Rongeurs
Thérapie génique pour les rétinopathies par surexpression d’un facteur de transcription CRX sur différents modèles murins
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
9 144 souris de huit lignées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection d'un virus AAV sous la rétine sous anesthésie, des anesthésies répétées pour des examens de la vision (électrorétinogramme, tomographie optique) et des tests comportementaux nommés, optocinétique et exploration d'une boîte claire ou obscure, pour valider une thérapie génique de surexpression du gène CRX. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animal ne reproduit la rétine, tissu complexe, et conclut à la "nécessité" de recourir à la souris. Les retombées annoncées pour les patients atteints de rétinopathies restent renvoyées à un stade ultérieur, l'objectif immédiat étant de tester l'efficacité et la sécurité du traitement chez la souris.
Objectifs
La perte progressive des photorécepteurs (PR), les cellules sensibles à la lumière de notre œil, sont des causes fréquentes de déficience visuelle avec une prévalence de 1/4 000. Certaines de ces pathologies sont liées à des facteurs de transcription spécifiques aux photorécepteurs, comme le cone-rod homeobox (CRX). Les facteurs de transcriptions sont primordiaux pour le développement des photorécepteurs, leur différentiation en cônes ou en bâtonnets, leur maintien et leur fonctionnement. Ils permettent l’expression d’autres gènes, et sont donc en amont de nombreuses voies. Une mutation, un défaut, dans ce genre de gène induit donc de nombreux changements qui peuvent conduire notamment à la mort des photorécepteurs. Par ce projet, nous souhaitons valider notre traitement thérapeutique pour soigner les patients atteints de ces mutations sur Crx, mais aussi sur d’autres gènes important pour la rétine. Les modèles de souris mimant ces pathologies, et présentant différentes mutations dans Crx ont déjà permis de comprendre le fonctionnement de ce gène et d’approfondir nos connaissances sur les rôles tenus par ce facteur de transcription. Il nous est désormais possible d’exploiter nos nouvelles connaissances pour proposer des solutions thérapeutiques aux pathologies liées à Crx. Nous proposons de surexprimer Crx au moyen d’un Adeno-Associated Virus (AAV). L'efficacité et la sécurité des thérapies géniques, au moyen d'injections d’AAV, ont été prouvées avec des succès précliniques démontrant leur efficacité clinique. Chez un de nos modèles de souris Crx aveugle, nous avons précédemment montré que notre traitement permettait de restaurer partiellement les photorécepteurs et ainsi d’établir une basse vision. Nous devons maintenant tester cette thérapie sur d’autres modèles présentant d’autres mutations dans Crx pour valider notre thérapie sur plusieurs pathologies. Nous souhaitons améliorer l’efficacité de notre AAV, pour répondre plus efficacement à ces différentes pathologies. Nous souhaitons également pouvoir proposer notre traitement à d’autres patients, atteints de dégénérescence rétinienne non liée à Crx. Pour cela, nous utiliserons encore une fois des souris qui mimeront des pathologies telle que la rétinite pigmentaire (RP), et qui nous permettront de valider l’effet protecteur de Crx pour d’autres pathologies.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, peu de thérapies sont proposées aux patients atteints de rétinopathies, ou dégénérescence visuelle. La plupart permettent uniquement de ralentir les symptômes, mais ne ralentissent pas la mort des cellules et encore moins des photorécepteurs, nos cellules sensibles à la lumière. Ils doivent donc vivre avec leur perte de vision sans solutions efficace. Il existe actuellement quelques traitements de thérapie génique, qui sont eux plus efficaces, mais ils ne sont proposés qu’en fonction de la mutation génétique du patient induisant la maladie. Hors il existe des dizaines de gènes, ayant eux-mêmes des dizaines de mutations possibles, qui peuvent entrainer une même maladie. Ces traitements sont donc à usage très limités. Nous réalisons ce projet afin de développer une thérapie génique efficace aussi bien pour des rétinopathies liées à un facteur de transcription spécifique, CRX, que ce soit une mutation dominante ou non, qui n’ont pour l’instant pas de traitement disponible, que pour des rétinopathies liées à d’autres gènes, et entrainant la perte des photorécepteurs. Ce serait donc un traitement plus général, applicable au plus grand nombre. Nous espérons par ce projet démontrer l’efficacité de notre traitement sur plusieurs modèles de souris. Ces différents modèles présentent soit une mutation dans le gène Crx, soit une mutation sur d’autres gènes connus. Dans tous les cas, ces souris miment les pertes de visions humaines. Si notre produit s’avère efficace sur ces animaux, nous auront alors la preuve de notre concept. Nous pourrons donc produire notre traitement à plus grande échelle, afin de le proposer en essai clinique pour les patients. Nous espérons ainsi pouvoir proposer un réel traitement thérapeutique qui permettra aux patients de voir aussi longtemps que possible.
Procédures
Nous utiliserons 8 lignées de souris ayant des pathologies différentes, qui permettront de mesurer l’impact que pourrait avoir notre traitement thérapeutique et le nombre de patient que cela pourrait aider par la suite. Toutes les souris recevront une injection sous rétinienne d’AAV sous anesthésie générale (1 à 2 min par œil). La bonne réalisation de l’injection sera validée par observation sous macroscope. Certaines souris seront euthanasiées à différents temps après les injections, pour collecter les rétines, sans suivre d’autres expérimentations. Une partie des animaux seront de nouveau anesthésiés à 35, 60, 90, 155, 270 et/ou 360 jours, pour réaliser un ERG (mesure non invasive de la réponse électrique de la rétine à un stimulus lumineux) et un OCT (visualisation non invasive de la rétine en coupe chez la souris) sur les deux yeux (environ 20/30 minutes pour les deux tests). Ces examens sont non invasifs et nous permettent de mesurer la fonction visuelle de la souris. Une autre partie des souris passeront un test d’optocinétique à 65, 95, 155, 275 et/ou 365 jours (3 x 20minutes espacés d’1 heure minimum). Ce test permet de quantifier les reflexes oculaires de la souris et se fait donc sur animal vigil. Elles pourront également réaliser un test comportemental appelé clair/obscur (5 minutes), ou la souris est filmée en train d’explorer une boite soit noire soit éclairée, afin de visualiser son comportement face à la lumière, les souris étant des animaux nocturnes. Ces tests nous permettent de mesurer la vision réelle de la souris. A chaque temps, à la fin de ces tests, des souris seront euthanasiées pour analyser les rétines en coupe histologiques, ou quantifier la production d’ARN ou de protéines.
Impact sur les animaux
Plusieurs modèles de souris seront utilisés dans cette étude. Les techniques qui seront effectuées pour évaluer l’efficacité de notre thérapie génique sont peu invasives et couramment utilisées en recherche ophtalmologique (électrorétinogramme, tomographie par cohérence optique, tests d’optocinétique). Les phénotypes des animaux utilisés sont restreints à la rétine. La vision est un des sens les moins utilisé par la souris, qui est plutôt un animal nocturne. Le caractère non dommageable des lignées murines utilisées pour ce projet a d’ailleurs été établi précédemment par la Structure chargée du Bien-Être Animal (SBEA). Les souris élevée dans le noir jusqu’à leur 28 ème jour (chez les rd10, afin de préserver la rétine du stress dû à la lumière, qui induit la dégénérescence rétinienne dans ce modèle) ne développent pas de stress particulier. Les anesthésies répétées peuvent être dommageables pour les souris, mais elles sont espacées de 14 jours minimum, et les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et quotidiennement. Une grille d’évaluation nous permet d’ailleurs de suivre le bien-être de l’animal tout au long de sa vie, par différentes observations. Si un animal présente des signes de douleurs, il sera pris en charge. L’injection sous rétinienne se réalise également chez l’homme, et n’engendre pas de douleurs. Le décollement rétinien dû à la procédure se résorbe en 48h. Par précaution, nous prévoyons d’utiliser un analgésique local et un anti-inflammatoire. Une opacification de la cornée peut être observée malgré l’ajout systématique de gel ophtalmique. Si une cataracte apparait néanmoins, elle se résorbe normalement d’elle-même rapidement. Si les animaux présentent des saignements anormaux dans l’œil lors de l’injection ou avant leur réveil, ils seront euthanasiés. A la fin des procédures, les animaux sont euthanasiés, ce qui permet d’étudier la rétine à un niveau cellulaire et moléculaire, pour valider l’efficacité de notre traitement.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, afin de récupérer les rétines et réaliser des marquages immunologiques sur les coupes histologiques, ou analyser les effets de notre traitement au niveau transcriptomique et protéique.
Remplacement
Le projet visant la validation d’une stratégie thérapeutique pour le traitement de maladies rétiniennes, une validation de ces approches in vivo est un prérequis des agences réglementaires avant la mise en place d’essais cliniques. Il est également fondamental de travailler sur des modèles animaux présentant des pathologies comparables à celles développées chez l’Homme. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie également par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel correct. Dans ce contexte il est essentiel de travailler in vivo car les processus de mort cellulaire, de neuroprotection, ou de réparation sont totalement dépendants de l’environnement cellulaire. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Notre étude se déroule sur 5 ans, et comprend l’analyse de plusieurs lignées. Ces différentes lignées sont importantes pour vérifier que notre stratégie thérapeutique va cibler le plus grand nombre de patients ainsi que pour comprendre le mécanisme d’action. Nous indiquons ici un nombre d’animaux surestimé pour réaliser toutes les expérimentations que nous pensons nécessaire, mais cela sera ajustable. Le nombre de modèles à étudier pourra être revu à la baisse en fonction des résultats obtenus sur les autres modèles. Finalement, si nous nous apercevons que le traitement n’est plus efficace à partir d’un certain temps, les temps restant supérieurs ne seront pas réalisés. Notre étude commencera toujours par établir la dose d’AAV à injecter à chaque modèle sur les temps courts. Nous comparerons ensuite l’efficacité de nos deux AAV, pour ne réaliser les procédures chez ce modèle qu’avec l’AAV à la dose efficace. Si les anesthésies répétées s’avèrent trop néfastes pour les animaux (difficultés au réveil, difficultés de récupérations…) nous réduirons le nombre de tests nécessitant une anesthésie. Les animaux étudiés aux temps les plus lointains pourront donc être moins suivis que prévu. Si un nombre d’individus correctement injecté pour obtenir les résultats statistiques souhaités est atteint avant d’avoir utilisé tous les animaux prévus, nous pourrons utiliser les animaux pour les autres expériences ou stopper la reproduction. Le but est d’obtenir 12-18 yeux, en fonction des expérimentations, pour chaque vecteur, à la fin de la procédure. Le taux de réussite d’injections pouvant varier entre 50% et 75%, nous prévoyons donc plus d’animaux que nécessaire. Nous ne garderons que les animaux correctement injectés dans au moins un œil, ceux-ci pouvant être analysés séparément dans la plupart des expériences. Les autres seront sacrifiés à la fin de l’injection, encore sous anesthésie.
Raffinement
Durant l’injection sous-rétinienne, une anesthésie locale sera effectuée en plus de l’anesthésie générale. Une goutte de gel oculaire hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil. Afin de prévenir une éventuelle douleur, les animaux recevront un anti-inflammatoire suite à l’opération. Ils seront observés quotidiennement pour surveiller l’apparition éventuelle d’infection oculaire. Une grille d’évaluation de la douleur est utilisée pour apprécier l’état des animaux. Si des signes de douleur ou de gêne se manifestent, ou en cas de perte d'appétit ou de prostration, les animaux seront soignés autant que possible, mais pourront être euthanasiés si leur état se dégrade trop. Les animaux qui entreront dans notre protocole seront suivis à divers temps de manière non invasive et indolore, grâce à nos équipements. Dans le but de réduire le plus possible la douleur, souffrance ou angoisse, nous imposons : - des conditions d’élevage conformes à la directive 2010/63/UE et à la STE123 (animaux en groupe autant que possible, nidification et abris, croquettes et eau à volonté, change hebdomadaire). - des méthodes d’anesthésie adaptées à l’âge de l’animal. - des méthodes d’évaluation de la douleur par une observation et un suivi quotidiens.
Choix des espèces
La thérapie génique que nous souhaitons développer nécessite d’être validée in vivo avant d’être testée chez l’homme. Afin d’être le plus proche des pathologies humaines que nous souhaitons traiter, et ainsi évaluer les bénéfices/risques de notre approche thérapeutique, nous prévoyons d’utiliser des souris comme modèle d’étude. L’existence de lignées de souris atteintes naturellement ou non de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. Nos modèles sont bien établis en recherche ophtalmologique. Chaque modèle est différent, et les temps choisis pour les injections correspondent aux contraintes imposées par la dégénérescence rétinienne. Nous observerons ensuite les effets de notre traitement entre 3 semaines et 1 an après injection.
Coopération de mutations géniques et de l’inflammation dans le développement de la leucémie myélomonocytaire chronique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des souris receveuses sont irradiées pour détruire leur moelle osseuse, greffées avec des cellules mutées, puis suivies jusqu'à deux ans par prises de sang répétées, avec des injections induisant une inflammation chronique. Le porteur indique que l'irradiation peut entraîner infections opportunistes, anémie, apathie et perte de poids dans les deux semaines suivant la greffe. Il conclut qu'il est "indispensable" de développer un modèle murin, la leucémie ne pouvant selon lui être étudiée in vitro.
Objectifs
Les leucémies sont des cancers du sang c’est-à-dire qui affectent la production normale des cellules sanguines. Les cellules du sang sont renouvelées quotidiennement à partir de cellules souches qui se trouvent dans la meolle osseuse : les cellules souches hématopoïétiques. Ces cellules sont douées d’auto-renouvèlement et sont donc responsables de la production des toutes les cellules du sang (les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes) tout au long de la vie. Il est donc tout à fait crucial de préserver leurs fonctions. Quand ces fonctions sont altérées, par exemple par exemple par des stress environnementaux (radiations) induisant des changements dans l’expression de certains gènes, cela conduit au développement de leucémies. La leucémie myélomonocytaire chronique est une leucémie caractérisée par l’accumulation de monocytes, un type des globules blancs circulants dans le sang. Cette maladie touche le sujet âgé. Elle est peu fréquente mais grave, avec une survie inférieure à 3 ans. L’âge avancé des patients ne permet pas d’utiliser la greffe de moelle osseuse et il n’existe actuellement aucun traitement curateur. De nouvelles approches thérapeutiques sont donc nécessaires. Il n'est pas possible de modéliser les fonctions des cellules souches hématopoïétiques, base du cancer, in vitro. De même, le processus de développement d’une leucémie requiert l’environnement de la moelle osseuse impossible à reproduire dans une boite de pétri. Il est donc indispensable de développer des modèles murins mimant le plus fidèlement possible le développement de la maladie pour tester des molécules d’intérêt thérapeutique et en découvrir de nouvelles. Notre projet a pour but de : 1/ Développer des modèles de leucémie myélomonocytaire chronique chez la souris ressemblant au plus près à la maladie humaine et qui s’adapteraient à une étude clinique. Comprendre les mécanismes d’aggravation de la maladie. (2) Etudier le rôle d’une inflammation chronique sur le développement de la leucémie. Au cours de la vie nous subissons de nombreuses infections bactériennes ou virales qui mettent en jeu le système immunitaire et la production de monocytes dans le sang et créent une inflammation chronique. (3) Etudier les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie et analyser les mécanismes de la naissance du cancer pour découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. (4) Tester un composant chimique sur le développement et la guérison de la maladie.
Bénéfices attendus
Il n'existe pas de traitement curatif spécifique de cette leucémie qui reste donc une maladie très sévère, induisant la mort des patients dans les 30 mois après le diagnostic. Il n’existe pas non plus de bons modèles de souris mimant cette pathologie humaine. En développant de tels modèles, notre projet permettra de tester de nouveaux traitements spécifiquement adaptées à cette leucémie incurable et sera à terme très bénéfique pour les patients. Au niveau plus fondamental, notre projet permettra de comprendre comment la maladie survient, quel est le rôle de l’inflammation chronique qui survient avec l’âge sur son développement ou son accélération.
Procédures
Pour étudier le développement de cette leucémie, nous utiliserons la transplantation de moelle osseuse. Les transplantations sont réalisées par injection par voie veineuse, sous anesthésie, de cellules de moelle osseuse de souris donneuses, portant des mutations dans des gènes, dans des souris receveuses préalablement irradiées. L’irradiation a pour but de tuer toutes les cellules de la moelle osseuse et de libérer ainsi de la place pour les cellules transplantées qui vont venir s’y greffer. La prise de greffe est analysée un mois après la transplantation par la présence de cellules donneuses dans le sang des animaux, par une prise de sang à la veine faciale, effectuée sous anesthésie. Nous suivrons ensuite le développement de la maladie au cours du temps, jusqu’à 2 ans, par prise de sang régulières (toutes les deux semaines ou toutes les semaines si la maladie s’aggrave) et analyse des différentes cellules sanguines. Toutes les souris receveuses seront soumises à ces injections et prélèvements sanguins. Pour induire une inflammation chronique, des injections intra-péritonéales seront réalisées 2 fois par semaine pendant un mois. Une anesthésie locale avec de la lidocaïne sera utilisée pour ces injections.
Impact sur les animaux
Malgré la greffe de d’un nombre important de cellules de moelle qui permet aux cellules du sang de se reformer rapidement après l’irradiation, il se peut que dans les 2 semaines suivant la transplantation, les animaux souffrent : 1/ d’infections opportunistes, les cellules de l’intestin pouvant être aussi étant affectées par l’irradiation. 2/ d’une mauvaise prise de greffe et des difficultés à récupérer un taux normale de cellules dans le sang qui pourrait engendrer une diminution des globules rouges (anémie), fatigue, apathie, perte de poids, et perte de l’alimentation et dégradation de l’état général.
Devenir
Les animaux sont les animaux receveurs de cellules de moelle osseuse lors des transplantations dans nos procédures. Ils seront mis à mort et leurs organes prélevés pour étudier le phénotype et les mécansimes de la maladie.
Remplacement
Il n’est pas possible in vitro d’étudier les fonctions des cellules souches hématopoïétiques qui se trouvent dans la moelle osseuse, les mécanismes de production des cellules du sang et le développement de leucémies in vitro. Le développement de ces maladies requiert l’environnement de la moelle osseuse impossible à reproduire in vitro. Enfin, la prolifération in vitro de cellules cancéreuses est limitée et ne reflète pas ce qui se passe dans un individu. Il est donc indispensable de développer des modèles de souris mimant le plus fidèlement possible le développement de la maladie leucémique pour tester et sélectionner de nouvelles thérapies.
Réduction
La maladie évolue avec l’âge donnant des variations importantes d’un animal à l’autre. Pour avoir un pouvoir statistique suffisant nous pourrions être obligés d’étendre l’élevage pour avoir un nombre suffisant d’animaux du même âge au temps de l’expérience. Pour pallier cela (réduction), nous utiliserons la transplantation qui consiste en une greffe de moelle osseuse provenant d’une même souris donneuse à plusieurs souris receveuses qui développeront alors chacune une maladie identique. Nous pouvons utiliser moins d’animaux pour tester rapidement plusieurs conditions avec un pouvoir statistique important. Cette approche permet aussi de réduire considérablement les élevages et d’avoir des groupes de souris greffées à traiter du même âge. Nous pouvons greffer 10 souris à partir d’une souris donneuse. Ces modèles de leucémie sont nouveaux, le rythme de développement de la maladie n’est donc pas encore connu. En conséquence, nous avons calculé le nombre de souris nécessaires par groupe de greffe en nous fondant sur les données du laboratoire et de la littérature pour des pathologies similaires.
Raffinement
Immédiatement après irradiation, une observation des animaux sera réalisée 2 à 3 fois par semaine, afin de s’assurer que l’animal ne présente pas de complications directement liées à l’irradiation. Afin de favoriser le bien-être des animaux, l’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux et la nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu (coton de nidification, cabanes) sera mis en place dans chaque cage. Les procédures seront réalisées par un personnel expérimenté et sous anesthésie pour tous les gestes techniques. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Des points limites généraux sont établis. Les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi en tout temps. Du DietGel Energy sera ajouté dans les cages après transplantation ou en cas de diminution de la prise alimentaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour étudier l’hématopoïèse et les cancers du sang car elle possède un système hématopoïétique et immunitaire proche de celui de l’Homme. Les souches des animaux sont bien caractérisées ce qui permet d’effectuer des greffes de moelle osseuse en évitant les problèmes liés au rejet de greffe. Enfin, il s’agit d’espèces faciles à élever qui permettent l’obtention relativement rapide de résultats du fait de leur temps de génération réduit. Nous utiliserons des souris de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adultes. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte pour être dotées d’un système immunitaire fonctionnel.
Validation in vivo de nouveaux agents de contraste spécifiques pour la détection précoce du cancer mammaire métastatique.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection induisant un cancer mammaire, jusqu'à trois examens d'imagerie sous anesthésie, une injection de sonde et un prélèvement de sang terminal avant la mise à mort. Le porteur indique n'avoir observé aucun effet indésirable notable au cours de deux années d'études antérieures et suit les tumeurs au pied à coulisse. Il présente la validation in vivo de ces agents de contraste comme "primordiale" et "indispensable", aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui la dissémination métastatique.
Objectifs
Depuis 2 ans, les études de notre client, menées dans le projet autorisé sur la « validation in vivo de nouveaux agents de contraste spécifiques pour la netrin-1, potentiel biomarqueur du cancer mammaire métastatique », ont démontré des résultats prometteurs in vitro e in vivo. La suite des études a permis la conception d’autres agents de contraste pour le même biomarqueur (nétrine-1), ainsi que l’identification d’autres biomarqueurs pour lesquels notre client a cependant conçu des sondes d’imagerie, qui ont été synthétisées et testés in vitro. Notre client souhaiterait pouvoir les étudier in vivo, sur des souris témoin ainsi que des souris porteuses de tumeur mammaire. Pour cette nouvelle demande, il s’agit de pouvoir effectuer le même type de procédures autorisés que dans le projet précédent, mais, cette fois, concerne l’étude de plusieurs biomarqueurs, en utilisant des sondes d’imagerie de petite taille, à administrer par voie intraveineuse.
Bénéfices attendus
L’imagerie moléculaire, notamment le ciblage de biomarqueurs spécifiques, représente une alternative de choix pour une détection précoce de cancer étant donné que les changements physiologiques apparaissent bien avant les changements morphologiques que ces biomarqueurs engendrent et doit permettre un diagnostic précoce. Les études in vitro réalisées au préalable démontrent une affinité ou une réponse au biomarqueur de choix pour certaines des sondes développées par notre client et leur validation in vivo sur des modèles de cancer est primordiale.
Procédures
Induction de cancer mammaire : 1 injection par animal 5 minutes maximum sous anesthésie générale gazeuse. Suivi par imagerie : au maximum 3 examens non invasifs sur 24h avec 1 délai d'1h minimum entre 2 examens sous anesthésie générale. Administration de la sonde 1 seule injection par voie intraveineuse sur souris vigile. Prélèvement de sang sur animal anesthésié volume de 400μL puis mise à mort. Mesure de la tumeur au pied à coulisse: sur animal vigile, 2 minutes, 1 fois par semaine.
Impact sur les animaux
Concernant la mise en place du modèle de cancer mammaire, les dommages attendus sont liés au développement d’une tumeur et nous mettrons en place un suivi ainsi que des points limites pertinents permettant d’anticiper toute douleur ou stress qui pourrait être provoqué chez l’animal. La douleur infligée par l’injection des cellules et réactifs pour l'imagerie, elle, correspond à celle d’une piqûre d’aiguille. Après ces 2 ans d’études, nous n’avons pas remarqué d’effets indésirables ou nuisances dues au développement tumoral ni à l’administration des sondes. La cinétique par imagerie scintigraphique 3D ainsi que la biodistribution ex vivo ont été réalisées 10 jours post induction. A ce stade, les tumeurs sont
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.
Remplacement
Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes, tissus et types cellulaires, conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur survie et dissémination dans l’organisme. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro, le recours aux animaux est indispensable. Par ailleurs, ce projet vise à vérifier le ciblage spécifique d’un agent de contraste vers la tumeur ; et de comprendre la biodistribution de ces agents de contraste parmi les différents organes, ce qui n’est possible qu’en utilisant un animal vivant. Pour ces raisons l’utilisation du modèle animal souris est fondamental, puisque l’étude préclinique en particulier ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour chacune des sondes, pour chaque procédure et à chacun des 6 souris sont induites avec des cellules 4T1 en intramamaire. Nous en sélectionnons 3 sur les 6 de taille de tumeur identique pour effectuer les examens. L’analyse statistique sera effectuée avec le logiciel GraphPad PRISM V7 pour comparer les lots expérimentaux. Etant donné le nombre réduit de souris par lot, des tests Mann-Whitney non paramétriques avec correction de Welch seront utilisés pour déterminer les différences entre chaque lot change selon la distribution des échantillons, et le test de Kruskal-Wallis non paramétrique suivi par un post-test de Dunns ou Tukeys de comparaison de groupes multiples.
Raffinement
Les animaux seront observés scrupuleusement et des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance au cours de l’expérimentation. Les études réalisées depuis 2 ans ont montré très peu de souffrance des animaux. Les points limites n’ont jamais été atteints (pas de perte de poids observée, pas de tumeur >200mm3, pas de nécrose sévère des tumeurs mammaires. De plus, durant les examens d'imagerie et l'induction du modèle tumoral, les souris seront anesthésiées. Enfin, les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du celluron. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. La lignée de cellules 4T1 est une lignée d'origine murine. Elle est classiquement administrée au laboratoire sur la lignée de souris BALB/c By. Le fournisseur de la lignée cellulaire (ATCC) indique qu'elle provient de souris BALB/c By (Aslakson CJ, Miller FR. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52: 1399-1405, 1992). Un lot de souris BALB/c By témoin sera aussi étudié. 5 - 6 semaines, stade où les bourgeons mammaires ne sont pas complètement développés et où les conditions hormonales de la souris sont adéquates pour la croissance tumorale.
Implantation de cathéters chez les rongeurs de laboratoire pour une utilisation à des fins scientifiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Rats : 2800
Hamsters dorés : 400
4 000 souris, rats et hamsters vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une chirurgie de pose de cathéter vasculaire ou non vasculaire, jusqu'à 45 minutes, suivie d'un hébergement individuel de deux à six jours. Le porteur reconnaît une douleur pendant et après la chirurgie et un inconfort lié à l'isolement. Il présente cette prestation comme préparant des rongeurs cathétérisés expédiés vers d'autres laboratoires, et décrit l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'homme.
Objectifs
Les rongeurs sont les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux dans les domaines tels que l'oncologie, les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et métaboliques, l'immunologie, etc. Ce projet a pour but d’avoir des rongeurs préparés en vue de leur utilisation dans des études expérimentales. Plusieurs prestations sont réalisées chaque année sur rats, souris et hamsters concernant l'implantation de cathéters (vasculaire : 400/an et non vasculaire : 400/an).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, le projet diminue le stress car il évite les appareils de contention, allège et diminue la contention manuelle. Il empèche également la douleur provoquée par des injections ou des prélèvements, unique ou répétés.
Procédures
Chaque animal subira sous anesthésie, une chirurgie de pose de cathtéter(s) vasculaire ou/et non vasculaire, pour une durée maximum de 45 minutes. Suite à la chirurgie, l'animal sera hébergé individuellement, pour une durée comprise entre 2 et 6 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie, celle en post-opératoire, et également l'hébergement en individuel, pouvant générer inconfort et stress.
Devenir
La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche
Remplacement
Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans des études expérimentales.
Réduction
Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique ne sera réalisée.
Raffinement
Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce au sein de l'ordre des rongeurs est conditionné par les besoins suivant les éléments cibles de l'organisme. Les animaux commenceront le projet à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimun) et devront peser au moins 100 g (pour les rats), 20 g (pour les souris) et 60 g pour les hamsters. L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet.
Evaluation des effets de traitements par plasmas froids sur la cicatrisation de plaies cutanées ischémiques chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent sur deux jours une chirurgie du dos induisant une plaie cutanée chronique avec arrêt de l'irrigation sanguine, puis des traitements par plasma froid trois fois par semaine et un maintien en cage individuelle. Le porteur indique que l'induction de la plaie peut causer une souffrance limitée dans le temps et qu'un excès d'espèces réactives pourrait provoquer une nécrose des tissus, constituant un point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet de suivre la cicatrisation sur plusieurs semaines et conclut que le recours au rat est nécessaire.
Objectifs
Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants de par la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. Les plasmas froids produisent des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote qui ont une capacité pro-cicatrisante et antibactérienne. L'utilisation des plasmas froids se différencie par le fait qu’elle est non invasive, c’est-à-dire sans contact, et sans douleur. Les objectifs de cette première étude menée dans le cadre d’un nouveau projet sont d’évaluer les effets de plasmas froids générés par une nouvelle technologie sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques induites chez le rat. Les effets seront comparés à ceux observés sur des plaies cutanées chroniques non traitées. Les traitements par plasmas froids seront effectués sous anesthésie 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète. A l’issue de l’étude, des dosages seront effectués sur un prélèvement de sang après placement des animaux sous anesthésie générale, suivi après leur euthanasie du prélèvement d’organes pour la réalisation d’analyses.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette première étude dans le cadre d'un projet global va permettre d’évaluer les effets de traitements par plasmas froids de "nouvelle génération" sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat, et de comparer ces effets avec des plaies cutanées chroniques non traitées. Les données des analyses effectuées sur les prélèvements de sang, de peau de la région cicatrisée et des organes prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets des traitements effectués sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat. Cela permettra de poursuivre les études sur l’animal dans le cadre de ce projet, et notamment d’étudier les effets d’une combinaison traitements par plasmas froids et pansement actif, et d’envisager leur utilisation future chez l’Homme. Cela permettra à terme de proposer une nouvelle thérapie innovante pour le traitement de plaies cutanées chroniques chez le sujet sain ou diabétique.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée chronique avec arrêt de l’irrigation sanguine sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale sur 2 jours consécutifs. Un traitement analgésique sera administré chaque jour avant la chirurgie et 6 heures après la fin de celle-ci le 2ème jour. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ le 1er jour et en 10 minutes environ le 2ème jour. Les plaies cutanées seront traitées 3 fois par semaine et seront protégées par un morceau de gaze stérile et 2 bandes de sparadrap pour le maintien de celle-ci. Un suivi quotidien des rats sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps, et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation.
Impact sur les animaux
L’induction d’une plaie cutanée chronique réalisée sur 2 jours successifs peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Les traitements et les changes de gaze et de sparadraps, effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 5 à 10 minutes, n’engendreront quant à eux aucune douleur. Une toxicité éventuelle des traitements par plasmas froids pourrait se traduire par exemple par une nécrose avancée des tissus traités en raison d'un excès d'espéces réactives de l'oxygène, pouvant alors constituer un point limite. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps au cours de la période de traitement. Cela permet également d’éviter toute interférence avec le processus de cicatrisation qui est un processus long passant par différentes phases successives. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social. Un prélèvement de sang de 3 ml environ sera réalisé sur les 20 rats lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, effectué en moins d’une minute avant leur euthanasie, pour réaliser des analyses sanguines.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 20 rats seront euthanasiés lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, après réalisation d’un prélèvement de sang pour la réalisation d’analyses sanguines. Les rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de la peau au niveau de la région ou la plaie cutanée a été induite, ainsi que des organes pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes successifs. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études menées sur un autre modèle expérimental chez le rat, et d’un calcul de puissance statistique. Sur la base de ce calcul il est nécessaire d’utiliser au moins 9,5 rats par groupe de traitement pour les 2 groupes de traitement envisagés. Nous utiliserons donc 2 groupes expérimentaux de 10 rats.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine lors de chaque traitement et/ou change de gaze et de sparadrap et observation des plaies cutanées. Si une perte de poids importante est observée, ou si des signes d’infection de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront placés en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique et respecter également la période de réalisation des traitements appliqués pour être dans des conditions similaires à celles qui seront utilisées chez l’Homme. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage de rats comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière. L’utilisation de cages transparentes permettra de maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.
Choix des espèces
Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet car il présente une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme, avec une durée de cicatrisation suffisamment longue. Les animaux seront de jeunes rats âgées de 8 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9 semaines pour la réalisation des expérimentations. Les rats auront ainsi une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme.
Transfert d’embryons sur rongeurs de laboratoire pseudogestantes
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Rats : 10400
83 200 souris et rats vont être utilisés, la plupart tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles subissent une chirurgie de transfert d'embryons d'environ quinze minutes sous anesthésie générale, pour servir de mères porteuses. Le porteur indique que ces femelles réimplantées sont tuées au sevrage des petits, sauf quelques-unes gardées comme sentinelles sanitaires, et que 156 rates sont réutilisées. Il justifie la voie chirurgicale par un taux de naissance 2,5 fois supérieur à la méthode non invasive, qu'il juge sans réelle "valeur ajoutée éthique".
Objectifs
Ces transferts d’embryons ont pour but de mettre à disposition de la communauté scientifique des animaux sains. En effet, la présence de contaminants dans les colonies de rongeurs de laboratoire peut introduire un biais dans les résultats obtenus et leur analyse, ainsi qu'avoir des conséquences néfastes sur le bien être de ces animaux. La cryoconservation et le transfert d’embryons permettent de réduire considérablement les populations de rongeurs de laboratoire, en ciblant la naissance d'une majorité d'animaux d'intérêt scientifique. En effet, à partir d’embryons décongelés, de sperme suivi d’une fécondation IN VITRO ou encore de collecte d’embryons post accouplements naturels, les embryons collectés et lavés en milieux stériles appropriés sont réimplantés dans des femelles pseudogestantes qui vont en assurer le développement IN UTERO et leur élevage jusqu’au sevrage. Enfin, au-delà des 2 arguments cités ci-dessus, le transfert d’embryons permet également d’autres améliorations telles que le retour à un microbiote caractérisable, améliorer les conditions d’élevage, sécuriser sanitairement les échanges lors de collaboration,… Ce projet est donc un élément de base dans la gestion et l'élevage des colonies de rongeurs de laboratoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d'obtenir rapidement des rongeurs d'intérêt scientifique et de haute qualité sanitaire issus de femelles réimplantées ayant la capacité de donner les meilleurs taux de naissances possibles post transfert embryonnaire par voie chirurgicales.
Procédures
Les animaux subissent une procédure chirurgicale unique d'une durée moyenne de 15 minutes après anesthésie générale
Impact sur les animaux
La chirurgie de transfert d'embryon est composée d’un protocole chirurgicale unique et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum.
Devenir
Les femelles réimplantées seront mises à morts au sevrage des petits sauf quelques-unes qui seront utilisées en tant que sentinelles pour le contrôle du statut sanitaire des portées. Les animaux sevrés seront envoyés au donneur d’ordre pour des fins scientifiques.
Remplacement
Des solutions commerciales de kits de transfert d'embryons par voie naturelle sont proposées par différentes compagnies. Les méthodes dites "non invasives" (par voies naturelles) offrent des taux de naissance de l'ordre de 2.5 fois moins comparativement à la méthode chirurgicale. Cela nécessite donc l'utilisation d'un plus grand nombre de donneuses d'embryons et de mères porteuses pour obtenir un même résultat. Les taux de naissances obtenus et les spécificités techniques associées à leur utilisation ne permettent donc pas encore une réelle valeur ajoutée éthique pour les transferts d'embryons par des quantités réduites d'animaux au strict minium pour atteindre les objectifs scientifiques souhaités. Les transferts d'embryons dans des femelles pseudgestantes B6CBA/F1 permettent également la réalisation de shéma d'accouplement (IN VIVO ou IN VITRO) avec des taux d'animaux d'intérêts supérieurs à ceux issus d'accouplements naturels. Ces transferts évitent ainsi de nombreux accouplements naturels pour une cible finale en terme de nombre d'animaux d'intérêt identique dont les femelles du modèle ne pourraient pas: ovuler, assurer une gestation ou encore allaiter correctement.
Réduction
L'aspect réduction du nombre d'animaux est traité via une politique de réduction au strict minimum nécessaire de femelles réimplantées pour atteindre des objectifs fixés par les utilisateurs finaux. Les revitalisations de modèles maintenus au format congelé lorsqu'ils ne sont pas en études actives, les décontaminations par transfert embryonnaires, les expansions rapide de colonies par fécondation IN VITRO,... sont toutes des solutions qui répondent complètement aux 3R et à l'objectif de réduction d'animaux en élevage. La production d’animaux expérimentaux par des méthodes alternatives, intégrant des transfert d’embryons, permet de rationaliser les besoins des chercheurs : - en évitant les élevages permanents desquels une infime partie des animaux produits est utilisée. - en offrant une homogénéité des lots, une qualité génétique et sanitaire supérieure, et un microbiote standardisé. - en permettant de réduire la quantité d’animaux produite aux uniques besoins. Un élevage moyen d’un modèle produit environ 500 animaux par an, ce qui arriverait à une quantité de 2 500 000 animaux nés sur 5 ans pour 1000 modèles. Pour le même nombre de modèle, le transfert embryonnaire pour produire les lots d’animaux expérimentaux sur 83 700 mères porteuses permet une réduction minimale de 10 fois la quantité d’animaux produite en élevage continue. Cette méthode répond efficacement aux attentes d’une démarche 3R.
Raffinement
Le raffinement sera obtenu par l'application d'une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux avec une grille d’évaluation adaptée pour déceler tout signe clinique et atteinte des points limites, par un hébergement avec enrichissement adapté à l'espèce et à son état physiologique et par un protocole analgésique maitrisé lors de la chirurgie. D'après notre historique, les taux de gestations et taux de naissance sont similaires à ceux d'accouplements naturels et nous avons une absence de mortalité post chirurgie. Ces éléments témoignent d'une procédure maitrisée.
Choix des espèces
L’espèce choisie doit être identique à celle du modèle scientifique et pour lesquel le recours à cette technique est nécessaire. Parmi les rongeurs, les espèces les plus utilisées par la communauté scientifique sont les souris et les rats. Pour les souris, nous avons choisi l’hybride B6CBA/F1 qui est la plus reconnue scientifiquement pour ses qualités reproductrices pour assurer une gestation et un sevrage d'un plus grand nombre de petits avec un gabarit homogène et donc une standardisation optimale du process. Pour les rats, la souche Sprague Dawley est reconnue comme étant la plus appropriée pour cette même technique et pour ses qualités reproductrices. L’âge est déterminé par l'âge de maturité des fonds génétiques et la faculté des animaux utilisés à mener à bien la production d’une portée jusqu’à son sevrage : -Rats: Sprague Dawley de 10 à 12 semaines -Souris: B6CBA/F1 de 10 à 15 semaines
Etude de l’effet antiallodynique d’une molécule dans un modèle de douleur post opératoire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une incision de la peau et du muscle de la patte arrière sous anesthésie pour induire une allodynie, puis reçoit des candidats médicaments par diverses voies avec parfois des prélèvements de sang répétés. Le porteur indique que le modèle repose sur la douleur provoquée par l'incision plantaire et signale des risques de non-réveil ou de mauvaise cicatrisation. Il présente ces deux modèles comme intégrés à "l'offre de service" de l'entreprise, destinée à des clients développant des analgésiques.
Objectifs
Dans le cadre de son travail, le laboratoire teste des candidats médicaments. Le but de ce projet est de tester des molécules dans un modèle de douleur post-opératoire chez la souris. Les douleurs post-opératoires sont des douleurs survenant à la suite d’une intervention chirurgicale. Les patients atteints de ces douleurs présentent des symptômes caractéristiques tels qu’une hyperalgésie (sensation douloureuse ressentie comme encore plus douloureuse) et une allodynie (sensation non-douloureuse ressentie comme douloureuse). Ce type de douleur est encore principalement traité par des opiacées, mais aussi des antiépileptiques ou anti-inflammatoires. Le traitement ne peut donc pas rester perdurer sur du long terme sans entrainer dépendance, accoutumance ou de lourds effets secondaires. Aux vues du nombre d’opération réalisées chaque jour, il est important de trouver des molécules fiables et efficaces pour traiter les douleurs post-opératoires. Deux modèles précliniques de douleur ont donc été mis au point pour étudier les nouveaux traitements contre ces douleurs post-opératoires. Un de ces deux modèles consiste à inciser seulement la peau plantaire, alors que l’autre consiste à inciser en plus les tissus profonds. L’incision de la peau et des tissus profonds induit une douleur plus importante que l’incision de la peau seule. L'incision de la peau et des muscles imite mieux la chirurgie invasive (une douleur aiguë intense) et conduit à une douleur chronique (entre 4 et 5jours). Ce modèle de douleur post-opératoire peut être associé avec des tests d’allodynie mécanique : von Frey électronique ou monofilament de von Frey. Ces tests sont couramment décrits dans la littérature. Le test de monofilament de von Frey est utilisée avec la méthode dit “up-and-down” et va permettre de déterminer le seuil 50% de retrait de la patte en gramme. Le von Frey électronique va, lui, permettre de donner une valeur en gramme du seuil de retrait de la patte.
Bénéfices attendus
Ces deux modèles seront intégrés dans l’offre de service de l’entreprise qui pourra ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés avec un modèle proche de la clinique, qui permet de proposer de tester ces candidats médicaments sur l’allodynie mécanique chez la souris.
Procédures
Les animaux sont soumis à une incision de la peau et une incision du muscle de la patte arrière droite, cela dure environ 4-5min par animal. Ils sont soumis à l’administration de composés à potentiel anti-douleur par voie p.o., ip., sc., i.v. ou i.m. Les souris peuvent recevoir une injection ou deux si le client demande une co-admnistration. Le geste de l'admnistration dure 1minute environ. Les souris peuvent aussi être soumises à des prélèvements de sang afin de surveiller la pharmacocinétique d’un composé. Cela peut être des prélèvements uniques ou répétés en fonction de la demande client.
Impact sur les animaux
La nuisance principale est liée au modèle lui-même qui consiste en l’induction d’une allodynie par incision de la voute plantaire des animaux. Pour limiter la douleur lors de l’induction du modèle, l’incision est réalisée sous anesthésie gazeuse. De plus, les effets indésirables peuvent être un non-réveil suite à l’anesthésie sous isoflurane ou une mauvaise cicatrisation de la plaie. Des nuisances associées à la pharmacologie peuvent également apparaitre (tremblement, sédation, déshydratation). Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie (IC, jugulaire, rétro-orbital). Les administrations et prélèvements peuvent donc présenter des nuisances pour les souris.
Devenir
Le modèle de douleur post-opératoire chez la souris entraine une activation des processus inflammatoires. Les processus inflammatoires sont mobilisés dans de nombreux modèles de douloureux même chronique comme les neuropathies. Il est donc difficile d’évaluer l’impact que pourrait avoir cette chirurgie sur un autre modèle de douleur. De plus, les administrations de candidat médicaments peuvent aussi créer des interactions ou des modifications biologiques difficiles à évaluer dans le cadre de ce travail. Il n’est donc pas cohérant de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité de la société.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle et confirmé lors des études subséquentes réalisées par la société. Cet effectif par groupe a été confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance via BiostaTGV.
Raffinement
Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Le test avec les monofilaments de von Frey comporte une valeur de cut-off à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance. Pour limiter le stress les animaux sont habitués au dispositif de tests aussi. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation et 24h aux salles de tests). De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, papier kraft et briquettes en bois à ronger). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude ou à défaut par un autre technicien du laboratoire (formé à l’expérimentation animale niveau I ou II). Concernant l'anesthésie, les animaux pour la chirurgie POP sont sous isoflurane durant maximum 5minutes, un système de chauffage et d'aspiration sont intégrés à la table d'anesthésie gazeuse afin de garantir un réveil plus confortable pour les animaux.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein d’ANS Biotech. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature. 1560 souris seront utilisées pour ce projet. Le découpage de ce nombre par procédure se présente ainsi : - 780 souris subiront la procédure n°1 - 780 souris subiront la procédure n°2 Soit un total de 1560 souris Lots 10 animaux/groupes x 5 groupes + 2 animaux x 3 études/an x 5ans = 780souris par procédure
Impact de E. coli dans la colonisation et pathogénèse de S. agalactiae
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système urogénital
788 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des femelles gestantes sont inoculées par voie orale, urétrale ou vaginale, et des souriceaux nouveau-nés reçoivent une goutte de suspension bactérienne sur la région naso-buccale. Le porteur indique que l'infection au streptocoque peut provoquer chez les souriceaux une bactériémie ou une pneumonie aiguë, les animaux étant tués selon un score clinique prédéfini. Il décrit le recours à la souris comme "irremplaçable", aucun modèle in vitro ne permettant selon lui d'observer la dissémination bactérienne entre organes et de la mère aux nouveau-nés.
Objectifs
Les infections au Streptocoque du groupe B (Streptococcus agalactiae) sont une cause majeure de morbidité et de mortalité, notamment chez les femmes enceintes et les nouveau-nés. Le streptocoque du groupe B est la cause la plus fréquente d'infection néonatale. Les facteurs de risque de l’infection néonatale sont la colonisation vaginale ou rectale de la mère. L’infection néonatale à début précoce (moins de 7 jours après la naissance) est attribuée à la transmission verticale du Streptocoque par la mère, par infection ascendante à partir du tractus génital, ou lors du passage dans le canal vaginal pendant l'accouchement. Les manifestations typiques sont une bactériémie et pneumonie. L’infection tardive (7-90 jours après la naissance) est attribuée à l'acquisition horizontale. La méningite est plus fréquente dans l’infection tardive, et peut se présenter aussi sous forme de bactériémie, d'infection urinaire, de pneumonie ou d'infection d’autres sites. Escherichia coli est une bactérie intestinale commensale ubiquitaire chez l’Homme. E. coli fait partie des premières bactéries qui colonise le nouveau-né après la naissance, puis persiste dans le microbiote durant toute la vie de l’individu. E. coli peut aussi être responsable d’infections urinaires, fréquentes chez la femme. Les E. coli infectent la vessie par infection ascendante de l’arbre urinaire à partir du réservoir intestinal, ou encore à partir de la colonisation des cellules épithéliales du vagin. Des observations pilotes in vitro démontrent que E. coli produit et excrète un métabolite qui peut être utilisé par le Streptocoque de groupe B pour respirer et devenir plus virulente. Ce projet vise à étudier l’interaction entre E. coli et Streptocoque de groupe B, deux espèces bactériennes qui colonisent la mère et le nouveau-né, et comment cette co-colonisation périnatale peut influer sur la pathogénèse du Streptocoque. L’objectif du projet est de comprendre comment le métabolite produit par E. coli agit sur la dissémination et la virulence de S. agalactiae chez l’hôte gestant et chez les nouveau-nés.
Bénéfices attendus
Les infections néonatales au Streptocoque du groupe B aboutissent à une mortalité qui peut atteindre jusqu’à 10%. L'antibioprophylaxie intra-partum a réduit l'incidence des infections néonatales à début précoce, mais sans avoir un impact notable sur l'incidence de l’infection à déclenchement tardif. L'augmentation de la fréquence de la résistance aux antibiotiques a été observée. Le développement de stratégies visant à identifier les hôtes, et à traiter judicieusement et prévenir les maladies invasives est donc essentiel pour réduire la charge de ces infections. Ce projet permettra de découvrir de nouvelles pistes pour la prévention ou le traitement de cette infection néonatale grave.
Procédures
Les souris gestantes seront inoculés per os, ou via l’urètre, ou dans le vagin, avec des suspensions de bactéries d’intérêt, sous anesthésie gazeuse et avec des cathéters lubrifiés avec un gel anesthésiant. L'intervention dure une minute par animal. Des souriceaux seront inoculés avec les bactéries d’intérêt, par dépôt d’une goutte de suspension bactérienne sur la région naso-buccale (pas de gavage forcé). Cette inoculation est effectuée en moins d'une minute pour chaque animal. Des prélèvements de fèces et urine seront effectués sur les animaux adultes, par contention par un expérimentateur entrainé. Des lavages vaginaux seront effectués sous anesthésie gazeuse. Ces prélèvements sont effectués en environ une minute par animal.
Impact sur les animaux
La colonisation recto-vaginale par les deux bactéries est asymptomatique et sans conséquence pour la souris adulte. L’infection urinaire induit un inconfort au niveau de l’aine, mais aucun autre signe clinique aigüe n’est attendu. Chez le souriceau l’infection au Streptocoque, avec une bactériémie ou une pneumonie, peut induire une pathologie aigüe. Une attention particulière sera donc portée sur le suivi des animaux, qui seront euthanasiés selon un score clinique objectivé prédéterminé.
Devenir
Les animaux sont sacrifiés et les organes d'intérêt sont analysés (histologie..); ce sort est justifié par le but de l'expérimentation.
Remplacement
Des études ont été préalablement conduites in vitro ainsi que sur des cellules épithéliales en culture pour étudier l’interaction E. coli et Streptocoque B et montrent une forte interaction entre ces 2 microorganismes. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’examiner la dissémination bactérienne entre les différents organes (intestin, vagin, vessie, poumons, sepsis) et entre la mère et les nouveau-nés.
Réduction
Une attention particulière est portée sur le nombre d’animaux strictement nécessaire pour chaque expérience. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (signes cliniques, charge bactérienne, prélèvements de tissus et fluides lors de la nécropsie) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires. Des groupes expérimentaux de 6 à 10 animaux seront utilisés qui pourront être analysés avec des outils statistiques ANOVA et Kaplan-Meir.
Raffinement
Raffiner : Le protocole d’expérimentation est adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur. Ainsi, les injections vaginales ou trans-urétrales sont effectuées sous anesthésie gazeuse, et avec un gel lubrifiant anesthésiant. Pendant les phases infectieuses, une grille de lecture du score clinique est utilisée pour chaque animal afin de déceler au plus tôt une souffrance. L’abandon du souriceau par la mère est pris en compte dans la grille de lecture. Une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial ou une baisse de température nous conduira à l’euthanasier. Enrichir : l'enrichissement de l'environnement des animaux, essentiel à leur bien-être, sera effectué selon la réglementation en vigueur et en accord avec les pratiques de l’animalerie. Des blocs de cellulose et de cartons et des briques de bois seront rajoutées dans les cages pour satisfaire au besoin naturel de nidation et pour que les animaux puissent ronger. Des nids de polycarbonates semi-transparentes rouges seront fournies pour que les animaux puissent se cacher.
Choix des espèces
La souris est un animal modèle bien connu et maitrisé pour l’étude de la colonisation recto-vaginale, pour l’infection urinaire, et pour la colonisation périnatale des nouveau-nés. Le projet examine la colonisation de mères gestantes et de leurs souriceaux nouveau-nés. Les animaux seront donc utilisés de la naissance jusqu’à l’âge adulte.
Rôle du glucose et de son transporteur neuronal GLUT3 dans l’activation cérébrale et les performances cognitives chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie cérébrale de 35 minutes avec injection d'une molécule dans le cerveau, la moitié un test de reconnaissance d'objets, et cent d'entre eux une injection intracardiaque terminale sous anesthésie. Le porteur indique attendre une perte transitoire de discrimination des textures par les vibrisses et une perte de poids légère après la chirurgie. Il présente une cible thérapeutique contre Alzheimer ou les AVC comme retombée à terme, l'objectif immédiat restant de comprendre le rôle du glucose dans la mémoire.
Objectifs
Pour fonctionner et assurer des tâches complexes, telles que l’apprentissage et la mémoire, les neurones ont besoin d’énergie. Historiquement, il était admis que le glucose est le seul nutriment principal des neurones, mais des travaux récents suggèrent fortement que le lactate, un métabolite du glucose produit principalement par les astrocytes (cellules du cerveau autres que les neurones), pourrait être également une source d’énergie pour les neurones. De plus, les astrocytes sont idéalement positionnés entre les vaisseaux et les neurones, cette position clé leur permet notamment de réguler de manière adaptée l’information entre les cellules au niveau du cerveau. Le but de ce projet est de mieux comprendre et de définir dans le cerveau, si la source d’énergie des neurones en activité, est le glucose et/ou le lactate. Pour répondre à cet objectif, nous allons évaluer la contribution et le rôle du glucose dans l'apprentissage et la mémoire, chez des rats privés ou non d’un transporteur au glucose. Cette évaluation sera réalisée chez le rat, par l’analyse des capacités d’apprentissage, de reconnaissance et de mémorisation des textures de certains objets de son environnement.
Bénéfices attendus
Notre projet va nous permettre de mieux comprendre le rôle du glucose et du lactate dans l’apprentissage et la mémoire. Cette meilleure compréhension, nous permettra de définir une cible thérapeutique, qui pourra ensuite être évalué dans un protocole thérapeutique chez le rat. A terme cette thérapie sera envisagée pour une évaluation chez l'homme afin d'améliorer la prise en charge des troubles cérébraux répandus comme la maladie d'Alzheimer (15% de personnes atteintes parmi les plus de 80 ans) ou les Accidents Vasculaire Cérébraux AVC (3ème cause de décès après les maladies cardiovasculaires et le cancer).
Procédures
Sur animaux vigiles : Pour tous les animaux, 17 pesées (1 min par pesée). Chez une partie des animaux (160 animaux), 4 injections sous cutanée d’un antalgique avant et après la chirurgie (1 min par injection). Chez 50% des animaux (100 animaux), un test de comportement, reconnaissance d'objets (6 sessions de 10 min). Chez tous les animaux (200 animaux), 1 injection intra-péritonéale d’un mélange anesthésique/analgésique. Sur animal anesthésié : Chez une partie des animaux (160 animaux), 1 application oculaire de pommade ophtalmique afin de prévenir une sécheresse oculaire, 1 acte chirurgical (durée de 35min) sous anesthésie et analgésie avec injection d'une molécule dans le cerveau pour en étudier son effet, 1 injection transdermique et 1 application locale d'antalgique à l'endroit de l'incision chirurgicale. Chez 50% des animaux (100 animaux), 1 chirurgie pour injection intracardiaque avant mise à mort alors que l'animal est encore anesthésié.
Impact sur les animaux
Suite à l'injection, l'effet indésirable attendu sur les animaux est, une perte de la discrimination via les vibrisses entre les différentes textures des objets chez les animaux recevant notamment une molécule contrôle affectant les capacités de reconnaissance des textures. Suite à la chirurgie les effets indésirables attendus sur les animaux sont un inconfort transitoire ainsi qu’une perte de poids légère et transitoire dans les premières 48h-72h après chirurgie.
Devenir
Tous les animaux de chaque procédure seront mis à mort afin de récupérer les cerveaux pour des analyses biologiques et métaboliques.
Remplacement
Seul un protocole in vivo peut reproduire la complexité des mécanismes dans le cerveau et permettre l’étude du comportement. Il est donc nécessaire de recourir à un modèle animal.
Réduction
Concernant la réduction, nous réalisons en amont, des expériences sur des neurones en culture in vitro afin de valider l'utilisation des réactifs nécessaires au projet. Cette phase d'étude in vitro limitera le nombre de rats utilisés dans le projet. Le nombre d'animaux, défini pour répondre aux différentes questions du projet, est réduit au minimum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les tissus prélevés chez les animaux seront placés dans une banque d'organes/tissus afin de mutualiser les échantillons au sein du laboratoire.
Raffinement
Le raffinement de cette étude a été pris en compte, les animaux seront hébergés dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce (matériel de nidification et tunnel) afin d'éviter l'ennui et complété par un suivi quotidien de leur état de santé. Les animaux en pré, per et post-chirurgie feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement, cicatrisation), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe) et des « actions » seront mises en place, sans délai, en cas de « problème(s) » observé(s). Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie centrale et locale sur tapis chauffant, par un personnel compétent et expérimenté à l’expérimentation animale et à la chirurgie, et les animaux bénéficieront d’une prise en charge antalgique pré, per et post-chirurgie afin de réduire au maximum la douleur. Concernant le test du comportement, durant toute la période du test les animaux seront manipulés par la même personne à laquelle ils seront habitués ce qui diminue leur stress. De plus ce test de comportement est considéré comme un enrichissement vu qu’il se base sur le fait de la mise en contact de l’animal avec un objet nouveau qui stimule sa curiosité procurant ainsi un bien-être à l'animal. Enfin, nous avons mis en place une grille de score ainsi que des points-limites adaptés, qui nous permettront d’avoir une prise en charge afin d’arrêter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le choix porté sur le rat Wistar repose sur les critères principaux suivants : 1) L'aspect translationnel, presque tous les gènes humains liés aux maladies neurodégénératives sont équivalents chez le rat. Le rat Wistar présente un répertoire comportemental plus élaboré et proche de l'homme. 2) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. 3) La maîtrise, l’expertise et la validation de la chirurgie dans ce modèle de rat, ainsi que les études de comportement. Les rats arriveront dans l’animalerie à 7 semaines d’âge, puis la procédure chirurgicale sera réalisée chez les animaux après 14 jours d’acclimatation (rats âgés de 9 semaines). Puis 3 semaines après, le test du comportement sera réalisé chez ces rats âgés de 12 semaines, âge adulte pour lequel le cerveau est complètement développé pour avoir une homogénéité de réponse des cellules cérébrales. Le test du comportement sera réalisé durant 1 semaine.
Études de pharmacocinétique de formulations destinées aux animaux
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 100
Cochons d'Inde : 100
Hamsters dorés : 100
Chats : 250
Chiens : 250
900 animaux non-humains, dont des souris, rats, cobayes, hamsters, chats et chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des administrations répétées de formulations vétérinaires par voies variées et de multiples prélèvements de sang, jusqu'à dix chez les chiens et chats sur 48 heures. Le porteur indique que les rongeurs sont tués en fin d'étude tandis que les 250 chiens et 250 chats sont réutilisés puis proposés à l'adoption. Il qualifie ces études de "stricte nécessité" réglementaire, ne pouvant selon lui être remplacées pour la mise sur le marché des produits.
Objectifs
Lors de la mise au point de nouvelles formulations à usage vétérinaire, le screening de substances actives ou le choix des ingrédients de la formulation est basé entre autres sur leur propriétés pharmacocinétiques. La connaissance des principes actifs et/ou ingrédients (bibliographie, historique des études etc...), l’usage de méthodes alternatives in silico et in vitro ainsi que de la modélisation pharmacocinétique permet une première sélection mais la complexité d’une formulation (mélange d’excipients, pH, volume injecté, etc.) nécessite une ou plusieurs évaluations préliminaires avant le choix définitif de la formulation (sélection ou optimisation de formulations) et de son utilisation (posologie, voie d’administration). En amont des essais sur espèces cibles, il est possible de réaliser des études sur des rongeurs. Si les résultats sont concluants, le produit pourra être testé sur la ou les espèces cibles.
Bénéfices attendus
Ce projet contribue au développement et à la mise à disposition de produits pharmaceutiques sûrs et efficaces auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les exigences réglementaires pour la mise sur le marché de ces produits. Dans le cadre du développement de nouveaux produits ou amélioration de produits existants sur le marché, les bénéfices envisagés de cette procédure seront la meilleure connaissance et compréhension du fonctionnement de ces produits (dose, voie d’administration, adjuvants/excipients, innocuité, efficacité, mécanisme d’action) ainsi que la réalisation des études réglementaires permettant la mise sur le marché de ces produits.
Procédures
●Prélèvements de Sang : - chiens chats : 2 minutes par prélèvement, maximum 10 prélèvements sur 48h et dépendant du volume et du temps de récupération sur une période d’une semaine. - Rongeurs : 1 minute par prélèvement . Souris, rats : maximum 1% du volume circulant total sur 24h et maximum 15% du volume circulant total sur une période de 28 jours. - Hamsters, cobayes : maximum 5 prélèvements par 48 h et dépendant du volume et du temps de récupération sur une période d’une semaine. ●Prélèvements avec écouvillons : nasal, salive, larmes. Chiens et Chats : 1 minute par prélèvement. Rongeurs : 1 minute par prélèvement sur animal anesthésié. ●Prélèvements non invasifs : poils : sans restriction de nombre. Des administrations de produits pour toutes les voies : -1 traitement par voie (durée environ 5 minutes chez les carnivores et 1 minute chez les rongeurs. Les voies d’administration peuvent être orale (ou per os), gingivale, parentérale (entre autres sous-cutanée, intradermique, intrapéritonéale, intramusculaire, ou intraveineuse), nasale, topique (par exemple spot-on, pour-on, collier, patch), auriculaire.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir une douleur transitoire aux sites d’injection lors de l’administration du produit testé, d’anesthésique ou de médication, liée à l’introduction d’une aiguille. Suite à l’administration du produit testé, les animaux pourront présenter des signes cliniques locaux et/ou généraux, qualifiés d’effets indésirables transitoires comme une réaction cutanée locale (prurit, œdème, tuméfaction, nodule, douleur à la palpation), des réactions systémiques transitoires (perte de poids, réduction de consommation alimentaire). Ces nuisances pourront être répétées car plusieurs administrations pourront être réalisées selon la posologie envisagée. Le suivi de la température par voie rectale pourra causer de l’inconfort temporaire. Enfin, lors du suivi régulier des animaux, les nuisances envisagées seront fonction du type de prélèvements réalisés telles qu’une légère gêne (ex : écouvillon oral), ou douleur transitoire liée à l’introduction de l’aiguille (ex : prise de sang), le cas échéant.
Devenir
Pour les rongeurs, les animaux sont euthanasiés à la fin de l’étude. Pour les carnivores, l’ensemble des animaux sont ré-utilisés puis proposés à l’adoption.
Remplacement
Cette procédure a un caractère de stricte nécessité : elle ne peut pas, pour le moment, être remplacée par des méthodes alternatives car elle répond à l’obligation réglementaire ou scientifique d’être conduite sur l’espèce de destination du produit ou sur un modèle de rongeurs le cas échéant lors d’études préliminaires.
Réduction
Le nombre d’animaux envisagés dans cette procédure à été défini à son minimum : - soit en conformité avec la réglementation et la pharmacopée - soit étayé à l’aide d’un raisonnement scientifique et/ou d’une analyse statistique et/ou d’une recherche bibliographique permettant l’atteinte de l’objectif du projet. Il est également évalué en fonction du développement des projets sur les 5 ans à venir et des animaux déjà utilisés sur ceux-ci. Les études peuvent être réalisées selon différents designs : - design croisé (cross-over) : tous les animaux reçoivent successivement tous les traitements (test et référence) dans un ordre aléatoire. L’essai croisé utilise le sujet comme son propre témoin ; - design en parallèle : chaque groupe d’animaux reçoit un seul type de traitement. L’essai en parallèle utilise généralement un groupe témoin versus un ou des groupes traités car les groupes sont indépendants entre eux ; - design par étapes : quand le nombre de sujets est important, l’étude peut être réalisée en deux étapes avec un nombre inférieur de sujets. Si la première étape (plus de 50% des sujets totaux) ne permet pas de répondre à la question, la seconde étape est réalisée avec le nombre de sujets pour compléter le nombre total. Entre chaque période de traitement, une période d’attente sera définie pour permettre aux animaux de récupérer et/ou permettre l’élimination du produit administré précédemment (principe actif et métabolites) ou de son effet pharmacologique. Des tests statistiques seront adaptés à chaque design d'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement utilisées sont : - Une période d’acclimatation adaptée aux conditions de l’étude - Habituation des chats aux prélèvements de sang sur animaux vigiles. - socialisation des carnivores domestiques à l’aide d’une période de jeu dans une pièce dédiée. - Enrichissement des box afin d’améliorer le confort des animaux (musique, jouets adaptés...). - renforcement positif (récompenses ou caresses) - Selon le produit et l’étude, possibilité d’utiliser un sédatif/anesthésique pour soit l’administration, soit les prélèvements, soit les 2, selon les caractéristiques du produit et l’instruction d’utilisation en vigueur. - Une surveillance sera mise en place jusqu’au réveil complet de l’animal - Médication : selon le produit, l’objectif de l’étude et l’impact scientifique, l’utilisation d’anti-douleur sera étudiée au cas par cas et selon les caractéristiques du produit. - Adaptation du type de nourriture afin de faciliter l’alimentation des animaux (pâtée). - Observation quotidienne des animaux et examen/suivi clinique effectué aussi souvent que cela sera jugé nécessaire avec une fréquence qui pourra être augmentée en cas de besoin (en particulier pour le suivi d’innocuité). - Mise en place de points limites adaptés et précisément définis qui pourront être réévalués en fonction des observations recueillies. - En cas d’obligation d'héberger les animaux individuellement, des mesures complémentaires seront mises en place: une présence augmentée du personnel, possibilité pour les animaux de voir, sentir et entendre leurs congénères, augmentation du nombre de jouets dans l’hébergement, un suivi renforcé par les vétérinaires avec une attention particulière sur le comportement des animaux.
Choix des espèces
De façon réglementaire, les études de pharmacocinétique doivent être menées sur la ou les espèces de destination. Il est possible d’utiliser les rongeurs dans les études préliminaires de sélection de nouvelles molécules, formulations, voies d’administration ou posologie si pertinentes et avant les études sur espèces de destination. Les études sont réalisées chez des animaux sevrés, représentatifs de l’espèce de destination et de son statut physiologique, ceci comprenant entre autres l’âge ou la maturité sexuelle. Ces choix sont faits selon l’utilisation future du produit.
Etude du lien entre inflammation chronique et cancer au cours de l’obésité: un rôle des voies de l’immunité innée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un régime gras jusqu'à douze semaines, des tests métaboliques avec prélèvements de sang caudal toutes les quinze minutes pendant deux heures, un jeûne intermittent et des injections sous-cutanées de cellules cancéreuses avec suivi tumoral. Le porteur indique que le régime gras dégrade leur statut métabolique et que les greffes induisent des tumeurs sous-cutanées, mammaires ou prostatiques. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives" à ces expériences de preuve de concept in vivo.
Objectifs
L’inflammation, processus naturel permettant déliminer des pathogènes tels que bactéries, virus et parasites, peut dans certaines conditions s'installer à long terme. On parle alors d’inflammation chronique. Cette inflammation excessive semble avoir un rôle causal dans de nombreuses affections, tels que l'arthrite, l'obésité/diabète, le sporiasis ou encore le cancer. L'activation de l'immunité innée, responsables de la production de cytokines pro-inflammatoires notemment les interférons de type I participe à l'installation et la persistance de l'inflammation chronique. Nous souhaitons ici comprendre le lien entre inflammation chronique due à l'accumulation d'acides nucléiques cytosoliques et les déréglements métaboliques chez l'obèse ainsi que leur effet sur la tumorigènèse. Les résultats obtenus au sein du laboratoire d’accueil suggèrent que l'activation de l’immunité innée et l'inflammation chronique dans les cellules cancéreuses favorise la prolifèration tumorale. De façon intéressante, l’analyse de l’impact de facteurs environnementaux sur l’apparition des cancers met en évidence un lien étroit entre l’adiposité et l’incidence du cancer. Vu le caractère fortement inflammatoire du tissu adipeux, il est tentant d’émettre l’hypothèse que le tissu adipeux promeut la tumorigénèse au cours de l'obésité.
Bénéfices attendus
Les résultats de notre projet permettra de mieux comprendre le lien entre inflammation et co-morbidités au cours de l'obésité. Ces résultats ouvriront la voie à de nouvelles appoches thérapeutiques pour limiter l'inflammation chronique dans un contexte d'obésité. En effet ce projet permettra également de déterminer l'intérêt de l'utilisation d'un inhibiteur de la voie de reconnaissance des acides nucléiques (cGAS/STING) dans le traitement du cancer en particulier chez le patient obèse.
Procédures
Les animaux recevront 5 types différents d'interventions: 1- intervention diététique pendant 12 semaines maximum: régime normal ou gras 60% 2- tests métaboliques avec injection intrapéritonéale d'insuline ou de glucose selon le test puis prélévement de sang caudal (une goutte toutes les 15 minutes pendant 2 heures) sur animaux vigiles. 3- jeûn intermittent 24h jeun/ 24h nourri pendant 20 jours maximum. 4- injection en sous-cutanée de cellulales cancéreuses (injection 5 minutes puis suivi tumoral environ 3 semaines) sous anesthésie (isoflurane). 5- injection de cellules cancéreuses (injection 15 minutes puis suivi tumoral environ 3 semaines) en orthotopique (sein ou prostate) sous isoflurane. 5- administration d'un inhibiteur de notre voie d'intêret pendant 4 semaines (sous-cutanée ou intrapéritonéal) pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux soumis à un régime gras vont prendre du poids rapidement et voir leur statut métabolique ( sensibilité à l'insuline, tolérance au glocuse) se dégrader. L'injection de cellules cancéreuses chez les animaux va induire le dévelopement d'une tumeur sous cutanée ou mammaire/prostatique selon le type d'injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés au CO2 ou par discolacation des cervicales afin de prélevements les organes et /ou la tumeur des animaux.
Remplacement
Il s’agit ici de l’effet in vivo du régime gras sur l’inflammation et son impact sur le développement tumoral ainsi que l'effet d'un nouvel inhibiteur de l'inflammation : Il n'existe pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo. Cependant des tests in vitro sur des lignées adipocytaires sont menés afin de mieux comprendre l'activation de notre voie d'interet.
Réduction
Le chercheur en charge du projet a déjà mis en place des études similaires dans le passé et s'appuie sur les données des précedentes études pour établir le nombre d'animaux nécessaire dans les cohortes afin d'observer une différence significative si elle existe.
Raffinement
Le changement de litière, la pesée des animaux pourront être amener à etre plus fréquents si besoin.
Choix des espèces
La souris immunocompétente de type C57BL/6 J ou N constitue un modèle expérimental de référence pour ce type d'expérience sur le métabolisme et les greffes de cellules tumorales murines. La C57BL/6N présente des caractéristiques proches de la C57BL/6J. La C57BL/6N n’est pas porteuse de la mutation du gène Nnt contrairement à la C57BL/6J. Cette différence induit une légère différence de phénotype face au régime gras et au développement de l’insulinorésistance. Nos lignées mutantes sont majoritairement sous fond 6J, cependant 2 d’entre elles sont 6N, nous sommes dans l’optique de les backcrosser pour les passer en J. Nos résultats préliminaires ont donné des résultats positifs chez les souris STING sous fond B6J que cela soit en termes de métabolisme ou de tumorigénèse. Souris adultes de 8 à 12 semaines afin d’avoir des animaux adultes (d’âge mûr), pour une utilisation dans un protocole classique de métabolisme et de croissance tumorale.
Mise au point du protocole du modèle murin de l’asthme allergique préscolaire
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de sept jours, séparés de leur mère, reçoivent quatre instillations intranasales et deux injections d'allergène, avant une trachéotomie sous anesthésie sans réveil pour mesurer les paramètres respiratoires. Le porteur indique que la sensibilisation peut provoquer une inflammation des voies aériennes et une dyspnée, corrigée par nébulisation de salbutamol. Il présente ce modèle comme visant de nouvelles cibles contre l'asthme de l'enfant, un bénéfice renvoyé au long terme, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'estimer le remodelage bronchique.
Objectifs
L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. La prévalence de l’asthme préscolaire est estimée entre 5-10 pour cent des enfants d’âge préscolaire (moins de 6 ans) et affecte autant les garçons que les filles. Il est associé à un risque accru d'asthme et d'altération de la fonction pulmonaire pendant l’enfance et à l’âge adulte qui à leur tour augmentent le risque d’apparition précoce de comorbidités respiratoires, cardiovasculaires ou métaboliques de décès prématuré. Ainsi, modifier l'histoire naturelle de l’asthme à l'âge préscolaire a été l'un des principaux objectifs de ces dernières années. L’asthme préscolaire est caractérisé par une hyperactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Cependant, si les deux premières caractéristiques sont ciblées spécifiquement par les traitements antiasthmatiques actuels, aucun traitement ne cible spécifiquement le remodelage bronchique. Le remodelage bronchique associe plusieurs anomalies structurelles de la paroi bronchique où l’augmentation de masse du muscle lisse bronchique apparaît comme un élément déterminant dans la physiopathologie et la persistance de la maladie. En effet, une augmentation de la masse du muscle lisse bronchique (MLB) pendant la période préscolaire a été associée à la persistance de l’asthme et à l’altération de la fonction respiratoire à l’âge scolaire. De plus, nous avons récemment démontré que l’augmentation de la masse du muscle lisse bronchique chez les enfants asthmatiques préscolaires était associée à une augmentation de prolifération mitochondrie-dépendantes des cellules musculaires lisses bronchiques. Nos données préliminaires suggèrent que cette dysfonction mitochondriale semble liée à une anomalie de la dynamique mitochondriale et un déséquilibre entre la formation et l'élimination des mitochondries. Afin de confirmer in vivo cette hypothèse, nous avons besoin de mettre en place le modèle murin d’asthme préscolaire. Nous allons également comparer nos data obtenus grâce à ce modèle avec celles issues du modèle murin d’asthme d’adulte qui a été déjà mis en place au laboratoire. Nous espérons ainsi de révéler les mécanismes communs jouant le rôle primordial dans l’asthme chez les enfants en bas âge.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des voies moléculaires conduisant à une augmentation de la masse des muscles lisses bronchiques (MLB) permettra d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement d’asthme chez l’enfant et l’adulte.
Procédures
Les animaux seront soumis aux quatre instillations intranasales sous l’anesthésie gazeuse (durée jusqu’à 2 minutes) et les deux injections intra-péritonéales de l’allergène (2 injections). Pour les instillations les animaux seront séparés de leur mère pendant une vingtaine de minutes. Les mesures de paramètres respiratoires seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés. Il n’y a pas de réveil après les mesures des paramètres respiratoires qui durent environ dix minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels sur les animaux seront : un léger stress suite aux contentions pour l’injection/l’instillation des allergènes et un bref enfermement dans une boîte en plexiglas le temps de la manipulation (2-3 minutes). Les souris ressentiront une légère douleur de la piqûre pendant l’injection (quelques secondes). L’anesthésie sous isoflurane induit également un léger stress. La sensibilisation aux allergènes peut induire des symptômes asthmatiques chez l’animal : l’inflammation des voies respiratoires et éventuel remodelage bronchique. Ces symptômes peuvent survenir après l’instillation de l’allergène et éventuellement provoquer une dyspnée (un essoufflement). Après l’anesthésie légère, les animaux seront observées par l’opérateur et la dyspnée éventuelle sera corrigée par la nébulisation du salbutamol (1g/ml pendant 15 sec).
Devenir
L’objectif de ce projet est de mettre en place le modèle murin d’asthme préscolaire. Suite au développement des symptômes d’asthme, les paramètres respiratoires seront réalisé sur les animaux mis à mort et les organes seront prélevés et analysés au laboratoire.
Remplacement
En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. Grace au modèle animale, nous testerons les hypothèses apparues après nos résultats in-vitro sur les lignées cellulaires. L’utilisation du modèle murin d’asthme préscolaire dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes et à terme de proposer des traitements plus efficaces pour la prise en charge des personnes asthmatiques.
Réduction
Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Ainsi, nous utiliserons 12 souris dans chacun des trois groupes. Nous allons comparer les organes des groupes de souris asthmatiques avec ceux des animaux témoins.
Raffinement
Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, frisottis et bâtonnets), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide (salbutamol 1g/ml). Toute la durée du protocole expérimental, les souriceaux ne seront jamais séparés de leur mère, sauf pour une courte période d’exposition à l’allergène. Afin de ne pas entraîner un rejet des nouveaux nés par la mère après l’exposition à l’allergène, lors de leur introduction, les souriceaux seront frottés avec la litière souillée pour masquer les odeurs. Les souriceaux seront remis tous ensemble dans la cage pour ne déranger la mère qu'une fois. Les animaux seront surveillés après réintroduction. Les mesures respiratoires sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie.
Choix des espèces
La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés sont des souriceaux âgés de 7 jours afin d'avoir une maturité du système respiratoire semblable à celle des enfants en bas âge.