l'animal. Cependant nous limitons cet effet secondaire par une injection intratumorale avec un volume d'injection limité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever le sang et des organes pour analyse.Aucun animal ne peut donc être replacé, adopté ou réutilisé.

Remplacement

Seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration qui existe entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique ne peut se faire que chez l’animal. Dans ce cadre la souris est utilisée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée pour optimiser les protocoles expérimentaux et s’assurer de la non-obtention de résultats déjà publiés. Le nombre d’animaux utilisés sera déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, des étapes de sélection in vitro des meilleurs candidats sera effectuée afin de réduire drastiquement le nombre d'animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée qui peut être limitée en se basant sur une grille d’observation visant à définir des points limites à partir desquels l’expérience sera arrêtée immédiatement. Si les animaux présentent des signes de douleur, un anti-douleur sera utilisé. Un enrichissement est également apporté par des abris de cellulose et des carrés de coton vierge.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris permet aussi l’utilisation de modèle transgénique, des modèles de Knock-Out qui peuvent être intéressant dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le cancer. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (animaux âgés entre 6 et 8 semaines au début de protocole) afin que le système immunitaire soit mature au moment de l’inoculation de la tumeur et de l’injection intra-tumorale des différents AAV.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation d'un canal sodique cardiaque, elles subissent l'implantation chirurgicale de capteurs de télémétrie et trois échocardiographies sous sédation avant que leur cœur ne soit prélevé. Le porteur qualifie ses investigations d'"indolores et non-invasives" tout en décrivant une étape chirurgicale de 25 minutes et un isolement de dix jours en cage individuelle. Il affirme que la progression de la maladie ne peut s'étudier que dans un "organisme entier" et conclut qu'aucune méthode de substitution n'existe.

Objectifs

Le projet consiste à étudier une pathologie : la cardiomyopathie dilatée, liée à une mutation d’un canal ionique (sodique) cardiaque. Le mécanisme induit par la mutation est nouveau. Les investigations in-vivo sont essentielles pour comprendre le développement de la pathologie et permettre de nouvelles approches thérapeutiques. Il s’agira de caractériser, de manière non-invasive, les effets de la mutation sur différents paramètres cardiaques clés d’un modèle murin (souris) porteur de la mutation.

Bénéfices attendus

Des données cliniques humaines associent la mutation étudiée ici à une cardiomyopathie dilatée. La mutation d'un canal ionique est le plus souvent accompagné par le développement d'un phénotype remarquable in-vivo, pouvant se traduire par des effets sur l'électrocardiogramme (ECG), avec la survenue d'arythmies très souvent létales, et des modifications de la structure, de la morphologie et de la fonction du cœur. L'étude in-vivo est incontournable pour valider le concept du lien entre la mutation et la cardiomyopathie dilatée, étudier la relation gène-phénotype complexe (parfois contre-intuitive), et évaluer le potentiel thérapeutique de molécules visant, soit directement la cible d'intérêt, soit indirectement le remodelage cardiaque pathologique. A notre connaissance, il n'y a aucune étude équivalente à l'heure actuelle.

Procédures

Les investigations in-vivo sont indolores et non-invasives. On notera une étape chirurgicale légère, unique, d'une durée de 25 minutes qui consiste à implanter les capteurs de signaux en amont des enregistrements d’ECG en télémétrie. Les capteurs sont retirés après le sacrifice des animaux. Les enregistrements ECG sont complètement neutres pour l’animal (pas de présence humaine, pas de stress, réalisés en ambulatoire comme chez l’homme). Trois échocardiographies seront réalisées avec des anesthésies légères et un stress limité à une manipulation pendant 10 minutes.

Impact sur les animaux

La lignée murine utilisée, génétiquement modifiée, est établie depuis plusieurs générations avec une transmission de la modification génétique stable. Ni dans le laboratoire qui l’a établie, ni dans notre étude pilote, il n’a été noté de phénotype dommageable. Le phénotype est purement cardiaque (comme attendu) avec une insuffisance cardiaque, modérée et stable, et des troubles du rythme ne conduisant pas à la mort subite. L’échocardiographie est une méthode de choix pour l’exploration indolore de la morphologie et de la fonction cardiaque in-vivo. Sa nature non invasive permet des études longitudinales avec un suivi des animaux au cours du temps. Elle permettra de caractériser la fonction cardiaque in-vivo (3 investigations). Le stress subi se limite à la manipulation pendant une période courte (10 min/animal). Une sédation légère permet l’obtention d’images échocardiographiques de qualité (rythme cardiaque proche de la physiologie). Concernant l'enregistrement des ECG par télémétrie en ambulatoire, le bénéfice expérimental inclut l’absence d’interférence liée à une anesthésie, sans limitation de la durée d’observation, avec un accès aux périodes diurnes et nocturnes, une qualité supérieure du signal. La nuisance liée à l'implantation chirurgicale des capteurs (25 minutes) est limitée. Après l’implantation, les aninaux sont maintenus en cage unique pendant 10 jours pour : (i) éviter des blessures au niveau des cicatrices chirurgicales par les congénères (risque d’inflammation ; modification des conditions expérimentales) et, (ii) respecter la nécessité technique d’avoir un seul animal par plaque (qui est le receveur des signaux) d'enregistrement de l'ECG.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour prélever le coeur à des fins d'études in vitro (électrophysiologie, biochimie, histologie).

Remplacement

Le projet, dans sa globalité fait appel à des approches in-vitro et in-vivo. Les approches in-vitro concernent la caractérisation des effets moléculaires et cellulaires de la mutation. Elles permettent de comprendre les mécanismes de base, sans utilisation d’animaux. Pourtant, la validation des effets dans un modèle expérimental in-vivo est indispensable pour évaluer l’impact de la mutation sur la fonction cardiaque intégrée. Il n'existe actuellement aucune méthode (in-vitro ou in-silico) de substitution. Le cœur est un organe complexe, en interaction forte avec de nombreux autres systèmes. La progression de la maladie et les nombreux effets qui découlent de la mutation ne peuvent être étudiés que dans un organisme « entier ». La validation du modèle et les connaissances acquises permettront cependant d’évoluer vers l’utilisation de cellules cardiaques dérivées de cellules souches de patients en se basant en partie sur les connaissances acquises in-vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en obtenant des informations fiables et robustes, nous utiliserons deux techniques de choix dérivées d’approches couramment utilisées chez l’homme en clinique ; à savoir : (i) l’électrocardiograhie (ECG par télémétrie) et (ii) l’échocardiographie. Elles permettent toutes les deux un suivi de l’animal au cours du temps ; ce qui permet d’augmenter la puissance statistique et de limiter le nombre d’animaux utilisés dans le cas d’une pathologie évolutive comme la cardiomyopathie. Les animaux peuvent ainsi faire l’objet d’investigations répétées (chaque animal étant son propre témoin), au lieu d’être sacrifiés à chaque stade de la pathologie. Le protocole expérimental a été conçu à partir d'études similaires. Notre expérience permet, pour chacun des paramètres étudiés, de définir de manière pratique, le nombre minimum, mais scientifiquement nécessaire, d'animaux dans chaque groupe. Il est à noter que le phénotype cardiaque murin normal est parfaitement connu; ce qui simplifie et fiabilise les interprétations scientifique, et réduit ainsi le nombre d'animaux nécessaire.Nous avons évalué le nombre d’animaux nécessaires par une étude statistique, établi à un minimum de 10 par groupe (échocardiographie, ECG). Dans un souci de Réduction, chaque animal sera également utilisé pour mesurer plusieurs autres caractéristiques (physiologiques, histologiques, biochimiques et moléculaires).

Raffinement

Nous réaliserons des approches in-vivo non invasives (électrocardiographie, échocardiographie) pour comparer le phénotype murin pathologique avec la pathologie humaine afin de transférer les résultats et les connaissances acquises vers la clinique. Nous veillerons à maintenir les meilleures conditions de vie possibles pour les animaux tout au long du protocole, ce qui garantira aussi la qualité et la pertinence des résultats scientifiques. Cela inclut la réduction des contraintes pour les animaux, en matière de stress (ex : période de « repos » après le transport), de douleurs éventuelles (soins adéquats avant, pendant et après l’implantation des capteurs de télémétrie ; anesthésie/analgésie), d’enrichissement du milieu (jouets, tunnel, etc…), de détresse, de points limites et d’arrêt anticipé des procédures expérimentales. Une grille d’évaluation avec différents scores a été établie pour mesurer, réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse, et pour définir précisément des points limites et l’arrêt anticipé de la procédure.

Choix des espèces

Les animaux transgéniques sont principalement des modèles murins (souris). Les rongeurs sont effectivement le modèle le plus couramment utilisé en laboratoire. Ceci est particulièrement vrai pour l’étude du phénotype pathologique résultant de mutations humaines (comme décrit ici). Le phénotype cardiaque murin normal est parfaitement connu, à la fois au laboratoire et via une bibliographie abondante ; ce qui simplifie et fiabilise les analyses et les interprétations scientifique. Cela réduit aussi le nombre d'animaux nécessaire pour maitriser le modèle. Les animaux seront réceptionnés au stade jeune adulte, entre 4 et 8 mois. Ils seront utilisés après une période d'adaptation dans l'animalerie. Le stade choisi rend plus faciles et précises les investigations échocardiographiques et l'implantation des capteurs de télémétrie pour l'ECG (taille de l'animal). Il s’agit également d’un stade approprié pour l’étude de la progression de la cardiomyopathie.

6500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendus porteurs de tumeurs disséminées de type leucémie ou métastases, souvent après xénogreffe de cellules humaines chez des animaux immunodéprimés, ils subissent irradiations, administrations répétées, prélèvements de sang et de moelle osseuse et séances d'imagerie, pour évaluer des candidats médicaments avant leur passage chez l'humain. Le porteur indique que le développement tumoral induit une perte de poids et des difficultés locomotrices, et prévoit une trentaine d'études par an. Il décrit les modèles de reconstruction en 3D comme "marginaux" et aux résultats "difficilement transposables à l'homme", concluant au caractère "indispensable" du recours aux rongeurs.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Un système d’identification sera mis en place sur tous les animaux, sous anesthésie générale (moins de 1 minute, une seule fois). Induction tumorale de tous les animaux sous anesthésie (moins de 1 minute, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 2 heures). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 minute) Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 1 minute). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 1 minute) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : - Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Technique d’imagerie, potentiellement répétée: sous anesthésie générale entre 10 et 45 minutes (en fonction des techniques).

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal: -Identification des animaux -Transport vers le site où est réalisée l’irradiation -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale -Traitements par voies orale, Intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée ou radiothérapie -Suivi des animaux par imagerie Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang ou de moelle osseuse en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : Le développement tumoral induira une perte de poids et des difficultés locomotrices.

Devenir

Les animaux étant porteur de tumeur ils seront tous mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidatsmédicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations des paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individu. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Près de 30 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle) à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisée dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal. En général, en oncologie et du fait de la randomisation, le nombre d’animaux greffés est supérieur au nombre d’animaux utilisés randomisés dans chaque groupe. Pour les modèles disséminés ce nombre d’animaux surnuméraire est réduit à un maximum de 10% (pour 100 animaux, 110 seront greffés). Au-delà, une dérogation sera demandée et le modèle sera expertisé pour évaluer si plus de 10% des animaux sont réellement nécessaires. Dans tous les cas, il sera recommandé l’utilisation d’un minimum de résidus

Raffinement

Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. L’induction tumorale se fera sous anesthésie. avec traitement antalgoique adaptée. L’induction tumrale fera l’objet d’une surveillance et de soins post induction seront pratiqués si nécessaires. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse, les animaux en plus d’être anesthésiés recevront une antalgie adaptée. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations du comité éthique en termes de volume, d’anesthésie, de fréquence et d’antalgie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux Dans toutes les cages, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.