Rongeurs
Traitement thérapeutique in utero de la souris Moblo, un modèle d’étude de la maladie de Menkes (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour tester un transporteur synthétique de cuivre contre la maladie de Menkès. Les femelles reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept pendant la gestation et les mâles malades des injections jusqu'à J38 ainsi que sept tests neurocomportementaux. Le porteur décrit une mortalité importante des souriceaux à la naissance et un risque d'anévrisme aortique mortel chez les animaux non traités. Douze femelles sont tuées au vingtième jour de gestation et les mâles destinés aux analyses tués à J38, tandis que quarante femelles sont gardées pour la reproduction et des mâles surnuméraires gardés vivants pour une étude de survie.
Objectifs
La maladie de Menkès est une maladie génétique rare au niveau du chromosome X qui a pour conséquence un déficit en cuivre dans l’ensemble de l’organisme. C’est l’incapacité du cuivre à franchir les barrières biologiques (placenta, intestin, cerveau) qui est responsable de la pathologie. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir des enfants malades reste extrêmement pauvre avec des troubles graves aboutissant à un décès dans les premières années de vie. Les nanoparticules ont la capacité de franchir différentes barrières biologiques dont la barrière placentaire. Nous suivons une piste thérapeutique chez la souris porteuse de cette mutation, par l’utilisation d’un transporteur synthétique du cuivre (TSC) qui permet d’acheminer le cuivre aux organes cibles tels que le cerveau ou le placenta. Nos travaux ont montré une tolérance des souriceaux à ce traitement. Nous avons déterminé une dose et un rythme d’administration optimaux de TSC, et démontré l’amélioration des signes cliniques chez les souriceaux mâles malades traités par TSC. Néanmoins, malgré un allongement très net de l’espérance de vie et un comportement exploratoire plus alerte, nous n’avons pas corrigé les troubles squelettiques dont les malformations apparaissent au stade embryonnaire, notre traitement actuel ne démarrant qu’au 5e jour post-natal. De plus, les souriceaux mâles non traités montrent une forte mortalité à la naissance avec des ratio sexe/génotype non respectés. Les atteintes liées au déficit en cuivre apparaissent dès le stade embryonnaire. Notre projet vise à montrer qu’un traitement précoce des souris gestantes porteuses de la mutation va permettre une viabilité́ plus importante tout en corrigeant les troubles squelettiques des descendants malades. Le gène de la maladie du métabolisme du cuivre étant porté par le chromosome X, les mâles sont fortement touchés. L’étude sera donc menée sur des femelles dites hétérozygotes, i.e. porteuses d’une version mutée et d’une version non mutée du gène responsable de la maladie, et ne déclarant que peu ou pas de symptômes. Les souris mâles hémizygotes, i.e. porteuses d’un exemplaire unique du gène muté et donc souffrant de la maladie, et nées de ces femelles seront également utilisées pour réaliser les tests neurocomportementaux pour certains, tandis que les animaux surnuméraires seront traités tout au long de leur vie afin d’établir une courbe de survie pour ce modèle d’étude.
Bénéfices attendus
1) Une restauration des ratios sexe/génotype avec une diminution importante de la mortalité à la naissance 2) Une croissance squelettique normalisée pour les descendants mâles malades mais traités avec le médicament. 3) Une restauration des fonctions biologiques altérées. 4) Une restauration des fonctions cognitives principales. 5) Une amélioration de la survie.
Procédures
- Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’au 20e jour de gestation pour les femelles porteuses de la maladie mais non atteintes - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie - Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J38 pour les souris mâles malades.
Impact sur les animaux
1) Une mortalité importante à la naissance des souriceaux issus de femelles porteuses de la maladie mais non atteintes, et non traitées pendant la gestation. 2) Mort des animaux non traités ou traités par histidine-cuivre liée au risque d’anévrisme aortique. Ce point est prévisible dans la plupart des cas notamment avec une stagnation voire une perte de poids, ainsi qu’une apathie et une fébrilité (troubles de la mobilité, difficultés d’alimentation). Les études précédemment réalisées ont montré que les souriceaux recevant le TSC avaient une espérance de vie considérablement augmentée, ce qui nous permet de dire que les animaux traités ne subiront pas d’anévrisme aortique grâce au traitement administré. 3) Modification du comportement maternel pendant la gestation et à la naissance (construction du nid, gestion de la portée...) grâce au traitement.
Devenir
Les femelles porteuses de la maladie (mais non atteintes) destinées à l’étude du passage placentaire (au nombre de 12) seront mises à mort au vingtième jour de la gestation, juste avant la mise bas. Les femelles porteuses de la maladie (mais non atteintes) (40) allant jusqu’à la mise bas seront gardées en vie pour de futurs accouplements. Les descendants mâles seront gardés en vie jusqu’à J38 pour ceux destinés aux tests neurocomportementaux (40) dans le but d’effectuer les analyses biochimiques et histologiques. La descendance mâle surnuméraire (40) destinée à l’étude de survie sera gardée vie jusqu’à J100 dans le but de valider les effets bénéfiques du traitement sur la survie. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traitées avec le placebo ou l’histidinate de cuivre (traitement actuel mais inefficace de la maladie de Menkes) est comprise entre 3 et 5 semaines. Au total 132 souris seront impliquées dans ce protocole expérimental.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie, le ratio sexe/génotype dans les portées et l’amélioration de la mobilité et du comportement du souriceau porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L'étude gestationnelle portera sur 52 femelles au total reparties en 4 groupes de 3 femelles pour la validation du traitement gestationnel. La cohorte de 12 femelles porteuses saines de la mutation, sera mise à mort au 20e jour de gestation dans le but de confirmer les effets positifs potentiels du traitement au cours de la gestation. Au vu des résultats encourageants que nous avons obtenus sur nos travaux portant sur le franchissement de la barrière sang-cerveau, et partant du principe que les mécanismes biologiques régissant le transport du cuivre sont similaires au niveau du cerveau et du placenta nous pensons que le TSC franchira cette barrière placentaire. Si les résultats de dosage du cuivre confirment notre hypothèse de transport à travers le placenta, 4 autres groupes de 10 femelles porteuses saines de la mutation seront destinées à l'étude de l'impact du traitement gestationnel sur la descendance mâle. L’étude comportementale, quant à elle, portera sur 40 souris réparties en 4 groupes de 10 souris malades qui seront étudiés et mis à mort une fois les tests comportementaux terminés, à l’âge de 38 jours. La courbe de survie sera évaluée à partir d'animaux surnuméraires, selon la même distribution de 40 souris mâles supplémentaires et porteuses de la maladie. Au total 132 souris seront impliquées dans l'étude, un nombre d’animaux nécessaire pour mener à bien ce protocole expérimental et obtenir une puissance statistique suffisante. De plus, l’hypothèse faite serait que grâce au traitement, les ratios sexe/génotypes devraient être restaurés et produire au moins 2 mâles mutants par portée. Un mâle sera dédié aux tests neurocomportementaux tandis que le deuxième permettra d’établir une courbe de survie nécessaire pour valider l’effet positif du traitement gestationnel.
Raffinement
Toutes les cages du protocole sont garnies d’éléments enrichissants (coton, buchettes, etc.). Ces éléments permettront notamment aux femelles gestantes de nidifier, ce qui va créer une atmosphère sécurisante pour l’ensemble des souris. Au cours des expérimentations, les souriceaux devant subir un traitement seront isolés de la mère le temps de l’expérimentation (injection et/ou tests neurocomportementaux), et la mère mise à distance, dans le but de réduire le stress maternel. A la fin de l’expérimentation, les petits seront remis rapidement dans la cage avec la mère et isolé au calme (pièce d’hébergement, sans mouvement brusque de la cage). S’agissant d’une maladie génétique, les troubles physiologiques sont présents tout au long de la vie de l’animal et il n’est pas prévu de pratiquer une analgésie qui pourrait d’une part générer un stress supplémentaire lors du traitement quotidien et d’autre part perturber fortement les tests neuro-comportementaux, rendant les résultats inexploitables. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites : isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux.
Choix des espèces
La souris ATP7Amoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant une étude de cette pathologie génétique. L'utilisation d'un modèle mammifère, et de souris en particuliers, permet d'étudier l'efficacité du médicament dans l'intégralité d'un organisme vivant proche de l'homme. Ce choix se justifie aussi par la possibilité de faire des liens avec d’autres modèles transgéniques murins utilisés pour l'étude d'autres maladies métaboliques. Nous focaliserons l’étude de la conception jusqu’au-delà du sevrage, à J38 pour les souriceaux destinés aux études neurocomportementales et J100 pour les souriceaux surnuméraires destinés à l’étude de la survie. Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité du traitement du développement embryonnaire et ce jusqu’à l’âge adulte. Les femelles porteuses saines de la mutation seront mises en accouplement à l'âge de 3 à 5 mois, et celles qui subissent le traitement pendant la gestation seront utilisées à nouveau pour maintenir la lignée.
Etude du rôle du dihydrogène dans l’effet anti-tumoral d’un régime enrichi en fibres alimentaires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime riche en fibres par gavage trois à cinq fois par semaine, une implantation de tumeur sous la peau ou une injection intraveineuse de cellules cancéreuses, et sont privées d'eau et de nourriture jusqu'à quatre heures lors des mesures de dihydrogène expiré. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et présente l'implantation de tumeurs comme n'induisant pas de souffrance. Il indique que le rôle du microbiote ne peut être étudié qu'in vivo et qu'il n'existe "pas d'alternative à ce jour".
Objectifs
Nous avons montré qu’un régime riche en fibre (High Fiber Diet - HFD) permet de moduler positivement la composition de la flore intestinale, ainsi que ses fonctions, impactant sur le métabolisme et l'immunité de l’hôte. Ceci conduit à l’activation de cellules immunitaires particulières au niveau intestinal. Dans un modèle de mélanome chez la souris, nous montrons qu’un pré-conditionnement à l’aide d’un régime HFD permet de prévenir la pousse tumorale, grâce aux mêmes cellules immunitaires que celles retrouvées dans l'intestin. Ainsi, nos données suggèrent qu’un régime riche en fibre, en modulant le microbiote intestinal et ses métabolites, dont le dihydrogène, active l’immunité locale et systémique de l’hôte, permettant une immunosurveillance accrue des cancers. De plus, nous avons montré qu’un régime HFD conduit à la production de dihydrogène (H2), connu pour ses propriétés immunostimulantes. Afin d’étudier le rôle du H2 dans l’effet immunostimulant et antitumoral du régime HFD, nous proposons de comparer les effets d’un régime HFD avec ceux induits par l’administration d’H2 (hydrogénothérapie). Cette démonstration renforcera nos observations et permettra le transfert rapide du régime HFD en clinique humaine, ainsi que dans la population générale.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de répondre à deux questions : (i) La quantité d’H2 produit par consommation d’inuline alimentaire peut-elle suffire à induire, par inhalation, une inhibition de la croissance tumorale ? Pour répondre à cette question, nous déterminerons tout d’abord la quantité d’H2 produite chez des souris nourries avec un régime HFD. Cette dose d’H2 déterminée sera ensuite administrée à des souris porteuses de tumeurs afin que nous étudiions la croissance tumorale et la réponse immunitaire anti-cancer. (ii) L’H2 produit par la consommation de fibres participe-t-il à l’induction de l’immunité anti-cancer ? Pour répondre à cette question, l’immunité basale des animaux sera analysée après 2 semaines de traitement. En démontrant l’effet anti-cancer d’une dose modérée d’H2 et son implication potentielle dans l’effet anti-tumoral du régime HFD, nous aurons des données préliminaires solides pour demander des financements de recherche préclinique (sur le mécanisme d’action de prébiotiques) et pour engager rapidement des essais cliniques. Enfin, ce projet doit permettre de développer de nouvelles technologies applicables dans des études précliniques sur des rongeurs de laboratoire et qui pourront être transférées en clinique (dispositifs de mesure de H2 exhalé et/ou dispositif d’administration de H2).
Procédures
Une partie des animaux sera nourrie avec un régime HFD, administré par gavage oral 3 ou 5 fois par semaine durant 1 mois (1 minute / gavage). Les animaux sont hébergés dans l'enceinte de mesure d'H2 pendant au maximum 4h consécutives, durant lesquelles ils seront surveillés par l'expérimentateur. Les fèces des animaux seront collectés après 2 semaines de préconditionnement (< 1 minute / souris). Une partie des animaux recevra une implantation tumorale par injection sous-cutanée (1 minute / souris), ou une injection de cellules cancéreuses par voie intra-veineuse, sous anesthésie (5 minutes / souris). Les prélèvements sanguins (2 minutes / souris) seront réalisés uniquement en fin d'expérience, sous anesthésie volatile, et sans réveil. Lorsque les animaux (ou un des animaux) atteindront un des points limites, ils subiront une anesthésie volatile terminale puis un prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
Nous n'attendons pas d'effet indésirable dans ce projet. Le traitement des animaux sera apporté par des gestes expérimentaux de classe légère (gavage ou inhalation). L'implantation de tumeurs en elle-même n'induit pas de souffrance des animaux. Les prélèvements sanguins seront systématiquement réalisés sous anesthésie générale. En revanche, durant la mesure d'H2 exhalé et l'hydrogénothérapie, les animaux n'auront pas accès à l'abreuvement et à l'alimentation, pour une durée relativement courte (maximum 4 heures).
Devenir
Les animaux en fin d'expérimentation seront euthanasiés après avoir atteint les points limites, pour des prélèvements d'organes et de tissus.
Remplacement
Le rôle du microbiote intestinal ne peut être étudié qu'in vivo. En effet, les interactions hôte/microbes et notament système immunitaire de l'hôte/microbes et les réponses anti-tumoralesinduites nécessitent une étude dans un organisme vivant. Il n'existe donc pas d'alternative à ce jour.
Réduction
Afin de tenir compte de la variabilité inter individuelle dans la réponse aux différents traitements, des groupes de 6 animaux seront constitués. Ainsi, malgré la variabilité, ce nombre d'animaux par groupe apportera une fiabilité au niveau statistique. De plus, plusieurs conditions expérimentales seront testées en parallèle, afin de mutualiser les groupes contrôles, et donc de réduire le nombre d'animaux contrôles utilisés. La dernière expérience ne sera réalisée que si les précédentes donnent des résultats satisfaisants.
Raffinement
Afin d'assurer le bien-être des animaux, les souris seront hébergées par cage de 6, avec environnement enrichi. Le régime alimentaire sera administré par gavage, et l'hydrogénothérapie par inhalation. L'injection sous-cutanée ou intra-veineuse de cellules cancéreuses n'induit qu'une légère souffrance des animaux. Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés à la suite des implantations tumorales. Les injections et prélèvements sont réalisées sous légères anesthésies générales.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent pour mener ce genre d'étude. La manipulation de leur flore est acquise. De plus, les modèles tumoraux ainsi que les outils pour étudier les réponses immunes induites sont parfaitement développées pour ce modèle animal. Tous nos résultats précédents obtenus dans le cadre de cette thématique l'ont été avec ce même modèle murin. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines d'âge (livrées à 5 semaines + 1 semaine d'acclimatation). A ce stade, les souris sont sevrées et le système immunitaire est pleinenement mature et permet donc son étude.
Comparaison de l’intégration de la sensibilité méningée au niveau du système nerveux central chez les mâles et les femelles
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une craniotomie pour implanter une canule, puis jusqu'à quatre injections de molécules inflammatoires sur les méninges pour reproduire une crise de migraine, avec mesure de la sensibilité par filaments de von Frey. Le porteur indique que le modèle provoque une douleur ressentie deux heures après chaque injection et impose un isolement en cage individuelle de deux semaines pour éviter l'arrachage des canules. Les retombées annoncées, de nouveaux traitements tenant compte des différences femmes/hommes, sont renvoyées au long terme, l'objectif immédiat restant de comparer l'activation cérébrale entre sexes.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier l’activation des voies de la douleur par des stimulations méningées qui miment le mal de tête ressenti lors de la migraine, en utilisant des marqueurs d’activation neuronale. Nous souhaitons comparer l’activation des régions du système nerveux central chez les mâles et les femelles pour voir s’il y a des différences entre les mâles et les femelles, mais aussi en fonction des variations hormonales qui ont lieu pendant le cycle sexuel chez la femelle. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons un modèle animal mimant l'inflammation qui semble avoir lieu au niveau des méninges pendant les crises de migraine et qui provoque la douleur ressentie. En effet, pendant la phase « mal de tête », la douleur ne peut être générée qu’au niveau des méninges puisqu’il n’existe pas de récepteurs à la douleur dans le cerveau. L’hypothèse actuelle est que cette douleur est la conséquence d’une inflammation provoquée par des molécules (histamine, bradykinine, sérotonine, prostaglandines…) libérées par les fibres nerveuses au niveau des méninges.
Bénéfices attendus
A moyen terme, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes d’intégration de la douleur ressentie lors des migraines au niveau du système nerveux central chez les mâles et les femelles. En effet la migraine touche plus les femmes que les hommes, mais les études ont été majoritairement réalisées chez les mâles. Pourtant, il est connu qu’il existe des différences d’intégration inhérentes au sexe et au cycle hormonal. Ainsi identifier les différences ainsi que le rôle des différentes régions cérébrales dans cette pathologie nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A plus long terme, mieux comprendre la pathologie peut nous aider à développer de nouveaux traitements qui pourraient mieux soulager les patients en tenant compte des différences hommes/femmes.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 intervention chirurgicale qui consiste en une craniotomie pour pouvoir implanter une canule pour appliquer à la surface des méninges une inflammation, mimant ce qui se passe pendant les crises de migraines. Les chirurgies sont réalisées chez les animaux anesthésiés. Chaque chirurgie dure environ 30 à 45 min. Injection des molécules sur les méninges afin de mimer les crises de migraine: 4 injections (au maximum) tous les 2 ou 3 jours ; l'injection se fait sous anesthésie brève et dure moins de 2 min ; réveil des animaux en 5 min. Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h (4 fois maximum) ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal toutes les 15 min pendant 4 h après l'injection des molécules sur la dure-mère (chaque application dure quelques secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois : cela dure 5 min.
Impact sur les animaux
Nous réalisons une procédure chirurgicale (implantation de la canule). La douleur est prise en charge en post-opératoire. Par ailleurs, nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie pendant 2 h après l’injection, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey induisent un retrait de la face signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure moins d’une seconde. Un autre effet indésirable est l’obligation de séparer les animaux (un par cage) après la chirurgie pour la mise en place de la canule. En effet, si les animaux restent ensemble, ils arrachent les canules. Ils sont donc seuls dans une cage pendant 2 semaines.
Devenir
La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau: les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Cependant, l’expérience montre qu'un certain nombre d'échecs est rencontré lors des études qui incluent une chirurgie (perforation des méninges, anesthésie, canules bouchées, échec de l'habituation) soit des échecs dans environ 20% des cas, ce qui nous amène à prendre 10 animaux par groupe. Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles.
Raffinement
Les nuisances identifiées sur le bien-être des animaux sont : la douleur engendrée par la chirurgie, la douleur engendrée dans le cadre du modèle, et la séparation des animaux après la mise en place de la canule sur les méninges. Afin de réduire la douleur de la chirurgie, un traitement avec un antalgique est donné pendant 3 jours. Pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la chirurgie, la cornée est protégée par de la vaseline pendant toute cette étape. Concernant la douleur générée par l’application des filaments de Von Frey, nous respectons les recommandations de l'International Association for the Study of Pain (IASP). Nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Pour améliorer le bien-être des animaux après la chirurgie, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher avant la chirurgie. Après l’implantation de la canule, les animaux seront seuls dans une cage pour éviter de s’arracher les canules. Les rouleaux seront remplacés (risque d’arracher la canule) par des feuilles de sopalin blanc pour permettre aux animaux de faire un nid.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.
Etude pilote : Déterminer les effets de l’injection sous-cutanée ou intradermique de fragments de cellules sénescentes sur l’activation du système immunitaire murin.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie à l'isoflurane, elles reçoivent des injections sous-cutanées dans les flancs ou intradermiques dans les oreilles de fragments de cellules sénescentes, puis sont tuées au dioxyde de carbone à 24, 48, 72 ou 168 heures pour prélever ganglions et sites d'injection. Le porteur n'attend qu'une réaction locale, rougeur ou gonflement, sans réponse systémique. Il affirme que cette réponse impliquant plusieurs organes est impossible à étudier in vitro et conclut que le recours à la souris est "indispensable".
Objectifs
Dans notre groupe nous étudions la sénescence cellulaire. La sénescence est une destinée cellulaire. Elle se caractérise, entre autres, par la sécrétion de molécules spécifiques et un arrêt permanant du cycle cellulaire en réponse à des stimuli dommageables. De multiples études ont montré que les cellules sénescentes sont à l'origine du vieillissement et des maladies liées à l'âge, mais le mécanisme d’action reste inconnu. Une autre caractéristique observée dans les tissus vieillissants est l'inflammation chronique de bas bruit appelée inlamm’aging, de la contraction d’inflammation et âge. Lors de nos études, nous avons récemment découvert une nouvelle caractéristique de la sénescence que nous avons nommée fragmentation. Les cellules sénescentes génèrent des fragments et comme leur nom l’indique il s’agit de petits bouts qui se détachent des cellules. L’intégrité des fragments est maintenue jusqu’à trois jours après leur formation, après quoi ils se rompent et relarguent leur contenu. Leur rôle est pour le moment inconnu et nous cherchons à le comprendre. L’analyse du contenu des fragments a révélé la présence d’une grande majorité de molécules liées à l’inflammation. Les fragments sont donc potentiellement une source d’inflamm’aging et ils ne sont pas encore décrits dans la littérature scientifique. L’objectif principal de notre projet est de tester la capacité de ces fragments de cellules sénescentes à induire de l’inflammation ou en d’autres termes leur capacité à activer le système immunitaire. Dans cette expérience pilote, nous cherchons à trouver les conditions optimales pour mesurer l'effet des fragments sur l'activation de la réponse immunitaire locale dans un modèle de souris. Pour cela, nous isolerons des fragments et ferons des injections sous-cutanée ou intradermique des fragments et des contrôles appropriés. Nous évaluerons la réponse inflammatoire liée à ces injections à 4 temps différents et en utilisant des techniques communément utilisées en laboratoire telles que l’immunomarquage fluorescent (IF), l’analyse de cytométrie de flux (FACS) et la PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR). La meilleure méthode sera sélectionnée pour de futures études des mécanismes des effets pro-inflammatoires des fragments sénescents.
Bénéfices attendus
La senescence est, entre autres, liée aux mécanismes de réparation tissulaire, au vieillissement et aux maladies liées à l’âge. Ce projet va nous permettre d’établir un modèle optimal d’étude des effets immunomodulateurs des fragments produits par les cellules sénescentes. En manipulant ce modèle nous pourront évaluer le caractère et l’intensité de la réponse immunitaire aux fragments. Ce modèle nous servira également à caractériser les mécanismes d’action des fragments et leurs interactions avec les cellules immunitaires.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections sous-cutanées ou intradermiques. Elles seront, au préalable, anesthésiées par inhalation d'isoflurane. La moitié d’entre elles sera soumise à une injection sous-cutanée dans chacun des flancs dorsaux (soit deux injections par souris) _ une injection de fragments d’un côté et une injection d’un contrôle de l’autre. L’autre moitié sera soumise à une injection intradermique dans chacune des oreilles (soit deux injections par souris) _ une injection de fragments d’un côté et une injection d’un contrôle de l’autre. La durée totale de la procédure est estimée à 10 minutes par animal. Aux temps suivants : 24h, 48h, 72h et 168h ; des groupes d’animaux de chaque condition expérimentale seront euthanasiés par exposition à des doses croissante de dioxyde de carbone et les tissus d’intérêts (sites d’injection, ganglions lymphatiques adéquats) seront disséqués pour les analyses ultérieures.
Impact sur les animaux
L’injection de fragments ou cellules syngéniques, c’est-à-dire génétiquement identique à la souris injectée, ne devrait pas déclencher de réponse immunitaire systémique. Au pire, il pourrait y avoir une réponse, locale et limitée, caractérisée par de l’infiltration des cellules immunitaires et de l’inflammation locale. Les effets secondaires qui seraient éventuellement liés à la piqure, tels que des rougeurs, gonflements ou automutilations au niveau du site d’injection seront surveillés pendant les trois jours suivant l’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à des moments bien précis selon un protocol autorisé, afin d'isoler les ganglions lymphatiques et le site d'injection pour des analyses supplémetaires.
Remplacement
La réponse du système immunitaire à la présence de fragments produits par les cellules sénescentes implique des interactions complexes entre différents organes et différents types cellulaires. Cette réponse complexe est impossible à étudier avec des modèles cellulaires in-vitro. Pour bien comprendre la dynamique de cette réponse immunitaire et les types cellulaires en jeu, l’utilisation d’un modèle in vivo est indispensable.
Réduction
Du fait de l’activation de la réponse immunitaire au niveau local uniquement, nous pouvons appliquer l’échantillon à tester et l’échantillon contrôle sur une même souris, réduisant ainsi de moitié le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Ainsi l’utilisation de 10 souris par conditions devrait être suffisante pour obtenir des résultats statistiquement interprétables.
Raffinement
Les souris seront regroupées à plusieurs par cage afin de préserver les interactions sociales, avec un nid comme enrichissement de milieu. Les injections sous-cutanées et intradermiques se feront sous anesthésie gazeuse. Du gel ophtalmique sera appliqué durant tout le temps de l’anesthésie pour prévenir le dessèchement de la cornée. Après l’injection l’animal sera placé dans une cage chauffée à 37°C et surveillé jusqu’au réveil complet. D’une manière générale, l’état de la souris (apparence générale, comportement, posture, mouvements) sera surveillé durant toute la durée du protocole. Si un animal venait à présenter des signes de détresse, il serait soigné et retiré de l’étude. Dans un cas plus sévère, l’animal serait euthanasié.
Choix des espèces
Les systèmes immunitaires humain et murin présentent des similitudes, en termes d’immunité innée et acquise, qui rendent l’utilisation de la souris très appropriée pour cette étude. De plus les molécules des DAMP et leurs récepteurs sont très similaires entre la souris et l’humain. De même, les cellules murines et humaines sénescent de la même manière. Les animaux seront utilisés dès l'âge de 8 -12 semaines pour étudier la réponse immunitaire aux fragments sénescents à l'âge adulte. Nous avons choisi cette tranche d'âge, car à ce stade, le système immunitaire inné et adaptatif est suffisamment mature.
Effets de la chirurgie bariatrique sur l’amélioration des fonctions cardio-vasculaires, hépatiques, métaboliques et osseuses de la femelle rat obèse et sur sa descendance
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
250 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère. Des femelles rendues obèses subissent une chirurgie bariatrique classée sévère, puis elles et leur descendance passent prises de sang, scanners osseux, échographies et tests de glycémie avant d'être tuées pour prélèvement de multiples organes. L'étude évalue les effets de cette chirurgie avant la grossesse sur les mères et leurs petits. Le porteur affirme que les répercussions d'une chirurgie ne peuvent être évaluées ni sur cellules en culture ni en biobanque, "sans alternative" au recours aux animaux non-humains.
Objectifs
Ce projet continue une recherche déjà en cours afin de la poursuivre et de l'achever, au vu des retards pris durant la crise sanitaire du Covid 19. Son objectif global est d'établir, dans un modèle d'obésité induite par la nourriture grasse et sucrée chez le rat, les effets à court et long terme de la chirurgie bariatrique (ou "chirurgie de l'obésité") des mères avant leur grossesse sur leur propre santé, mais aussi sur celle de leur descendance. Nous allons ainsi: 1. Evaluer les effets de la chirurgie bariatrique réalisée avant la grossesse sur le statut nutritionnel et métabolique (diabète et cholestérol), sur les risques cardiaques et vasculaires (hypertension, risques d'infarctus du myocarde), sur le devenir hépatique (maladie du foie gras), sur la fragilité osseuse (ostéoporose) et sur les capacités de lactation des mères. 2. Evaluer sur les mêmes paramètres les effets de la chirurgie bariatrique réalisée avant la grossesse chez les descendants des mères opérées placés sous alimentation normale. 3. Evaluer sur les mêmes paramètres les effets de la chirurgie bariatrique réalisée avant la grossesse chez les descendants des mères opérées placés sous alimentation grasse et sucrée au sevrage, afin de rechercher des effets protecteurs ou délétères de la chirurgie bariatrique maternelle sur le développement précoce d'altérations métaboliques, cardio-vasculaires ou hépatiques. 4. Identifier des biomarqueurs de risque de l'obésité chez les descendants, et évaluer leurs modifications potentielles induite par la chirurgie bariatrique maternelle.
Bénéfices attendus
Amélioration des connaissances sur les répercussions de la chirurgie bariatrique faite avant la grossesse sur la santé globale des mères opérées, avant, pendant et après la gestation et l'allaitement. Analyse des risques potentiels induits à court et long terme chez leurs descendants, dans un environnement nutritionnellement normal ou hypercaloriqueet en prenant en compte l'existence de possibles différences en fonction du sexe, d'une susceptibilité au développement d'une obésité, d'anomalies du métabolisme du sucre et des lipides, de stéatose hépatique, d'anomalies cardiaques et vasculaires précoces, et de fragilisation osseuse. Recherche de facteurs pouvant expliquer le ou les profils à risque identifiés et de biomarqeurs de risques, pouvant être utilisés secondairement en clinique pour des stratégies de prévention primaire dans le cadre d'une médecine personnalisée. Ces résultats pourront être validés en clinique par des tests faits sur les biocollections locales, sans contrainte supplémentaires sur des animaux ou des patients.
Procédures
Les mères seront soumises à une procédure chirurgicale (une heure maximum d'intervention), dont seules les procédures de chirurgie bariatrique sont classées en procédures sévères, et à deux prises de sang, effectuées sous anesthésie générale, avec un intervalle de plus de 3 mois. Elles auront également, sur la durée totale de suivi de 8 mois, deux passages de moins de 24 heures en cage isolée pour quantifier les calories ingérées, 4 scanners osseux d'une durée de 30 minutes (test indolore, réalisé sous anesthésie générale courte), 3 échographies cardiaques de 10 minutes, 3 séries de tests de glycémies, et deux séries de prises de tension artérielle. Les descendants auront, dans les 15 jours précédant leur euthanasie, une mesure de tension artérielle, une échographie cardiaque, un scanner osseux, une mise en cage isolée de moins de 24h, une prise de sang (sous anesthésie générale), et un test de glycémies.
Impact sur les animaux
Stress induit par la mise en cage d'isolement des animaux d'une durée inférieures à 24 heures, réalisé une fois par animal, et minimisé par intégration dans la cage de petit tunnel comme objet de distraction. Douleur post-opératoire après chirurgie bariatrique durant environ 48-72 heures, avec risque de nausées, prévenus par l'administration systématique de médicaments anti-douleurs et anti-émétiques et surveillance rapprochés pluri-quotidienne des animaux dans les trois jours postopératoires. Les mesures de glycémie à la queue de l'animal occasionnent une douleur très brève initiale lors de la première ponction, non accessible à une antalgie orale ou intra-veineuse, et minimisée par le maintien de l'animal dans sa cage avec ses congénères qui permet de diminuer son stress lors de l'examen.
Devenir
Les femelles obèses opérées et leurs descendants inclus dans les groupes de suivi longitudinal seront euthanasiés pour prélèvement multi-organes afin de réaliser dessus des analyses fonctionnelles et histologiques sur les différents tissus. Ces dernières permettront de déterminer s'il existe des anomalies du tissu osseux (résistance), du coeur (facteurs favorisant les infarctus), des artères (plaques d'athérosclérose, anomalies du fonctionnement favorisant l'hypertension artérielle), de la graisse (quantification, analyse de la morphologie des cellules de graisse) et du foie (accumulation de tissus gras, fibrose, voire cellules cancéreuses).
Remplacement
Contrairement à l'effet d'une molécule, les répercussions d'une intervention chirurgicale ne peuvent pas être évaluées sur un modèle de cellules en culture ou des analyses de tissus en biobanque, et continuent donc à nécessiter l'utilisation d'animaux, sans alternative ou solution de remplacement possible.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires par groupe a été calculé par analyse statistique en amont au plus juste, portant à 12 (6 mâles et 6 femelles) le nombre d'animaux par groupe d'âge d'analyse.
Raffinement
La gestion du bien-être animal sera assurée par un habitat optimisé, et groupes de 3 à 5 individus, avec des objets de stimulation dans la cage, une surveillance clinique quotidienne, et l'utilisation de médicaments antidouleurs adaptés à tout geste potentiellement douloureux. Tous ces gestes seront limités au maximum et effectués sous anesthésie générale . Les situations non douloureuses mais stressantes seront également limitées en nombre et dans leur durée.
Choix des espèces
Contrairement à l'effet d'une molécule, les répercussions d'une intervention chirurgicale ne peuvent pas être évaluées sur un modèle de cellules en cultures, et continuent donc à nécessiter l'utilisation d'animaux, sans alternative ou solution de remplacement possible. Il a été démontré que les modèles de rongeurs pouvaient reproduire fidèlement le profil de patients avec une obésité induite et les effets de la chirurgie bariatrique. Leur rapidité d'évolution et de reproduction, en comparaison avec l'observation de cohortes humaines, devrait en outre nous permettre d'obtenir des résultats rapidement, et de mener dans les cinq ans à une bonne identification des profils des descendants à risque métabolique particulier. Les femelles rat Sprague-Dawley seront incluse dans le protocle de régime obésogène, en vue d'une chirurgie bariatrique ou sham à 7 semaines de vie, afin d'avoir un âge compatible avec un bon taux de fertilité au terme du protocole (obésité induite + chirurgie bariatrique, 10 semaines +/- 1 au total). Leurs descendants seront inclus dans le protocole de suivi longitudinal au moment du sevrage. Les mâles reproducteurs auront aux alentours de 12 semaines de vie.
Développement d’une molécule thérapeutique pour la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
1 722 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, la grande majorité en sévère. Génétiquement modifiées pour développer une paralysie progressive proche de la sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent des injections, une pose de minipompe par chirurgie et des tests moteurs répétés, pour tester une molécule dérivée du virus de la rage. Le porteur indique que la paralysie apparaît vers cent jours et que les souris sont mises à mort à un score neurologique de 4 ou une perte de poids de 25 %. Il affirme que le modèle murin est "le plus utilisé" pour développer de nouvelles thérapies de cette maladie.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est provoquée par une dégénérescence progressive des neurones moteurs du cerveau et de la moelle épinière qui contrôlent la contraction et le relâchement des cellules musculaires. Cette mort neuronale entraîne une atrophie des muscles qui ne sont plus stimulés et une paralysie. Une réaction inflammatoire impliquant plusieurs populations de cellules immunitaires amplifie ce processus de mort neuronale et aggrave la pathologie. Il a été démontré que cette neuroinflammation est en partie causée par une déficience des cellules régulant l’inflammation, les lymphocytes T régulateurs (Treg).Ces cellules inhibent normalement l’activité des autres cellules immunitaires. Les souris transgéniques SOD1G93A expriment plusieurs copies du gène humain SOD1 comportant la mutation G93A qui est responsable de cas familiaux de SLA chez l’homme. Ce modèle murin développe une pathologie très proche de la SLA sur le plan clinique et pathologique. Sur le plan histopathologique, une diminution progressive du nombre de neurones moteurs dans la moelle épinière est observée ainsi que des processus neuroinflammatoires. Cette lignée de souris est la référence dans le domaine de la SLA et est largement utilisée pour tester de nouvelles molécules thérapeutiques. Nous souhaitons tester dans ce modèle expérimental de SLA, les propriétés neuroprotectrices et anti-inflammatoires de la biomolécule «NV», développée et brevetée par notre laboratoire. NV est un bio-peptide dérivé du virus de la rage. Notre laboratoire a montré sur des cultures de neurones que NV favorise la survie des cellules, l’élongation des prolongements cellulaires qui permettent les connections entre neurones, et la repousse de ces connections après lésion. L’effet neuroprotecteur de NV a également été démontré in vivo dans un modèle murin de dégénérescence des neurones de la rétine. Par ailleurs, nous avons observé que NV possède des propriétés anti-inflammatoires par un mécanisme impliquant l’augmentation de l’expression d’une molécule immunosuppressive, PDL1 (Programmed Death PD-1 ligand). De plus, il a été montré que PDL1 était également un activateur de l’activité des cellules Treg. Ces résultats suggèrent que NV pourrait être utilisé dans la SLA à la fois pour protéger les neurones moteurs de la mort cellulaire (effet neuroprotecteur) et inhiber le processus neuroinflammatoire délétère (effet anti-inflammatoire).
Bénéfices attendus
La SLA est une maladie neurodégénérative qui détruit graduellement les motoneurones induisant une paralysie musculaire progressive et qui devient rapidement létale lorsque les muscles respiratoires sont touchés. Les traitements actuellement disponibles se limitent à deux molécules qui ne prolongent que de quelques mois la vie des patients. Dans ce contexte, de nouvelles molécules sont activement recherchées et plusieurs essais cliniques suivant de nouvelles approches thérapeutiques sont actuellement en cours. NV, une nouvelle molécule qui pourrait à la fois stimuler la survie des motoneurones, ralentir leur atrophie et en même temps inhiber la neuro-inflammation retarderait le début de la paralysie létale et prolongerait la vie des patients. En traitant les symptômes communs à toutes les formes de SLA et non la cause, NV pourrait être appliquée à tous les patients atteints de SLA.
Procédures
Tout d’abord, les nuisances prévues sont liées au phénotype dommageable. A cela s’ajoute les nuisances prévues lors des procédures testant l’administration de la molécule NV directement ou vectorisées par un vecteur viral par différentes voies d’injections en liens avec les protocoles d’anesthésie et d’analgésie. Chaque animal ne sera inclus que dans une seule des procédures du projet de recherche. Par conséquent, chaque animal ne subira qu’une injection unique, quelle que soit la voie d’administration nécessitant une chirurgie ou non. Les souris seront soumises à 6 types d’interventions : anesthésie gazeuse à l’isoflurane, injection de la biomolécule ou du vecteur virale, prélèvements sanguins, intervention chirurgicale pour la pose d’une minipompe osmotique, test neurologique et test moteur. Toutes les souris subiront une anesthésie gazeuse à l’isoflurane, ponctuelle, de 3 minutes environ. Cette anesthésie gazeuse précédera soit une injection unique de la biomolécule NV ou du vecteur viral par voie intraveineuse (moins d’une minute), par voie intrathécale (moins d’une minute) ou par voie intracérébroventriculaire (moins de 5 minutes). Soit l’anesthésie gazeuse, suite à une analgésie, précédera une intervention chirurgicale d’une dizaine de minute pour la pose d’une minipompe osmotique diffusant la biomolécule NV durant au moins 4 semaines. Les souris subiront toutes un prélèvement sanguin hebdomadaire de moins d’une minute pendant 3 à 17 semaines selon les procédures. Enfin, 3 fois par semaines, les souris subiront un test neurologique et un test des capacités motrices de moins de 5 minutes chacun.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris SOD1G93A. Les souris SOD1G93A expriment plusieurs copies d’un transgène contenant le gène humain mutant SOD1 et sont le modèle animal de référence pour l’étude de la SLA. Ce modèle murin présente des signes cliniques et pathologiques en commun avec la maladie chez l’Homme tel que la perte des motoneurones, une faiblesse et une atrophie musculaire progressive avec une éventuelle paralysie allant jusqu’à la mort de l’individu. Les souris SOD1G93A développent une SLA agressive caractérisée par une paralysie progressive des membres postérieurs dès l’âge de 3 mois (90 jours) suivi d’une mort des individus à l’âge de 5 mois environ. Pas d’effets indésirables liés à la molécule NV en elle-même ne sont attendus. De même, pas d’effets indésirables liés à l’utilisation des vecteurs viraux ne sont attendus. Les potentiels effets indésirables sont liés aux interventions chirurgicales (injections intra-cérébro-ventriculaire et pose de la pompe osmotique) où il est probable qu’une infection se développe après l’intervention. Néanmoins, les mesures d’hygiène seront rigoureusement respectées afin d’éviter au maximum ces effets liés à la chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. L’ euthanasie des animaux est nécessaire afin d’étudier et de comprendre le plus précisément possible les potentiels effets bénéfiques de NV au niveau immunitaire et au niveau histologique dans les tissus nerveux.
Remplacement
Au préalable de ce projet d’étude, la biomolécule NV a fait l’objet d’une sélection in vitro sur des cultures de neurones parmi plusieurs molécules candidates. Seule la molécule ayant montrée les meilleurs résultats a été retenue. Les effets bénéfiques de NV ayant été démontré sur des cultures de neurones in vitro, l’étape suivante est de tester la biomolécule NV dans un modèle in vivo. Cette étape est nécessaire pour savoir si les effets de NV sont effectivement bénéfiques dans un modèle murin de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), De plus, l’utilisation d’un modèle animal est une étape cruciale et déterminante pour évaluer efficacement le potentiel thérapeutique de la biomolécule NV avant de la tester chez des patients atteints de SLA.
Réduction
La lignée SOD1G93A a été historiquement utilisée sur un fonds génétique mixte. Nous utiliserons dans ce projet les souris SOD1G93A sur un fonds pur C57BL/6 ce qui limitera la variabilité phénotypique et ainsi le nombre d’individus requis dans les différentes procédures. Pour réduire le nombre d’animaux, une seule molécule thérapeutique sera testée in vivo. Le nombre d’animaux requis pour pouvoir démontrer l’efficacité de NV dans le modèle SOD1G93A a été calculé par des tests de puissance statistique à partir de données publiées dans la littérature sur le phénotype des souris SOD1G93A.
Raffinement
Les techniques de chirurgie nécessaires à la réalisation du projet (injections intracérébroventriculaires, pose de minipompe osmotique) seront acquises auprès d’un laboratoire de référence. Les animaux recevront des antalgiques avant et après chirurgie. La surveillance des animaux sera quotidienne durant les 5-7 jours suivant les chirurgies, puis bihebdomadaire. La douleur et le stress seront mesurés selon une grille d’évaluation mise en place en partenariat avec la structure responsable du bien-être animal encadrant notre laboratoire. Les souris SOD1G93A développent de façon spontanée une paralysie progressive à partir de 100 jours. La progression de la pathologie musculaire sera évaluée deux fois par semaine à partir de 80 jours à l’aide d’un système de score neurologique de référence.. A partir d’un score de 2 les souris seront suivies quotidiennement. Le poids sera mesuré deux fois par semaine. A un score neurologique de 4, une immobilité > 24h ou une perte de poids > 25%, les animaux seront mis à mort
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris car son génome est facilement modifiable et permet d’établir des lignées transgéniques. Le modèle souris SOD1G93A développe une pathologie très proche de la SLA humaine et est le modèle le plus utilisé pour développer de nouvelles thérapies. Nous utiliserons à la fois des nouveau-nés et des souris adultes pour administrer les AAV-NVs. Chez les nouveau-nés, l’administration d’AAV permet de cibler un plus grand nombre de neurones que chez l’adulte. En effet les barrières hématoencéphaliques et la barrière liquide céphalorachidien/cerveau sont plus perméables chez le nouveau-né et permettent un meilleur accès des AAVs au système nerveux central. L’expression du transgène par les neurones et ensuite stable tout au long de la vie de l’animal. Ces expériences nous permettront de réaliser une preuve de concept de l’efficacité de NV lorsque la molécule est exprimée avant le développement de la maladie. L’administration chez les adultes permettra de déterminer l’effet thérapeutique de la molécule NV lorsque la pathologie est déjà présente.
Enseignement en travaux pratiques de neurophysiologie en L3 : Mesure de divers paramètres comportementaux chez des souris témoins sans problèmes particuliers dans le but de les comparer à ceux préalablement obtenus chez des lignées de souris mutantes.
- Enseignement supérieur
32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque année, seize souris témoins passent individuellement trois tests comportementaux, exploration en champ libre, équilibre sur un pont horizontal et sur un cylindre rotatif, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau, dans le cadre d'un enseignement de licence. Le porteur indique que le stress provient de l'isolement et de la nouveauté de l'environnement, et que les lignées mutantes utilisées auparavant ont été jugées trop dommageables. Il justifie l'usage de la souris par la formation des étudiants à l'"éthique animale" et à un modèle qu'ils pourront rencontrer en recherche.
Objectifs
Ce TP fait suite à celui qui avait lieu jusqu’en mars 2022 dans lequel des étudiants en L3 étudiaient les troubles neurologiques (défauts de démarche, tremblements) de 2 lignées de souris mutantes en les comparant à des souris témoins sans problèmes particuliers. Du fait du non renouvellement de ce protocole initial (les caractéristiques observables des souris mutantes ayant été ré-évaluées comme dommageables), nous nous proposons désormais sur les conseils du comité d'éthique, de travailler sur les données et tissus des souris mutantes obtenus les années précédentes et de n’utiliser désormais que des souris sans problèmes particuliers. Concrêtement, le TP consistera donc en la réalisation de tests comportementaux, les animaux étant manipulés par un personnel expérimenté (les enseignants). Les étudiants observeront quant à eux les manipulations et analyseront le comportement des animaux. Ils pourront le comparer au comportement anormal de souris mutantes (présenté uniquement via l’intermédiaire de vidéos et de résultats de tests comportementaux effectués les années précédentes). Les étudiants doivent ensuite rechercher les causes de ces comportements anormaux au niveau tissulaire, cellulaire et moléculaire (utilisation de tissus congelés obtenus les années précédentes). Outre les diverses connaissances dans le domaine de la neurophysiologie qu'apporte le suivi de ce TP, notre objectif est également de proposer ici aux étudiants un premier contact avec le modèle souris et une sensibilisation aux règles de l'éthique animale. En effet, une grande partie des étudiants en L3 qui suivent ces TPs se destine à une carrière scientifique où ils seront potentiellement amenés à utiliser des modèles animaux et il est important qu'ils puissent comprendre avant de choisir leur futur laboratoire d'accueil tout ce qu'implique le fait de travailler sur le modèle souris, tant au niveau pratique, qu'organisationnel et éthique.
Bénéfices attendus
Formation des étudiants à l'éthique, et à l'utilisation du modèle souris. Pour celles et ceux qui poursuivront une carrière en recherche, les futurs choix de leurs laboratoires d'accueil (tant pour les stages, que pour leur laboratoire de thèse) et éventuellement du ou des modèles sur le(s)quel(s) ils travailleront se feront ainsi en toute connaissance de cause. S'ils sont amenés à travailler sur la souris notamment, on s'attend à ce que cette formation initiale les aide à mettre en œuvre les bonnes pratiques éthiques régissant l'utilisation de ce modèle. Acquisition de connaissances en neuro-physiologie.
Procédures
Les animaux (vigiles) seront uniquement soumis à des tests comportementaux ne provoquant pas d’atteinte à l’intégrité physique de la souris. Néanmoins du stress peut exister chez les animaux dû à leur isolement (chacune des 16 souris réalisera individuellement chacun des 3 tests décrits ci-après), à la découverte d’un environnement nouveau, et aux manipulations nécessaires au passage de leur cage au dispositif de test et vice-versa. Plus précisément 3 tests comportementaux sont réalisés : Le test de comportement exploratoire en champs libre (une fois par souris) qui permet de quantifier l'activité d'une souris et sa propension à explorer son environnement : chaque souris est placée dans une large cage contenant aussi quatre cubes de bois placés de façon régulière. Le comportement de la souris dans ce nouvel environnement est observé et mesuré pendant 10 minutes (déplacements dans les différents secteurs de la cage, nombre de fois où la souris se met sur ses deux pattes arrières, nombre de fois et temps passé par la souris à faire sa toilette, nombre de fois où la souris monte sur les plateformes. Le test du pont horizontal permettant de quantifier l'équilibre de la souris: un « pont » de bois est placé entre deux plateformes séparées de 50 cm, 20 cm au dessus du sol d’une grande boîte en carton qui sert de cage pour empêcher la souris de s’échapper pendant l’expérience. Au départ du test, la souris est placée au milieu du pont. On mesure alors le temps que la souris met pour atteindre l’un ou l’autre côté du pont. Si la souris tombe, ou n'atteint pas l'une des deux plateformes pendant les 3 minutes imparties, on considère que la souris a échoué. Le test est à réaliser trois fois par souris. Le test du cylindre rotatif permettant lui aussi de quantifier l'équilibre de la souris: chaque souris est placée sur un cylindre rotatif et la rotation démarre en accélérant progressivement pendant 2 minutes. Le test s’arrete à l’issue des 2 minutes ou quand la souris chutte du cylindre ou s’accroche à celui-ci en s’arretant de marcher. Dans ces deux derniers cas, le temps passé à marcher sur le cylindre est mesuré. Le test est à réaliser trois fois par souris. Entre chacun des tests, chaque souris est remise dans sa cage d’origine où elle bénéficie d’un temps de pause minimum de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Du stress peut exister chez les animaux dû à leur isolement (chacune des souris réalisera individuellement chacun des 3 tests comportementaux), à la découverte d’un environnement nouveau, et aux manipulations nécessaires au passage de leur cage au dispositif de test et vice-versa.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever des tissus (cerveaux) nécessaires aux analyses moléculaires (analyse comparative de la présence de différents types de molécules (ARNms et protéines)) chez les différentes lignées de souris : mutantes d'une part et témoins sans problèmes particuliers d'autre part. Les tissus de souris mutantes (surnuméraires) ont préalablement été congelés lors des TPs des années précédentes.
Remplacement
Après la mise à mort à J2, des prélèvements tissulaires sont effectués en vue de mener des analyses moléculaires comparatives afin d'essayer de déterminer la cause des défauts comportementaux observés chez les souris mutantes. Des prélèvements concernant les lignées mutantes avaient été effectués (et congelés) les années précédentes sur des souris surnuméraires. Ces prélèvements n'ayant pas été réalisés sur des souris témoins sans problèmes particuliers, la comparaison entre lignées mutantes et témoins ne peut être effectuée au niveau moléculaire qu'en prélevant des tissus sur des souris témoins.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans ce TP découle du fait que chaque groupe d'étudiants en TP doit pouvoir travailler avec deux souris. Les promotions étant habituellement composées 8 groupes de 3 étudiants, nous comptons utiliser chaque année 8x2=16 souris témoins sans problèmes particuliers. Ce nombre permet aux étudiants de comprendre concrètement la variabilité des réponses inter-individuelles lors des tests comportementaux sur animaux vivants. En effet, deux souris appartenant à la même lignée peuvent avoir malgré tout des comportements légèrement différents, et ce n'est que l'analyse d'un nombre suffisament grand de souris de la même lignée (obtenu en mettant en commun les résultats récoltés par tous les groupes d'étudiants) qui permet justement d'établir des statistiques et de pouvoir comparer les différentes lignées entre elles (ici les mutantes d'une part et les souris témoins sans problèmes particuliers d'autre part). Ce nombre maximal de souris de 32 sur 2 ans sera réduit si le nombre d'étudiants devait être inférieur à celui que nous avions les années précédentes (le chiffre de 24 étant le maximum que nous pouvons accueillir en salles de TP).
Raffinement
Toutes les souris bénéficient d’un environnement enrichi au cours de leur hébergement. Afin d'avoir le temps d'être "acclimatées", les souris seront transférées à l'animalerie le jeudi de la semaine précédant les TPs. Lors des tests comportementaux, l'observation d'une réduction durable de la mobilité et/ou de signes d'angoisses prolongés constituerait un point limite, et entrainerait le retrait du test.
Choix des espèces
La souris est l’une des espèces animales les plus pertinentes pour les études de neurophysiologie du fait de la connaissance de l'architecture cérébrale de ce rongeur, et de l’existence de nombreuses lignées transgéniques bien caractérisées. De plus la présence à proximité du lieu d'enseignement d'une animalerie nous fournissant les souris témoins sans problèmes particuliers, permet de limiter tout problème de transport. Les souris doivent avoir environ 2 mois. En effet l'une des lignées de souris sur laquelle nous effectuions par le passé des tests comportementaux avait une espérance de vie limitée de 3 mois. L'âge de 2 mois auquel nous faisions les tests nous permettait de ne pas atteindre cette limite et de réduire le temps de maintien des souris en élevage. Comme nous allons comparer les résultats des tests comportementaux des souris témoins sans problèmes particuliers avec ceux enregistrés les années précédentes à partir des lignées mutantes, nous devons utiliser des souris du même âge.
« Effet des dérivés de probiotiques sur un modèle murin de mucite orale chimio-induite »
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
198 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections répétées de chimiothérapie qui provoquent des érosions douloureuses de la bouche, une perte de poids et une baisse des globules blancs, pour tester des dérivés de probiotiques contre la mucite orale. Le porteur décrit des ulcérations attendues vers le quatorzième jour, censées durer moins d'une semaine sans traitement. Il affirme que le modèle murin est "incontournable" avant toute application clinique et ne peut être remplacé par des tests in vitro.
Objectifs
La mucite orale est une inflammation de la muqueuse orale secondaire à traitement anticancéreux comme la chimiothérapie. Elle peut être à l’origine d’ulcérations des muqueuses orales douloureuses et conduire à une modification ou un arrêt de la thérapie anticancéreuse ce qui impacte le pronostic vital des patients atteints. De nombreux traitements ont été évalués mais leur efficacité s’est révélée partielle et peu démontrée. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la mucite orale, et en particulier l’inflammation, afin d’évaluer au mieux l’efficacité de nouveaux traitements tels que les dérivés des probiotiques. Le modèle de mucite orale chimio-induite chez la souris choisi constitue une référence dans l’étude de cette maladie car il est particulièrement mimétique du fait de sa ressemblance à la plupart des régimes anticancéreux humains actuels utilisant le 5-fluorouacil (5-FU) (médicament utilisé dans le traitement des cancers) et car il ne nécessite pas l’application d’autres facteurs agressant l’organisme. Une approche thérapeutique novatrice et prometteuse de la mucite orale chimio-induite est constituée par des dérivés de probiotiques. Nous émettons l’hypothèse que les dérivés des probiotiques grâce notamment à leurs propriétés anti-inflammatoires/ immunomodulatrices pourraient exercer un effet thérapeutique dans la mucite orale chimio-induite. Si cette hypothèse se confirme, nos résultats pourraient ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques dans le traitement de cette maladie. Les objectifs de ce projet sont donc : (i) Introduire au sein de notre laboratoire un modèle de mucite orale chimio-induite chez la souris et d’en caractériser la chronologie de l’inflammation (procédure expérimentale 1), (ii) Evaluer le potentiel thérapeutique des dérivés de probiotiques dans ce modèle, délivrés localement par un gel adhérent aux muqueuses (procédure expérimentale 2).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. D’abord, mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la mucite orale chimio-induite , et en particulier le rôle des médiateurs inflammatoires, en utilisant l’un des modèles les plus mimétique décrit dans la littérature chez la souris. Ensuite, vérifier notre hypothèse selon laquelle les dérivés des probiotiques pourraient exercer un effet thérapeutique dans ce modèle. Si cette hypothèse se confirme, nos résultats pourraient ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques dans le traitement de cette maladie chez l’Homme et pour laquelle il n’existe pas de traitement réellement efficace à l’heure actuelle.
Procédures
Ce projet va nécessiter l’utilisation de souris qui seront réparties de la manière suivante : 1) Etude de chronologie de l’inflammation dans le modèle de mucite orale chimio-induite chez la souris. La mucite orale sera induite chez la souris uniquement par des injections d’une faible dose de chimiothérapie (5-FU) tous les 2 jours pendant 14 jours (7 injections au total, durée du geste entre 30 secondes et 1 minute) sous anesthésie gazeuse. 2) Etude de l’efficacité thérapeutique des dérivés des probiotiques dans un modèle de mucite orale chimio-induite chez la souris. La mucite orale sera induite chez la souris uniquement par des injections de 5-FU comme décrit dans la procédure expérimentale 1 (gestes identiques en tout point). Les différents traitements topiques à évaluer seront déposés quotidiennement en intrabuccal tout au long du protocole (durée du geste entre 30 secondes et 1 minute, la durée du traitement sera déterminée précisément lors d’expériences préliminaires mais ne devrait pas excéder 21 jours) sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
La mucite orale sur lequel porte notre étude est un effet indésirable de la chimiothérapie. Dans le modèle que nous allons utiliser, des érosions douloureuses qui caractérisent les stades avancés de la mucite orale sont attendues vers 14 jours, sur une zone très limitée de la cavité buccale (jusqu’au maximum 13% de la surface de langue) et devraient durer moins de 7 jours en l’absence de traitement. La fonction intestinale sera maintenue. Les autres conséquences de l’administration de la chimiothérapie prévisibles sont une perte de poids inférieure à 20% ainsi qu’une diminution du nombre de certains globules blancs dans le sang impliqués dans la lutte contre les infections (neutropénie), réversibles à l’arrêt du traitement.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever leurs tissus et réaliser les analyses permettant de répondre à nos questions de recherche.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est indispensable au bon déroulement de ce projet, permettant de faire un lien entre les résultats obtenus in vitro, et une éventuelle application clinique. Aucune autre manière de procéder ne permet d’étudier la physiopathologie de la mucite orale dans sa globalité. L’utilisation de ce modèle animal est incontournable avant une application clinique et ne peut être remplacée par des expérimentations in vitro.
Réduction
Un suivi longitudinal de chaque animal n’est pas possible pour évaluer la chronologie de la mucite orale (procédure intrabuccale) ce qui impose de sacrifier les animaux à différents temps du protocole. Le nombre d’animaux utilisés pour mener à bien ce projet sera réduit au maximum pour pouvoir conclure de façon statistiquement significative. Ce nombre a été basé sur les données issues de la littérature.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera primordial durant les expérimentations, notamment par des phases d’acclimatation, un enrichissement de l’environnement (ajout de papier dans chaque cage pour leur permettre la conception d’un «nid »), une visite quotidienne, une gestion de la douleur via l’utilisation d’anesthésiques ou d’analgésiques suivant une échelle stricte et des points limites adaptés, ainsi que des critères d’arrêt bien établis.
Choix des espèces
Le modèle de mucite orale chimio-induite chez la souris choisi constitue une référence pour l'étude de la mucite orale car il est mimétique et reproduit la physiopathologie observée chez l'Homme. Il est adapté pour étudier l’efficacité de traitements délivrés au moyen d’un gel adhérent aux muqueuses tel que nous allons utiliser. De plus, le choix de la souris par rapport au rat par exemple nous permettra d’avoir éventuellement recours à des modèles transgéniques pour des études ultérieures. Les animaux seront âgés de 8 semaines. Cet âge correspond à un animal adulte afin de pouvoir établir une corrélation avec la pathologie chez l’Homme et d’éviter des biais potentiellement induits par la phase de croissance de l’animal.
Etude pilote pour la mise en place d’un protocole expérimental in vivo de contamination interne au césium-137 chez le rat, dans le cadre d’une mise au point de contremesures médicales.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont contaminés par gavage au césium-137, reçoivent un antidote, puis passent en cage à métabolisme et en tube de contention pour une spectrométrie, avant le prélèvement de leurs organes. L'étude cale un modèle de contamination interne en vue de tester un décorporant, notamment dans un contexte d'"actes de malveillance". Le porteur affirme que le modèle animal reste "indispensable" pour étudier la rétention du césium, tout en reconnaissant que des méthodes in vitro ont servi en amont.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de mettre en place un modèle de contamination interne chez le rat. Il permettra de tester l’efficacité d’un nouvel antidote. Pour être plus efficace que les produits disponibles, cet antidote se présentera sous une autre forme d’administration. Si les résultats obtenus par ce modèle expérimental pilote sont concluants, il sera possible de répondre à des appels à projets en lien avec les actes de malveillance. Si ces études nous permettent de conclure, des études complémentaires seront réalisées pour l’enregistrement et l’obtention d’une nouvelle Autorisation de Mise sur le Marché (AMM).
Bénéfices attendus
Le présent projet vise à mettre en place un modèle expérimental de contamination interne chez le rat afin de pouvoir tester ultérieurement l’efficacité d’une nouvelle formule de décorporation. Selon les résultats obtenus, nous pourrons compléter ces résultats par des études précliniques nécessaires sur la tolérance. Enfin, si la tolérance attendue est confirmée, nous complèterons par la suite les études nécessaires pour l’obtention d’une nouvelle AMM.
Procédures
Pour l’ensemble des animaux, 40 rats : - gavage à jeun du Cs-137 et de l’antidote oral - injection iv de l’antidote injectable - La collecte des urines et des fèces sera réalisée par passage en cage à métabolisme (durant 24 heures) 4 jours avant contamination puis 24h et 72h après contamination (3 collectes). - Une mesure corps entier par spectrométrie gamma (zooradiamétrie) sera effectuée 4 jours avant contamination, juste après contamination et 24h et 72h après contamination (4 mesures d’environ 20 minutes réalisées en tube à contention après une période d’habituation des animaux).
Impact sur les animaux
Les différentes traitements (injections iv, gavages) peuvent générer du stress dû à la contention et aux interventions pratiquées, un inconfort mineur, une hémorragie ou un hématome ou encore une douleur en cas de geste non maitrisé. Le passage en cages métaboliques peut générer stress et inconfort ; de même pour le passage en tubes à contention. D’après le recul acquis au laboratoire, la contamination à la dose utilisée de Cs-137 ne génère pas de conséquences cliniques notables particulièrement pendant la durée de l’expérimentation (72 heures). L’administration à la dose pharmacologique des 2 produits ne génère pas de conséquence clinique notable chez les animaux. En termes de toxicité, il existe des informations disponibles et publiées sur le Cs-137 et le produit de référence. Des données confidentielles concernant la solution injectable ont en outre été transmises au laboratoire.
Devenir
Le prélèvement des organes sera fait post-mortem (les organes sélectionnés sont des cibles biologiques connues du Cs-137). Les prélèvements concernent tous les animaux du projet
Remplacement
Afin d’étudier la décorporation du Cs-137 et sa rétention au sein d’un organisme biologique complexe, le modèle animal reste indispensable et il n’est pas encore remplaçable totalement par des méthodes alternatives. Cependant des méthodes alternatives (in vitro) ont permis en amont du projet de sélectionner la molécule candidate.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet, une étude statistique a été menée. Le nombre minimum d’animaux pour obtenir une puissance statistique suffisante est de 10 par groupe. Cet effectif nous fournira des résultats statistiquement robustes.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées à la procédure réalisée afin de limiter au minimum la souffrance animale, une habituation au système de spectrométrie gamma sera réalisée au cours de la phase d’acclimatation pour limiter le stress généré. Si un des indicateurs du bien-être n’était plus respecté, l’euthanasie pourrait s’avérer nécessaire.
Choix des espèces
Le rat est un modèle d’études précliniques utilisé en contamination interne au Cs-137. Les animaux employés dans cette étude pilote seront âgés de 3 mois (stade adulte). Ils permettront de faire la preuve de concept de l’efficacité du modèle expérimental.
Evaluation des effets bénéfiques de nouveaux agonistes non peptidiques du récepteur à l’ocytocine dans un modèle murin d’autisme
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection unique de nouvelles molécules agonistes du récepteur à l'ocytocine et passent des tests d'interaction sociale, dans un modèle murin d'autisme, avant d'être tuées pour prélèvement de tissus. Le porteur affirme que les composés testés n'ont pas montré d'effets secondaires et que les tests sociaux n'ont "aucun impact négatif connu". Il conclut que l'autisme, sans marqueur biologique, ne peut être modélisé qu'au niveau de l'"animal entier" exprimant son répertoire comportemental.
Objectifs
Les troubles du spectre autistique (TSA) sont des pathologies neurodéveloppementales complexes, caractérisées par un déficit social et des comportements stéréotypés, et dont l’incidence moyenne atteint près de 1% d’après de récentes études à grande échelle. Il n’existe à l’heure actuelle aucun médicament capable de soulager les symptômes de l’autisme. Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules, agissant sur le récepteur à l’ocytocine, pour traiter l’autisme, et en particulier les déficits d’interaction sociale. L’utilisation d’ocytocine est une piste prometteuse pour soulager les TSA. Malheureusement, il s’agit d’un peptide qui possède une faible biodisponibilité qui ne persiste que peu de temps dans les organismes traités, ce qui rend son usage thérapeutique difficile. Nous avons publié des résultats montrant qu’un agoniste non peptidique du récepteur à l’ocytocine est capable de restaurer la sociabilité dans un modèle murin d’autisme. Cette molécule a l’avantage de persister plus de temps dans les organismes. Une deuxième génération d’agonistes a été synthétisée par nos collaborateurs, plus efficace encore sur le récepteur à l’ocytocine. Dans ce projet, nous allons caractériser 3 de ses nouveaux composés dans un modèle d’autisme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer de nouveaux agonistes des récepteurs à l’ocytocine pour soulager les troubles autistiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection unique qui se fera soit par voie intrapéritonéale, soit par voie orale. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux éthologiques non invasifs
Impact sur les animaux
Les études de toxicité des composés testé n’ont pas montré d’effets secondaires et les composés seront administrés de manière aigue, limitant ainsi les phénomènes inflammatoires potentiels au niveau des site d’injection. Le test d’interaction sociale directe n’a aucun impact négatif connu sur le bien-être des souris.
Devenir
En fin d'expérience les animaux seront euthanasié dans le but de prélever des tissus et étudier l'impact du traitement pharmacologique au niveau moléculaire
Remplacement
La compréhension des mécanismes causaux de l’autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère de validité d’aspect pour la pathologie autistique, et aussi d’évaluer le cas échéant l’efficacité d’une approche thérapeutique. L’évaluation des effets bénéfiques d’un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu’au niveau comportemental : en effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.
Réduction
Nous utilisons des outils statistique adéquat pour calculer précisement le nombre d'animaux necessaire pour réaliser les expériences.
Raffinement
Nous raffinerons nos expériences en soulageant l’inconfort ou le stress potentiels subis par les animaux tout au long du protocole expérimental, en logeant les souris par groupe de 4, en mettant à disposition le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Le suivi des points limites au cours des expériences inclura les éléments suivants : suivi de l’expression faciale et de la posture, poils hérissés, dos voûté, absence de toilettage, ptose palpébrale, perte de poids ou prise de poids de plus de 20% (pesée hebdomadaire). Les animaux présentant une perte de poids excessive ou des signes de douleur chronique seront mis à mort.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées . Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Les déficits comportementaux détectés chez les souris modélisant l’autisme sont suffisamment importants et robustes pour tester la validité d’aspect du modèle et, le cas échéant, permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l'age adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les déficits comportementaux fixé
Contribution des stocks de glycogène astrocytaires au soutien métabolique de l’activité neuronale dans le cerveau sain (EU2/2 collaborateur)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil ou légers. Une partie subit sous anesthésie une craniotomie d'une à une heure et demie ou des injections d'insuline et de glucose pouvant provoquer une hypoglycémie, avant que le cerveau soit fixé par un faisceau de micro-ondes qui les tue. L'étude porte sur le rôle des réserves de glycogène dans le fonctionnement du cerveau. Le porteur affirme que le recours à l'animal vivant est "indispensable" car l'interaction entre le cerveau et les vaisseaux ne se modélise pas in vitro.
Objectifs
Les stocks énergétiques du cerveau consistent principalement en réserves de glycogène présentes dans les cellules gliales. Ces stocks représentent une proportion infime des quantités totales de glycogène présentes dans l’organisme, par exemple dans le foie ou les muscles. Ils sont présents dans toutes les régions du cerveau, notamment le cortex cérébral, l’hippocampe et même le nerf optique. Même limités, ces stocks sont situés au plus près des neurones et de l’activité synaptique et cette localisation privilégiée les met en position de participer à l’activité normale ou pathologique du cerveau. Ils sont recrutés en conditions d’hypoglycémie ou d’ischémie pour alimenter les cellules du cerveau, lorsque les ressources énergétiques sont limitées. Des résultats récents indiquent que les réserves de glycogène peuvent aussi être sollicitées pendant des phases d’activité neuronale, et contribuer ainsi au fonctionnement normal du cerveau, par exemple pendant le codage et la consolidation de la mémoire. Le glycogène est une macromolécule d’environ 10-40 nm de diamètre qui peut être hydrolysée pour entrer dans les réactions de glycolyse qui permettent de produire l’énergie des cellules. Les données récentes de la littérature suggèrent que lorsque les astrocytes hydrolysent leurs stocks de glycogène, ils libèrent préférentiellement du lactate, et que ce lactate est mis à disposition des neurones qui peuvent le transformer en pyruvate et alimenter le cycle de Krebs pour produire de l’énergie. Cependant, la dynamique et les mécanismes de ces échanges de lactate sont encore très mal connus, ainsi que leur rôle in vivo. Le but de ce projet est de décrire ces flux de lactate grâce à une technique de détection innovante afin de comprendre quand et comment est recruté le glycogène pendant le fonctionnement normal du cerveau.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ce projet, permettra de mieux comprendre le rôle des réserves de glycogène dans le fonctionnement normal du cerveau, et représentera une avancée dans la compréhension du métabolisme cérébral en conditions physiologiques ou pathologiques. Il pourra ouvrir la voie vers de nouvelle stratégies de protection du cerveau pendant des agressions cérébrales aiguës comme le traumatisme crânien et les hémorragies méningées.
Procédures
Les interventions consisteront à fixer le cerveau par un faisceau de micro-ondes. Dans certains cas, la fixation sera précédée d'une intervention chirurgicale ou d'injections sous-cutanées d'insuline et de glucose. L'intervention chrirugicale visera à induire une ou plusieurs dépolarisations corticales. Elle consistera en une craniotomie sous anesthésie générale et analgésie, et durera entre 1h et 1h30. Les injections consisteront en une administration sous-cutanée d'insuline suivie de trois injections de glucose espacées d'une heure, l'ensemble de la procédure durant 3h.
Impact sur les animaux
Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et analgésie sans réveil. Les nuisances sur les animaux sont donc très minimes. L’anesthésique utilisé permettra de couvrir la durée nécessaire aux expériences à réaliser. Les effets indésirables sur l’animal se limitent donc à des problèmes d’anesthésie pouvant provoquer un réveil de l’animal lors de son positionnement dans l’appareil stéréotaxique ou en cours d’enregistrement, ce qui reste rare. L'injection d'insuline peut provoquer des épisodes d'hypoglycémie entre deux injections de glucose.
Devenir
Les animaux seront mis à mort par le faisceau de micro-ondes dirigé sur le cerveau. Le cerveau sera ensuite prélevé ce qui exclut la survie de l'animal.
Remplacement
Les flux de glucose, de lactate et d’oxygène dans le cerveau reposent sur l’interaction entre le cerveau et le système vasculaire qui l’alimente en nutriments. Cette interaction ne pas encore être modélisée in vitro. Notamment, dans les tranches de cerveau, les capillaires sanguins sont découpés et le flux sanguin est absent. Pour cette raison, le recours à l’animal vivant est indispensable.
Réduction
Ce projet impliquera 72 rats adultes mâles et femelles. Le nombre d’animaux utilisés au cours du projet est maintenu à un niveau minimal permettant des analyses statistiques nécessaires à l’établissement de conclusions fiables.
Raffinement
Concernant la douleur pendant la chirurgie, un traitement analgésique est prévu avec une injection sous-cutanée de buprenorphine (0.02 mg/kg) et une administration locale de lurocaïne sur le scalp, pratiquées avant l’incision de la peau. La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale par l'isoflurane et en appliquant les points limites définis par (1) une défaillance du système d'anesthésie pouvant conduite au réveil de l'animal et (2) l'apparition d'une hemorragie incontrôlée au niveau du scalp. Concernant l'angoisse infligée à l'animal, elle est réduite par un hébergement par groupes de deux à six dès l’arrivée au laboratoire et par l’insertion d’un enrichissement dans les cages d’hébergement (roue d’exercice, matériau de nidification). Les animaux disposent de nourriture et de boisson à volonté.
Choix des espèces
Le rat est un modèle mammifère très utilisé dans la recherche sur le métabolisme cérébral ; ce qui permet de s’appuyer sur un corpus bibliographique conséquent. Par rapport à la souris, le rat possède une boite crânienne plus grande, qui permet d’implanter facilement plusieurs capteurs, ce qui est plus difficile chez la souris. Il est possible que ce projet se poursuive par des études chez l’animal vigil, et si c’était le cas, seul le rat pourrait supporter l’implantation de capteurs embarqués et d’amplificateurs miniaturisés. Rats seront des adultes de 10 semaines ou 300g de poids corporel. A cet âge, le développement de l'animal est terminé et les mécanismes biologiques restent stables dans le temps.
Sénolyse dans l’histiocytose des cellules de Langerhans.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène, des gavages cinq jours sur sept pendant quatre semaines et dix séances d'imagerie sous anesthésie, tout en développant un phénotype d'histiocytose langerhansienne, pour tester des molécules sénolytiques. Le porteur indique que la maladie provoque un inconfort et de possibles contraintes pour les animaux. Il affirme qu'aucune lignée cellulaire n'existe et que le modèle murin est "le seul" permettant d'évaluer de nouveaux traitements de cette maladie de l'enfant.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester in vivo des drogues sénolytiques dans un modèle murin d’histiocytose langerhansienne. L’histiocytose langerhansienne est une maladie relativement rare qui touche essentiellement les enfants et peut atteindre n’importe quel organe. Cette maladie consiste en une accumulation dans divers tissus de cellules de type phagocytes. Les patients atteints d’histiocytose langerhansienne sont traités en première intention par chimiothérapie de façon empirique (traitement qui a été testé dans les années 80). 50% des patients rechutent et sont alors traités par d'autres médicaments . Le traitement jusqu’à présent est donné à vie car la maladie revient dès que ce traitement ciblé est interrompu. Il y a donc à l’heure actuelle des enfants traités depuis plus de 5 ans par vces médicaments , avec une quasi impossibilité de suspendre le traitement mais un risque d’effet secondaire à long terme élevé (notamment cancers secondaires). Il est donc absolument primordial d’essayer de trouver des traitements plus efficaces, avec une durée limitée, permettant une éradication définitive de la maladie.
Bénéfices attendus
La mise en évidence d'un traitement sénolytique efficace chez la souris permettra d'ouvrir la voie à un essai clinique chez l'homme (enfants).
Procédures
Les aminaux seront soumis à des injections de tamoxifène (nombre: 4, durée 1 minute) et à des gavages 5 jours sur 7 pendant 4 semaines, durée 1 minute. L'activité bioluminescente sur les animaux sera évaluée par imagerie, 10 fois, durée 10 minutes, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les souris recevront des traitements par injection, ceci peut entraîner un inconfort ou une douleur transitoire, ou par gavage, ceci peut éventuellement entraîner une irritation de l'oesophage. Les souris auront aussi des séances d'imagerie sous anesthésie générale qui n'ont pas de conséquence a postériori. Les souris vont présenter un phénotype d'histiocytose langerhansienne. Cette maladie bien que moyennement aggressive va entrainer un inconfort et de potentielles contraintes pour les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour analyses post-mortem sur tissus .
Remplacement
Il n'existe pas de lignées cellulaires d'histiocytose langerhansienne. De plus, les cellules de l'histiocytose langerhansienne ont comme caractérique principale l'absence de prolifération. Ainsi au sein des tissus endommagés, elles sont très peu nombreuses. Il n'est donc pas possible de les cultiver ex vivo, ce d'autant qu'elles ne prolifèrent pas in vitro (tout comme in vivo). Cette maladie touche essentiellement les enfants. La chirurgie n'est pas une stratégie de traitement proposé dans l'histiocytose, il est donc impossible de travailler sur des prélèvements humains. Néanmoins, dés que possible nous utiliserons au maximum le sprélèvements humains (sang, moelle et tissus) afin de caractériser plus précisement cette maladie et afin de ne pas faire appel aux modèles in vivo. Néanmoins, le modèle animal qui nous décrivons est à l'heure actuel le seul modèle permettant d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements et premettant de comprendre la physiopathologie de cette maladie.
Réduction
Le nombre de souris sera limité au minimum nécessaire. Comme le phenotype est parfaitement pénétrant et reproductible, un nombre minimal d'animaux par groupe permettra d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Aucun réplicat ne sera réalisé.
Raffinement
Les animaux feront l'objet d'une surveillance quotidienne avec examen clinique. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.. La maladie est lentement progressive comme chez l'homme, et son évolution sera surveillée par imagerie de luminescence, permettant un arrêt précoce si nécessaire. Une anesthésie générale par isoflurane sera réalisée lors de l'imagerie. Les animaux seront hébergés en groupe sociaux dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
Génétique proche de celle de l’Homme. Modèle de choix en oncologie préclinique, permettant l'utilisation également de souris génétiquement modifiées: modèles de la maladie et détection de certaines acitivités cellulaires (luminiescence, fluorescence). Animaux jeunes, comme la population de patients.