Rongeurs
Etude de l’effet d’administration de souches bactériennes probiotiques sur la colonisation néonatale du tube digestif murin par des souches bactériennes pathogènes
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système urogénital
3 640 souris, dont des femelles gestantes et leurs souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les nouveau-nés sont colonisés par une bactérie E. coli puis gavés quotidiennement pendant trois à six semaines avec une suspension bactérienne, pour tester des souches probiotiques contre des bactéries résistantes aux antibiotiques. Le porteur indique que le gavage provoque un stress mais qu'il n'entraîne qu'extrêmement rarement une réponse délétère, et prévoit un surplus de souriceaux dont seuls les mieux colonisés sont conservés. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune expérience in vitro ne peut reproduire la colonisation intestinale in vivo.
Objectifs
Escherichia coli est une bactérie qui colonise le tube digestif de l’Homme et des animaux à sang chaud, dès les premières heures qui suivent la naissance. Un sous-groupe d’E. coli est responsable de maladies telles que les méningites néonatales, les septicémies et les infections urinaires. Le traitement de ces infections passe par l’administration d’antibiotiques. Cependant, dans un contexte de multiplication de résistance bactérienne aux antibiotiques, la recherche d’autres voies de lutte contre ces agents infectieux est nécessaire. Parmi plusieurs stratégies, l’usages de bactéries issues d’un autre sous-groupes de E. coli possèdant des propriétés bénéfiques, notamment la capacité de combattre les souches potentiellement pathogènes, est décrit.
Bénéfices attendus
Le projet vise à amorcer le développement d'une stratégie de lutte contre les bactéries pathogènes multirésistantes aux antibiotiques trouvant leur réservoir dans le tube digestif des mammifères sans utiliser d'antibiotique.
Procédures
- Récolte de fèces sur animaux vigiles - Gavage oral qutodiein pendant 3 à 6 semaines avec 100 uL d'une suspension bactérienne (non visqueuse, non irritante) ou du PBS Administration antibiotique dans l'eau de boisson. Contamination par contact des nouveau-nés par la souche d'intérêt.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale, basée sur un gavage oral des souris avec une suspension bactérienne, implique une nuisance (stress) pour l'animal. Cependant, le gavage oral des souris par des E. coli commensales et pathogènes n’occasionne qu’extrêmement rarement une réponse délétère pour l’animal. Lors de l'expérimentation pilote, aucun individu n'a présenté de signe imputable à la colonisation bactérienne initiale ni aux gavages quotidiens. Le prélèvement de féces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur. Cependant un léger stress peut être provoqué par la préhension de l'animal avant le prélèvement, il sera limité par l'habituation et dure 1 à 2 minutes le temps du prélèvement.
Devenir
L'ensemble des animaux est euthanasié par dislocation cervicale à l'issu de la procédure expérimentale.
Remplacement
Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet. Des expérimentations in vitro de diminution du nombre et de la croissance de notre bactérie cible ont été effectués au laboratoire en réponse à notre souche probiotique. Différentes doses et combinaisons (mutants, souches expérimentales) ont pu être testées permettant de sélectionner la souche probiotique la plus efficace et pertinente in vitro. Cependant, l'objectif du projet étant de démontrer l'efficacité de la souche probiotique Nissle à réduire le portage intestinal d'une souche multirésistance, les systèmes in vitro (tube à essai) ne nous permet pas d'appréhender cette question. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité de l'organisme et l'effet de l'administration quotidienne par gavage de la souche probiotique sur le portage de la souche multirésistante dans l'intestin.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires est calculé au plus juste en tenant compte des éléments suivants : - Une expérimentation pilote a permis de montrer que des résultats positifs pouvaient être observés chez certains animaux (n= 4 animaux par groupe dans cette expérience obtenus à partir de différentes femelles gestantes) pour deux souches probiotiques sélectionnées après 28 jours de gavage. Les résultats obtenus ont permis de sélectionner une souche probiotique pertinente à tester sur un plus grand nombre d'animaux pour conclure sur son efficacité. - Notre expérience montre que les femelles Swiss font des portées comprenant en moyenne 12 souriceaux. Afin de garantir 10 mâles et 10 femelles colonisés par groupe, 7 femelles gestantes sont nécessaires, avec un attendu de 84 souriceaux. Le surplus de souriceaux permettra de ne conserver que les animaux dont la colonisation est suffisament élevé (au moins 10^8 log(CFU/g de fèces)) et stable entre les 2 points initiaux de mesure, ainsi que de compenser un sexe-ratio différent de 1 (données imprévisibles). L'expérimentation pilote a permis de montrer que pour constituer notre effectif final de 64 souris, 7 mères gestantes étaient nécessaires. 91 individus seront nécessaires par expérimentation (7 femelles gestantes + 84 souriceaux). Nous serons amenés à reproduire ce protocole pour valider nos données (répétition) et utiliser différents probioiques (nombre estimé à 6) contre différents variants de E. coli pathogènes (nombre estimé à 10). Ainsi, nous pensons sur la période de 5 ans utiliser 3640 souris (dont 280 femelles gestantes). - Les résultats obtenus sont comparés avec le logiciel Prism GraphPad 8, en utiliant le test du Chi-2 (comapraison des moyennes de charges bactériennes dans les fèces en CFU/g de fèces) ou le test exact de Fischer (comparaison des proportions de souris toujours excrétrices de bactéries pathogènse par rapport au nombre total de souris).
Raffinement
Le suivi expérimental repose sur des techniques non-invasives. Le prélèvement de fèces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur mais une habituation à la contention par l'expérimentateur sera réalisée avant les prélèvements. La contention des animaux lors des gavages oraux et des récoltes de selles s'effectue par du personnel qualifié et expérimenté dans la manipulation des souris. Les gavages sont réalisés avec des sondes souples. La solution de gavage est de volume limité (100 uL maximum par administration). Celle-ci n'est ni visqueuse, ni irritante. Compte-tenu de la fréquence des gavages, ceux-ci sont réalisés uniquement par du personnel qualifié, en veillant à ne pas placer la sonde trop profondément dans l'oesophage, et l'administration se fait lentement. Durant cette phase, les souris sont évaluées individuellement à l'aide de critères cliniques et pesées 2 fois par semaine, opérations effectuées par des personnels formés et habitués à la manipulation de souris notamment dans le cadre de ce modèle expérimental. Nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et mettrons en place une grille d'évaluation. La grille d'évaluation comprendra les points suivants: - qualité du poil (lisse/hérissé; propre/sale), - perte de poids éventuelle (supérieure ou pas à 15%), prostration: l'animal sera mis sur la main de l'expérimentateur (mesure de la vivacité: curieux (redresse la tête, sens en alerte) / prostré (mise en boule, recroquevillé), mesure de la mobilité: mouvement exploratoire se déplaçant sur la main / pas de mouvement), qualité et aspect des selles (normales, molles, présence de diarrhées ou sang). Si un point limite est atteint alors la procédure s'arrêtera et l'animal sera euthanasié. Les animaux seront hébergés en présence d'un enrichissement (même quantité de coton dans toutes les cages) en présence d'une petite maison en plastique rouge transparente pour leur permettre de se faire un nid tout en nous permettant de les observer sans les déranger.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude de l’établissement de la colonisation intestinale. Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet. L'administration de bactéries à effet probiotique s'effectue par gavage quotidien. Une administration par voie orale d'une culture fraîche à cette fréquence offre toutes les chances d'une efficacité rapide. L'expérimentation pilote a permis de montrer que des résultats positifs pouvaient être observés chez certains gavage. Femelles reproductrices et souriceaux agés de moins de 2 jours pour la colonisation via l'environnement de la souche pathogène (absence de contact). Souriceaux âgés de J21 à J70 pour le suivi de la colonisation dans les selles et gavages avec le probiotique
Utilisation d’une supplémentation en acide gras à chaine courte afin de limiter les effets indésirables d’un médicament anti-rejet de greffe
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent par gavage un immunosuppresseur destiné à provoquer une entéropathie, puis un acide gras dans l'eau de boisson, pour tester si celui-ci limite les lésions digestives. Le porteur indique que les animaux traités peuvent développer perte de poids, diarrhée, sang dans les selles et douleurs digestives. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité du tube digestif et qu'une étape in vivo est nécessaire pour prouver l'effet protecteur.
Objectifs
La transplantation d’organe est un traitement de choix pour certaines pathologies chroniques ; la greffe améliore la qualité de vie et la survie des patients. Ces dernières années, l’augmentation de la survie du greffon est attribuée à l’utilisation des traitements immunosuppresseurs qui inhibent la réponse immunitaire responsable du rejet. Le recours aux immunosuppresseurs, en fragilisant le système immunitaire, provoque l’émergence d’infections et d’atteintes tumorales, en plus de leurs nombreux effets indésirables. Une meilleure gestion de ces effets pourrait contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des transplantés. L'acide mycophénolique (MPA) est l'un des médicaments immunosuppresseurs les plus utilisés dans les transplantations d'organes solides, comme le rein ou le foie. Le traitement au MPA est associé à des effets indésirables, parmi lesquels les troubles gastro-intestinaux constituent une préoccupation majeure. En effet, plus de 30 % des patients présentent des effets indésirables gastro-intestinaux, allant des nausées aux érosions du tractus gastro-intestinal et aux ulcérations hémorragiques, qui mettent en jeu le pronostic vital. La seule option thérapeutique actuelle consiste en une réduction de la dose ou de la fréquence d'administration, ou à un remplacement par d’autres molécules moins efficaces, ce qui augmente le risque de rejet de greffe. Le MPA est responsable d’altérations du microbiote intestinal, appelées dysbiose. Le microbiote intestinal, qui est constitué de microorganismes comme des bactéries, est nécessaire au processus de digestion et, à travers la production d’acides gras à chaine courte (AGCC) particuliers, il protège la paroi intestinale. Nous émettons l’hypothèse qu’une supplémentation en AGCC spécifique des bactéries pourrait limiter les lésions associées à l’entéropathie induite par le MPA. Notre objectif est d’étudier l’effet d’AGCC donnés dans l’eau de boisson sur une entéropathie modérée provoquée par le MPA chez la souris.
Bénéfices attendus
Le MPA est l’immunosuppresseur le plus utilisé pour éviter le rejet de greffes d’organes solides. L’entéropathie induite par le MPA touche aujourd’hui plus de 30% des patients transplantés : sont proposés à ces patients une diminution de la dose de MPA ou une substitution de cet immunosuppresseur par une autre classe thérapeutique moins efficace sur le maintien et la tolérance de la greffe. La supplémentation en AGCC, déjà testée et proposée à certains patients au cours de la prise en charge de la maladie digestive de Crohn, pourrait amener une amélioration de la qualité de vie pour les patients transplantés en limitant les effets indésirables du MPA.
Procédures
- Préhension pour pesée (animal vigile, tous les animaux, moins de 30 secondes par animal, 17 fois par animal) - Contention pour habituation au gavage (animal vigile, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 9 fois par animal) - Gavage (animal vigile, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 7 fois par animal) - Prélèvement sanguin (animal anesthésié, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 1 fois par animal). Les modes d’administration utilisés (eau de boisson pour l’AGCC et l’administration par voie orale à l’aide d’une canule) ont été décrites dans la littérature pour ces molécules, et sont reconnues efficaces.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables sont attendus pour les animaux traités à l’immunosuppresseur comme une perte de poids, de la diarrhée, la présence de sang dans les selles, des douleurs digestives et des altérations du comportement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever différents organes et tissus nécessaires aux analyses.
Remplacement
L’utilisation de cellules in vitro a permis de démontrer certains effets intéressants du médicament immunosuppresseur MPA et des AGCC. Cependant, les études in vitro ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du tube digestif et des tissus qui l’entourent. Or les effets globaux du MPA et des AGCC, s’ils existent, résulteront de l’interaction du médicament et des AGCC avec différentes cellules au sein de différents tissus et organes. A ce stade des travaux, les études in vitro doivent être complétée par des études sur l’animal afin d’apporter la preuve définitive de l’effet protecteur des AGCC vis-à-vis de l’entéropathie induite par le traitement immunosuppresseur chez les greffés.
Réduction
Dans le but de réduction du nombre d’animaux, le projet comprend 2 étapes : une étude pilote pour déterminer la dose de MPA à utiliser et l’étude à proprement parler des AGCC sur l’entéropathie induite par le MPA. Cette stratégie en deux étapes permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude de l’effet des AGCC. De plus, un test statistique de puissance a été réalisé afin de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour avoir des résultats exploitables. Enfin, des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à l’espèce et qui respectent leur bien-être : densité animale, température, hygrométrie contrôlées, présence d’enrichissement, eau et nourriture à volonté. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement, voire deux ou trois fois par jour si l’état le nécessite. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si l’état le justifie, l’animal sera euthanasié. Les personnes qui manipuleront et observeront les souris sont expérimentées.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence pour l’étude des entéropathies que l’Homme développe. Les animaux utilisés seront des souris adultes d’un poids moyen de 24-26 g âgées de 8-10 semaines au début du projet. A ce stade de développement les souris présentent des caractéristiques physiologiques stables. De plus, ce stade de développement est celui utilisé dans les publications de référence pour le projet.
Implication du co-transporteur KCC2 dans les perturbations de la neurotransmission inhibitrice dans l’hippocampe d’une souris transgénique modèle de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus cérébraux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces souriceaux reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen à partir du 14e jour après la naissance et pendant quinze jours, avant une anesthésie sans réveil, pour étudier un transporteur dans un modèle de maladie d'Alzheimer. Le porteur indique qu'une souffrance liée aux injections répétées peut apparaître et que la mère peut perturber le nid ou refuser de nourrir ses petits. Sur le remplacement, il affirme que le modèle ne peut pas être remplacé par des cultures cellulaires et justifie le recours à des souris transgéniques développant des plaques amyloïdes.
Objectifs
L'objectif de notre projet de recherche est de corriger les perturbations de la neurotransmission dans l'hippocampe d'une souris modèle de la maladie d'Alzheimer
Bénéfices attendus
Il n’existe à l’heure actuelle, aucun traitement capable de guérir la maladie d’Alzheimer ou de ralentir son évolution dans le cerveau. Toutefois quatre médicaments sont actuellement sur le marché. Ces traitements ont pour but de traiter les problèmes d'apprentissage et de mémorisation de la personne malade. Ils n’empêchent cependant pas la progression de la maladie et l’efficacité varie largement d’un patient à l’autre. De plus, ils présentent de nombreux effets indésirables. Il semble donc important non seulement de traiter les symptômes mais également et surtout, d’empêcher l’initiation et la progression de la maladie. Notre objectif de cibler la maladie à ses débuts devrait offrir de nouvelles perspectives de traitement.
Procédures
Les animaux seront injectés quotidiennement dans l'abdomen à partir du 14ème jour post-natal et ceci pendant 15 jours. Les animaux subiront une anesthésie sans réveil pour effectuer des prélèvements.
Impact sur les animaux
Une souffrance liée à la répétition des injections peut être mise en évidence. Nous pourrions également observer une perturbation du nid et un éventuel refus de la mère de nourrir ses petits.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux afin de mieux comprendre les mécanismes du traitement concerné dans ce projet
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des modèles de culture cellulaire. Ce choix du modèle souris est également justifié par le fait que nous utiliserons des souris transgéniques modèles de la maladie d'Alzheimer. Ces souris transgéniques développent des plaques amyloïdes au niveau du cerveau et manifestent les mêmes troubles touchant la mémoire et la cognition que l'homme.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum tout en garantissant la validité statistique des résultats obtenus.
Raffinement
Nous serons particulièrement attentifs au bien-être animal et nous surveillerons les animaux quotidiennement. Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies et dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'annexe II du 01 février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Pour limiter un éventuel refus de la mère de les nourrir, nous mettrons dans le nid le matériel utilisé pour les injections pour habituer la mère à leur odeur. Les petits abandonnés seront replacés avec une autre mère ayant une portée du même âge. Les injections seront faites avec des aiguilles très fines. Ce geste n'induit pas de saignement et correspond à une douleur légère (introduction d'une aiguille). Les seringues et aiguilles sont changées pour chaque souris. Nous surveillerons et pèserons les animaux avant chaque injection.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau anatomique et fonctionnel des circuits de l'hippocampe. De plus, l'existence de modèles de souris exprimant des mutations humaines de deux protéines permet de mimer la pathologie humaine et de les étudier dès l'âge de 1 mois à un stade précoce, sans symptômes de la maladie.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
5 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une tumeur leur est greffée puis elles reçoivent chimiothérapie et immunothérapie deux fois par semaine, avec des prélèvements sanguins répétés, pour valider un anticorps neutralisant une cytokine avant un programme clinique. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner des difficultés de locomotion, une ulcération et un état moribond au-delà d'un certain volume. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité des interactions entre système immunitaire et cellules tumorales et juge ces preuves de concept "indispensables".
Objectifs
Les avancées en termes d’immunothérapies dans les cas de cancers sont très encourageantes mais une recherche accrue est toujours de mise afin d’une part de découvrir de nouvelles cibles mais également d’améliorer les traitements déjà existants. Ce projet a ainsi pour but de continuer à approfondir nos données sur les actions et les efficacités de la neutralisation de notre cible, une cytokine (protéine messagère et régulatrice du système immunitaire naturellement présente dans chaque organisme) et ce dans un contexte de développement tumoral (multiplication des cellules tumorales) chez la souris. Après avoir mis en évidence dans un précédent projet, l’intérêt de bloquer cette cible afin d’améliorer la survie des animaux, il s’agit maintenant de trouver les meilleures conditions afin de valider notre outil bloquant (un anticorps thérapeutique) et de le présenter par la suite dans un programme clinique chez l’Homme. Pour cela, différents types de modèles cancéreux seront utilisés comme les mélanomes, les fibrosarcomes, les cancers mammaires, colorectaux, pancréatiques, du poumon ou encore du col de l‘utérus. Grâce à ces modèles de développement tumoraux, nous pourrons analyser chez les souris l’impact du blocage de cette cytokine en synergie (effet cumulé) avec d’autres immunothérapies et chimiothérapies déjà connues en clinique. Ce projet nous permettra également de valider les meilleurs anticorps possibles qui pourront ainsi devenir des candidats pour de futurs essais cliniques antitumoraux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but principal de valider la preuve de concept d’inhibition de notre cible pour induire des effets antitumoraux et de comprendre les mécanismes d’action et les voies de signalisation impliquées. Plusieurs bénéfices seront alors apportés par l’avancement de ce projet. L’utilisation de modèles où le gène de la cytokine a été invalidé (supprimé) d’une part et d’outil inhibant (bloquant) la cible d’autre part permettre de confirmer l’implication de la cible dans des mécanismes de développements tumoraux. Les différents protocoles de traitements testés, détermineront les conditions optimales d’utilisation des outils afin d’arrêter la croissance tumorale. Enfin, les études de suivi de la cible en présence ou absence d’anticorps expliqueront les cinétiques d’action de ces différentes molécules. Toutes ces approches sont indispensables pour pouvoir amener ces technologies dans des essais précliniques réglementaires puis des essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
L’ensemble des animaux de ce projet seront greffés une fois en injection sous-cutanée (SC) sur animal vigil (15 secondes/souris avec contention) ou en injection intra-mammaire (IM) pour le modèle de cancer du sein sur animal anesthésié (4 minutes/souris comprenant l’anesthésie). Pour les procédures 1 et 2, les animaux subiront ensuite une injection de chimiothérapie (en intrapéritonéale (IP) : 10 secondes ou en intraveineuse (IV) dans certains cas rares : 3 minutes) suivis des traitements par les immunothérapies (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en injection SC : 10 secondes, ou en injection IV dans certains cas rares : 3 minutes), cela 2 fois par semaine. Les animaux de la procédure 3 recevront en plus un traitement par les anticorps cibles 2 à 3 fois par semaine (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en injection SC : 10 secondes, ou en injection IV dans certains cas rares : 3 minutes). Certains animaux des procédures 1, 2 et 3 subiront des prélèvements sanguins sur animal vigil à la veine mandibulaire maximum une fois par semaine (0,11mL par prélèvement) sur maximum 5 semaines. La durée de chaque prélèvement est estimée à 1 minute. Les animaux des procédures 4, 5 et 6 subiront des traitements séquentiels en commençant par l’injection de la cible (la cytokine) (en IP : 10 secondes, en SC : 10 secondes, ou en IV dans certains cas rares : 3 minutes). L’anticorps dirigé contre la cible sera ensuite injecté jusqu’à 3 fois par semaine (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en SC : 10 secondes, ou en IV dans certains cas rares : 3 minutes). Dans certains cas (qui seront connus à l’issu des procédures 1, 2 et 3), les souris auront également une l’injection de la chimiothérapie en dose unique (en IP : 10 secondes ou en IV dans certains cas rares : 3 minutes) suivie de l’immunothérapie 2 fois par semaine (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en SC : 10 secondes, ou en IV dans certains cas rares : 3 minutes). Ces animaux subiront des prélèvements sanguins sur animal vigil à la veine mandibulaire en gestes répétés sur 24h (volume maximum de 0,11mL) ou une fois par semaine (0,11mL par prélèvement) sur 4 semaines. La durée de chaque prélèvement est estimée à 1 minute / souris avec contention. Certains animaux subiront un prélèvement de sang en terminal à la veine cave (animal sous anesthésie profonde et sans réveil) afin de collecter un volume de sang suffisant.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs chez la souris avec un problème de locomotion possible au-delà d'un certain volume ou une ulcération de la tumeur pouvant entrainer un état moribond de l’animal si elle évolue trop rapidement. Les injections de chimiothérapie et d’immunothérapie observées lors des études précédentes ne montrent quant à elles aucun effet délétère observable sur l’état clinique de l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral ou tout autre point limite listé, soit avant pour prélever la tumeur et les organes immunitaires périphériques afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments (à l’aide de technique d’histologie, de cytométrie ou encore de biologie moléculaire).
Remplacement
Il s’agit du suivi de croissance tumorale, il n’existe pas de méthode alternative à ces expériences in vivo. Ces preuves de concept et ces études de mécanismes d’action ne peuvent s’établir que sur de véritables modèles précliniques dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui a démarré par des études bibliographiques, suivies d’études In Vitro approfondies ayant permis d’affiner et de réduire efficacement les pistes de recherches. Cependant, compte tenu des avancées actuelles, à ce stade du projet, il n’est pas possible de substituer l’animal par un modèle in vitro pour continuer ces recherches. Ce dernier ne peut pas retranscrire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules tumorales pour tester nos traitements antitumoraux.
Réduction
L’analyse statistique permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, est réalisée en collaboration avec une unité de biométrie, spécialisée dans les études de biostatistique. L’étude de l’efficacité antitumorale induit deux types d’analyse : -modélisation de la croissance tumorale (en fonction du nombre de jours post-greffe) et comparaison entre les deux groupes de traitement en utilisant un modèle linéaire mixte permettant un delta de 200 mm3. -analyse de survie en considérant le délai nécessaire pour atteindre la médiane (50 % de survie) un delta de 5 jours. Compte tenu de cette analyse et des données obtenues lors de précédentes expériences réalisées au sein du laboratoire le nombre de souris est limité à 10 par groupe et chaque étape est reproduite une fois afin de supprimer le biais pouvant être induite par un problème technique de greffe de cellules ou d’injection de molécule et ainsi avoir un résultat de deux expériences indépendantes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 20-24°C, 30-50% d'hygrométrie, en portoirs de cages à couvercle filtrant, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Un système d’enrichissement adapté à la souris est mis en place afin de réduire le stress des animaux. Il comporte la présence dans chaque cage d’un tunnel ou d’un dôme en cellulose, de briques Aspen et de carré de cellulose afin que les animaux établissent un nid végétal. Des souris femelles sont utilisées dans nos protocoles expérimentaux car elles présentent un système immunitaire exacerbé, facilitant les mises en évidence d’efficacité pro-immunitaire et anti-cancéreux. Tout au long du déroulement des expériences de croissance tumorale, une observation systématique de l’état clinique des animaux et notamment de l’évolution de la taille des tumeurs est réalisée par du personnel formé et compétent. Les conditions d’utilisation sont encadrées par la règlementation en vigueur et ont pour but de réduire le stress, l’inconfort et la douleur que l’animal pourrait ressentir. Une habituation des animaux sera mise en place en ce qui concerne la contention manuelle (immobilisation de l’animal par l’expérimentateur pour pouvoir l’injecter sans risque) et le placement dans les tunnels de contention (en vue des injections intraveineuses). Ces habituations seront effectuées en amont du début des études et des injections afin de diminuer le stress de l’animal. L’état des animaux sera surveillé quotidiennement pour vérifier l’aspect de la tumeur ou l’apparition de signes cliniques Dans les conditions expérimentales définies (limite du volume tumoral), les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. De plus, au cours de nos expériences antérieures, parmi les paramètres listés ci-dessus, nous n’avons jamais observé de signe de diarrhée, de déshydratation ou de problème respiratoire.
Choix des espèces
La souris immunocompétente de type C57Bl/6 constitue un modèle expérimental de référence. Ces souris dont le système immunitaire est fonctionnel sont greffées avec des cellules tumorales murines de même fond génétique. Ce modèle a déjà permis d’obtenir les premiers résultats à l’origine de ce projet, nous avons ainsi un recul important sur le comportement et les caractéristiques de ce modèle. Il est indispensable pour réaliser les étapes 1 et 2 de ce projet. La 3ème étape nécessite différents modèles de souris immunocompétentes afin de comprendre le rôle du système immunitaire et de suivre la cinétique de la cible au sein de la tumeur et dans la circulation sanguine. Le choix s’est porté sur les modèles les plus caractérisés et sur lesquels nous avons déjà un recul important : C57Bl/6, BalbC. Références bibliographiques : (Rondepierre F et Al. Melanoma Res. 2010 Apr;20(2):77-84, Bertrand et Al. Cancer Res. 2015 May, Eslahi NK et al.Cancer Gene Ther. 2001 Jan;8(1):55-62, Morikane K at al. Int Immunol. 2001- Feb;13(2):233-40, Hannani D et al.Cell Death Differ. 2014;21(1):50-8).
Utilisation de modèles murins d’asthme : Contrôle environnemental de la réponse immunitaire pulmonaire dans l’asthme
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
7 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des instillations intranasales d'allergènes jusqu'à cinq fois par semaine et, pour la mesure de la fonction respiratoire, sont anesthésiées, curarisées puis trachéotomisées avant des aérosols de méthacholine, une intervention terminale. Le porteur affirme que les modèles d'asthme "n'induisent pas d'effets indésirables particuliers". Sur le remplacement, il indique que les cibles thérapeutiques ne peuvent être définies qu'in vivo, tout en mentionnant des coupes de poumon cultivées qui remplacent certaines expériences de mise au point.
Objectifs
L’asthme est une maladie complexe et chronique associée à une hyperréactivité bronchique, une inflammation pulmonaire, et un remodelage des voies respiratoires. L’asthme allergique est un problème mondial : en 2014, le nombre d’individus atteints était estimé à 334 millions. En France, 20 à 25% de la population générale souffre d’une maladie allergique, et la prévalence de l’asthme atteint 7%. Cette maladie entraîne 2000 décès par an, dont environ 200 parmi les enfants, les adolescents ou les adultes de moins de 45 ans. L’asthme provient de l’interaction complexe entre des facteurs génétiques et des agents environnementaux comme les allergènes, les pathogènes respiratoires ou encore les polluants. En outre, des observations cliniques et expérimentales suggèrent que des perturbations du microbiote gastrointestinal , ainsi que des perturbations du rythme circadien peuvent rompre des mécanismes de tolérance immunologique et pourraient influencer la capacité de l’hôte à développer ou non de l’asthme. Ces données suggèrent que l’environnement pourrait donc intervenir à la fois dans l’induction et l’amplification de l’asthme allergique. Le projet vise à étudier le rôle de l’environnement sur le contrôle de la réponse immune dans l’asthme allergique. Des interventions thérapeutiques sous forme de d’antagonistes de l’immunité innée, des anti cytokines ou récepteurs de cytokines ou des vaccins seront également testées.
Bénéfices attendus
1. Evaluation du rôle de certains récepteurs de l’immunité innée, cytokines, cellules innées, dont le rôle dans la physiopathologie de l’asthme allergique est totalement inconnu. 2. Elucidation du rôle des polluants de type HAP dans le développement des asthmes sévères caractérisés par une forte composante Th17 et Th22 et dans la régulation cytokinique. 3. Implication de certaines populations cellulaires dans le lien reliant le rythme circadien et l’asthme. 4. Implication de certaines populations cellulaires dans l’exacerbation de l’asthme induite par les agents pathogènes 5. Identification de nouvelles thérapeutiques dans l’asthme
Procédures
Les animaux reçoivent des intra nasales d’allergènes de 1 à 5 fois par semaine (durée 5 à10 minutes) ou d’autres produits (administration non invasive) de 1 à 5 fois par semaine (durée 5 à10 minutes), pour lesquels une anesthésie par isofluorane est pratiquée. Pour les groupes pour lesquels une analyse de la fonction respiratoire est prévue (Flexivent), les animaux sont anesthésiés et curarisés avant la trachéotomie et le branchement à l’appareil de mesure. Quatre aérosols de méthacholine sont effectués à différente concentrations, et la procédure dure 30 minutes. Cette intervention est terminale.
Impact sur les animaux
Les modèles d’asthmes n’induisent pas d’effets indésirables particuliers. Le retentissement sur la fonction pulmonaire est évalué sur animaux avec anesthésie létale.
Devenir
L’analyse des résultats obtenus dans les différentes expériences nécessite d’avoir accès aux organes (dosage des protéines, des gènes, coupes de poumon en gel, évaluation histologique) et au sang (réponse humorale) et de pouvoir analyser la réponse fonctionnelle respiratoire. Toutes ces procédures nécessitent une anesthésie létale afin d’empêcher toute souffrance de l‘animal.
Remplacement
Les alternatives non animales de ce projet sont l’homme lui même. Cependant, si des prélèvements périphériques (sang) et même bronchiques peuvent être obtenus chez l’homme, les expériences in vivo visant à définir de nouvelles cibles thérapeutiques dans l’asthme restent cantonnées aux animaux. Il s’avère à l’heure actuelle impossible d’évaluer l’implication de certaines populations cellulaires ou molécules cibles thérapeutiques in vivo chez l’homme, sans avoir en amont un solide background des effets potentiellement bénéfiques de ces voies/molécules dans cette pathologie. Par contre on peut envisager des remplacements partiels de certaines parties expérimentales. Ainsi, nous avons mis au point un système de coupes de poumon frais cultivables dans du milieu permettant une évaluation ex vivo par exemple de la meilleur dose d’antagoniste ou de la meilleure cinétique à utiliser, ce qui permet de remplacer un certain nombre d’expériences animales de mise au point.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, dans la plupart de nos protocoles, un seul groupe témoin est utilisé et permet la comparaison avec les différentes souris génétiquement modifiées. De plus les analyses statistiques effectuées dans nos travaux précédents nous ont permis de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser, soit 6 souris par groupe, en répétant l’expérience 3 fois afin d’obtenir suffisamment de cellules à analyser pour la cytométrie en flux, 8 souris par groupe pour l’analyse des résistances des voies aériennes par flexivent (indépendamment de la cytométrie en flux car il a été montré que l’acétylcholine (dont un équivalent : la métacholine, est utilisée pour mesurer l’hyperréactivité bronchique au Flexivent®) induisait l’activation des cellules immunitaires comme les lymphocytes (augmentation rapide et transitoire du Ca2+ intracellulaire), ce qui pourrait modifier l’analyse de l’activation et de la production de cytokines des différentes cellules immunitaires analysées dans nos protocoles), et 4 souris par groupe pour l’histologie (de nouveau indépendamment des autres mesures car les lavages bronchoalvéolaires ou le flexivent endommage considérablement la structure du poumon).
Raffinement
Afin de réduire stress et souffrance, un enrichissement de l’environnement est pratiqué dans notre animalerie (maison rouge dans toutes les cages, maximum 4 souris par cage, possibilité de rajouter du carton). De plus, une surveillance régulière journalière des animaux est effectuée, et la mise à mort par injection létale de pentobarbital réalisée en cas de souffrance identifiée par des caractéristiques telles que : prostration, poils hirsute, perte de poids (égale ou supérieure à 15% du poids initial).
Choix des espèces
Les modèles animaux souris reproduisent les différents paramètres de la pathologie asthmatique allergique. En outre de nombreuses souris génétiquement modifiées ou anticorps spécifiques existent permettant d’identifier des molécules ou cellules impliquées et des cibles thérapeutiques pertinentes chez l’homme. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-8 semaines) comme dans la majorité de la littérature sur le sujet.
Caractérisation de lignées épileptiques de souris génétiquement modifiées pour la voie mTOR
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une souris qui fait une crise de plus de cinq minutes, ou plus de dix crises par jour pendant les enregistrements, atteint un point limite et est mise à mort. 450 souris de lignées génétiquement modifiées sur la voie mTOR, sujettes à des crises d'épilepsie spontanées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées, au plus tard à un an pour celles qui ne font aucune crise. Elles sont génotypées par un prélèvement au bout de la queue à une semaine, puis, selon les groupes, subissent l'implantation d'électrodes dans le crâne suivie d'un isolement pour des enregistrements vidéo-EEG d'une semaine, répétés après une à deux semaines de repos, ou jusqu'à sept tests de comportement de dix minutes à une heure. Le résumé ne nomme aucun de ces tests, destinés à repérer des "altérations comorbides à l'épilepsie".
Objectifs
Le projet a pour but de caractériser les conséquences fonctionnelles de mutations de la voie mTOR retrouvé chez l’homme, qui conduisent à des phénotypes épileptiques. Nous créerons de nouveaux modèles de souris génétiquement modifiées afin de faire un suivi de leur phénotype, ainsi qu’une caractérisation électrophysiologique et comportementale (altérations comorbides à l’épilepsie).
Bénéfices attendus
Le projet permettra de valider les modèles murins d’épilepsie, afin de comprendre les mécanismes à l’origine des crises d’épilepsies et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces avancées sont urgentes en raison de la pharmacoresistance élevée des patients avec une dysplasie focale corticale liée à ces mutations, et la nécessité du recours à la chirurgie de l’épilepsie pour contrôler les crises.
Procédures
**Les lignées maintenues dans le cadre de ce projet peuvent présenter des crises d'épilepsies spontanées. Une chirurgie sous anesthésie et analgésie (1h maximum) sera pratiquée pour l’implantation d’électrode intracrânienne puis isolement et enregistrement EEG (Electro-encéphalographique) afin d’enregistrer l’activité électrique cérébrale sur animal vigile (session d’une semaine séparée par 1-2 semaine de repos) pour détecter des crises d’épilepsie spontanées. Des études de comportement sur animal vigile (7 tests maximum, tous les 2-3 jours, d’une durée minimale de 10 min et maximale d’1h par test) seront réalisées. **
Impact sur les animaux
**Les nuisances attendues sont : 1) Le développement prédit d’un phénotype épileptique avec des crises spontanées dont la fréquence reste à définir (quotidienne, hebdomadaire ou mensuelle selon les modèles), 2) La chirurgie due à l’implantation intra crâniale d’électrodes (douleur, inconfort), et l’isolement des animaux prévus pour l’enregistrement vidéo-EEG de l’activité électrique cérébrale 3) Un stress lié à l’analyse comportementale des animaux.**
Devenir
**Maintien et suivi de lignées dommageables : les animaux implantés seront euthanasiés dès qu’un point limite sera atteint, ou à l’âge d’un an maximum si aucune crise ne survient. Analyse vidéo-EEG (enregistrement de l’activité électrique cérébrale) : les animaux seront euthanasiés à la suite de la détection de crises épileptiques, ou à l’âge d’un an maximum si aucune crise ne survient. Les animaux étant implantés avec des électrodes, nous ne pouvons pas utiliser les animaux pour le comportement car les électrodes pourraient avoir un impact. Des prélèvements pourront être réalisés pour études biochimiques (Western blot). Analyse comportementale : Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.**
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car: (1) Les modifications cérébrales nécessaires ne peuvent être étudiées chez l’humain. (2) La culture cellulaire ne reproduit pas certaines propriétés des crises d'épilepsie dans un cerveau entier. (3) La modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore manquantes
Réduction
**Nous veillerons à générer le minimum d'animaux nécessaires à la fois pour le maintien de nos lignées et pour leur utilisation dans des expériences en vue de produire des conclusions scientifiques statistiquement fiables. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance, nous procèderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le calcul de puissance sera ajusté selon les premiers résultats, car nous ne pouvons pas encore prédire les différences de moyennes et de variabilité entre nos groupes. Nous avons prédit un minimum de 10 animaux par groupe (n=450). **
Raffinement
**Les animaux sont hébergés selon les normes en vigueur et les cages enrichies d’un nid de coton, et d’une maison en cas d’inconfort (animal isolé) ou pour les souris gestantes. Si un animal fait une crise de plus de 5 minutes (par observation dans la cage), cela constituera un point limite. De plus, lors des enregistrements vidéo-EEG (enregistrement de l’activité électrique cérébrale) : si un animal fait plus de 10 crises par jour, cela constituera un point limite. Les animaux feront donc l'objet d'une surveillance étroite par le personnel de soin animalier. Le poids, l'apparence physique et des changements de comportement seront les facteurs pris en compte. Suite à la procédure d’implantation d’électrodes, on administre un analgésique. Ce traitement pourra être prolongé jusqu’au rétablissement de l’animal (si aucun point limite n’est atteint). L'expérimentateur pèsera les animaux chaque jour suivant la chirurgie pendant une semaine, puis une fois par semaine, et évaluera objectivement l'apparence physique de l'animal (convulsions, dos voûté) et son comportement (lenteur des mouvements) au moins une fois par semaine. D'autre part, les animaux feront l'objet d'un suivi postopératoire avec une surveillance rapprochée de l'expérimentateur jusqu'au réveil complet de l'animal et surveillance quotidienne étroite de l'expérimentateur et du personnel de soin animalier pendant les deux semaines suivant la chirurgie. Les mouvements, le poids, la respiration et les réflexes tels que le retrait de la patte seront observés. S'ils révèlent une dégradation ou une souffrance de l'animal, celui-ci sera euthanasié afin d’arrêter la douleur.**
Choix des espèces
**Nous travaillerons sur une espèce animale: la souris. Notre choix a été motivé par des raisons scientifiques: (1) Nos études portent sur des modèles génétiques d'épilepsie nécessitant des modifications génétiques ciblées, possibles chez ces animaux (CRE/lox). (2) L'établissement de lignées pures avec un fond génétique stable et homogène utilisées dans les laboratoires du monde entier permet la reproductibilité et la comparabilité des résultats et donc la réduction du nombre d’animaux. (3) Ces deux espèces sont majoritairement utilisées pour modéliser les crises d’épilepsies. Elles ont donc été explorées de manière exhaustive de la molécule au comportement, permettant une solide base scientifique sur laquelle baser nos travaux. (4) Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. Les animaux seront génotypés par biopsie d’un bout de queue (environ 1 mm) à l’âge de 1 semaine (avant la queue est trop peu développée pour permettre le prélèvement). Pour le suivi, les animaux seront observés dès l’âge de 15 jours (une fois le génotype établi). L'épilepsie apparaissant généralement à l'âge juvénile-jeune adulte Pour les autres procédures, les souris seront utilisées à partir de l’âge 3 semaines (après sevrage). Pour la même raison que l'âge d'observation des animaux, de plus la procédure n°2 impose un isolement des animaux après chirurgie, or cela n'est pas possible avant sevrage.**
Evaluation de l’efficacité de composés pharmacologiques dans un modèle d’épilepsie néonatale liée au gène Kcnq2.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Traitées par l'alimentation, par gavage ou par injection intrapéritonéale, pendant un à trois jours ou chaque jour de leur 25e à leur 90e jour de vie, des souris porteuses d'un variant du gène Kcnq2 font des crises d'épilepsie spontanées et passent des tests d'apprentissage et de mémoire que le résumé ne nomme pas. 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur système nerveux central. L'équipe prévoit de tester 20 molécules, et un résultat favorable servirait de base à une demande d'essai clinique chez l'enfant. Le porteur écrit qu'aucun "effet indésirable particulier n'est attendu", puis qu'une crise spontanée peut conduire "à la mort de l'animal".
Objectifs
Des variants pathogènes dans le gène KCNQ2 provoquent une épilepsie dans l'espèce humaine. Cette épilepsie se manifeste par de fréquentes crises survenant durant les tous premiers mois de vie (avant l'âge de 3 mois). Cette activité épileptique est accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle knock-in porteuse d'un variant récurrent du gène KCNQ2 (T274M). La souris hétérozygote pour ce variant reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Ce modèle permet de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Ce modèle est le premier (et le seul pour le moment) qui puisse permettre de tester des approches thérapeutiques sur organisme entier dans un contexte valide par rapport à la pathologie humaine. Le projet comporte la stabulation d'animaux à phénotype dommageable, leur traitement par des candidats médicaments et l'évaluation de leur phénotype sur le plan des crises d'épilepsie et des capacités cognitives. A l'heure actuelle, il existe des molécules qui vont atténuer les crises d'épilepsie chez les enfants présentant une épilepsie liée au gène KCNQ2 (par exemple la carbamazépine). La multiplicité des traitements subis par ces enfants et leur hétérogénéité (clinique et génétique) ne permet cependant pas d'établir clairement si les traitements efficaces sur les crises le sont aussi sur le développement neurologique. Il s'agit pourtant d'une question essentielle. Pour l'ensemble de ce projet, nous envisageons de tester 20 molécules. Nous avons pour objectif d'identifier des molécules qui apporteront un bénéfice en terme de neurodéveloppement. Si le traitement est efficace, nos souris modèle devront présenter moins de crise mais aussi avoir un neurodéveloppement le plus normal possible.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans un modèle unique d'encéphalopathie épileptique. Si un candidat médicament s'avère efficace pour diminuer les crises d'épilepsie et pour améliorer les déficits cognitifs dans le modèle, les résultats serviront de base à une demande d'essai clinique dans l'espèce humaine.
Procédures
Traitements pharmacologiques par l'alimentation, par gavage ou injection intrapéritonéale en fonction des candidats médicaments. Traitements aigus (1 à 3 jours) ou chroniques (entre P25 et P90) en fonction de la pharmacocinétique des composés testés. Prélèvements sanguins en fin de protocole pour estimer la biodisponibilité des composés ou de leurs métabolites et confirmer l'exposition.
Impact sur les animaux
Etant donné que les molécules administrées sont censées avoir un effet antiépileptique, nous attendons une amélioration du phénoptype des anilmaux (moins de crises, meilleures capacités d'apprentissage). Aucun effet indésirable particulier n'est attendu. Dans le pire des cas, les candidats médicaments n'auront pas d'efficacité. S'ils aggravent le phénotype (voir suivi des animaux ci-dessous), les traitements seront alors immédiatement interrompus. Dans ce modèle, il est également possible que les animaux présentent une crise spontannée conduisant à la mort de l'animal.
Devenir
Les animaux sont conservés pendant la durée de la procédure (traitement, évaluation des améliorations phénotypiques, prélèvement sanguin) puis euthanasiés en fin de procédure afin de prélever le système nerveux central pour réaliser des analyses histologiques, transcriptomiques et protéomiques.
Remplacement
Les épilepsies sont provoquées par des décharges inadaptées de cellules excitables en réseau. Les crises ainsi générées se traduisent, le plus souvent, par des mouvements anormaux. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le gène Kcnq2 est très conservé entre la souris et l'Homme. Les tests phénotypiques sont bien développés dans cette espèce. Le modèle que nous utilisons est le premier et le seul disponible pour le moment pour cette pathologie. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les médicaments candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de modèles iPS avant d'en préciser les caractères de d'efficacité et de toxicité éventuelle. L'étude des capacités d'apprentissage et de mémorisation ne peut être effectuée que sur l'animal vivant.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé sera optimisé et calculé de façon à ce que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats s'ils doivent être utilisés ultérieurement pour justifier un essai clinique pédiatrique.
Raffinement
L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. La méthode d'administration des traitements la moins contraignante possible sera utilisée (dans les croquettes servant d'alimentation à chaque fois que cela est possible). Des points limite clairs sont définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu'ils atteindront les critères d'interruption.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Les souris seront traitées au moment où apparaissent les crises d'épilepsie spontanées dans ce modèle et uniquement chez des animaux sevrés (entre P25 et P30). La suppression des crises d'épilepsie est le premier critère de jugement d'efficacité de la molécule testée. Le traitement pourra se poursuivre quotidiennement jusqu'à P90 où l'évaluation finale de leur comportement sera effectuée (tests d'apprentissage et mémorisation). Dans l'espèce humaine, la maladie est sporadique (sans histoire familiale) et n'est donc détectée chez un nourrisson qu'au moment où les premières crises apparaissent. Nous nous placerons donc dans ce même cas de figure avec les animaux modèles étudiés ici, traités au moment où leur pathologie se manifeste.
Colite : Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques sur l’inflammation du colon induite par administration d’agents chimiques ou de bactéries, par injection d’anticorps, ou par transfert de cellules chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 2000
8 000 souris et 2 000 rats, soit 10 000 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour prélever de grands volumes de sang et de la peau. L'équipe provoque chez eux une colite par du DSS dans l'eau de boisson, jusqu'à trois cycles de cinq jours, par du TNBS administré dans le rectum après 12 à 16 heures de jeûne, par la bactérie Citrobacter rodentium, ou, chez des souris immunodéficientes, par un anticorps ou des cellules immunitaires, avec une diarrhée parfois hémorragique et des pertes de poids marquées attendues. Les composés testés, présélectionnés sur des cellules humaines et destinés à la maladie de Crohn ou à la rectocolite hémorragique, leur sont administrés par toutes les voies, y compris par minipompe implantée, et les rongeurs peuvent subir endoscopies, biopsies de peau et jeûnes de huit heures. Le porteur affirme employer le "nombre minimum suffisant" et explique l'effectif par le "nombre d'études élevé prévu pour tester un grand nombre de composés", sans dire combien de composés sont visés.
Objectifs
La colite inflammatoire se traduit par une diarrhée chronique consécutive à l’inflammation des parois de l’intestin. Elle peut être provoquée par des bactéries, des parasites, la prise de médicaments, le traitement par radiothérapie, la rectocolite hémorragique ou la maladie de Crohn. La rectocolite hémorragique est caractérisée par une inflammation de la muqueuse et sous-muqueuse du rectum et du colon. La maladie de Crohn entraîne plus de complications, car l’inflammation peut toucher le tube digestif entier, de la bouche jusqu’à l’anus, et créer une obstruction partielle de l’intestin. La colite post-radiothérapie s’observe surtout après irradiation dans la zone abdominale et pelvienne dans le cas de traitement anti-cancéreux. Les parasites et bactéries provoquent des colites spontanément résolutives, mais certains d’entre eux peuvent produire des lésions qui ressemblent à une maladie inflammatoire primitive. Ce projet a pour but de tester in vivo des composés chimiques ou biologiques dont le potentiel anti-inflammatoire aura été déterminé au préalable dans des tests in vitro. Pour cela, il est nécessaire de disposer d’un modèle rongeur où il est possible de créer un état inflammatoire du colon tel qu’on peut l’observer chez l’homme. Actuellement, l’arsenal thérapeutique disponible, notamment les anti-inflammatoires, ne permet pas de soigner correctement ces pathologies lourdes, et de multiples interventions chirurgicales sont nécessaires pour retirer au fur et à mesure les portions lésées de l’intestin. Malgré leur efficacité, les anti-TNF doivent être utilisés avec précaution dans ces pathologies car ils augmentent la survenue de maladies infectieuses. Il existe clairement un besoin thérapeutique pour soigner les colites inflammatoires. Pour réaliser ce projet, un travail important est réalisé au préalable in vitro sur des cellules humaines, ceci dans le but de sélectionner les meilleures molécules à progresser. Cependant, étant donnée la complexité des mécanismes impliqués dans les pathologies inflammatoires du colon, il est difficile de prédire le potentiel thérapeutique d’une molécule uniquement sur la base de résultats in vitro. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les différents aspects de ces maladies, afin de pouvoir évaluer in vivo les meilleurs composés identifiés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur plusieurs maladies inflammatoires digestives : maladie de Crohn, rectocolite hémorragique, colite ulcéreuse... A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies pour laquelle les options sont pour le moment limitées et imparfaites.
Procédures
Une colite pourra être induite par l’administration de Dextran sulfate sodium (DSS) dans l’eau de boisson des animaux soit pendant 7 jours, combiné ou non à des anticorps (2 injections par semaine, 5 minutes par injection). Ces études dureront au maximum 4 semaines. Il est aussi possible d’administrer le DSS dans l’eau de boisson trois fois 5 jours, avec 5 jours sans DSS entre les cycles. Ces études dureront au maximum 8 semaines. Le Trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) pourra aussi être administré 1 ou 2 fois par voie intra-rectale (sous anesthésie générale, acte d’1h), après 12 à 16h à jeun. Ces études dureront 2 semaines au maximum. Des bactéries Citrobacter Rodentium (administration durant 5 minutes) pourront être administrées. Ces études dureront au maximum 3 semaines. Chez des souris immunodéficientes, le modèle aigu de colite (sur 8 jours) est induit par administration d’un anticorps (injection unique, prenant 5 minutes). En utilisant les mêmes souris immunodéficientes, un modèle chronique de colite est inductible par injection de cellules immunitaires humaines ou murines (injection prenant 5 minutes). Les études dureront au maximum 16 semaines. Des modèles de souris développant spontanément une colite peuvent aussi être utilisés. Ces études dureront au maximum 22 semaines. Les animaux seront pesés deux fois par semaine avant induction, puis une fois par jour à partir de l’induction ou de l’apparition des signes cliniques dans les modèles spontanés (5 minutes). Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par voie : intranasale et intratrachéale (anesthésie, 1h), intramusculaire et intradermique (anesthésie, avec analgésie, 1h), orale sur animaux vigiles (1 minute), sous cutanée et intrapéritonéale (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute), ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (anesthésié 1 heure). Des prélèvements de sang ou d’urine ou de fécès pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie). Des biopsies de peau pourront éventuellement être réalisées, sous anesthésie générale avec analgésie (1h30). Des endoscopies digestives pourront être réalisées, après de 8h de mise à jeun, sous anesthésie générale (1h environ). Les animaux pourront aussi être mis à jeun avant et pendant l’administration puis la digestion de Dextran Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) afin de mesurer la perméabilité digestive (mise à jeun totale de 8h).
Impact sur les animaux
Dans ces modèles de maladies inflammatoires digestives, de la diarrhée, potentiellement hémorragique, est attendue. Des pertes de poids marquées sont attendues. Les animaux pourront recevoir des traitements par toutes voies et avec toutes les fréquences d’administrations possibles, dans le respect des recommandations vétérinaires. Des prélèvements de sang pourront être effectués dans le respect des recommandations de voies et de volume. Pour induire la colite, les animaux pourront recevoir du TNBS par voie intrarectale, une à deux fois, après mise à jeun 12 à 16H. Des endoscopies pourraient être réalisées, sous anesthésie générale, avec mise à jeun de 12h. Dans le cas où du Dextran FITC serait administré, les animaux seront mis à jeun 12h maximum.
Devenir
Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de la peau et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. Dans tous ces modèles, il a été démontré que 8 à 11 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres, sauf dans les modèles spontanés sur souris transgéniques dans lesquels 10 à 12 animaux seront nécessaires. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévu pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.
Raffinement
La diarrhée et le sang dans les selles seront suivis quotidiennement à partir de l’induction. Dans les modèles spontanés, ils seront suivis deux fois par semaine jusqu’à apparition des signes cliniques puis une fois par jour. Le poids des animaux sera suivi deux fois par semaine jusqu’à l’induction puis une fois par jour. Dans les modèles spontanés, le poids sera suivi deux fois par semaine avant apparition de signes cliniques / pertes de poids puis une fois par jour dès l’induction. Les actes douloureux seront réalisés avec analgésie. Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
-L’administration du DSS ou du TNBS peut être réalisée sur des souris ou des rats, et est très bien documentée dans la littérature. -Pour créer un modèle de colite d’origine auto-immune, il faut utiliser des souris immuno-déficientes qui ne possèdent pas de lymphocytes T et B matures. -Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées à minima sur une espèce rongeur (rat ou souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles d’inflammation digestive d’intérêt sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.
Etude pilote du rôle d’IL4I1 sur la croissance d’un modèle de cancer du sein triple négatif.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
94 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein triple négatif leur sont greffées dans la glande mammaire sous anesthésie, puis la tumeur est mesurée trois fois par semaine, pour cette étude pilote sur le rôle de l'enzyme IL4I1. Le porteur indique que 20 à 30 % des souris peuvent développer une ulcération ou une nécrose de la tumeur, et fixe un volume de 1 500 mm³ comme point limite. Il justifie la mise à mort par une croissance tumorale "inéluctable" et affirme que le contrôle de la tumeur par le système immunitaire ne peut pas être modélisé in vitro.
Objectifs
Rationnel : IL4I1 est une enzyme immunosuppressive (elle empêche le système immunitaire de fonctionner). Sa production dans les tumeurs est associée à des paramètres de mauvais pronostic ou une survie diminuée des patients atteints de différents types de cancers. Nos données préliminaires montrent qu’elle est présente dans les cancers du sein dits « triple-négatifs », une forme agressive de cancer mammaire, pour laquelle les traitements actuels sont peu efficaces, y compris les nouvelles immunothérapies. L’inhibition d’IL4I1 (par invalidation du gène qui code l’enzyme ou administration d’un inhibiteur chimique de l’activité enzymatique) réduit la croissance tumorale dans différents modèles murins, en particulier, l’inhibition d’IL4I1 freine la croissance de modèles de cancer du pancréas et de mélanome. Objectif : Dans cette étude pilote, nous souhaitons vérifier la pertinence de l’invalidation d’IL4I1 pour améliorer le contrôle de la croissance tumorale des cancers du sein triple-négatifs, en utilisant une lignée tumorale murine modèle de ces tumeurs (EO771). Stratégie envisagée : Nous allons greffer des cellules tumorales EO771 dans la glande mammaire de souris syngéniques afin de développer un modèle orthotopique immunocompétent. Nous testerons l’effet de l’invalidation d’IL4I1 sur la croissance tumorale en comparant les courbes de croissance des tumeurs développées chez les souris de la souche naturelle (WT) à celles des tumeurs développées chez les souris déficientes en IL4I1 (IL4I1-/-).
Bénéfices attendus
L’étude pilote permettra de valider l’intérêt d’étudier le rôle d’IL4I1 dans le développement du cancer du sein triple négatif. Dans un deuxième temps (saisine future), une fois cette preuve de concept obtenue, le projet permettra de mettre au point chez la souris un modèle de traitement reposant sur l’inhibition d’IL4I1 avec un composé chimique et d’étudier les mécanismes immunitaires sur lesquels repose l’effet thérapeutique.
Procédures
Injection lente et continue d’une suspension cellulaire en tampon salin dans la glande mammaire (volume = 100 microlitres) sous anesthésie à l’isoflurane. L’injection dure moins d’une minute. Mesure de la tumeur (croissance superficielle) avec un pied à coulisse sur animal vigil, 3 fois par semaine pendant 2 semaines. La mesure dure moins d’une minute par animal.
Impact sur les animaux
L’anesthésie limite le stress lié à la contention et améliore la précision de l’injection. Une injection précise permet une croissance harmonieuse et localisée de la tumeur et ainsi limite le risque de souffrance. Malgré ces précautions, dans 20 à 30% des effectifs, il peut apparaitre une ulcération, une nécrose ou un suintement localisé au niveau de la tumeur qui représente un point limite. Un volume tumoral de 1500 mm3 (atteint habituellement 3 semaines après injection) est également considéré comme un point limite.
Devenir
La croissance tumorale est inéluctable, les animaux doivent donc être mis à mort en fin d’expérimentation.
Remplacement
Le contrôle de la croissance tumorale par le système immunitaire ne peut pas être modélisé in vitro, car il implique de très nombreuses interactions cellulaires et moléculaires coordonnées au cours du temps dans l’organisme entier. Bien qu’imparfait, le modèle murin reste d’utilisation courante pour ce type d’étude.
Réduction
Nous souhaitons observer une réduction d’au moins 20% de la croissance tumorale dans le groupe de souris IL4I1-/- (souche invalidée pour l’expression d’IL4I1) par rapport au groupe contrôle (souche naturelle), de façon à pouvoir considérer cette diminution comme biologiquement significative. Si on considère que cet effet devra être visible lorsque la tumeur du groupe contrôle aura atteint un volume de 500 mm3 (environ 18 jours après injection de 0,25x10E6 cellules), la variance habituelle à cette date étant de 150 mm3, le nombre de souris à tester par groupe est de 36. Les animaux qui seraient mis à mort avant la fin de l’expérimentation ne pourraient pas être pris en compte. Sachant que jusqu’à 30% des animaux auront atteint un point limite avant J18 du fait de lésions au niveau de la tumeur, il faut prévoir 30% d’animaux supplémentaires par groupe, soit 0,3x36 + 36 = 47 animaux par groupe. Des courbes d’incidence de l’apparition des tumeurs et de survie (Kaplan-Meier) seront réalisées en parallèle. L'estimation du nombre d'animaux nécessaires sur la base d'une différence de 30% de la survie est de 45 animaux par groupe en tenant compte des 30% d'animaux non évaluables. Dans le cas où cette différence atteindrait 40%, 28 animaux par groupe seraient suffisants. La totalité de cet effectif ne sera pas inclus dans une seule expérimentation, permettant d'adapter le nombre d'animaux inclus aux résultats obtenus. Habituellement, nous incluons 8 à 12 animaux par groupe et par expérimentation. Ainsi, la procédure sera arrêtée dès qu'une différence statistique entre les deux groupes sera obtenue.
Raffinement
Les animaux bénéficient de mesures d’enrichissement du milieu. L’injection des cellules tumorales sera faite sous anesthésie (isoflurane, 4% pour induction, 2% pour maintien), ce qui limite le stress pour les animaux et augmente la précision de l’injection dans la glande mammaire. Le suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine par le même opérateur, à partir du huitième jour après injection. La taille des tumeurs sera mesurée avec un pied à coulisse. Le comportement et l’aspect général des animaux ainsi que l’aspect de la tumeur seront évalués de façon à détecter précocement des signes de souffrance (tels que ralentissement des mouvements, tremblements, perte de poids) ou un point limite (tel que nécrose de la tumeur) qui nécessiteraient d’interrompre l’expérimentation pour cet animal.
Choix des espèces
Notre projet s’intéresse au contrôle de la croissance du cancer du sein triple négatif par le système immunitaire (précisément par l’enzyme IL4I1 qui joue un rôle de frein de la réponse immunitaire contre le cancer). Seule la souris permettra d’étudier la croissance d’une lignée murine reconnue comme modèle de cancer du sein triple négatif. Souris adultes (plus de 6 semaines). Le cancer du sein est une tumeur de l’adulte.
ETUDE DES MECANISMES REGULANT LE REMODELAGE VASCULAIRE AU COURS DE L’HYPERTENSION CHEZ LA SOURIS
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, subissent une chirurgie de 15 à 20 minutes pour induire une hypertension puis des mesures de pression et une échocardiographie sous anesthésie, pour étudier le remodelage des vaisseaux. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, infection et hémorragie et que l'anesthésie peut entraîner un arrêt cardiaque, tout en affirmant que l'hypertension induite reste indolore. Sur le remplacement, il affirme que la régulation de la pression artérielle ne peut être évaluée qu'in vivo et impose le modèle murin.
Objectifs
L’objectif de notre recherche est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'altération de la structure des vaisseaux et le développement de l’hypertension artérielle. Plusieurs travaux ont corrélé l’activation d’un récepteur membranaire avec l’augmentation de la pression artérielle plus particulièrement chez les mâles. Notre objectif est de démontrer que cette voie régule la pression artérielle et la structure des vaisseaux, de comprendre quelles cellules vasculaires sont affectées et quelle est l'origine de l'effet dépendant du sexe.
Bénéfices attendus
L'identification de nouveaux acteurs régulant la structure des vaisseaux et jouant un rôle dans le développement de l'hypertension va permettre de mettre à jour de nouvelles cibles potentielles pour le traitement des hypertensions résistantes aux traitements actuels (environ 15% des malades).
Procédures
Au total 600 souris seront utilisées pour 3 procédures légères ou modérées. Dans les procédures modérées 1 et 2, les 480 souris seront soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes durant 1 semaine puis 2 fois par semaines pendant 5 semaines. Elles seront soumises à une procédure chirurgicale de 15 à 20 min pour mettre en place des modèles d’hypertension. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie et sous analgésique donné en préventif mais aussi en post-chirurgical. La pression sera mesurée à la queue de façon hebdomadaire. Les souris seront aussi étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie légère quelques jours avant la fin de la procédure où la pression sera mesurée dans la carotide sous anesthésie puis les souris seront euthanasiées. Dans la procédure 3 légère, les 120 souris seront soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes durant 1 semaine. La pression sera mesurée à la queue toutes les 2 semaines pendant 3 ou 6 mois. Les souris seront aussi étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie légère quelques jours avant la fin de la procédure où la pression sera mesurée dans la carotide sous anesthésie puis les souris seront euthanasiées.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront certains actes chirurgicaux qui pourront entrainer de la douleur péri et post-opératoire. Les procédures chirurgicales ou d’injection peuvent aussi conduire à des infections. Lors de la chirurgie, il peut y avoir une hémorragie. L’anesthésie peut aussi entrainer un arrêt cardiaque. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Selon notre expérience, les modèles transgéniques, utilisés à l'état adulte, n’entrainent pas de phénotype douloureux pour les animaux.
Devenir
Les 600 animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés en fin d’expérimentation à l’issue d’une mesure de la pression artérielle sous anesthésie. Les animaux sont utilisés à des fins expérimentales qui nécessitent leur euthanasie afin de pouvoir mesurer leurs paramètres hémodynamiques et vasculaires et étudier les tissus.
Remplacement
Dès que possible, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture (progéniteurs en culture, cellules vasculaires en culture), cependant la régulation de la pression artérielle et la participation de cellules au remodelage vasculaire ne peuvent être évalués qu'in vivo, c'est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins.
Réduction
Ce projet implique 600 souris au total avec des lots de 10 et 15 animaux. La taille des effectifs des différents lots a été déterminée grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. A notre connaissance, ces expériences n'ont jamais été réalisées ni en France, ni dans le monde, par d'autres équipes dans un protocole expérimental semblable.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Le poids des animaux est suivi tout au long des procédures. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum et une température et hygrométrie constantes. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée et le poids des animaux sera mesuré régulièrement. Les points limites seront évalués selon une grille de suivi. En post-opératoire, les souris seront observées quotidiennement et pesées tous les 2 jours pendant 1 semaine. La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémiques en péri-opératoire et à 24h et 48h en post-opératoire et pourra être renouvelée en cas de souffrance de l’animal. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids. Une perte de sang importante, des signes de souffrance (prostration, poil hérissé, yeux fermés) qui se maintiennent, une prostration, une incapacité à se déplacer, des yeux larmoyants et exorbités constituent également des points limites. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème antibiotique ou par administration d’antibiotique.
Choix des espèces
Nous effectuons des expériences avec des souris modifiées par transgénèse afin de permettre la modification de l'expression de certains gènes ou de marquer des cellules par immunofluorescence. Seuls des modèles de souris existent pour ces altérations géniques. De plus la souris est un modèle couramment utilisé pour l'étude des mécanismes cellulaires impliqués dans le développement de l'hypertension artérielle. Les études sur le rôle de la voie ciblée sur le remodelage vasculaire et la pression artérielle seront effectuées au stade adulte, lorsque le développement vasculaire et cardiaque est fini, après l'âge de 8 semaines. De plus, la voie étudiée est importante pour le développement de la souris, donc nous utiliserons les souris à l'âge adulte (entre 8 et 15 semaines) afin de ne pas perturber leur développement en modulant la voie étudiée.
La voie PIWI/piRNA dans la maintenance de l’intégrité génomique des cellules souches hématopoiétiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser leur moelle osseuse, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des injections répétées de LPS ou de 5-FU, des irradiations aux rayons X et des prélèvements de sang dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie, pour étudier la voie PIWI/piRNA dans les cellules souches du sang au cours du vieillissement. Le porteur indique que la transplantation ou les injections répétées peuvent provoquer une aplasie de la moelle osseuse, et fixe un point limite de perte de poids de 20 % déclenchant la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme que l'obtention de ces cellules impose des prélèvements invasifs et rend le modèle murin "indispensable".
Objectifs
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont à l’origine de toutes les cellules du sang et assurent leur renouvellement en continue. Afin de répondre à l’homéostasie ou à un stress, ces cellules peuvent sortir de leur état latent, proliférer et se différencier. L’induction de la prolifération des CSH peut conduire à un vieillissement précoce. La voie PIWI/piRNA a été montré pour être nécessaire pour limiter la perte de fonction des cellules souche intestinale chez la drosophile en réponse a un stress induisant la prolifération. Nous souhaitons donc utiliser différents modèles de stress prolifératifs afin d’analyser l’importance de la voie PIWI/piRNA dans les CSH.
Bénéfices attendus
Le projet est un projet de recherche fondamentale. Le contrôle de l’intégrité génomique des CSH est indispensable afin de maintenir une hématopoïèse efficace. En effet, l’apparition de dommages de l’ADN comme ceux pouvant être engendrer par les éléments transposables, peuvent conduire soit à une senescence et donc à une diminution de la production de cellules sanguines soit au contraire à l'apparition de clones leucémiques. Il est donc important de bien connaitre les acteurs permettant de contrôler ces éléments transposables, tel que la voie PIWI/piRNA.
Procédures
Ce projet compte 10 procédures différentes comprenant des injections en intrapéritonéale notamment de LPS ou de 5-FU et des irradiations par rayon X sur animaux vigiles, des injections en sous-cutanées et en retro-orbitale ainsi que des prélèvements de sang en retro-orbitaux sous animaux endormis. Chacune de ces procédures est très rapide (de l'ordre de quelques secondes ou de quelques minutes pour l'irradiation), elles sont indolores au moment de la manipulation car au besoin elles sont réalisées sous anesthésie générale par isofluorane (1-3 mn en boîte à anesthésie isofluorane 4%, débit 2L/mn). Certaines injections en intrapéritonéales seront réalisées plusieurs fois (entre 1 et 10 fois tous les 2 à 14 jours d'intervalle selon la procédure).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront être soumis à des irradiations par rayon X, une transplantation par injection intraveineuse de cellules hématopoïétiques, des injections en intrapéritonéale ou sous cutanées. Chacune de ces procédures est très rapide (de l'ordre de quelques secondes ou de quelques minutes pour l'irradiation), elles sont indolores au moment de la manipulation car au besoin elles sont réalisées sous anesthésie générale par isofluorane. Cependant, la transplantation ou des injections répétées de 5-FU ou de LPS peuvent entrainer une aplasie médullaire des animaux. Ces animaux seront donc surveillés quotidiennement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chacune des procédures afin de pouvoir analyser les cellules souches hématopoiétiques présentes dans la moelle osseuse.
Remplacement
Dans l'impossibilité d'obtenir des échantillons de cellules souches hématopoiétiques (nécessitant des prélèvements invasifs), l'utilisation de modèles animaux est indispensable. De plus, la seule manière d'aborder de manière efficace et pertinente les questions que nous posons est de combiner des expériences in vivo, en utilisant les différents modèles de souris génétiquement modifiées. Ne pouvant donc pas remplacer le modèle murin, nous réduirons l'utilisation de souris au nombre minium possible.
Réduction
Sur la base de nos données préliminaires, nous calculerons le nombre minimum de souris nécessaire pour chaque expérimentation permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif (calcul du n avec un test unilateral pour une différence de 10%, un risque alpha de 5%, une puissance beta de 80%). Nous inclurons dans nos groupes expérimentaux aussi bien les males que les femelles afin de limiter au strict minimum le nombre d’animaux produits pour l’expérimentation. Ainsi, pour ce projet, nous utiliserons 600 animaux.
Raffinement
Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les souris afin d'améliorer le bien-être de l'animal pour obtenir des données fiables. Nous vérifierons l’état de santé des souris quotidiennement : tout changement dans leur comportement ou l’apparition de signes cliniques (posture, prostration, difficultés à se déplacer et à s’alimenter, déshydratation) sera relevé et évalué grâce à une grille d'évaluation de la douleur. Lorsque les souris présenteront une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids maximum ou si des signes de souffrances apparaissaient, les animaux seront mis à mort. Durant l’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température et ventilation régulées, lumière avec un cycle de 12h, hygrométrie), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Les souris seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. L’environnement sera enrichi par des dômes en carton ou du coton.
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. De nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiés (que nous ou d'autres ont créées) permettant de poser les questions biologiques qui nous intéressent existent déjà. Des souris adultes entre 6 semaines et 20 mois seront utilisées car nous analysons l'importance de la voie PIWI au cours du vieillissement des CSH.
Analyse de l’effet de molécules thérapeutiques dans le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à 8 grays, greffées avec de la moelle osseuse et des lymphocytes T sous anesthésie, puis reçoivent des injections quotidiennes d'anticorps et des prélèvements de sang dans le sinus rétro-orbital, pour tester des traitements de la maladie du greffon contre l'hôte. Le porteur indique que les souris développent perte de poids, poil terne, atteintes cutanées et posture voûtée, qu'aucun antalgique n'est administré car il modifierait le système immunitaire, et que les animaux atteignant un score clinique de 5 sont mis à mort. Sur le remplacement, il affirme que les expériences in vitro ne peuvent pas répondre à son hypothèse in vivo.
Objectifs
Les lymphocytes T régulateurs sont des cellules immunitaires avec un rôle d’inhibition de la réponse immune. Dans le cas de la maladie du greffon contre l’hôte ces cellules peuvent jouer un rôle important en freinant la réponse immune contre le greffon et diminuant le rejet de greffe par conséquence. Ainsi cibler ces cellules est une des stratégies développées par notre équipe dans l’objectif d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte. Dans ce sens l’objectif de ce projet sera de tester l’efficacité clinique d’anticorps thérapeutiques ciblant cette population spécifiquement. Nous utiliserons des anticorps dirigés contre le CD25 et le TNFR2, des molécules exprimées par les lymphocytes T régulateurs et ayant un rôle dans leur fonction. Nous étudions également l’effet de ces anticorps directement sur les cellules responsables de la maladie qui peuvent temporairement et sous certaines conditions d’activation exprimer les mêmes molécules ou d’autres comme le CD38.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte chez l'homme, une maladie qui requiert aujourd'hui de nouveaux traitements permettant la prise en charge des patients réfractaires aux traitements classiques et de soulager ainsi la souffrance des patients. Dans ce projet, nous allons valider des molécules thérapeutiques pour lesquelles nous avons obtenu des résultats importants.
Procédures
Les souris seront irradiées en 2 fois 5 minutes chacune à raison de 0,8 Gy/min pour un total de 8 Gy. Elles seront ensuite injectées sous anesthésie gazeuse isofluorane avec de la moelle osseuse seul ou de la moelle osseuse avec des lymphocytes T provenant de souris donneuses dans un volume total de 100ul par souris. Ces souris seront traitées selon le schéma choisi (traitement curatif ou préventif) avec 5 injections quotidiennes pendant 5 jours suivi de 5 injections répartis sur 10 jours avec des molécules thérapeutiques dans un volume final de 100ul d’anticorps dilués dans une solution saline et administré par injection intrapéritonéale. Des prélèvements sanguins dans le sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie gazeuse isofluorane à raison d'une à deux fois maximum par expérience. Le premier prélèvement sera effectué 14 jours après le début de l’expérience, le deuxième au moment du sacrifice qui tombe en moyenne à 60 jours après le début de l’expérience. Le volume maximale prélevé sera de 100ul.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer des signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte caractérisés par une perte de poids associée à un pellage terne, possiblement mais pas systématiquement à des atteintes cutanées voire à une posture voutée de l’animal. Les signes cliniques seront classés suivant un score établi de 1 à 5 avec 5 les signes les plus graves. L’évaluation clinique des animaux (score) se fait de la façon suivante : un score de 1 correspond à la présence d’un des signes suivants et qui peuvent apparaître sans ordre précis : une perte de poids de 10%, une posture voutée, une atteinte des poils, une desquamation de la peau, une diarrhée. Les scores s’additionnent pour arriver à un maximum de 5. Si les souris atteignent un score de 5, elles seront euthanasiées. Il est à noter que quand la perte de poids atteint 20% et en absence d’autre signe clinique, les souris seront aussi euthanasiées. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pour établir le score, mais seront surveillés tous les jours pour vérification de leur état par rapport au jour d’avant. Les souris ayant une aggravation de situation seront alors euthanasiées. Ce score a été évalué par nos pairs spécialiste de la greffe de moelle osseuse, publié dans une revue internationale.
Devenir
Les animaux dont la perte de poids aura atteints 20% du poids initial ou bien un score clinique de 5 seront euthanasiés ainsi que les animaux qui n'auront pas atteints les points limites deux mois après l'irradiation. Les animaux restant à la fin des 2 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus.
Remplacement
Le but de ce projet est d'étudier l'effet de molécule thérapeutique sur le développement de la maladie du greffon contre l'hôte in vivo. Dans ce cadre, les expériences in vitro ne pourront pas remplacer l'utilisation des animaux et ne pourront pas répondre à l'hypothèse émise. Toutefois, toutes expériences pouvant donner des informations sur le mode d'action de la molécule en question sans avoir recours à l'expérimentation in vivo sera réalisée.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés au maximum, les expériences seront regroupé dans le maximum possible. Ainsi, nous testerons par exemple les traitements en préventif et en curatif dans une seule expérience, ceci nous permettra de réduire le nombre d'animaux contrôles nécessaires pour chaque expérience.
Raffinement
Afin d’éviter la souffrance des animaux, les souris ayant atteint un score de 5 soit une perte de poids de 20% seront sacrifiées. Cette méthode impose une analyse fine 3 fois par semaine de chaque animal afin d’établit le score clinique associée à un suivi quotidien de l’état général des souris dans le but d’abréger toute sorte de souffrance. Les drogues antalgiques peuvent agir directement sur le système immunitaire et modifier les résultats, elles ne seront donc pas utilisées dans nos expériences. Toutefois, les animaux seront sacrifiés quand leur état ne permet pas d'envisager une amélioration. Enfin il existe une surveillance quotidienne des animaux greffés par les zootechniciens de la plateforme, lesquels sont informés de la nécessité d'une surveillance accrue des animaux du fait de leur engagement dans une expérience. Des enrichissements sont placés dans les cages à raison de 3 par cage afin de réduire l’angoisse des animaux. Lors de l’injection des cellules et du prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbitale, les souris seront anesthésiées sous isofluorane réduisant ainsi la douleur.
Choix des espèces
La maladie du greffon contre l'hôte a été étudié depuis longtemps dans plusieurs milliers d'études publiées. La disponibilité de modèle génétiquement modifié représente un atout non présent dans les autres espèces et qui nous permet de mieux étudier la réponse immune et de se rapprocher au plus de la maladie chez l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte préférentiellement entre 8 et 12 semaines. A cet âge, il possèdent un système immunitaire bien développé et sont suffisamment matures pour supporter les doese d'irradiations auquelles ils seront soumis.